Name: Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Naucz się przygotowywać próbki do analizy cytometrii masowej z wykorzystaniem Cisplatyny i barwienia przeciwciałami. Ta metoda umożliwia badanie heterogenicznych populacji komórkowych na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Barton była wspierana przez grant z Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). Badania te były częściowo wspierane przez stypendium szkoleniowe dla Ryana L. McCarthy'ego z National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. Główny ośrodek, który utrzymuje i obsługuje maszynę do cytometrii masowej, jest wspierany przez grant CPRIT (RP121010) i grant rdzeniowy NIH (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
<li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół został z powodzeniem zastosowany do przetwarzania różnych hodowanych linii komórkowych (hESC H1 i H9, mESC, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) oraz pierwotnych próbek tkanek (szpik kostny myszy, wątroba embrionalna myszy, wątroba dorosłego myszy, guz myszy). Niezależnie od źródła, każda tkanka, która może zostać zdysocjowana na pojedyncze komórki przy zachowaniu stanu komórkowego, powinna być podatna na analizę za pomocą cytometrii masowej, ale może wymagać pewnej optymalizacji protokołu. Waż...

Cytometria umożliwia jednoczesny pomiar wielu celów przeciwciał na poziomie pojedynczej komórki w dużych populacjach komórek. W tradycyjnej cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji liczba parametrów, które można określić ilościowo, jest ograniczona przez nakładanie się widma między widmem emisyjnym wielu fluoroforów, co wymaga coraz bardziej złożonych obliczeń kompensacyjnych wraz ze wzrostem liczby parametrów. Ograniczenia te są eliminowane za pomocą cytometrii masowej, w której przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi są wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu (TOF), aby znacznie rozszerzyć liczbę parametrów zbieranych jednocześnie i uzyskać wysokowymiarowy profil obfitości białek dla każdej pojedynczej komórki.
Podstawowe zrozumienie działania przyrządu do cytometrii masowej jest korzystne dla użytkownika i może być niezbędne do rozwiązywania problemów. Bardziej szczegółowy opis strojenia i uruchamiania maszyny do cytometrii masowej można znaleźć w powiązanym manuskrypcie1. Krótko mówiąc, próbka komórki jest znakowana panelem przeciwciał sprzężonych z metalami ukierunkowanych na markery powierzchniowe komórki, białka cytoplazmatyczne, białka jądrowe, białka związane z chromatyną lub inne epitopy będące przedmiotem zainteresowania (Figura 1i). Oznakowane komórki są ładowane do maszyny, pojedynczo przez ręczne wstrzykiwanie lub za pomocą automatycznego podajnika próbek, który pobiera próbki z 96-dołkowej płytki. Załadowane komórki są wstrzykiwane przez nebulizator, który generuje rozpylone kropelki cieczy otaczające komórki (ryc. 1ii). Spray ten jest umieszczony w taki sposób, że komórki są jonizowane przez palnik plazmowy argonowy. Ta jonizacja generuje chmurę cząstek składającą się ze wszystkich atomów składowych każdej komórki (rysunek 1iii). Gdy ta chmura cząstek przemieszcza się do detektora, atomy o niskiej masie atomowej są oddzielane od jonów o dużej masie przez kwadrupolowy filtr masowy. Pozostałe jony o dużej masie są dalej przesyłane do detektora, gdzie określa się ilościowo obfitość każdego izotopu (ryc. 1iv). Surowe dane zebrane przez detektor są analizowane przez oprogramowanie przyrządu do cytometrii masowej w celu identyfikacji zdarzeń komórkowych. Dla każdego zidentyfikowanego zdarzenia komórki sygnał wykryty w każdym kanale jest określany ilościowo i zapisywany w wyjściowym pliku .fcs. Kanały masowe używane do wykrywania przeciwciał sprzężonych z metalami ciężkimi wykazują minimalne nakładanie się widma, które waha się od 0 do 4%, przy czym większość udziałów wynosi poniżej 1%. Ze względu na ten niski przesłuch między kanałami, generalnie nie ma potrzeby przekształcania danych za pomocą macierzy kompensacji przed analizą2. Należy jednak zachować ostrożność podczas projektowania eksperymentalnego panelu przeciwciał w celu zapewnienia, że przeciwciało z epitopem o wysokiej liczebności nie jest przypisywane do kanału masowego, który przekazuje sygnał do kanału przypisanego do przeciwciała o niskiej liczebności, ponieważ może to spowodować sztucznie zawyżoną populację w kanale odbierającym wkład sygnału.
Dokładne przygotowanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej zależy w dużym stopniu od rodzaju pobieranych próbek i testowanej hipotezy eksperymentalnej. Podajemy przykłady dwóch protokołów pobierania różnych typów komórek (ludzkie embrionalne komórki macierzyste) i komórek pierwotnych (izolat komórek nabłonkowych guza piersi myszy). Rozpoczynając badanie cytometrii masowej, zaleca się najpierw przeprowadzenie małego eksperymentu pilotażowego, aby upewnić się, że wszystkie protokoły i przeciwciała, które mają być zastosowane, działają dobrze w rękach badacza. Jest to szczególnie istotne, gdy mają być stosowane niestandardowe przeciwciała sprzężone, ponieważ reakcja częściowej redukcji podczas koniugacji przeciwciał może zakłócić powinowactwo przeciwciał; Dlatego każde niestandardowe przeciwciało musi zostać zweryfikowane empirycznie, aby zapewnić dokładność danych. Inne rozważania obejmują określenie, czy przeciwciała powierzchniowe komórki, które mają być użyte w teście, rozpoznają swoje epitopy po utrwaleniu, czy też należy je zastosować do żywych komórek. Pewne utrwalenie może uniemożliwić prawidłowe barwienie przeciwciałami na powierzchni komórki, jak wiadomo, że występuje w przypadku barwienia peptydowo-MHC3,4. W przypadku niektórych przeciwciał może być konieczne barwienie przeciwciał na powierzchni komórek na żywych komórkach, ale wyklucza to możliwość kodowania kreskowego przed znakowaniem przeciwciał, ponieważ większość metod kodowania kreskowego jest wykonywana po utrwaleniu5, chociaż kod kreskowy oparty na przeciwciałach6,7 jest wyjątkiem.
Przy określaniu liczby komórek do przygotowania, ważne jest, aby wiedzieć, że tylko część komórek załadowanych na maszynę zostanie wykryta i wygeneruje dane. Strata ta wynika przede wszystkim z nieefektywności, gdy nebulizator rozpyla próbkę na palniku. Dokładna strata procentowa zależy od konfiguracji maszyny do cytometrii masowej i typu komórki, ale może wynosić od 50 do 85% i powinna być brana pod uwagę podczas projektowania eksperymentu. Protokół ten został zoptymalizowany dla 2x106 komórek na próbkę, ale może być dostosowany do przetwarzania mniejszych lub większych rozmiarów próbek. Protokół ten może być stosowany z minimalnymi modyfikacjami dla wielkości próbek od 1 x 106 do 4 x 106, jednak bardzo ważne jest, aby wielkość próby była spójna w eksperymencie. Zmiany w liczbie komórek mogą wpływać na intensywność barwienia kodami kreskowymi i przeciwciałami i powinny być mniej więcej spójne we wszystkich próbkach, aby można je było bezpośrednio porównać.
Niektóre procedury, takie jak znakowanie martwych komórek i etykietowanie DNA, powinny być przeprowadzane w zdecydowanej większości, jeśli nie we wszystkich eksperymentalnych projektach. Znakowanie martwych komórek w eksperymentach analizujących tylko markery powierzchniowe można osiągnąć przy użyciu Rh103, ale Rh103 należy unikać w eksperymentach, w których wymagana jest przepuszczalność, ponieważ powoduje to utratę barwienia. W przypadku eksperymentów obejmujących przepuszczalność zaleca się stosowanie cisplatyny8 i, jeśli to możliwe, przeciwciała rozpoznającego rozszczepiony PARP lub rozszczepioną kaspazę w celu wykrycia apoptozy i martwych komórek.
Kody kreskowe próbek mogą zmniejszyć zużycie przeciwciał, skrócić czas pobierania i wyeliminować zmienność między próbkami9. Proces kodowania kreskowego polega na zastosowaniu unikalnego kodu specyficznego dla próbki do wszystkich komórek, który służy do przypisania każdej komórki do próbki pochodzenia. Po zakodowaniu kreskowym próbki można połączyć przed barwieniem przeciwciałami, co zapewnia jednakowe barwienie wszystkich próbek. Aby zminimalizować błąd eksperymentalny, rozsądnie jest oznaczyć kreską i połączyć wszystkie próbki, które mają być bezpośrednio ze sobą porównane. Obecnie istnieje kilka metod oznaczania próbek do kodów kreskowych do analizy cytometrii masowej5,6,7, z których dwie są przedstawione tutaj (patrz poniżej).
Dzięki obecnie dostępnym odczynnikom możliwe jest ilościowe określenie obfitości 38 celów przeciwciał, identyfikacja komórek w fazie S10, rozróżnienie żywych i martwych komórek8 i zmierzenie komórkowego poziomu niedotlenienia11 w multipleksowanym eksperymencie z wieloma próbkami. Ta zdolność do zbierania danych o pojedynczych komórkach o wysokich parametrach dla dużych populacji komórek umożliwia lepsze profilowanie wysoce heterogenicznych populacji komórek i już przyniosła szereg nowatorskich spostrzeżeń biologicznych12,13,14,15,16. Przekształcenie uzyskanych w ten sposób złożonych danych w możliwe do zinterpretowania informacje wymagało użycia algorytmów obliczeniowych, w tym Spanning Tree Progression of Density Normalized Events (SPADE)17 i viSNE18.
Ten artykuł przedstawia przystępny przegląd tego, jak zaprojektować i przeprowadzić eksperyment z cytometrią masową oraz wprowadza podstawową analizę danych cytometrii masowej.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Ciepło w temperaturze pokojowej przed użyciem</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Ciepło w 37&nbsp; &deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Ciepły w 37&nbsp; &deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Hyklon</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Identyfikator komórki Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Dostarczony w 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>podany pod adresem 1&nbsp; Identyfikator komórki mM</td></tr><tr><td>Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>podany pod adresem 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Rozpuszczalny do 25&nbsp; mg / ml w</td></tr><tr><td>zestawie kodów kreskowych DMSO Cell-ID 20-plex Pd</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-jodo-2'-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Rozpuszczalny w 74&nbsp; mg/ml w 0,2&nbsp; N NaOH</td></tr><tr><td>Środek pośredniczący Rhod 103</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Schłodzić w temperaturze -20&nbsp; &deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL probówki okrągłodenne</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &#956; m rurki z nasadką filtracyjną</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ czteroelementowe koraliki kalibracyjne</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza Typ I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Cytometria masowa wykorzystuje przeciwciała sprzężone z etykietami metali ciężkich, podejście, które znacznie zwiększyło liczbę parametrów i możliwości głębokiej analizy znacznie ponad to, co jest możliwe przy użyciu konwencjonalnej cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji. Podobnie jak w przypadku każdej nowej technologii, istnieją krytyczne kroki, które pomagają zapewnić niezawodne generowanie danych wysokiej jakości. Przedstawiono tutaj zoptymalizowany protokół, który obejmuje wiele technik przetwarzania próbek komórek do analizy cytometrii masowej. Opisane tutaj metody pomogą użytkownikowi uniknąć typowych pułapek i osiągnąć spójne wyniki poprzez zminimalizowanie zmienności, która może prowadzić do niedokładnych danych. Aby uzyskać informacje na temat projektu eksperymentu, omówiono uzasadnienie opcjonalnych lub alternatywnych kroków w protokole oraz ich skuteczność w odkrywaniu nowych odkryć w biologii badanego systemu. Na koniec przedstawiono reprezentatywne dane w celu zilustrowania oczekiwanych wyników przedstawionych tutaj technik.

Przedstawiony tutaj protokół można szeroko zastosować do wielu rodzajów hodowli komórkowych i próbek komórek pierwotnych przy wprowadzeniu jedynie niewielkich modyfikacji. W zależności od wymagań eksperymentu może on być wykonywany w sposób modułowy, gdy niektóre elementy, takie jak kodowanie kreskowe (barcoding) lub barwienie powierzchni komórek, nie są konieczne. Zastosowany w całości protokół ten umożliwia przygotowanie multipleksowych próbek do cytometrii masowej, znakowanych w celu w...

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Ogólnym celem tego procesu przygotowania próbki jest uzyskanie solidnego i spójnego barwienia przeciwciałami różnych próbek, aby umożliwić badanie heterogenicznych populacji komórek. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące tożsamości komórki, sygnalizacji komórkowej i odpowiedzi komórki w złożonej heterogenicznej populacji komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pomiar wysokiego poziomu białka o wysokich parametrach na poziomie pojedynczej komórki.Procedurę tę zademonstruje Aundrietta Duncan, doktorantka z naszego laboratorium. Dla każdej próbki zawiesiny pojedynczej komórki zawiesić ją ponownie w ilości czterech razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w pożywce wolnej od surowicy, dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej 50 cisplatyny mikromolowej na 2/10 do sześciu komórek i inkubować próbki na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Po jednej minucie schłodzić cisplatynę równą objętością buforu do przemywania i odwirować komórki.Odrzucić supernatant i przemyć próbki jeszcze dwa razy, dodając 500 mikrolitrów buforu do przemywania wodą, odwirowując komórki i wylewając bufor do przemywania wodą. Następnie należy dwukrotnie przepłukać 500 mikrolitrów PBS, podobnie odwirowując próbki i odrzucając supernatant. Po drugim praniu PBS ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach świeżego PBS i utrwalić komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% PFA.Odpipetuj komórki do wymieszania. Następnie umieścić próbki na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji komórki osadzić przez odwirowanie, odlać supernatant, a następnie przepłukać świeży PBS.Aby przepuszczalność komórek, ponownie odwiruj komórki i wyrzuć supernatanty. Ponownie zawiesić próbki w pozostałym PBS przez delikatne wirowanie i natychmiast dodać jeden mililitr 100% metanolu na 2/10 10 do szóstych komórek za pomocą delikatnego pipetowania. Próbki inkubować w temperaturze czterech stopni przez co najmniej godzinę, a pod koniec inkubacji odwirować komórki.Następnie odlej metanol. Następnie umyj granulki w jednym mililitrze buforu do płukania na każdy mililitr metanolu, a następnie dwa kolejne przepłucz w 500 mikrolitrach świeżego buforu do mycia. Używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów ustawionej na 50 mikrolitrów, przenieś pozostały bufor do płukania z każdej granulki do probówki z odpowiednim koktajlem przeciwciał.Odpipetować ponownie połączony roztwór bez zasysania powietrza do końcówki, przytrzymując częściowo wciśnięty tłok. Następnie przenieść końcówkę pipety do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów buforu do płukania bez zwalniania tłoka. Zwolnić tłok, pobierając bufor do przemywania dla całkowitej objętości koktajlu przeciwciał wynoszącej 50 mikrolitrów i oznaczyć odpowiednią odpowiednią próbkę zasysanym koktajlem przeciwciał przez delikatne pipetowanie.Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu przemyć próbki cztery razy, za każdym razem wylewając bufor do mycia. Aby oznaczyć komórki irydem, ponownie zawiesić końcowe granulki w 500 mikrolitrach PBS, a następnie dodać 500 mikrolitrów czteroprocentowego PFA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego 62,5 nanomolowego irydu i PFA do próbek na kolejne 15 minut wstrząsania w temperaturze pokojowej.Następnie odwirować komórki, odlać supernatant, a następnie dwukrotnie przepłukać 500 mikrolitrami 0,1 procent BSA i przefiltrowaną wodą dejonizowaną. Analizuj próbki, dodając kulki normalizacyjne do dołków płytek z próbkami, pipetując komórki do tych studzienek, a następnie wykonując cytometrię masową w ciągu 24 godzin. Po normalizacji intensywności sygnału, koraliki kalibracyjne można usunąć z danych poprzez bramkowanie na populacji ujemnej perełków irydu 191.Zdarzenia pojedynczej komórki można następnie bramkować w celu usunięcia szczątków i multipletów komórkowych za pomocą dwuosiowego wykresu ujemnej ekspresji irydu 193 w funkcji długości zdarzenia. Znakowanie cisplatyną można wykorzystać do pomiaru głębokości komórek. Na przykład tutaj pokazane są próbki z małą i większą ilością martwych komórek.Martwe komórki można usunąć poprzez bramkowanie populacji platyny 198-dodatniej, kodowanie kreskowe powoduje wyraźną separację próbek w ramach parametrów kodowania kreskowego, co pozwala na przypisanie komórkom ich oryginalnej tożsamości próbki. Oznakowanie IDU może być wykorzystane do wykrycia zaobserwowanych tutaj komórek twarzy w USA. Po wstępnej normalizacji, dekodowaniu kreskowym i bramkowaniu, dane wysokowymiarowe mogą być analizowane przy użyciu algorytmu SPADE w celu wygenerowania niskowymiarowej reprezentacji danych, która jest bardziej podatna na interpretację wizualną.Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu czterech do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu strat próbki podczas wykonywania etapu mycia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki do analizy cytometrii masowej.Nie zapominaj, że praca z azydkiem sodu może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano kroki niezbędne do codziennego strojenia i optymalizacji wydajności cytometru masowego CyTOF. Omówiono uwagi dotyczące optymalnego przygotowania próbek oraz szybkości...

Cytometria masowa: Protokół codziennego strojenia i analizy próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

Ten film przedstawia metodę proteomiczną pojedynczej komórki, która wykorzystuje przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi do odrębnego kodowania kreskowego komórek. Następnie stosuje się barwienie immunologiczne i cytometrię masową w celu oceny zmian immunologicznych fenotypowych i funkcjonalnych w ludzkich komórkach odpornościowych pochodzących z krwi pełnej.

Test kodów kreskowych do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej komórek odpornościowych

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Protokół ten przedstawia szczegółową metodę izolowania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek zarówno ze zdrowej, jak i z guzowymi tkankami płuc myszy. Protokół ten może być stosowany w scRNA-seq, analizie cytometrii przepływowej oraz izolacji komórek pierwotnych.

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego

Naucz się przygotowywać próbki do analizy cytometrii masowej z wykorzystaniem Cisplatyny i barwienia przeciwciałami. Ta metoda umożliwia badanie heterogenicznych populacji komórkowych na poziomie pojedynczych komórek.

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Przeglądaj więcej filmów