Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej
29 kwietnia 2017
Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.
Ogólnym celem tego procesu przygotowania próbki jest uzyskanie solidnego i spójnego barwienia przeciwciałami różnych próbek, aby umożliwić badanie heterogenicznych populacji komórek. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące tożsamości komórki, sygnalizacji komórkowej i odpowiedzi komórki w złożonej heterogenicznej populacji komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pomiar wysokiego poziomu białka o wysokich parametrach na poziomie pojedynczej komórki.
Procedurę tę zademonstruje Aundrietta Duncan, doktorantka z naszego laboratorium. Dla każdej próbki zawiesiny pojedynczej komórki zawiesić ją ponownie w ilości czterech razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w pożywce wolnej od surowicy, dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej 50 cisplatyny mikromolowej na 2/10 do sześciu komórek i inkubować próbki na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Po jednej minucie schłodzić cisplatynę równą objętością buforu do przemywania i odwirować komórki.
Odrzucić supernatant i przemyć próbki jeszcze dwa razy, dodając 500 mikrolitrów buforu do przemywania wodą, odwirowując komórki i wylewając bufor do przemywania wodą. Następnie należy dwukrotnie przepłukać 500 mikrolitrów PBS, podobnie odwirowując próbki i odrzucając supernatant. Po drugim praniu PBS ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach świeżego PBS i utrwalić komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% PFA.
Odpipetuj komórki do wymieszania. Następnie umieścić próbki na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji komórki osadzić przez odwirowanie, odlać supernatant, a następnie przepłukać świeży PBS.
Aby przepuszczalność komórek, ponownie odwiruj komórki i wyrzuć supernatanty. Ponownie zawiesić próbki w pozostałym PBS przez delikatne wirowanie i natychmiast dodać jeden mililitr 100% metanolu na 2/10 10 do szóstych komórek za pomocą delikatnego pipetowania. Próbki inkubować w temperaturze czterech stopni przez co najmniej godzinę, a pod koniec inkubacji odwirować komórki.
Następnie odlej metanol. Następnie umyj granulki w jednym mililitrze buforu do płukania na każdy mililitr metanolu, a następnie dwa kolejne przepłucz w 500 mikrolitrach świeżego buforu do mycia. Używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów ustawionej na 50 mikrolitrów, przenieś pozostały bufor do płukania z każdej granulki do probówki z odpowiednim koktajlem przeciwciał.
Odpipetować ponownie połączony roztwór bez zasysania powietrza do końcówki, przytrzymując częściowo wciśnięty tłok. Następnie przenieść końcówkę pipety do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów buforu do płukania bez zwalniania tłoka. Zwolnić tłok, pobierając bufor do przemywania dla całkowitej objętości koktajlu przeciwciał wynoszącej 50 mikrolitrów i oznaczyć odpowiednią odpowiednią próbkę zasysanym koktajlem przeciwciał przez delikatne pipetowanie.
Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu przemyć próbki cztery razy, za każdym razem wylewając bufor do mycia. Aby oznaczyć komórki irydem, ponownie zawiesić końcowe granulki w 500 mikrolitrach PBS, a następnie dodać 500 mikrolitrów czteroprocentowego PFA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego 62,5 nanomolowego irydu i PFA do próbek na kolejne 15 minut wstrząsania w temperaturze pokojowej.
Następnie odwirować komórki, odlać supernatant, a następnie dwukrotnie przepłukać 500 mikrolitrami 0,1 procent BSA i przefiltrowaną wodą dejonizowaną. Analizuj próbki, dodając kulki normalizacyjne do dołków płytek z próbkami, pipetując komórki do tych studzienek, a następnie wykonując cytometrię masową w ciągu 24 godzin. Po normalizacji intensywności sygnału, koraliki kalibracyjne można usunąć z danych poprzez bramkowanie na populacji ujemnej perełków irydu 191.
Zdarzenia pojedynczej komórki można następnie bramkować w celu usunięcia szczątków i multipletów komórkowych za pomocą dwuosiowego wykresu ujemnej ekspresji irydu 193 w funkcji długości zdarzenia. Znakowanie cisplatyną można wykorzystać do pomiaru głębokości komórek. Na przykład tutaj pokazane są próbki z małą i większą ilością martwych komórek.
Martwe komórki można usunąć poprzez bramkowanie populacji platyny 198-dodatniej, kodowanie kreskowe powoduje wyraźną separację próbek w ramach parametrów kodowania kreskowego, co pozwala na przypisanie komórkom ich oryginalnej tożsamości próbki. Oznakowanie IDU może być wykorzystane do wykrycia zaobserwowanych tutaj komórek twarzy w USA. Po wstępnej normalizacji, dekodowaniu kreskowym i bramkowaniu, dane wysokowymiarowe mogą być analizowane przy użyciu algorytmu SPADE w celu wygenerowania niskowymiarowej reprezentacji danych, która jest bardziej podatna na interpretację wizualną.
Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu czterech do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu strat próbki podczas wykonywania etapu mycia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki do analizy cytometrii masowej.
Nie zapominaj, że praca z azydkiem sodu może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metody pobierania i przetwarzania próbek do analizy cytometrii masowej. Metoda ma na celu uzyskanie spójnego barwienia przeciwciała w celu badania heterogenicznych populacji komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Cytometria masowa
Tło
- Cytometria masowa pozwala na pomiar wysokiego poziomu białek parametrów na poziomie pojedynczej komórki.
- Jest przydatna do zrozumienia tożsamości komórek i sygnalizacji.
- Technika jest stosowana do złożonych heterogenicznych populacji komórek.
- Przygotowanie próbki jest kluczowe dla uzyskania solidnych wyników.
Cel badania
- Aby pokazać proces przygotowania próbki do cytometrii masowej.
- Aby umożliwić badanie różnorodnych populacji komórek.
- Aby zapewnić wgląd w reakcje i interakcje komórek.
Stosowane metody
- Resuspendowanie próbek zawiesiny pojedynczych komórek w środowisku bez surowicy.
- Użycie świeżo przygotowanego Cysplatyny do leczenia komórek.
- Inkubacja na orbitalnym szejkerym dla spójnego mieszania.
- Centryfugacja i płukanie komórek po leczeniu.
Główne wyniki
- Demonstracja skutecznej techniki przygotowania próbki.
- Spójne barwienie przeciwciała osiągnięte na próbkach.
- Wysokiej jakości analiza parametrów na poziomie pojedynczej komórki.
- Wgląd w heterogeniczne populacje komórek uzyskany.
Wnioski
- Metoda zwiększa zdolność analizy złożonych populacji komórek.
- Solidne przygotowanie próbki jest kluczowe dla dokładnych wyników cytometrii masowej.
- Ta technika może poszerzyć badania w dziedzinie biologii komórki i neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
