Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Ogólnym celem tego procesu przygotowania próbki jest uzyskanie solidnego i spójnego barwienia przeciwciałami różnych próbek, aby umożliwić badanie heterogenicznych populacji komórek. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące tożsamości komórki, sygnalizacji komórkowej i odpowiedzi komórki w złożonej heterogenicznej populacji komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pomiar wysokiego poziomu białka o wysokich parametrach na poziomie pojedynczej komórki.

Procedurę tę zademonstruje Aundrietta Duncan, doktorantka z naszego laboratorium. Dla każdej próbki zawiesiny pojedynczej komórki zawiesić ją ponownie w ilości czterech razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w pożywce wolnej od surowicy, dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej 50 cisplatyny mikromolowej na 2/10 do sześciu komórek i inkubować próbki na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Po jednej minucie schłodzić cisplatynę równą objętością buforu do przemywania i odwirować komórki.

Odrzucić supernatant i przemyć próbki jeszcze dwa razy, dodając 500 mikrolitrów buforu do przemywania wodą, odwirowując komórki i wylewając bufor do przemywania wodą. Następnie należy dwukrotnie przepłukać 500 mikrolitrów PBS, podobnie odwirowując próbki i odrzucając supernatant. Po drugim praniu PBS ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach świeżego PBS i utrwalić komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% PFA.

Odpipetuj komórki do wymieszania. Następnie umieścić próbki na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji komórki osadzić przez odwirowanie, odlać supernatant, a następnie przepłukać świeży PBS.

Aby przepuszczalność komórek, ponownie odwiruj komórki i wyrzuć supernatanty. Ponownie zawiesić próbki w pozostałym PBS przez delikatne wirowanie i natychmiast dodać jeden mililitr 100% metanolu na 2/10 10 do szóstych komórek za pomocą delikatnego pipetowania. Próbki inkubować w temperaturze czterech stopni przez co najmniej godzinę, a pod koniec inkubacji odwirować komórki.

Następnie odlej metanol. Następnie umyj granulki w jednym mililitrze buforu do płukania na każdy mililitr metanolu, a następnie dwa kolejne przepłucz w 500 mikrolitrach świeżego buforu do mycia. Używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów ustawionej na 50 mikrolitrów, przenieś pozostały bufor do płukania z każdej granulki do probówki z odpowiednim koktajlem przeciwciał.

Odpipetować ponownie połączony roztwór bez zasysania powietrza do końcówki, przytrzymując częściowo wciśnięty tłok. Następnie przenieść końcówkę pipety do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów buforu do płukania bez zwalniania tłoka. Zwolnić tłok, pobierając bufor do przemywania dla całkowitej objętości koktajlu przeciwciał wynoszącej 50 mikrolitrów i oznaczyć odpowiednią odpowiednią próbkę zasysanym koktajlem przeciwciał przez delikatne pipetowanie.

Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu przemyć próbki cztery razy, za każdym razem wylewając bufor do mycia. Aby oznaczyć komórki irydem, ponownie zawiesić końcowe granulki w 500 mikrolitrach PBS, a następnie dodać 500 mikrolitrów czteroprocentowego PFA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego 62,5 nanomolowego irydu i PFA do próbek na kolejne 15 minut wstrząsania w temperaturze pokojowej.

Następnie odwirować komórki, odlać supernatant, a następnie dwukrotnie przepłukać 500 mikrolitrami 0,1 procent BSA i przefiltrowaną wodą dejonizowaną. Analizuj próbki, dodając kulki normalizacyjne do dołków płytek z próbkami, pipetując komórki do tych studzienek, a następnie wykonując cytometrię masową w ciągu 24 godzin. Po normalizacji intensywności sygnału, koraliki kalibracyjne można usunąć z danych poprzez bramkowanie na populacji ujemnej perełków irydu 191.

Zdarzenia pojedynczej komórki można następnie bramkować w celu usunięcia szczątków i multipletów komórkowych za pomocą dwuosiowego wykresu ujemnej ekspresji irydu 193 w funkcji długości zdarzenia. Znakowanie cisplatyną można wykorzystać do pomiaru głębokości komórek. Na przykład tutaj pokazane są próbki z małą i większą ilością martwych komórek.

Martwe komórki można usunąć poprzez bramkowanie populacji platyny 198-dodatniej, kodowanie kreskowe powoduje wyraźną separację próbek w ramach parametrów kodowania kreskowego, co pozwala na przypisanie komórkom ich oryginalnej tożsamości próbki. Oznakowanie IDU może być wykorzystane do wykrycia zaobserwowanych tutaj komórek twarzy w USA. Po wstępnej normalizacji, dekodowaniu kreskowym i bramkowaniu, dane wysokowymiarowe mogą być analizowane przy użyciu algorytmu SPADE w celu wygenerowania niskowymiarowej reprezentacji danych, która jest bardziej podatna na interpretację wizualną.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu czterech do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu strat próbki podczas wykonywania etapu mycia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki do analizy cytometrii masowej.

Nie zapominaj, że praca z azydkiem sodu może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy stosować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.