Charakterystyka przeciwdrobnoustrojowa zaawansowanych materiałów do zastosowań bioinżynieryjnych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii materiałowej, takie jak właściwości przeciwdrobnoustrojowe, które są bardzo pożądane w wielu zastosowaniach bioinżynieryjnych. Technika ta może być wykorzystana jako spójny protokół we wszystkich laboratoriach, aby pomóc mniej doświadczonym badaczom, którzy wymagają dogłębnych procedur krok po kroku, aby uzyskać dokładne wyniki. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy szukać protokołów przeciwdrobnoustrojowych i zdaliśmy sobie sprawę, że w literaturze nie ma szczegółowych protokołów na ten temat.

W tym badaniu cztery zaawansowane materiały o różnym nakładzie chemicznym i materiał kontrolny zostaną przetestowane pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Przygotuj każdy materiał, tnąc go na krążki o średnicy 10 mm. Następnie wysterylizuj każdą próbkę przez zanurzenie w 70% etanolu na 10 minut, a następnie promieniowanie ultrafioletowe przez godzinę z każdej strony.

Trzy różne mikroorganizmy zostaną wykorzystane do przetestowania aktywności przeciwdrobnoustrojowej zaawansowanych materiałów. Bakterie Gram-dodatnie, Staphylococcus aureus, bakterie Gram-ujemne, Escherichia coli i drożdże, Candida albicans. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika ponownie zawieś kilka kolonii każdego mikroorganizmu w 25 ml tryptycznego bulionu sojowego lub TSB, zawartego w sterylnej probówce wirówkowej.

Wiruj przez minutę, aby uzyskać równomierne mieszanie. Zmierzyć chłonność przy długości fali 540 nm dla każdej kultury mikroorganizmów za pomocą spektrofotometru. Dostosuj stężenie każdego mikroorganizmu do odpowiedniej liczby jednostek tworzących kolonię lub CFU na mililitr.

Wiruj zawiesinę mikrobiologiczną przez pięć sekund, aby poprawić dyspersję mikroorganizmów, i na krótko zanurz sterylny bawełniany wacik w tej zawiesinie mikrobiologicznej. Usuń nadmiar płynu z wacika, dociskając wacik do ścianki probówki zawierającej hodowlę. Równomiernie rozprowadź każdą zawiesinę bulionu mikrobiologicznego sterylnym wacikiem na powierzchni tryptycznego agatora sojowego lub płytki TSA w trzech płaszczyznach, aby pokryć całą powierzchnię mikroorganizmem.

Pozostaw płytki do wyschnięcia na pięć minut po zaszczepieniu. Pozostaw zawiesiny bulionu mikrobiologicznego na blacie stołu do późniejszego wykorzystania w celu sprawdzenia stężenia i czystości zawiesiny mikrobiologicznej. Wysterylizuj pęsetę, zanurzając ją w zlewce z 96% etanolem, a następnie podpalając palnikiem alkoholowym.

Użyj sterylnej pęsety, aby umieścić krążki z próbkami, które mają być testowane, na środku płytek TSA. Inkubować płytki TSA w pozycji odwróconej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby przeanalizować wyniki testu dyfuzji, należy zmierzyć średnicę strefy inhibicji i średnicę krążka próbki za pomocą suwmiarki cyfrowej lub wykonując zdjęcie i używając odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Procedura ta jest niezbędna do sprawdzenia, czy oznaczone wcześniej stężenia mikrobiologiczne są prawidłowe i zapewnienia braku zanieczyszczenia mikrobiologicznego środowiska. Za pomocą mikropipety z odpowiednimi autoklawowanymi końcówkami i w warunkach aseptycznych, dozować sterylne TSB do sterylnych probówek do mikrowirówek. Należy dołączyć próbkę, która zostanie wykorzystana jako kontrola ujemna.

Wykonaj sześć dziesiętnych seryjnych rozcieńczeń za pomocą mikrobiologicznych zawiesin bulionowych używanych wcześniej do smugowania płytek TSA. Za pomocą wstępnie wysterylizowanej szpatułki Drigalskiego rozprowadź 100 l każdego wybranego rozcieńczenia na płytce TSA. Rozprowadzić 100 l pożywki TSB bez mikroorganizmów na płytce TSA jako kontrolę ujemną.

Inkubować płytki TSA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia policz liczbę kolonii, aby sprawdzić, czy CFU na mililitr jest podobny do określonego wcześniej. Sprawdź płytkę kontroli ujemnej, aby upewnić się, że nie ma mikrobiologicznego zanieczyszczenia środowiska.

Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania różnych mikroorganizmów, które mają być testowane w TSB, w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zmierz OD540 w każdej nocnej hodowli, a następnie rozcieńcz każdą kulturę w 20 ml TSB w 50 ml wstępnie wysterylizowanej probówce wirówkowej do stężenia około dziesięciu do szóstej CFU na mililitr. Umieścić cztery krążki z każdym rodzajem materiału i cztery dyski kontrolne w oddzielnych dołkach sterylnej płytki 48-dołkowej.

Odpipetować 150 l zawiesiny mikrobiologicznej na każdą powierzchnię dysku. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji 48-dołkowej płytki przez 24 godziny, należy odpipetować 850 l sterylnego PBS na powierzchnię każdego z czterech krążków z próbką i czterech krążków kontrolnych i wymieszać je z zawiesiną mikrobiologiczną.

Zebrać każdą mieszaninę zawiesiny mikrobiologicznej PBS i każdy krążek z płytki 48-dołkowej i przenieść do wstępnie wysterylizowanej probówki o pojemności 15 ml. Mieszać mieszaniny i krążki zawiesiny mikrobiologicznej PBS przez jedną minutę. Wykonaj sonifikację przy 50 Hz przez pięć minut i ponownie wiruj przez jedną minutę, aby upewnić się, że żadne żywe mikroorganizmy nie przylegają do powierzchni materiału.

Wykonać dziesiętne seryjne rozcieńczenia kultur poddanych sonikacji i sterylnych probówek do mikrowirówek zawierających TSB. Rozprowadzić 100 l każdego rozcieńczenia na płytce TSA i inkubować płytki w tlenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po 24 godzinach policz liczbę kolonii i wyraź tę liczbę w jtk na mililitr.

Wyniki metody kontaktu są następnie analizowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wyniki testów dyfuzji krążka agaru wykazują aktywność nieprzeciwdrobnoustrojową dla pierwszego materiału i zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną wobec S.aureus i E. coli dla pozostałych trzech materiałów. Ten wykres pokazuje znormalizowane halo dla każdego dysku materialnego przeciwko S.aureus i E.coli po 24 godzinach inkubacji.

Wyniki metody kontaktowej wskazują również na aktywność nieprzeciwdrobnoustrojową w przypadku pierwszego materiału oraz zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w przypadku pozostałych trzech materiałów. C to żywe bakterie odzyskane z dysku kontrolnego po 24 godzinach inkubacji. Ten wykres pokazuje procentową utratę żywotności czterech materiałów w stosunku do S.aureus i E.coli na powierzchniach materiałów.

Próbka M1 nie wykazywała aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Chociaż nie pokazano tutaj, żaden z czterech materiałów nie jest w stanie zahamować wzrostu drożdży, Candida albicans, inną metodą. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić aktywność przeciwdrobnoustrojową za pomocą tych dwóch uzupełniających się metod.