Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie materiałów biomimetycznych składających się z czystych rekombinowanych adhezji, sprzężonych z kulkami polistyrenu, które można następnie wykorzystać do analizy biochemicznych i funkcjonalnych interakcji między poszczególnymi adhezjami bakteryjnymi a receptorami komórek gospodarza. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji patogenów gospodarza, takie jak pomiar wpływu na sygnalizację komórkową gospodarza i hamowanie cytotoksyczności za pośrednictwem patogenu. Główną zaletą tej techniki jest to, że oczyszczone adhezje, AEA, są kierunkowo i kowalencyjnie sprzężone z cząstkami polimeru, które są podobne pod względem wielkości do bakterii, a tym samym naśladują powierzchnię bakterii.

Procedurę zademonstruje ze mną doktorantka TU A-C-E-D-A z naszego laboratorium. Zostanie tutaj zademonstrowane kierunkowe sprzężenie tal-aminy. Protokół ten jest odpowiedni do sprzęgania białek zawierających cystynę z funkcjonalizowanymi aminami kulkami polimerowymi przy użyciu sukcynylu SUL dla maślanu p fenylu lub SMPB Jako środek sieciujący, przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki tuż przed użyciem, jak opisano w tekście protokołu, aby rozpocząć procedurę aktywacji kulek.

Wymieszaj zawiesinę perełek, delikatnie odwracając, a następnie przenieś wymaganą ilość zawiesiny kulek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Zawiera jeden mililitr sterylnego PBS pH 7,0, delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby umyć kulki i granulki przez odwirowanie w mikrowirówce. Ogromny, ostrożnie usuń naciupę za pomocą pipety i blizny.

Reese zawiesił granulkę kulek w jednym mililitrze świeżego sterylnego PBS i powtórzył etap prania. Ponownie zawieś granulkę koralików. W 0,8 mililitra PBS dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 10-milimolowego SFO SMPB.

Aby uzyskać końcowe stężenie dwóch milimolów, inkubuj zawiesinę kulek przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na obracającym się kole, podczas gdy kulki są w inkubacji. Przygotuj białko do następnego etapu sprzęgania, aby można je było natychmiast dodać do aktywowanych kulek. Sprawdź stężenie białka i dostosuj je do końcowego stężenia wymaganego w reakcji sprzęgania. Sześć.

Mikromolowe białko i PBS oraz objętość jednego mililitra są zwykle używane do redukcji białka. Dodać roztwór podstawowy TEP, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu milimolowców. Inkubować roztwór przez 30 minut W temperaturze pokojowej zachować kilka mikrolitrów roztworu białka w celu określenia początkowego stężenia białka i obliczenia wydajności sprzężenia.

Rozpocznij procedurę sprzęgania białek od granulowania aktywowanych kulek i umycia osadu. Raz na jeden mililitr świeżego, sterylnego PBS, ponownie zawiesić osad w przygotowanym roztworze białkowym, aby uzyskać pożądane stężenie białka. Inkubować zawiesinę kulek białkowych przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza na obracającym się kole Po dwóch godzinach dezaktywować pozostałe aktywowane grupy na kulkach, dodając roztwór podstawowy Sykstyny do końcowego stężenia 50 milimolów i inkubując do zawiesiny przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza na obracającym się kole.

Trzymał koraliki przez odwirowanie. Zachowaj snat do oznaczania stężenia białka i obliczania wydajności sprzęgania. Umyj granulkę kulki dwukrotnie jednym mililitrem PBS i zgięcia Resus oraz jednym mililitrem świeżego PBS, aby uzyskać produkt końcowy na dzień przed testem konkursowym, wysiewaj nasiona każdej studzienki z 24-dołkowej płytki z jednym mililitrem komórek hela o stężeniu 150 000 komórek na mililitr.

Pozwoli to komórkom osiągnąć około 80% płynności CO przed rozpoczęciem eksperymentu. Zaszczep pięciomililitrową morską kulturę LB świeżą kolonią V para hemolitycznego i hoduj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Przygotuj wystarczającą ilość wielowartościowej cząsteczki adhezyjnej sprzężonej z koralikami, jak pokazano wcześniej.

Pozostawić 100 mikrolitrów 10 x bulion kulek na studzienkę lub końcowe stężenie 500 nanomolowych białek w dniu testu konkursowego. Zmierz OD 600 w kulturze bakteryjnej. Przygotuj pożywkę infekcyjną, rozcieńczając kultury bakteryjne do bezbarwnego DMM bez dodatków.

Rozgrzej do 37 stopni Celsjusza zawierający 10% objętości do objętości pokonaj zawiesinę. Aby uzyskać MOI równy 10, przygotuj jeden mililitr na studzienkę i 10 do 20% nadwyżki objętości na próbkę. Usuń stare podłoże ze studzienek i umyj kulturę.

Ulecz komórki, dodając do każdej studzienki jeden mililitr sterylnego PBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Usuń PBS i dodaj jeden mililitr pożywki infekcyjnej na studzienkę. Dodaj roztwory zawierające kulki kontrolne i bakterie jako kontrole pozytywne i kulki adhezyjne oraz brak bakterii jako ujemne. Formantów.

Dodaj DMM zawierający 0,1% TRITTON X 100 jako kontrole lizy. Skonfiguruj każdy warunek eksperymentalny, w tym trzy kontrole. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez żądany czas.

Ocenia się cytotoksyczność. Cztery godziny po zakażeniu. Usunąć 200 mikrolitrów z każdej studzienki użytej w płytce 24-dołkowej i przenieść do nowej płytki 96-dołkowej.

Wirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 1 500 G przez pięć minut i przenieść 100 mikrolitrów z każdej studzienki do świeżej płytki 96-dołkowej. Dodać 100 mikrolitrów pożywki użytej podczas eksperymentów z infekcją do trzech świeżych dołków z 96-dołkową płytką, które mają być użyte jako ślepe próby. Przeprowadzić test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej przy użyciu zestawu do wykrywania cytotoksyczności LDH i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Najpierw oblicz ilość potrzebnego odczynnika w przyrostach co 25. Na przykład dla 100 próbek. Wymieszaj 11,25 mililitra odczynnika A z 250 mikrolitrami odczynnika B odwróć, aby uniknąć pienienia, nie wirować.

Następnie umieść mieszaninę w zbiorniku. Następnie dodać 100 mikrolitrów mieszaniny odczynników do każdej próbki i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10, 20 i 30 minut. Odczytaj absorbancję przy 490 nanometrach na czytniku płytkowym.

Następnie należy obliczyć procentową cytotoksyczność, jak opisano w manuskrypcie, pomiary adhezji bakteryjnej wykonuje się godzinę po zakażeniu. Usuń pożywkę z warstwy komórek i dokładnie umyj warstwę komórek sterylnym, wstępnie podgrzanym PBS, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone komórki. Przemyć co najmniej trzy do czterech razy jednym mililitrem PBS za każdym razem, gdy lyce do komórek gospodarza, dodając do każdej studzienki jeden mililitr sterylnego roztworu Triton X 100 objętości do objętości w PBS, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Odpipetować każdą próbkę w górę i w dół kilka razy przed przeniesieniem zawartości każdej studzienki do oddzielenia. Probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia próbek na sterylnej płytce PBS, 100 mikrolitrów każdej próbki na morskim agarze LB i rozprowadzić za pomocą rozsiewacza komórek, zoptymalizować rozcieńczenie na płytce w zależności od szczepów bakteryjnych i punktu czasowego dla tej konfiguracji eksperymentalnej.

Rozcieńczenie od 10 do 5 lub od 10 do 6 razy da odpowiednią liczbę CFU. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc następnego dnia, policz bakterie przez liczenie kolonii. W testach konkurencji komórki heela zostały zakażone szczepem hemolitycznym V para.

Słaby, oznaczony pozytywnym lub pozostawiony bez zakażenia w obecności różnych konkurujących ze sobą podmiotów. Zakażenie in vitro słabym powodowało bardzo wysoki poziom lizy komórek, który był hamowany przez siedem sprzężonych kulek MAM, ale nie przez jeden sprzężony MAM lub GST. Wyliczenie v paralityka przyczepionego do nieleczonych komórek HELOC lub komórek inkubowanych z MAM.

Siedem koralików kontrolnych MAM one lub GST ujawniło, że MAM. Siedem koralików, ale nie jeden MAM ani koraliki GST Control. Rywalizuj z parą hemolityczną o przyłączenie do receptorów powierzchniowych komórek gospodarza.

Zrosty sprzężone z fluorem. Cztery znakowane koraliki mogą naśladować adhezję bakterii do komórek gospodarza i są potężnymi narzędziami do obrazowania komórkowego. Rurka po prawej stronie zawiera zawiesinę fluorescencyjnych niebieskich kulek biomimetycznych. MAM.

Siedem sprzężonych fluorescencyjnych niebieskich kulek użyto do scharakteryzowania procesu przyczepiania się do komórek nabłonkowych za pośrednictwem MAM seven. Przyłączenie MAM seven do komórek gospodarza spowodowało rearanżację aktyny i powstanie włókien stresowych, które były współwizualizowane za pomocą Rumine Phin do barwienia f aktyny. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak oczyszczanie powinowactwa w połączeniu z proteomiką lub western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które czynniki komórkowe gospodarza są zaangażowane w procesy sygnalizacyjne po przyczepieniu się bakterii.