Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej
August 25th, 2018
Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.
Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie nowej, prostej metody izolowania i hodowli pierwotnych ludzkich komórek naskórka z dorosłej tkanki skórnej. Ta zaawansowana metoda jest bardziej odpowiednia do wytwarzania dużej liczby komórek naskórka o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych. Umyj chusteczkę PBS przed ważeniem.
Zważ tkankę skórną za pomocą wagi elektronicznej. Płucz tkankę skóry 70% etanolem przez 30 sekund. Inkubować tkankę w PBS z antybiotykami dwa razy przez pięć minut za każdym razem.
Przenieś tkankę do innego sterylnego naczynia i dokładnie homogenizuj za pomocą ostrzy skalpela. Dodawaj 200 mikrolitrów PBS co pięć minut, aby tkanka była mokra. Przenieś homogenizowaną tkankę do 50-mililitrowej probówki.
Dodaj 10 mililitrów mieszaniny enzymów na każdy gram tkanki skórnej. Enzymy dokładnie wymieszać z homogenizowanymi tkankami. Inkubować mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając.
Następnie dodaj 1/5 objętości 0,25% trypsyny. Kontynuuj inkubację przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać roztwór Dnazy I do mieszaniny w stosunku jeden do 100.
Następnie inkubuj przez kolejne pięć minut. Zatrzymaj proces trawienia, dodając taką samą objętość pożywki neutralizującej. Pipetować roztwór w górę i w dół około 20 razy.
Przefiltruj zdysocjowane komórki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów, aby usunąć resztki tkanek. Wirować przy 200 g przez pięć minut. Obserwuj granulki na dnie tuby.
Usunąć supernatanty i przemyć osad komórkowy 10 mililitrami pożywki neutralizującej. Następnie odwirować przy 200 g przez pięć minut. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do inokulacji za pomocą 10-mikromolowego inhibitora ROCK.
Płytka dwa razy od 10 do szóstych komórek w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Po trzech dniach zastąp pożywkę inokulacyjną pożywką keratynocytów bez surowicy. Zmieniaj podłoże co dwa dni.
Gdy komórki osiągną około 80% gęstości, przepuść komórki. Umyj komórki PBS. Jeśli to konieczne, trypsynizuj przez dwie minuty i umyj komórki PBS, aby usunąć zanieczyszczone komórki skóry.
Dodać taką samą objętość pożywki neutralizującej. Wirować przy 200 g przez pięć minut. Na koniec usunąć supernatanty i ponownie zawiesić osad komórkowy.
Wyizolowane keratynocyty z tkanek skóry ludzkiej inkubowano oddzielnie dwiema metodami. Konwencjonalna metoda to dwuetapowe trawienie, które obejmuje dwudniową procedurę. Natomiast nowa metoda to jednoetapowe trawienie, które trwa około trzech godzin.
Trzeciego dnia możemy łatwo znaleźć wiele klastrów komórkowych hodowanych nową metodą, podczas gdy zjawisko to nie występuje przy użyciu metody konwencjonalnej. W piątym dniu zaobserwowano, że nowa metoda wytworzyła większą ilość komórek pierwotnych. Aby przetestować stan różnicowania hodowanych keratynocytów, przeanalizowaliśmy marker komórek podstawnych K5 i końcowy marker różnicowania Loricrin.
Odkryliśmy, że 90% wszystkich komórek było K5 dodatnich, ale mniej niż 10% komórek wyrażało lorycynę w trzecim pasażu, co wskazuje, że są to niezróżnicowane keratynocyty. Sprawdziliśmy ekspresję wimentyny, która ulega ekspresji w fibroblastach skóry, aby zbadać zanieczyszczenie komórek skóry właściwej podczas izolacji. Odkryliśmy, że około 3% komórek skóry właściwej pojawiło się w początkowym pasażu, ale tylko około 0,02% komórek skóry właściwej zostało wykrytych w trzecim pasażu, co wskazuje na wysoką czystość komórek naskórka po pasażu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia uproszczony protokół izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłych tkanek skóry. Metoda wykorzystuje inhibitor ROCK Y-27632, aby ułatwić separację komórek naskórka od komórek skóry właściwej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Dermatologia
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- Pierwotne ludzkie keratynocyty są niezbędne do różnych zastosowań badawczych.
- Konwencjonalne metody izolacji mogą być skomplikowane i czasochłonne.
- Zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 oferuje bardziej wydajne podejście.
- Izolowanych keratynocytów można używać zarówno w warunkach laboratoryjnych, jak i klinicznych.
Cel badania
- Opracowanie bardziej wydajnej metody izolacji komórek naskórka.
- Zwiększenie wydajności komórek naskórka o wysokiej potencjale.
- Ułatwienie badań i zastosowań klinicznych z udziałem komórek skóry.
Stosowane metody
- Przepłucz tkankę skóry PBS przed ważeniem.
- Waż tkankę skóry za pomocą wagi elektronicznej.
- Spłucz tkankę 70% etanolem przez 30 sekund.
- Inkubować tkankę w PBS z antybiotykami dwa razy po pięć minut każda.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem izoluje pierwotne keratynocyty.
- Uzyskano wysokie wydajności żywych komórek naskórka.
- Metoda jest powtarzalna i wydajna.
- Izolowane komórki można wykorzystać do różnych zastosowań.
Wnioski
- Ta metoda upraszcza izolację pierwotnych keratynocytów.
- Zabezpiecza niezawodne podejście dla badaczy w tej dziedzinie.
- Zastosowanie inhibitora ROCK poprawia wydajność i żywotność komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
