Name: Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej skóry przy użyciu inhibitora ROCK Y-27632. Technika ta zapewnia wysoką wydajność i czystość komórek do zastosowań badawczych oraz klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2017YFA0104604), Program Ogólny Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, 81772093), Program Rozwoju Nauki i Technologii w Suzhou (ZXL2015128), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20161241) oraz Nagrodę Naukową Shandong Taishan (tshw201502065).

Ludzkie tkanki użyte w tym protokole zostały potraktowane zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach (NO.2015120401, data: 12 maja 2015).
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Zbierz świeże dorosłe tkanki skóry brzucha wyrzucone po operacji plastycznej w szpitalu w probówce o pojemności 50 ml z 10 ml lodowatego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin bez znaczącego wpływu na żywotność komórek.</li>
	<li>Przygotować odczynniki i pożywkę hodowlaną zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml penicyliny (100 j./ml) i streptomycyny (100 mg/l) do 50 ml roztworu buforowanego fosforanem (PBS) w celu przygotowania roztworu do mycia.</li>
		<li>Przygotować dwa zestawy roztworów do wytrawiania enzymatycznego: (1) przygotować 50 ml dypazy (2,5 mg/ml w DMEM) i 50 ml kolagenazy typu I (2,5 mg/ml w DMEM) oddzielnie dla metody konwencjonalnej; oraz (2) przygotować 50 ml mieszaniny dypazy i kolagenazy typu I (rozpuścić 125 mg proszku dispazy i 125 mg kolagenazy typu I w 50 ml DMEM) dla nowej metody><.
		UWAGA: Wszystkie roztwory enzymów należy przefiltrować za pomocą sitka o wielkości 0,22 μm i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj roztwory wytrawiające dla obu metod: 0,05% trypsyny i 0,25% trypsyny zostały zakupione na rynku. Przygotować roztwór DNazy I o stężeniu 10 mg/ml, rozpuszczając 50 mg proszku DNazy I w 5 ml PBS, przefiltrować go sitkiem o stężeniu 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj 500 ml pożywki, aby zneutralizować trawienie enzymatyczne: pożywka DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.</li>
		<li>Przygotuj 500 ml pożywki inokulacyjnej (pożywki zawierającej czynnik wzrostu, zwanej pożywką G): pożywki DMEM/F12 (3:1) zawierającej 1% penicyliny/streptomycyny, 40 μg/ml fungizonu, 40 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2), 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 2% suplementu B27.</li>
		<li>Na 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych należy potraktować 2 ml matrycy powlekającej zawierającej kolagen typu I przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Metoda konwencjonalna
<ol>
	<li>Wstępna obróbka tkanki skórnej
	<ol>
		<li>Weź 1,5cm2 tkanki skórnej i umyj ją 1x 10 ml PBS, następnie przepłucz 10 ml 70% etanolu przez 30 s i inkubuj 2x z 10 ml roztworu myjącego (PBS zawierający 2% penicyliny i streptomycyny), po 5 minut. 
		UWAGA: Wszystkie mycia wykonywane są w 100-milimetrowych naczyniach do hodowli komórkowych wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Przyciąć tkankę sterylnymi nożyczkami, aby usunąć podskórną warstwę tłuszczu w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych, a następnie zważyć tkankę skórną (waga w tym protokole wynosi 1 g). 
		UWAGA: Odpowiednie przycinanie jest bardzo ważne dla skutecznego oddzielenia naskórka od skóry właściwej. Żółtawą warstwę tłuszczu można łatwo odróżnić wizualnie.</li>
		<li>Przenieś tkankę do innego sterylnego naczynia o średnicy 100 mm stroną ze skórą właściwą do dołu, a następnie pokrój tkankę skórną na paski o szerokości od 3 do 4 mm za pomocą ostrza skalpela. 
		UWAGA: Strona skóry właściwej z warstwą tłuszczu jest łatwo rozpoznawalna wizualnie.</li>
		<li>Dodać 10 ml roztworu dyspazy o stężeniu 2,5 mg/ml do tkanek skóry w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym, a następnie inkubować szalkę przez noc w temperaturze 4 °C (nie dłużej niż 20 godzin). 
		UWAGA: Ilość roztworu dypazy można obliczyć, używając 10 ml roztworu dypazy do trawienia każdego grama tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielenie naskórka od tkanki skórnej
	<ol>
		<li>Drugiego dnia złuść naskórek ze skóry właściwej za pomocą cienkiej pęsety. 
		UWAGA: Jeśli złuszczanie naskórka jest trudne, trawienie w dyspazie nie było wystarczające, co zwykle wynika z niedostatecznego przycięcia tkanki. W takim przypadku tkanka potrzebuje dłuższego czasu inkubacji.</li>
		<li>Zmielić obrany naskórek z 500 μl pożywki do hodowli komórkowych na zawiesinę tkankową za pomocą ostrzy skalpela, a następnie ponownie zawiesić go z 10 ml 0,25% trypsyny w probówce o pojemności 50 ml i inkubować przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, wstrząsając.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie i hodowla komórek pierwotnych
	<ol>
		<li>Zneutralizować aktywność trypsyny, dodając równą objętość roztworu neutralizującego (10 ml w tym protokole).</li>
		<li>Oddziel komórki naskórka, pipetując roztwór w górę iw dół 20-krotnie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przepuść roztwór komórkowy przez sitko do komórek o średnicy 100 μm, aby usunąć wszelkie resztki tkanki.</li>
		<li>Odwirować roztwór komórkowy przy 200 x g przez 5 minut po filtracji; ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce neutralizacyjnej do przemycia, a następnie ponownie odwirować go przy 200 x g w celu uzyskania osadu komórkowego.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml niskowapniowego, bezsurowicowego podłoża keratynocytowego (SFM). Weź 10 μl tego roztworu, aby policzyć całkowitą liczbę komórek, a następnie rozłóż około 2 x 106 komórek z 10 ml SFM na 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych wstępnie potraktowanych matrycą powlekającą (zawierającą kolagen typu I). 
		UWAGA: Powlekanie jest niezbędnym krokiem w przypadku metody konwencjonalnej.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co 2 d. 
		UWAGA: Sprawdź adhezję komórek pod mikroskopem przed i po zmianie pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 80% konfluencji. 
		UWAGA: Wszystkie szalki hodowlane są wstępnie traktowane matrycą powlekającą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nowa metoda
<ol>
	<li>Wstępna obróbka tkanki skórnej
	<ol>
		<li>Pobrać tkankę w sposób opisany powyżej (krok 2.1) dla metody konwencjonalnej.</li>
		<li>Umyj tkankę skóry 1x 10 ml PBS, a następnie zważ ją w sterylnym plastikowym pojemniku za pomocą wagi elektronicznej (waga w tym protokole wynosi około 1 g). 
		UWAGA: Minimalna waga tkanki potrzebna do tego protokołu wynosi 0,1 g, ponieważ trudno jest uzyskać wystarczającą liczbę komórek, jeśli użyta próbka tkanki jest zbyt mała. W tym protokole nie ma maksymalnej wagi tkanki, która ostatecznie zależy od zdolności operatora do obsługi.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy przepłucz tkankę skórną 10 ml 70% etanolu przez 30 sekund.</li>
		<li>Inkubować tkankę 2x z 10 ml roztworu myjącego (przygotowanego w kroku 2.1.1), za każdym razem przez 5 minut. 
		UWAGA: Wszystkie wymienione powyżej etapy mycia są wykonywane w 100-milimetrowych naczyniach do hodowli komórkowych wewnątrz okapu z przepływem laminarnym (kaptur do hodowli tkankowych).</li>
		<li>Przenieś tkankę do innego sterylnego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm.</li>
		<li>Za pomocą ostrzy skalpela dokładnie zmiel tkankę na zawiesinę tkanki.</li>
		<li>Dodawaj 200 μl PBS co 5 minut, aby chusteczki były mokre. 
		UWAGA: Kroki 3.1.5 - 3.1.7 zajmują około 15 minut. Wszystkie powyższe kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie tkanki skórnej
	<ol>
		<li>Przenieść homogenizowany roztwór tkankowy do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml mieszaniny enzymów na każdy 1 g tkanki skórnej. Enzymy dokładnie wymieszać z homogenizowanymi tkankami.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę, wytrząsając w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodaj 1/5 objętości 0,25% trypsyny (2,5 ml w tym protokole) do mieszaniny wytrawiającej przez kolejne 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać roztwór DNazy I do mieszaniny enzymów w stosunku 1:100 (v/v) (250 μl w tym protokole) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie i hodowla komórek pierwotnych
	<ol>
		<li>Zatrzymaj proces trawienia, dodając 12,5 ml pożywki neutralizacyjnej w stosunku 1:1. Pipetować roztwór w górę iw dół przez około 20 razy, używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu dysocjacji komórek.</li>
		<li>Przefiltruj zdysocjowane komórki przez sitko do komórek o średnicy 100 μm, aby usunąć resztki tkanek. Odwirować supernatant przy 200 x g przez 5 minut. Obserwuj granulki na dnie tuby.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad komórkowy 10 ml pożywki neutralizującej, a następnie ponownie odwirować przy 200 x g przez 5 minut w celu zebrania komórek.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki do inokulacji (pożywka G z kroku 1.2.5) z 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Weź 10 μl roztworu, aby policzyć całkowitą liczbę komórek, a następnie rozłóż około 2 x 106 komórek z 10 ml pożywki G w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. 
		UWAGA: W przypadku nowej metody etap wstępnego powlekania nie jest konieczny, nie jest też wymagane usuwanie warstwy skórnej.</li>
		<li>Po 3 dniach zastąp pożywkę inokulacyjną pożywką SFM o niskiej zawartości wapnia. Zmieniaj pożywkę co 2 d. 
		UWAGA: Sprawdź przyczepność komórek przed i po zmianie podłoża.</li>
		<li>Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 80% konfluencji. 
		UWAGA: Jeśli to konieczne, potraktuj komórki 0,05% trypsyny przez 2 minuty i umyj komórki PBS, aby usunąć zanieczyszczające komórki skóry właściwej przed trypsynizacją komórek naskórka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przekazywanie komórek
<ol>
	<li>Usuń pożywkę, umyj komórki PBS, a następnie dodaj 2 ml 0,05% trypsyny (na każde naczynie o średnicy 100 mm).</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze (37 °C z 5% CO2 ) przez 5 minut.</li>
	<li>Sprawdź komórki za pomocą mikroskopu, aby upewnić się, że wszystkie komórki odłączyły się od naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Dodaj 8 ml DMEM z 10% FBS, aby zneutralizować reakcję enzymatyczną, a następnie zbierz komórki w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Powoli usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml pożywki SFM i policzyć liczbę komórek.</li>
	<li>Płytka 1 x 106 komórek z 10 ml SFM do każdej 100-milimetrowej płytki na komórki.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 2 d.</li>
</ol>

<ol><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+BIology%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).</li>
<li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal%2C+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li>
<li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+dermatologische+Forschung%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/306307941_A_new_method_to_isolate_human_epidermal_keratinocytes">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cornified+envelope%3A+a+model+of+cell+death+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li>
<li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li>
<li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowlane pierwotne HKC są szeroko stosowane w leczeniu ran w klinikach od ponad trzech dekad i od tego czasu zawsze ważne było skuteczne uzyskanie wystarczającej liczby komórek do zastosowań klinicznych w odpowiednim czasie. Dlatego w praktyce konwencjonalna metoda izolacji, która wymaga oddzielenia naskórka od skóry właściwej, utrudnia sprostanie tym wymaganiom, ze względu na niską wydajność komórek i niską zdolność do pasażu komórek dorosłych. W tym miejscu opisujemy nową, prostą metodę, którą opracowaliśmy w celu sku...

Celem było opracowanie prostego i skutecznego protokołu izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów (HKC) z tkanek dorosłych, szczególnie do zastosowań klinicznych. Komórki macierzyste naskórka skóry, zlokalizowane w warstwie podstawnej skóry, mają wysoki potencjał do namnażania się i różnicowania oraz dostarczania keratynocytów w celu utrzymania funkcji skóry1,2,3,4. HKC wyizolowane z tkanek skóry są szeroko stosowane do celów inżynierii i regeneracji tkanek skóry, zwłaszcza w naprawie uszkodzonej skóry oraz w terapii genowej do zastosowań klinicznych5,6. Kluczowym zagadnieniem dla aplikacji opartych na HKC jest efektywne izolowanie i namnażanie dużej liczby HKC o wysokim potencjale in vitro7,8. Chociaż różne grupy badawcze opracowały metody produkcji kultur HKC podobnych do łodyg, metody te są czasami czasochłonne i skomplikowane do wykonania oraz mają inne ograniczenia, takie jak niska wydajność komórek i ograniczenie rodzajem użytej próbki skóry9. Na przykład tradycyjna metoda izolowania HKC z tkanek skóry obejmuje dwuetapowe trawienie enzymatyczne z oddzieleniem naskórka od skóry właściwej6. Ta metoda zwykle działa dobrze w przypadku tkanek noworodków, ale staje się bardzo trudna, gdy jest stosowana do izolowania komórek z tkanek dorosłych.
Y-27632, inhibitor kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK), znacznie zwiększa skuteczność izolacji komórek macierzystych naskórka i wzrostu kolonii10,11,12. W poprzednim badaniu odkryliśmy, że Y-27632 ułatwia klonalny wzrost komórek naskórka, ale zmniejsza wydajność komórek skóry właściwej poprzez różnicową kontrolę ekspresji cząsteczek adhezyjnych13. Opracowaliśmy również nową kondycjonowaną pożywkę do inokulacji, zwaną G-pożywką, która wspomaga wzrost i wydajność pierwotnych komórek naskórka. Łącząc G-medium z Y-27632, ta nowatorska metoda może spontanicznie oddzielić komórki naskórka i skóry właściwej po trawieniu enzymatycznym, usuwając w ten sposób etap separacji naskórka i skóry właściwej13,14. Opierając się na poprzednich raportach, opisujemy teraz szczegółową procedurę tej nowej metody izolowania HKC z dorosłej tkanki skórnej.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess</td><td>Invitrogen Inc.&nbsp;</td><td>C10227</td><td>Automatyczne zliczanie komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific 51026333</td><td></td><td>Do inkubacji komórek</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Wirówka komórkowa</td></tr><tr><td>Wytrząsarka o stałej temperaturze</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>Do kąpieli wodnej</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>Do ważenia tkanek</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Do wirówki komórkowej</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>Corning wbudowane</td><td>431792</td><td>Filtracja komórkowa</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanami</td><td>Solarbio Nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Roztwór myjący</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Składnik pożywki neutralizującej</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>Pożywka do hodowli komórek naskórka</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Przemysł biologiczny</td><td>04-001-1AC5</td><td>Składnik pożywki neutralizującej</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>Do dysocjacji HKC</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna&nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Nauka & Technologia</td><td>T1350-100</td><td>Do dysocjacji HKC</td></tr><tr><td>Zestaw matryc powłokowych</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>Do matrycy powłokowej</td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Do izolacji HKC</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>Do izolacji HKC</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>Do izolacji HKC</td></tr><tr><td>F12 Mieszanka składników odżywczych, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Składnik G-medium</td></tr><tr><td>B27</td><td>Suplement Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Czynnik wzrostu w G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Czynnik wzrostu w G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Inhibitor ROCK</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Preparat do G-medium</td></tr><tr><td>EGF Rekombinowanego białka ludzkiego</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>czynnika wzrostu w G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>proliferacji komórek i testów cytotoksyczności</td></tr><tr><td>Mysia anty-ludzka cytokeratyna5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HKC</td></tr><tr><td>Królik Anti-Human Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HKC</td></tr><tr><td>Mysza technologia sygnalizacji komórkowej anty-ludzkiej wimentyny</td><td></td><td>3390</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego fibroblastów skóry</td></tr><tr><td>Integryna i alfa; 6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>analiza cytometrii przepływowej HKCs</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>przeciwciało kontroli ujemnej &alfa; 6-integryna&nbsp; w analizie cytometrii przepływowej&nbsp;</td></tr></tbody></table>

uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Pierwotne ludzkie keratynocyty izolowane ze świeżych tkanek skóry i ich ekspansja in vitro były szeroko stosowane do badań laboratoryjnych i zastosowań klinicznych. Konwencjonalna metoda izolacji ludzkich keratynocytów obejmuje dwuetapową sekwencyjną procedurę trawienia enzymatycznego, która, jak udowodniono, jest nieefektywna w generowaniu komórek pierwotnych z dorosłych tkanek ze względu na niski wskaźnik odzysku komórek i zmniejszoną żywotność komórek. Niedawno informowaliśmy o zaawansowanej metodzie izolowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych naskórka z tkanek skóry, która wykorzystuje inhibitor kinazy Rho Y-27632 w pożywce. W porównaniu z tradycyjnym protokołem, ta nowa metoda jest prostsza, łatwiejsza i mniej czasochłonna, a także zwiększa wydajność nabłonkowych komórek macierzystych i poprawia ich charakterystykę komórek macierzystych. Co więcej, nowa metodologia nie wymaga oddzielania naskórka od skóry właściwej, a zatem nadaje się do izolowania komórek z różnych typów dorosłych tkanek. Ta nowa metoda izolacji przezwycięża główne wady metod konwencjonalnych i jest bardziej odpowiednia do wytwarzania dużej liczby komórek naskórka o dużej mocy, zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nową metodę.

Schematy nowej metody (Rysunek 1A) oraz metody konwencjonalnej (Rysunek 1B) przedstawiono na Rysunku 1. Metoda konwencjonalna opiera się na dwuetapowym trawieniu, co wymaga 2-dniowej procedury. W przeciwieństwie do niej, nowa metoda polega na trawieniu jednoetapowym, którego wykonanie zajmuje około 3 godzin. Co istotne, nowa metoda jednoetapowa pozwala na jednoczesne uzyskanie dwóch populacji (komóre...

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie nowej, prostej metody izolowania i hodowli pierwotnych ludzkich komórek naskórka z dorosłej tkanki skórnej. Ta zaawansowana metoda jest bardziej odpowiednia do wytwarzania dużej liczby komórek naskórka o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych. Umyj chusteczkę PBS przed ważeniem.Zważ tkankę skórną za pomocą wagi elektronicznej. Płucz tkankę skóry 70% etanolem przez 30 sekund. Inkubować tkankę w PBS z antybiotykami dwa razy przez pięć minut za każdym razem.Przenieś tkankę do innego sterylnego naczynia i dokładnie homogenizuj za pomocą ostrzy skalpela. Dodawaj 200 mikrolitrów PBS co pięć minut, aby tkanka była mokra. Przenieś homogenizowaną tkankę do 50-mililitrowej probówki.Dodaj 10 mililitrów mieszaniny enzymów na każdy gram tkanki skórnej. Enzymy dokładnie wymieszać z homogenizowanymi tkankami. Inkubować mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając.Następnie dodaj 1/5 objętości 0,25% trypsyny. Kontynuuj inkubację przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać roztwór Dnazy I do mieszaniny w stosunku jeden do 100.Następnie inkubuj przez kolejne pięć minut. Zatrzymaj proces trawienia, dodając taką samą objętość pożywki neutralizującej. Pipetować roztwór w górę i w dół około 20 razy.Przefiltruj zdysocjowane komórki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów, aby usunąć resztki tkanek. Wirować przy 200 g przez pięć minut. Obserwuj granulki na dnie tuby.Usunąć supernatanty i przemyć osad komórkowy 10 mililitrami pożywki neutralizującej. Następnie odwirować przy 200 g przez pięć minut. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do inokulacji za pomocą 10-mikromolowego inhibitora ROCK.Płytka dwa razy od 10 do szóstych komórek w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Po trzech dniach zastąp pożywkę inokulacyjną pożywką keratynocytów bez surowicy. Zmieniaj podłoże co dwa dni.Gdy komórki osiągną około 80% gęstości, przepuść komórki. Umyj komórki PBS. Jeśli to konieczne, trypsynizuj przez dwie minuty i umyj komórki PBS, aby usunąć zanieczyszczone komórki skóry.Dodać taką samą objętość pożywki neutralizującej. Wirować przy 200 g przez pięć minut. Na koniec usunąć supernatanty i ponownie zawiesić osad komórkowy.Wyizolowane keratynocyty z tkanek skóry ludzkiej inkubowano oddzielnie dwiema metodami. Konwencjonalna metoda to dwuetapowe trawienie, które obejmuje dwudniową procedurę. Natomiast nowa metoda to jednoetapowe trawienie, które trwa około trzech godzin.Trzeciego dnia możemy łatwo znaleźć wiele klastrów komórkowych hodowanych nową metodą, podczas gdy zjawisko to nie występuje przy użyciu metody konwencjonalnej. W piątym dniu zaobserwowano, że nowa metoda wytworzyła większą ilość komórek pierwotnych. Aby przetestować stan różnicowania hodowanych keratynocytów, przeanalizowaliśmy marker komórek podstawnych K5 i końcowy marker różnicowania Loricrin.Odkryliśmy, że 90% wszystkich komórek było K5 dodatnich, ale mniej niż 10% komórek wyrażało lorycynę w trzecim pasażu, co wskazuje, że są to niezróżnicowane keratynocyty. Sprawdziliśmy ekspresję wimentyny, która ulega ekspresji w fibroblastach skóry, aby zbadać zanieczyszczenie komórek skóry właściwej podczas izolacji. Odkryliśmy, że około 3% komórek skóry właściwej pojawiło się w początkowym pasażu, ale tylko około 0,02% komórek skóry właściwej zostało wykrytych w trzecim pasażu, co wskazuje na wysoką czystość komórek naskórka po pasażu.

a-simplified-efficient-method-to-isolate-primary-human-keratinocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

Opisujemy metodę izolowania naiwnych multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzenia skórnego (SKP) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Pokazujemy, że te SKP pochodzące z kultur fibroblastów mają podobne właściwości komórek macierzystych do tych pochodzących bezpośrednio z biopsji ludzkiej skóry. Komórki te wyrażają marker grzebienia nerwowego, nestynę, oprócz markerów multipotencjalnych, takich jak OCT4 i Nanog.

Izolacja naiwnych dorosłych komórek macierzystych z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Poznaj uproszczoną metodę izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej skóry przy użyciu inhibitora ROCK Y-27632. Technika ta zapewnia wysoką wydajność i czystość komórek do zastosowań badawczych oraz klinicznych.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Przeglądaj więcej filmów