Name: Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowego organotypowego modelu sferoidalnego czerniaka, który odwzorowuje architekturę guza in vivo. Technika ta umożliwia badanie interakcji nowotwor-zwierzę i testowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Hannie Voersmann za stworzenie 3D organotypowego modelu czerniaka i sferoidy skóry oraz dostarczenie doskonałych protokołów. Autorzy dziękują również firmie Silke Busch za cenne wsparcie techniczne. Prace były wspierane przez program BMBF e:Med "Melanoma Sensitivity" 031A423A.

Wszystkie prace nad tkankami ludzkimi zostały wykonane przy użyciu zatwierdzonych protokołów instytucjonalnych.
1. Oddzielenie skóry właściwej i naskórka od ludzkiej skóry (napletek młodzieńczy od obrzezania)
<ol>
	<li>Umieść napletek (zwykle 1 - 2 cm2) w nieprzywierającym sterylnym naczyniu do hodowli komórek (Ø 10 cm) i przykryj go 10 - 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami+ (PBS, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, pH 7,2 = PBS+). Usuń cały nadmiar tkanki tłuszczowej za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy.</li>
	<li>Pokrój skórę na kawałki o wymiarach 3 mm x 5 mm, umyj je PBS i przenieś do nieprzywierającej sterylnej miski do hodowli komórkowych (Ø 6 cm). Przykryj kawałki tkanki 5 - 7 ml roztworu dyspazy (2 U/ml w PBS). Uszczelnić naczynie do hodowli komórkowych folią parafinową i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wycofaj naskórek z części skórnej za pomocą dwóch sterylnych kleszczy. Przenieść wypreparowane kawałki tkanki do indywidualnych nieprzywierających naczyń do hodowli komórkowych (Ø 6 cm) i przykryć każdą z nich PBS+.</li>
</ol>
2. Izolacja pierwotnych keratynocytów od naskórka
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjąć PBS+ z naczynia do hodowli komórkowych za pomocą pipety Pasteura i przemyć fragmenty tkanki naskórka (sekcja 1.3) PBS. Pokrój naskórek na mniejsze kawałki (1mm2) i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 1x Trypsin-EDTA (podgrzanej do 37 °C) i inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Mieszać zawiesinę tkankową co 2 minuty.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 1 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS). Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół plastikową pipetą o pojemności 10 ml przez 4 minuty. Staraj się unikać bąbelków i tworzenia się piany.</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę komórek do sitka komórkowego (wielkość porów 100 μm), umieszczonego na wierzchu świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przepłukać 3x 5 ml PBS. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 2 - 6 ml pożywki hodowlanej zawierającej 1% (v/v) gentamycyny. Określ liczbę komórek ręcznie, zliczając komórki w hemocytometrze i zasiewając 6 x 105 komórek do kolby do hodowli komórkowych T75.</li>
</ol>
3. Uprawa pierwotnych keratynocytów
<ol>
	<li>Inkubować pierwotne keratynocyty wyizolowane w kroku 2.3 w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce keratynocytów bez FCS, do 50 - 70% konfluencji.</li>
	<li>Aby przejść keratynocyty, ostrożnie usuń pożywkę, dodaj 5 ml PBS-EDTA i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdź, czy komórki zaczęły odłączać się od kolby hodowlanej pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4X: komórki będą wyglądały na zaokrąglone, ale nadal są przyczepione!). W przeciwnym razie należy zastąpić stary PBS-EDTA świeżym PBS-EDTA i ponownie inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 5 ml 1x Trypsin-EDTA do zaokrąglonych komórek nadal pokrytych 10 ml PBS-EDTA i ponownie je inkubować przez 1 - 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 1 ml FCS i zebrać oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce keratynocytowej i wysiać 6 x 105 komórek do świeżej kolby do hodowli komórek T75. 
	UWAGA: Do wygenerowania organotypowych rekonstrukcji skóry należy użyć keratynocytów pierwotnych nie później niż w pasażu 3 - 4.</li>
</ol>
4. Izolacja pierwotnych fibroblastów od skóry właściwej
<ol>
	<li>Pociąć tkankę skórną (sekcja 1.3) na mniejsze kawałki (1mm2) i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml roztworu kolagenazy (5 j./ml w PBS+) i inkubować przez 45 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Odwirować mieszaninę fragmentów tkanek i komórek w temperaturze 200 x g przez 5 min.</li>
	<li>Przemyj osad komórkowy dwukrotnie 10 ml DMEM zawierającym 4,5 g/l glukozy i L-glutaminy, ale bez L-pirogronianu. Na koniec ponownie zawiesić fragmenty tkanki w 2 ml DMEM zawierającym 1% (v/v) gentamycyny i 10% FCS. Przenieść je do kolby do hodowli komórkowych T25 i inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc. 
	UWAGA: Mała objętość pozwala fibroblastom na migrację z resztek tkankowych i zmusza je do przyłączenia się do kolby hodowlanej.</li>
	<li>Następnego ranka dodaj kolejne 6 ml DMEM/Gentamycyny/FCS i inkubuj przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną zbieżność 80-90%.</li>
</ol>
5. Uprawa pierwotnych fibroblastów
<ol>
	<li>Aby przejść przez fibroblasty, usuń pożywkę i przemyj przylegające komórki PBS. Dodać 5 ml 1x Trypsyna-EDTA i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 5 ml DMEM/FCS i zbierz oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce DMEM i wysiać 6 x 105 komórek do świeżej kolby do hodowli komórek T75. 
	UWAGA: Do wygenerowania organotypowych rekonstrukcji skóry należy użyć pierwotnych fibroblastów nie później niż w pasażu 4 - 6.</li>
</ol>
6. Generowanie sferoid czerniaka 3D metodą wiszącej kropli
<ol>
	<li>Hodowla komórek czerniaka (np. 451-LU lub dowolnej interesującej nas linii komórkowej czerniaka) zgodnie z ogólnymi protokołami, przy użyciu RPMI zawierającego 10% FCS15.
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć sferoidy czerniaka o podobnej wielkości i jakości, umyj komórki czerniaka w PBS, dodaj 5 ml 1x Trypsyna-EDTA w PBS do komórek w kolbie do hodowli komórek T175 i inkubuj przez 3 - 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Zneutralizuj trypsynę, dodając 5 ml RPMI/10% FCS. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w RPMI/FCS przy końcowym stężeniu 10 000 komórek/ml, określonym przez zliczenie w hemocytometrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą elektronicznej pipety wielofunkcyjnej umieścić 40 x 25 μl (= 250 komórek) zawiesiny komórkowej na wewnętrznej powierzchni pokrywy sterylnego, nieprzywierającego naczynia do hodowli komórkowych (Ø 10 cm). Szybkim, ale płynnym ruchem odwróć pokrywkę i umieść ją na odpowiednim naczyniu do hodowli komórkowych zawierającym 5 ml PBS.
	<ol>
		<li>Hodowla "wiszące naczynia kroplowe" w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 - 14 dni, w zależności od użytego typu komórki. 
		UWAGA: Komórki z fazy wzrostu MM zazwyczaj rosną szybciej i tworzą bardziej stałe sferoidy w zwisającej kropli w porównaniu z komórkami czerniaka pochodzącymi z RGP lub VGP. W celu indywidualnej oceny obserwuj wzrost sferoidy pod lornetką lub pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4x). Zazwyczaj sferoidy stają się wykrywalne po 48 godzinach pod lornetką lub pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4x). Po 10 - 14 dniach są widoczne bez żadnego urządzenia powiększającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 dni po pierwszym zauważeniu kropli dodaj 10 μl świeżej pożywki RPMI/10% FCS do każdej kropli. Następnie wymieniaj 10 μl pożywki co drugi dzień. Bardzo pomocne w tym kroku jest korzystanie z elektronicznego dozownika.</li>
	<li>W zależności od typu komórek, sferoidy (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 10) należy zebrać po 10 - 15 dniach, delikatnie spłukując je z pokrywki naczynia do hodowli komórkowych za pomocą PBS. Zbierz je w świeżym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Okres hodowli zależy od fazy wzrostu guza komórek czerniaka, kiedy zostały one pierwotnie uzyskane, np. sferoidy pochodzące z komórek 451-LU osiągają średnicę około 500 μm w ciągu 12 dni od hodowli w wiszącej kropli 15.</li>
</ol>
7. Generowanie kompartmentu skórnego organotypowych rekonstrukcji całej skóry
<ol>
	<li>Generuj modele skóry za pomocą 24-dołkowych wkładek mikroporowatej błony komórkowej (wielkość porów 8 μm) umieszczonych w 24-dołkowych płytkach. 
	UWAGA: Upewnij się, że nie używasz wiszących, ale stojących wkładów, ponieważ na późniejszym etapie zostaną one umieszczone na 6-dołkowej płytce do uprawy powietrzno-płynnej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór neutralizujący żel (GNL)15, a także pożywki hodowlane określane jako MM i pożywki wzrostu śródbłonka (EGM)16,17. Aby zapobiec krzepnięciu, przechowuj kolagen typu I (zwykle z ogona szczura, 3,5 - 4 mg / ml w 0,02 N kwasu octowego) na lodzie do czasu użycia, ponieważ zaczyna żelować w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić 1 x 105 fibroblastów na wkładkę w GNL i szybko wymieszać zawiesinę komórkową z kolagenem w stosunku 1:3 w końcowej objętości 500 μl / wkładkę. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki mogą pogorszyć jakość rekonstrukcji skóry.</li>
	<li>Pozwól, aby poszczególne żele skórne osiadły, trzymając je bez podłoża w temperaturze pokojowej przez 30 minut w sterylnym kapturze. Następnie przykryj każdy żel DMEM zawierającym 4,5 g/l glukozy, 1% L-glutaminy, 10% FCS i bez L-pirogronianu i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
8. Wytwarzanie kompartmentu naskórkowego organotypowych rekonstrukcji pełnej skóry
<ol>
	<li>Następnego dnia usunąć pożywkę z żeli skórnych i zrównoważyć je z pożywką EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/ml gentamycyny) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Pobrać pożywkę i ostrożnie wysiać 1 x 105 keratynocytów zawieszonych w 100 μl EGM na wierzchu żelu skórnego.</li>
	<li>Inkubować rekonstrukcje przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C, aby keratynocyty mogły przylegać do komory skórnej. 
	UWAGA: W tym czasie inkubacji żele zaczną się kurczyć z powodu skurczu wywołanego przez fibroblasty, a tym samym przynajmniej częściowo oderwą się od ścianek wkładu.</li>
	<li>Przykryj odpowiedniki skóry około 800 μl EGM i ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładki za pomocą małej (białej) końcówki pipety. Hodować odpowiedniki skóry zanurzone w EGM przez 7 dni w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i zmieniać pożywkę co drugi dzień. 
	UWAGA: W tym czasie odpowiedniki skóry znacznie się skurczą.</li>
</ol>
9. Powietrzno-płynna uprawa organotypowych rekonstrukcji całej skóry
<ol>
	<li>W 8 dniu przenieś każdą wkładkę do indywidualnego dołka na 6-dołkowej płytce. Do każdej studzienki należy dodać tylko 1,2 - 1,4 ml pożywki MM, tak aby rekonstrukcja skóry była zaopatrywana w podłoże z dna studzienki, ale nie była pokryta podłożem. 
	UWAGA: Uprawa na granicy faz powietrze-ciecz umożliwia rozwarstwienie części naskórka i utworzenie pełnej warstwy rogowej naskórka (stratum corneum).</li>
	<li>W ciągu następnych 10 - 17 dni należy zmieniać podłoże zgodnie z punktem 9.1 co drugi dzień. W tym okresie dodaj do pożywki leki lub inne bodźce w razie potrzeby. Ostrożnie usuń pełną rekonstrukcję skóry z wkładu mikroporowatej błony za pomocą zakrzywionej pęsety w celu dalszej analizy, np. analizy immunohistochemicznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
10. Generowanie organotypowych modeli skóry sferoidalnej czerniaka
<ol>
	<li>Aby zintegrować sferoidy czerniaka z kompartmentem skórnym organotypowej pełnej rekonstrukcji skóry, należy ostrożnie spłukać sferoidy (po kroku 6.4) z pokrywki wiszącego naczynia do hodowli komórek kroplowych za pomocą PBS. Zbierz 10 - 20 sferoidów/włóż do sterylnego, nieprzywierającego naczynia do hodowli komórkowych. Ostrożnie usuń nadmiar PBS za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Zassać sferoidy w najmniejszej możliwej objętości NWZ. W tym momencie obserwuj i licz sferoidy gołym okiem, bez żadnego dodatkowego urządzenia powiększającego. Weź 10 - 20 sferoid na model skóry/żel, jak podano w kroku 10.1.</li>
	<li>Przenieś je do żądanej objętości GNL zawierającej fibroblasty (podczas kroku 7.3) i wymieszaj z kolagenem typu I. Począwszy od tego kroku, postępuj zgodnie z opisem w sekcjach 7.3 - 9.1. 
	UWAGA: Sferoidy guza stają się widoczne w żelu skórnym jako białe plamy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2)</li>
</ol>

<ol><li>Boulais, N., Misery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermis%3A+a+sensory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The epidermis: a sensory tissue.</a> Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis%3A+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).</li>
<li>Shain, A. H., Bastian, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+melanocytes+to+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">From melanocytes to melanomas.</a> Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).</li>
<li>Clark, W. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cutaneous+malignant+melanoma+as+a+model+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).</li>
<li>Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+development+and+progression%3A+a+conspiracy+between+tumor+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host.</a> Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).</li>
<li>Miller, A. J., Mihm, M. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra052166">Melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).</li>
<li>Balch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Final+version+of+2009+AJCC+melanoma+staging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.</a> J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).</li>
<li>Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palliative+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma%3A+a+systematic+review+of+41+randomised+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials.</a> Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).</li>
<li>Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+targeted+therapy+and+immune+checkpoint+inhibitors+in+the+treatment+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma.</a> Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).</li>
<li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li>
<li>Flaherty, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mutated%2C+activated+BRAF+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).</li>
<li>Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dtsch.+Dermatol.+Ges%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy of metastatic melanoma.</a> J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+three-dimensional+organotypic+skin-melanoma+spheroid+model+for+in+vitro+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death.+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing.</a> Cell Death. Dis. 4, e719(2013).</li>
<li>Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+serum-free+epidermal+culture+model+to+show+deleterious+effects+of+epidermal+growth+factor+on+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation.</a> J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+%3A+biological+significance+of+bFGF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).</li>
<li>Sinnberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PI3K-AKT-mTOR+signaling+sensitizes+melanoma+cells+to+cisplatin+and+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide.</a> J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).</li>
<li>Niessner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+lonafarnib+inhibits+mTOR+signaling+and+enforces+sorafenib-induced+apoptosis+in+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).</li>
<li>Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiony tutaj organotypowy sferoidalny model skóry czerniaka gwarantuje nowe spostrzeżenia dla głębszego zrozumienia interakcji wewnątrz guza i guza-gospodarza oraz może zapewnić zaawansowaną platformę przesiewową do badania molekularnych mechanizmów rozwoju guza i oporności na terapię w przyszłości.
Aby zagwarantować najlepsze warunki fizjologiczne i naśladujące in vivo rekonstrukcji skóry, jakość komórek pierwotnych ma ogromne znaczenie. Jak wspomniano powyżej, młodzieńcze lub prenatalne komórki skóry wykazują najniższy stopień zróżnicowania i dlatego najlepiej nadają się do wytwarzania odpowiedników skóry o pełnej grubości. Pierwszą możliwą kontrolą jakości jest stopień skurczu skóry w 2 dniu po wysianiu keratynocytów i wyrównaniu żelu z EGM (sekcje 8.2 i 8.3 Protokołu). Żele skórne kurczą się najbardziej dzięki najlepszej jakości fibroblastom. Również integracja zbyt małej lub zbyt dużej liczby fibroblastów może upośledzać skurcz skóry, a w konsekwencji przyczepianie się naskórka do przedziału skórnego. To z kolei zaburzy różnicowanie naskórka, ponieważ proces ten wymaga rozległego wzajemnego oddziaływania między komórkami skóry właściwej i naskórka.
Jakość komórek pierwotnych zależy również krytycznie od konfluencji komórek, a także od przejścia komórek. Jeśli keratynocyty osiągną ≥80% zbieżności, natychmiast przestają się namnażać i zaczynają się różnicować. Dlatego ważne jest, aby hodować je do 40 - 70% zbiegu podczas pasażu i używać nie później niż w pasażu 3 - 4. Fibroblasty są mniej wrażliwe, ale nie powinny być używane później niż pasaż 4 - 6. Należy również pamiętać, że wszystkie pierwotne komórki i linie komórkowe używane do generowania organotypowych sferoidalnych modeli skóry czerniaka są hodowane bez antybiotyków, a zatem ryzyko zanieczyszczenia jest wysokie. Jednak dodatek antybiotyków zmienia fizjologię poszczególnych komórek, a tym samym obniża jakość ich odpowiedników w skórze.
Ogólnie rzecz biorąc, tworzenie sferoidów guza jest możliwe z prawie wszystkich rodzajów linii komórek nowotworowych, a także z komórek nowotworowych świeżo wyizolowanych z materiału pacjenta. Początkowa liczba komórek i/lub czas hodowli w celu uzyskania optymalnych rozmiarów sferoidów mogą się różnić w zależności od użytego typu komórek. Do wielkości 150 - 200 μm wszystkie komórki wchodzące w skład sferoidy mogą być nadal wystarczająco zaopatrywane w składniki odżywcze poprzez prostą dyfuzję. Tylko sferoidy o rozmiarach ≥500 μm wykazują wysoki stopień zróżnicowania komórkowego i reprezentują typowe cechy nieunaczynionej tkanki nowotworowej22.
Opracowany tutaj organotypowy model czerniaka i sferoidalnej skóry jest szczególnie przydatny do badania interakcji między guzem a gospodarzem oraz do testowania leków na czerniaka w warunkach zbliżonych do in vivo 15. Jednak środowisko czerniaka in vivo jest jeszcze bardziej złożone, zawiera różne typy komórek związanych z nowotworem, w tym komórki odpornościowe i komórki śródbłonka. Ponieważ dodanie odpowiednich pierwotnych komórek odpornościowych napotyka problemy z kompatybilnością tkankową, modele te nie są jeszcze w stanie odpowiednio monitorować podejść immunologiczno-terapeutycznych.
Niemniej jednak sferoidy czerniaka mogą być generowane ze świeżo wyizolowanego materiału pacjenta, a po włączeniu do pełnej rekonstrukcji skóry mogą służyć jako indywidualne platformy przesiewowe leków. Możliwe jest nawet włączenie fragmentów przerzutów czerniaka do rekonstrukcji skóry w celu przetestowania kombinacji leków w dostosowanym podejściu terapeutycznym. Włączenie organotypowego modelu 3D czerniaka skóry do badań przedklinicznych prawdopodobnie pomoże zapewnić, że tylko najbardziej obiecujące nowatorskie koncepcje terapeutyczne zostaną włączone do badań klinicznych, zmniejszając w ten sposób wskaźnik wyczerpania potencjalnych nowych metod leczenia tej choroby i zwiększając wskaźnik sukcesu terapeutycznego w badaniach klinicznych.

Ludzka skóra składa się z dwóch odrębnych komór, które pełnią różne funkcje w ochronie ciała przed niekorzystnym wpływem środowiska1. Dolny przedział skórny składa się z włóknisto-elastycznej tkanki łącznej. Składa się z luźno połączonych włókien kolagenu i elastyny syntetyzowanych przez fibroblasty, pełniących funkcję bariery mechanicznej. Skóra właściwa jest oddzielona od górnego naskórka blaszką podstawną, która jest wytwarzana jako macierz zewnątrzkomórkowa w wyniku ciągłej komunikacji między obydwoma przedziałami skóry. W przeciwieństwie do skóry właściwej, naskórek jest nabłonkiem płaskonabłonkowym, który składa się głównie z keratynocytów i może być podzielony na cztery warstwy. Warstwa podstawowa składa się z niezróżnicowanych keratynocytów podstawnych, które stale pochodzą z komórek progenitorowych skóry, rozwarstwiając się przez etapy warstwy kolczastej i warstwy ziarnistej do warstwy rogowej naskórka w celu ochrony organizmu przed odwodnieniem i infekcjami2. Melanocyty są ustawione w jednej linii na błonie podstawnej i komunikują się poprzez dendrytyczne rozszerzenia z wieloma keratynocytami. Wytwarzają pigment melaninę, aby chronić tkankę skórną przed niekorzystnymi skutkami promieniowania UV, takimi jak starzenie się skóry, immunosupresja, stany zapalne i indukcja nieczerniakowego raka skóry. Udział promieniowania UV w przekształcaniu melanocytów w czerniaka złośliwego jest jednak nadal przedmiotem dyskusji3.
Rozwój czerniaka jest zróżnicowany na różne etapy progresji guza i charakteryzuje się pewnymi zmianami genetycznymi, morfologicznymi i histologicznymi4. Powstają albo de novo, albo z wrodzonego lub nabytego znamienia z powodu lokalnego wzrostu proliferacji melanocytów powodującego łagodną neoplazję. Ta zmiana prekursorowa może przekształcić się w strukturalnie zmodyfikowaną tkankę dysplastyczną zawierającą komórki atypowe, która może przejść do pierwszego złośliwego etapu, radialnej fazy wzrostu (RGP). Ta wczesna faza progresji guza charakteryzuje się promieniście proliferującymi komórkami w naskórku, wykazując niewiele miejscowo inwazyjnych komórek w brodawkowatej skórze właściwej. Podczas kolejnej fazy wzrostu pionowego (VGP) komórki czerniaka wykazują już przerzutowy i inwazyjny fenotyp, przebijając się przez blaszkę podstawną, aby naciekać głębsze części skóry właściwej, a także tkankę podskórną5. Wreszcie, czerniak z przerzutami (MM) stanowi najbardziej agresywny etap progresji, w którym komórki przerzutowe rozprzestrzeniają się ogólnoustrojowo w układzie krwionośnym i limfatycznym, aby zaatakować dystalne narządy, takie jak wątroba, płuca i mózg6.
Do tej pory, wczesna diagnoza, a następnie operacja, nadal pozostaje najskuteczniejszą terapią czerniaka złośliwego. Rokowanie dla pacjentów z przerzutami odległymi pozostaje jednak szczególnie złe7, ponieważ klasyczne schematy chemioterapii przynoszą tylko niewielkie korzyści w zakresie przeżycia8,9. Jednak po dziesięcioleciach stagnacji, ostatnie postępy w terapiach celowanych znacznie poprawiły rokowanie w przypadku czerniaka złośliwego.
Rozregulowanie dwóch głównych szlaków aktywowanych przez mitogen, szlaków sygnałowych RAS-RAF-MEK-ERK i PI3K-AKT-PTEN, stanowią kluczowe czynniki progresji czerniaka, zwłaszcza gdy konstytutywnie aktywowane są mutacje punktowe protoonkogenów BRAFV600 i NRAS10. W związku z tym wynalezienie celowanych inhibitorów kinaz obiecywało korzyści terapeutyczne dla pacjentów cierpiących na czerniaka z przerzutami. Wiele badań klinicznych przeprowadzonych do tej pory nie przyniosło znaczących korzyści dla pacjentów z czerniakiem z przerzutami. Prawie wszystkie odpowiedzi są częściowe, a subpopulacja pacjentów wykazuje pierwotną oporność. Ponadto u większości pacjentów zaobserwowano nabycie wtórnej oporności prowadzącej do nawrotu choroby11,12.
Staje się jasne, że sama analiza statusu mutacji nie wystarcza do opracowania najskuteczniejszej strategii terapeutycznej. Nowe, szybkie i niezawodne narzędzia diagnostyczne są niezbędne do systematycznego rejestrowania i analizowania odpowiedzi poszczególnych komórek nowotworowych. Zdecydowana większość obecnie dostępnych danych dotyczących czerniaka u ludzi została uzyskana z dwuwymiarowych (2D) hodowli komórek czerniaka. Jednak komórki nowotworowe hodowane w 3D umożliwiają przesłuch międzykomórkowy między zróżnicowanymi subpopulacjami komórek rakowych, a także między komórkami rakowymi a nieprzekształconą otaczającą tkanką gospodarza. Dlatego najlepiej byłoby zrekonstruować środowisko 3D, w którym rozwinął się czerniak, aby wykorzystać je jako przedkliniczny model przesiewowy13,14.

<table><tbody><tr><td>albumina surowicy płodu (FCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>dodać 10 % do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>1X rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td>do hodowli linii komórkowych czerniaka</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965062</td><td>do hodowli fibroblastów pierwotnych</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco life technologies&nbsp;</td><td>17105041</td><td>2U/ml, rozpuścić w PBS</td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>zwykle z ogona szczura, stężenie powinno wynosić 3,5-4 mg/ml</td></tr><tr><td>24-dołkowe wkładki Nunclon&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140629</td><td>8 & mikro; m wielkość porów; Używaj wkładek stojących, a nie wiszących!</td></tr><tr><td>sitko komórkowe</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>żółte</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750060</td><td>rozpuszczają się w</td></tr><tr><td>pożywce keratycytowej PBS Keralife</td><td>Systemy</td><td></td> komórkowe <td>nie dodają FCS ani antybiotyków</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>NB4 standardowe</td></tr><tr><td>młodzieńcze ludzkie keratynocyty</td><td>Systemy komórkowe</td><td>FC-0007</td><td>alternatywa dla własnego preparatu z młodzieńczego napletka</td></tr><tr><td>młodocianych ludzkich fibroblastów</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0001</td><td>alternatywa dla własnego preparatu z młodego napletka</td></tr><tr><td>DMEM [+] 4,5 g/l Glukoza, [+] L-glutamina, [-] L-pirogronian</td><td>Gibco technologie życia</td><td>41965</td><td>wymieszać 1:1 z szynką i ostrą; s F-12 dla średniego MM; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; wymieszać 3:1 z szynką i ostrą; s F-12 dla NWZ średni</td></tr><tr><td>Ham&acute; s F-12 [+] L-Glutamina</td><td>Gibco life technologies</td><td>&nbsp; 21765-029</td><td>dodaj do DMEM w celu wygenerowania medium EGM i MM (patrz linia 15)</td></tr><tr><td>EGF&nbsp;</td><td>Technologie życiowe Gibco</td><td>&nbsp; 13247-051</td><td>dodać 10 ng/ml tylko do wytworzenia pożywki EGM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Merck Chemicals</td><td>2381</td><td>dodać 1,9 mM do wytworzenia EGM i 3,8 mM do pożywki MM</td></tr><tr><td>Kwas selenowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>18851</td><td>dodać 53 nM do wytworzenia pożywki EGM i MM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lilly</td><td>HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td><td>dodać 5 &mikro; g/ml do wytwarzania pożywki EGM i MM</td></tr><tr><td>Etanoloaminy</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E-0135</td><td>dodać 0,1 mM dla generacji EGM i MM medium</td></tr><tr><td>P-Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0503</td><td>dodać 0,1 mM dla generacji EGM i MM medium</td></tr><tr><td>Holo-Transferrine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T-0665</td><td>dodaj 5 &mikro; g/ml dla wytworzenia pożywki EGM i MM</td></tr><tr><td>Trijodtyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6397</td><td>dodać 20 pM do wytworzenia EGM i pożywki MM</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-088816</td><td>dodać 0,4 i mikro; g/ml dla generacji pożywki EGM i MM</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>dodać 10 nM tylko dla generacji pożywki EGM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3784</td><td>dodać 15 mM dla generacji pożywki NWZ i MM</td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td>dodać 1 mM dla generacji NWZ i MM pożywki</td></tr><tr><td>Cholinchloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C-7017</td><td>dodać 0,64 mM dla wytworzenia NWZ i medium MM</td></tr><tr><td>dFCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-0392 Lot 086K0361</td><td>dodać 2 % dla wytworzenia NWZ i MM medium</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A-9795</td><td>dodać 0,18 mM do wytworzenia EGM i pożywki MM</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>PromoCell</td><td>C-42209</td><td>dodać 7,25 mM do wytworzenia EGM i MM pożywki</td></tr><tr><td>chlorek strontu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>dodać 1 mM do wytworzenia EGM i MM pożywki</td></tr><tr><td>przeciwciało antycytokeratyny 10</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td>1:50</td></tr><tr><td>przeciwciało anty cytokeratyny 14</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-53253</td><td>1:200</td></tr><tr><td>&nbsp; przeciwciało anty laminina 5</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32794</td><td>1:50</td></tr><tr><td>przeciwciało anty filagrynowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-13440</td><td>1:50</td></tr><tr><td>przeciwciało anty inwolukrynowe</td><td>Przeciwciała Acris</td><td>AM33368PU</td><td>1:50</td></tr><tr><td>drugorzędowe poliklonalne kozie anty-mysie IgG FITC oznaczone</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C153907</td><td>1:50</td></tr><tr><td>drugorzędowe poliklonalne kozie anty-mysie IgG Cy3 oznaczone</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-003</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

organotypowy model sferoidalny czerniaka 3d

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Złośliwa transformacja melanocytów, komórek barwnikowych ludzkiej skóry, powoduje powstawanie czerniaka, wysoce agresywnego nowotworu o zwiększonym potencjale przerzutowym. Ostatnio monochemioterapia nadal ulega poprawie dzięki terapiom skojarzonym specyficznym dla czerniaka z celowanymi inhibitorami kinaz. Mimo to czerniak z przerzutami pozostaje chorobą zagrażającą życiu, ponieważ nowotwory wykazują pierwotną oporność lub rozwijają oporność na nowe terapie, odzyskując w ten sposób zdolność rakotwórczą. W celu poprawy skuteczności terapeutycznej czerniaka złośliwego konieczne jest określenie mechanizmów molekularnych nadających oporność na konwencjonalne metody leczenia; Wymaga to jednak innowacyjnych komórkowych modeli in vitro. W tym miejscu przedstawiamy trójwymiarowy (3D) organotypowy model sferoidalny czerniaka in vitro, który może przedstawić architekturę czerniaka złośliwego in vivo i może uzasadnić nowy wgląd w interakcje wewnątrz guza, a także guz-gospodarz. Model zawiera zdefiniowaną liczbę dojrzałych i zróżnicowanych sferoid czerniaka w trójwymiarowym modelu pełnej rekonstrukcji ludzkiej skóry składającym się z pierwotnych komórek skóry. Skład komórkowy i status różnicowania osadzonych sferoid czerniaka jest podobny do przerzutów czerniaka skóry in vivo. Wykorzystanie tego organotypowego modelu sferoidalnego czerniaka jako platformy badań przesiewowych leków może pomóc w identyfikacji osób reagujących na wybrane terapie skojarzone, przy jednoczesnym oszczędzeniu niepotrzebnego obciążenia związanego z leczeniem u osób niereagujących na leczenie, zwiększając w ten sposób korzyści z interwencji terapeutycznych.

Skuteczność leczenia przerzutów czerniaka może być wpływana przez komunikację między komórkami nowotworowymi, a także między komórkami nowotworowymi a nietransformowanymi komórkami gospodarza. Celem opracowania organotypowych modeli raka in vitro jest zapewnienie odpowiednich przedklinicznych systemów testowych, które odzwierciedlają trójwymiarową organizację i złożoność czerniaka u ludzi in vivo. Pozwala to na równoległe badanie wpływu terapeutycznego na guz w środowisku organotypowym oraz działań niepożądanych na otaczającą tkankę pierwotną.
Aby opracować optymalne organotypowe modele skóry, kluczowa jest jakość pierwotnych komórek. Korzystne jest zastosowanie pierwotnych fibroblastów i keratynocytów pochodzących od osobników młodszych, ponieważ są one zazwyczaj mniej zróżnicowane w porównaniu do pierwotnych komórek skóry dorosłych. Komórki skóry osobników młodszych można wyizolować z młodzieńczego napletka, zgodnie z opisem w sekcjach protokołu 1–5, ale można je również zakupić w firmach jako prenatalne pierwotne fibroblasty i keratynocyty. W przypadku zakupu konieczne jest zamówienie komórek od różnych dawców, aby uniknąć wyników specyficznych dla konkretnego dawcy, np. w zakresie wrażliwości na leki. Cały protokół przedstawiono w formie schematu na Rysunku 3.
Kontrola jakości trójwymiarowych ekwiwalentów pełnej skóry wymaga analizy immunohistochemicznej. Wstępne spostrzeżenia można uzyskać poprzez barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) skrawków zatopionych w parafinie (3 µm). Szczegółowa analiza jakości różnicowania naskórka i formowania błony podstawnej między skórą właściwą a naskórkiem wymaga analizy immunohistochemicznej z użyciem specyficznych przeciwciał przeciwko markerowi stratyfikacji naskórka. Pozwala to na rozróżnienie między nieróżnicującymi się, silnie proliferującymi komórkami zlokalizowanymi blisko błony podstawnej a silnie zróżnicowanymi i zkeratynizowanymi komórkami w stratum corneum poprzez formowanie wyraźnych warstw naskórka pomiędzy nimi. Jak pokazano w barwieniu immunohistologicznym (Rycina 4), różnicowanie keratynocytów w całym naskórku przebiegało podobnie jak w normalnej skórze: głównie nieróżnicujące się komórki z dolnych warstw naskórka (stratum basale i stratum spinosum) wykazują pozytywne barwienie na keratynę 14, podczas gdy bardziej zróżnicowane komórki z warstw ponadpodstawnych (stratum granulosum i stratum corneum) barwią się pozytywnie na keratynę 10 i inwolukrynę. Odpowiednio, barwienie na filaggrinę można zaobserwować jedynie w silnie zróżnicowanych komórkach stratum corneum. Co najważniejsze, barwienie na lamininę 5 wykazuje, że utworzyła się błona podstawna, która fizjologicznie łączy komponent naskórkowy z komponentem skóry właściwej w rekonstrukcie sztucznej skóry. Dowodzi to, że wygenerowano komunikujące się mikrośrodowisko organotypowe do hodowli komórek czerniaka lub sferoidów w celu analizy fizjologicznej i patofizjologicznej.
W celu przesiewania leków przeciwmelanomowych, pojedyncze komórki czerniaka można również zintegrować z skórą właściwą pełnych ekwiwalentów skóry, aby umożliwić de novo tworzenie gniazd czerniaka18,19W związku z tym komórki czerniaka łączy się z fibroblastami pierwotnymi w stosunku 5:1, wiruje wspólnie z prędkością 200 x g przez 5 min, a następnie resuspenduje w GNL przed wymieszaniem z kolagenem. W efekcie w przedziale skórnym samoistnie tworzą się gniazda komórek czerniaka. Z naszego doświadczenia wynika, że jedynie komórki w fazie wzrostu przerzutowego tworzą właściwe gniazda, w przeciwieństwie do komórek czerniaka w fazie RGP lub VGP.15Jedną z głównych wad tego typu modeli jest fakt, że liczba i wielkość tworzących się gniazd czerniaka nie są przewidywalne i mogą różnić się pomiędzy poszczególnymi rekonstrukcjami skóry, niezależnie od zastosowanego leczenia. Na przykład, 1000 komórek zasianych w przedziale skórnym może utworzyć 10 gniazd składających się ze 100 komórek lub 100 gniazd składających się z 10 komórek każde (Rysunek 5). Zmienne biologiczne te przejawiają trzy deficyty: po pierwsze, liczba i wielkość tworzonych gniazd czerniaka są nieprzewidywalne; po drugie, przerzuty in vivo są zazwyczaj większe niż gniazda czerniaka i wykazują bardziej złożoną różnorodność wewnątrznowotworową; po trzecie, ze względu na ograniczony czas życia modeli gniazd nowotworowych, leczenie jest rozpoczynane wcześnie, co w konsekwencji raczej hamuje wzrost nowotworu, zamiast powodować regresję istniejących gniazd nowotworowych.
Aby pokonać te ograniczenia, można wytworzyć organotypowe modele skóry z sferoidami czerniaka. Poprzez hodowlę 250 przerzutowych komórek czerniaka w kropli wiszącej przez 14 dni20, w sposób powtarzalny generowane są sferoidy składające się z żywotnych komórek czerniaka o zwartej strukturze i końcowej średnicy około 500 µm, co naśladuje nieunaczynione guzki nowotworowe, mikroprzerzuty lub międzykapilarne mikroregiony guzów litych21,22. Generalnie każda linia komórkowa czerniaka nadaje się do wytwarzania sferoidów metodą kropli wiszącej; jednak komórki pochodzące z bardziej zaawansowanych stadiów przerzutowych guza tworzą bardziej zwarte sferoidy w porównaniu do linii komórkowych pochodzących z wczesnych stadiów progresji, np. RGP.
W przypadku niektórych komórek, w celu prawidłowego formowania sferoidów, korzystne jest zwiększenie lepkości pożywki do hodowli w kropli wiszącej. Można to osiągnąć poprzez dodanie 10 - 50% metylocelulozy do pożywki hodowlanej. Aby przygotować roztwór stokowy metylocelulozy, należy autoklawować 1,2 g metylocelulozy wraz z magnetycznym mieszadłem w 100 mL szklanej butelce. Należy dodać 100 mL podgrzanej (60 °C) pożywki i mieszać przez 20 min w temperaturze pokojowej oraz przez kolejne 1 - 2 h w temperaturze 4 °C. Roztwór stokowy należy wirować przez 2 h przy 5,000 x g, a lepki nadsącz przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
Właściwa walidacja pełnych modeli sferoidów czerniaka skóry wynika z faktu, że określona liczba sferoidów czerniaka może – przynajmniej statystycznie – zostać zintegrowana z rusztowaniem z fibroblastów skóry i kolagenu I w 1. dniu konstrukcji modelu skóry, co pozwala na ich wspólny rozwój podczas różnicowania naskórka przez kolejne 25–27 dni. Wydajność sferoidów można przeanalizować bezpośrednio po wysianiu, ponieważ sferoidy pojawiają się jako białe punkty w przezroczystym żelu dermy i są widoczne bez użycia żadnego urządzenia powiększającego (Rysunek 2). W rezultacie powstaje trójwymiarowy model skóry zawierający dojrzałe sferoidy czerniaka, które były hodowane in vitro przez łącznie około 42 dni, wykazując najwyższy poziom wewnątrznowotworowego różnicowania komórek15.
Barwienie H&amp;E modelu sferoidów czerniaka skóry ujawnia, że wygląd histologiczny i rozkład komórkowy sferoidów czerniaka są bardzo podobne do tych obserwowanych w nieunaczynionych przerzutach czerniaka do skóry człowieka in vivo15 (Rysunek 6). W tych warunkach wyraźnie rozróżnić można dwie subpopulacje komórek czerniaka: obwodową subpopulację proliferującą oraz centralną subpopulację składającą się głównie z obkurczonych komórek apoptotycznych lub nekrotycznych, tworzących tzw. centrum nekrotyczne. Immunohistochemicznie żywe i proliferujące subpopulacje można wykryć za pomocą przeciwciał przeciwko markerowi proliferacji KI-67, natomiast komórki centrum nekrotycznego można zwizualizować za pomocą barwienia TUNEL15. Taki specyficzny rozkład subpopulacji komórek nowotworowych jest uzależniony od rozmiaru sferoidu (≥500 µm), co wynika z braku składników odżywczych i tlenu w części centralnej, gdzie gromadzą się produkty przemiany materii. Postępowanie zgodnie z przedstawionym protokołem pozwoli na stworzenie wiarygodnego i powtarzalnego organotypowego modelu pełnowarstwowej skóry ludzkiej z osadzonymi sferoidami czerniaka ludzkiego, które naśladują przerzuty czerniaka do skóry człowieka. Zastosowania tego modelu obejmują testowanie leków, screening toksyn, badanie wpływu związków kosmetycznych lub terapii laserowej na wzrost czerniaka oraz jego leczenie.
<img alt="Etapy hodowli komórek w dołkach; metody zanurzeniowa i interfejsu powietrze-ciecz; schemat eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Hodowla 3D organotypowych rekonstruktów skóry w warunkach zanurzenia w medium oraz na interfejsie powietrze-ciecz. W dniu 0 pierwotne keratynocyty są wysiewane na wierzch przedziału dermalnego składającego się z pierwotnych fibroblastów zatopionych w macierzy z kolagenu typu I. Rekonstrukty skóry 3D pozostają w hodowli zanurzonej w EGM przez 7 dni, odrywają się od ścianek insertu i zaczynają się kurczyć. W dniu 8 inserty są przenoszone do płytek 6-dołkowych i hodowane na interfejsie powietrze-ciecz, aby umożliwić stratyfikację naskórka. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Kultura sferoidów nowotworowych w przedziale skórnym, mikroskopia, konfiguracja badawcza wzrostu komórek 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Sferoidy czerniaka osadzone w przedziale skórnym widoczne jako białe punkty. Podczas przygotowywania przedziału skórnego w rekonstrukcji skóry 3D do mieszaniny fibroblastów i kolagenu typu I można dodać określoną liczbę sferoidów czerniaka. Po zastygnięciu żelu skórnego sferoidy czerniaka stają się widoczne jako białe punkty.
<img alt="Schemat procesu izolacji komórek skóry; od biopsji do hodowli; próbki skóry młodzieńczej i dorosłej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat konstrukcji trójwymiarowego organotypowego modelu skóry. Usunąć tkankę tłuszczową z próbki skóry i pociąć ją na mniejsze kawałki. Inkubacja z roztworem dyspazy przez noc w temperaturze 4 °C ułatwia oddzielenie naskórka od skóry właściwej. Izolowane pierwotne fibroblasty i keratynocyty należy hodować oddzielnie i wykorzystać odpowiednio między 4. a 6. oraz 3. a 4. pasażem. Następnie można przystąpić do generowania modelu 3D skóry zgodnie z opisem w protokole. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Pełny ekwiwalent skóry w porównaniu do skóry ludzkiej; barwienie H&amp;E, keratyną, filagryną i lamininą; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Trójwymiarowe organotypowe rekonstrukcje skóry wykazują poziom zróżnicowania podobny do prawidłowej skóry ludzkiej. Przekroje parafiniowe ekwiwalentów skóry (A) w porównaniu do prawidłowej skóry ludzkiej (B) zostały zabarwione w celu wykazania ekspresji keratyn 14 (czerwony: λex 554 nm; λem 568 nm) i 10, inwolukryny (zielony: λex 490 nm; λem 525 nm), filagryny (zielony: λex 490 nm; λem 525 nm) oraz lamininy 5 (zielony: λex 490 nm; λem 525 nm), a następnie przeanalizowane za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Jądra komórkowe zwizualizowano za pomocą barwienia DAPI (niebieski: λex 340 nm; λem 488 nm). Badanie immunohistochemiczne pełnej grubości 3D ekwiwalentów skóry wykazało prawidłową stratyfikację naskórka, tworząc wyraźne warstwy naskórka, jak ma to miejsce w prawidłowej skórze ludzkiej. Podczas gdy komórki z dolnych warstw naskórka barwiły się dodatnio na keratynę 14, bardziej zróżnicowane komórki z warstwy nadbazalnej wykazywały barwienie na keratynę 10 i inwolukrynę. Silnie zróżnicowane komórki w pobliżu stratum corneum wykazywały ekspresję filagryny. Barwienie na lamininę 5 pokazuje, że powstaje błona podstawna, która fizjologicznie łączy komponent naskórkowy z dermalnym (dolny panel). Rycina została zaczerpnięta z pracy Voersmann et al.15 za zgodą autorów. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy histologii tkanki skóry, przedstawiający warstwy naskórka i skóry właściwej, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Liczby i rozmiary spontanicznie powstałych gniazd czerniaka nie można przewidzieć. De novo tworzenie gniazd czerniaka w przedziale skóry właściwej pełnych ekwiwalentów skóry można osiągnąć poprzez zmieszanie określonej liczby komórek czerniaka z pierwotnymi fibroblastami w celu osadzenia obu typów komórek w macierzy kolagenu typu I. Liczbę i rozmiar spontanicznie powstałych gniazd czerniaka można przeanalizować dopiero w dojrzałej rekonstrukcji skóry 3D po około 21 dniach. Jak pokazano na dwóch próbkach (A) i (B), liczba i rozmiary gniazd czerniaka mogą się różnić między poszczególnymi rekonstrukcjami skóry. W konsekwencji trudno jest walidować te modele i przewidzieć wpływ terapeutyczny. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat histologiczny tkanki skóry przedstawiający powiększony widok przekroju mieszka włosowego przy powiększeniu 100x." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Sferoidy czerniaka zintegrowane z ekwiwalentami skóry odtwarzają kluczowe cechy przerzutów skórnego czerniaka u ludzi. Przekroje parafinowe sferoidów nowotworowych osadzonych w ekwiwalentach skóry, barwione H&amp;E, wykazały, że sferoidy dzielą kluczowe cechy z nieunaczynionymi przerzutami skórnego czerniaka u ludzi in vivo. Wyraźnie widoczne są dwie subpopulacje komórek: obwodowa subpopulacja żywych komórek oraz centralna subpopulacja składająca się głównie z obkurczonych komórek apoptotycznych lub nekrotycznych, tworzących centrum „nekrotyczne”. Taki rozkład subpopulacji komórek nowotworowych jest warunkowany wielkością sferoidu. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Voersmann et al.15 za zgodą autorów. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Ogólnym celem tego 3D organotypowego sferoidalnego modelu skóry czerniaka jest odtworzenie zarówno architektury, jak i złożoności wielokomórkowej narządu lub guza in vivo, przy jednoczesnym uwzględnieniu systematycznej interwencji eksperymentalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad czerniakiem, takie jak interakcja guz-gospodarz i interwencja terapeutyczna. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy naśladować architekturę 3D nieunaczynionych przerzutów in vivo.Implikacje tej techniki rozciągają się na to, jaką terapię czerniaka, ponieważ odzwierciedla ona niejednorodność guza. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć problemy, ponieważ jakość komórek pierwotnych jest decydująca, a podczas procesu komórkowego nie stosuje się antybiotyków. Implikacje tej techniki rozciągają się na to, co terapia czerniaka, ponieważ odzwierciedla ona niejednorodność guza.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ bardzo ważne jest prawidłowe obchodzenie się z modelem skóry czerniaka 3D. Na początek hoduj komórki czerniaka 451LU przy użyciu pożywki RPMI zawierającej 10% FCS, zgodnie z ogólnymi protokołami hodowli komórkowych. Aby wytworzyć sferoidy czerniaka, umyj wyhodowane komórki czerniaka w PBS.Następnie dodaj pięć mililitrów jednorazowej trypsyny EDTA do PBS. Inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Dodaj pięć mililitrów RPMI zawierających 10% FCS, aby zneutralizować trypsynę.Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Wirować 200 razy g przez pięć minut, aby zebrać komórki. Ponownie zawiesić osad ogniwa w RPMI zawierający 10% FCS.Następnie policz komórki i rozcieńcz zawiesinę komórek do końcowego stężenia 10 000 komórek na mililitr. Użyj elektronicznej pipety wielofunkcyjnej, aby wykonać 40 25 mikrolitrowych plamek zawiesiny komórek na wewnętrznej powierzchni pokrywy sterylnego, nieprzywierającego 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórek. Następnie odwróć pokrywkę szybkim, płynnym ruchem i umieść ją na naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym pięć mililitrów PBS.Hoduj wiszące naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 10 do 14 dni. Pięć dni po początkowym zauważeniu kropli użyj elektronicznego dozownika, aby dodać 10 mikrolitrów RPMI zawierających 10% FCS do każdej kropli. Po 10 do 15 dniach zbierz sferoidy, delikatnie spłukując je z pokrywki PBS.Zbierz sferoidy w świeżym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórkowych. Aby wygenerować skórny odpowiednik rekonstrukcji skóry, umieść osiem mikrometrowych wkładek membranowych o wielkości porów w 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Na każdą wkładkę należy ponownie zawiesić 100 000 fibroblastów w roztworze neutralizującym żel.Następnie szybko wymieszaj zawiesinę fibroblastów z kolagenem typu jeden w stosunku jeden do trzech w końcowej objętości 500 mikrolitrów bez tworzenia pęcherzyków. Następnie za pomocą pipety dodaj zawiesinę do każdej wkładki. Wewnątrz sterylnego kaptura umieść wkładki w temperaturze pokojowej bez pożywki na 30 minut, aby żele skórne mogły się ustabilizować.Następnie przykryj żele DMEM i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji usuń DMEM z żeli skórnych i równoważ je EGM przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wytworzyć naskórkowy odpowiednik rekonstrukcji skóry. Następnie za pomocą pipety usunąć EGM z żeli.Następnie ostrożnie wysiew 100 000 keratynocytów, zawieszonych w 100 mikrolitrach EGM na wierzchu każdego żelu. Inkubuj rekonstrukcje przez półtorej godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby keratynocyty przylgnęły do żelu skórnego. Za pomocą końcówki do pipety ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładki.Następnie przykryj każdą rekonstrukcję 800 mikrolitrami EGM i hoduj przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Ostrożnie usuń resztki żelu z wewnętrznej ścianki za pomocą małej, szerokiej końcówki pipety. Ósmego dnia umieść wkładki w oddzielnych dołkach na płytce sześciodołkowej.Następnie dodaj 1,2 do 1,4 pożywki z przerzutami czerniaka do każdej studzienki, aby pokryć tylko podstawę rekonstrukcji skóry. Następnie inkubuj przez 10 do 17 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Dodaj tylko 1,2 do 1,4 ml pożywki dla czerniaka z przerzutami do każdej studzienki, aby rekonstrukcja skóry była zaopatrywana w podłoże z dna studzienki, ale nie była pokryta podłożem.Aby zintegrować sferoidy czerniaka ze skórnym odpowiednikiem pełnej rekonstrukcji skóry, użyj PBS, aby ostrożnie spłukać sferoidy z pokrywki wiszącego naczynia do hodowli komórek kroplowych. Dla każdej pełnej rekonstrukcji skóry zbierz od 10 do 20 sferoid w sterylnym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórek. Użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie usunąć nadmiar PBS.Następnie zassaj sferoidy w minimalnej objętości EGM. Następnie przenieś je do wymaganej objętości roztworu neutralizującego żel, zawierającego 100 000 fibroblastów. Dla każdej wkładki wymieszać zawiesinę sferoidalną z kolagenem typu jeden w stosunku jeden do trzech w końcowej objętości 500 mikrolitrów.Na koniec wygeneruj organotypową pełną rekonstrukcję skóry, zgodnie z opisem we wcześniej opisanym protokole. Normalna ludzka skóra jest porównywana z rekonstrukcją skóry w celu walidacji organotypowej rekonstrukcji skóry 3D. Zabarwienie hematoksyliną eozyną skrawków parafiny pokazuje, że skóra właściwa i naskórek rekonstrukcji skóry są porównywalne do tych w skórze normalnej.Normalna ludzka skóra i rekonstrukcja skóry są analizowane immunohistochemicznie w celu porównania różnicowania naskórka. Barwienie immunologiczne przeciwko markerom stratyfikacji naskórka, a mianowicie keratynie 14, keratynie 10 oraz inwolukrynie i filagrynie wskazuje na podobny poziom keratyny, niezależnie od różnicowania skóry rekonstrukcyjnej i normalnej. Barwienie immunologiczne przeciwko lamininie piątej wskazuje, że blaszka podstawna jest utworzona w celu fizjologicznego połączenia naskórkowych i skórnych odpowiedników rekonstrukcji skóry, podobnie jak w przypadku normalnej skóry.Zabarwienie eozyną hematoksyliny w sekcji parafinowej rekonstrukcji skóry sferoidalnej czerniaka wskazuje, że rozmieszczenie komórkowe sferoidów czerniaka jest podobne do rozmieszczenia nieunaczynionych ludzkich przerzutów do skóry czerniaka in vivo. W badaniu histologicznym stwierdzono obecność obwodowej subpopulacji proliferacyjnej i centralnej subpopulacji martwiczej komórek czerniaka. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 40 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby użyć ogniw pierwotnych najlepszej jakości. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się czerniakiem do zbadania reakcji in vitro w środowisku naśladującym in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować ludzki model 3D organotypowego czerniaka skóry.

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Ten film opisuje technikę generowania trójwymiarowych sferoid metodą wiszącej kropli przy użyciu komórek czerniaka. Wygenerowany in vitro trójwymiarowy (3D) organotypowy model sferoidalny czerniaka może zobrazować architekturę czerniaka złośliwego in vivo i może dać wgląd w interakcje wewnątrz guza.

Metoda wiszącej kropli: technika generowania sferoid czerniaka 3D

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Opisujemy dwie uzupełniające się metody wykorzystujące wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) oraz analizę obrazu lub cytometrię przepływową do identyfikacji i izolacji komórek w wewnętrznych obszarach zatrzymanych G1 i zewnętrznych proliferujących sferoidach 3D.

Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowego organotypowego modelu sferoidalnego czerniaka, który odwzorowuje architekturę guza in vivo. Technika ta umożliwia badanie interakcji nowotwor-zwierzę i testowanie terapii.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Przeglądaj więcej filmów