Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Ogólnym celem tego 3D organotypowego sferoidalnego modelu skóry czerniaka jest odtworzenie zarówno architektury, jak i złożoności wielokomórkowej narządu lub guza in vivo, przy jednoczesnym uwzględnieniu systematycznej interwencji eksperymentalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad czerniakiem, takie jak interakcja guz-gospodarz i interwencja terapeutyczna. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy naśladować architekturę 3D nieunaczynionych przerzutów in vivo.

Implikacje tej techniki rozciągają się na to, jaką terapię czerniaka, ponieważ odzwierciedla ona niejednorodność guza. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć problemy, ponieważ jakość komórek pierwotnych jest decydująca, a podczas procesu komórkowego nie stosuje się antybiotyków. Implikacje tej techniki rozciągają się na to, co terapia czerniaka, ponieważ odzwierciedla ona niejednorodność guza.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ bardzo ważne jest prawidłowe obchodzenie się z modelem skóry czerniaka 3D. Na początek hoduj komórki czerniaka 451LU przy użyciu pożywki RPMI zawierającej 10% FCS, zgodnie z ogólnymi protokołami hodowli komórkowych. Aby wytworzyć sferoidy czerniaka, umyj wyhodowane komórki czerniaka w PBS.

Następnie dodaj pięć mililitrów jednorazowej trypsyny EDTA do PBS. Inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Dodaj pięć mililitrów RPMI zawierających 10% FCS, aby zneutralizować trypsynę.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Wirować 200 razy g przez pięć minut, aby zebrać komórki. Ponownie zawiesić osad ogniwa w RPMI zawierający 10% FCS.

Następnie policz komórki i rozcieńcz zawiesinę komórek do końcowego stężenia 10 000 komórek na mililitr. Użyj elektronicznej pipety wielofunkcyjnej, aby wykonać 40 25 mikrolitrowych plamek zawiesiny komórek na wewnętrznej powierzchni pokrywy sterylnego, nieprzywierającego 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórek. Następnie odwróć pokrywkę szybkim, płynnym ruchem i umieść ją na naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym pięć mililitrów PBS.

Hoduj wiszące naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 10 do 14 dni. Pięć dni po początkowym zauważeniu kropli użyj elektronicznego dozownika, aby dodać 10 mikrolitrów RPMI zawierających 10% FCS do każdej kropli. Po 10 do 15 dniach zbierz sferoidy, delikatnie spłukując je z pokrywki PBS.

Zbierz sferoidy w świeżym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórkowych. Aby wygenerować skórny odpowiednik rekonstrukcji skóry, umieść osiem mikrometrowych wkładek membranowych o wielkości porów w 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Na każdą wkładkę należy ponownie zawiesić 100 000 fibroblastów w roztworze neutralizującym żel.

Następnie szybko wymieszaj zawiesinę fibroblastów z kolagenem typu jeden w stosunku jeden do trzech w końcowej objętości 500 mikrolitrów bez tworzenia pęcherzyków. Następnie za pomocą pipety dodaj zawiesinę do każdej wkładki. Wewnątrz sterylnego kaptura umieść wkładki w temperaturze pokojowej bez pożywki na 30 minut, aby żele skórne mogły się ustabilizować.

Następnie przykryj żele DMEM i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji usuń DMEM z żeli skórnych i równoważ je EGM przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wytworzyć naskórkowy odpowiednik rekonstrukcji skóry. Następnie za pomocą pipety usunąć EGM z żeli.

Następnie ostrożnie wysiew 100 000 keratynocytów, zawieszonych w 100 mikrolitrach EGM na wierzchu każdego żelu. Inkubuj rekonstrukcje przez półtorej godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby keratynocyty przylgnęły do żelu skórnego. Za pomocą końcówki do pipety ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładki.

Następnie przykryj każdą rekonstrukcję 800 mikrolitrami EGM i hoduj przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Ostrożnie usuń resztki żelu z wewnętrznej ścianki za pomocą małej, szerokiej końcówki pipety. Ósmego dnia umieść wkładki w oddzielnych dołkach na płytce sześciodołkowej.

Następnie dodaj 1,2 do 1,4 pożywki z przerzutami czerniaka do każdej studzienki, aby pokryć tylko podstawę rekonstrukcji skóry. Następnie inkubuj przez 10 do 17 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Dodaj tylko 1,2 do 1,4 ml pożywki dla czerniaka z przerzutami do każdej studzienki, aby rekonstrukcja skóry była zaopatrywana w podłoże z dna studzienki, ale nie była pokryta podłożem.

Aby zintegrować sferoidy czerniaka ze skórnym odpowiednikiem pełnej rekonstrukcji skóry, użyj PBS, aby ostrożnie spłukać sferoidy z pokrywki wiszącego naczynia do hodowli komórek kroplowych. Dla każdej pełnej rekonstrukcji skóry zbierz od 10 do 20 sferoid w sterylnym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórek. Użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie usunąć nadmiar PBS.

Następnie zassaj sferoidy w minimalnej objętości EGM. Następnie przenieś je do wymaganej objętości roztworu neutralizującego żel, zawierającego 100 000 fibroblastów. Dla każdej wkładki wymieszać zawiesinę sferoidalną z kolagenem typu jeden w stosunku jeden do trzech w końcowej objętości 500 mikrolitrów.

Na koniec wygeneruj organotypową pełną rekonstrukcję skóry, zgodnie z opisem we wcześniej opisanym protokole. Normalna ludzka skóra jest porównywana z rekonstrukcją skóry w celu walidacji organotypowej rekonstrukcji skóry 3D. Zabarwienie hematoksyliną eozyną skrawków parafiny pokazuje, że skóra właściwa i naskórek rekonstrukcji skóry są porównywalne do tych w skórze normalnej.

Normalna ludzka skóra i rekonstrukcja skóry są analizowane immunohistochemicznie w celu porównania różnicowania naskórka. Barwienie immunologiczne przeciwko markerom stratyfikacji naskórka, a mianowicie keratynie 14, keratynie 10 oraz inwolukrynie i filagrynie wskazuje na podobny poziom keratyny, niezależnie od różnicowania skóry rekonstrukcyjnej i normalnej. Barwienie immunologiczne przeciwko lamininie piątej wskazuje, że blaszka podstawna jest utworzona w celu fizjologicznego połączenia naskórkowych i skórnych odpowiedników rekonstrukcji skóry, podobnie jak w przypadku normalnej skóry.

Zabarwienie eozyną hematoksyliny w sekcji parafinowej rekonstrukcji skóry sferoidalnej czerniaka wskazuje, że rozmieszczenie komórkowe sferoidów czerniaka jest podobne do rozmieszczenia nieunaczynionych ludzkich przerzutów do skóry czerniaka in vivo. W badaniu histologicznym stwierdzono obecność obwodowej subpopulacji proliferacyjnej i centralnej subpopulacji martwiczej komórek czerniaka. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 40 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby użyć ogniw pierwotnych najlepszej jakości. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się czerniakiem do zbadania reakcji in vitro w środowisku naśladującym in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować ludzki model 3D organotypowego czerniaka skóry.