Name: Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę interferencji wzmacniacza opartą na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych. Technika ta umożliwia jednoczesne testowanie wielu wzmacniaczy regulujących ekspresję genów w badaniach genomiki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH/NHGRI R00 HG006922 i NIH/NHGRI R01 HG008974 do J.G. oraz Huntsman Cancer Institute. J.B.C. był wspierany przez NIH Training Program in Genetics T32GM007464.

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadow+enhancers+foster+robustness+of+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation.</a> Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).</li>
<li>Lam, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+redundant+enhancers+cooperatively+maintain+Mammalian+pomc+expression+above+a+critical+functional+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT%2F+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li>
<li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
<li>Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Engineering+and+Analysis+of+Combinatorial+Enhancer+Activity+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells.</a> Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).</li>
<li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li>
<li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li>
<li>Stampfel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+form+diverse+groups+with+context-dependent+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions.</a> Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Inducible+CRISPR-dCas9-KRAB+Effector+System+to+Dissect+Transcriptional+Regulation+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).</li>
<li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).</li>
<li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje prostą i elastyczną metodę analizy funkcji wzmacniacza w endogennym locus genomu bez fizycznej zmiany sekwencji DNA. Chociaż Enhancer-i jest podobny w koncepcji do wcześniej opublikowanych protokołów interferencyjnych CRISPR wykorzystujących dCas9-KRAB27, różni się od tych protokołów na 3 główne sposoby. Po pierwsze, Enhancer-i wykorzystuje domenę oddziałującą SIN3A MAD120 w celu uzyskania dezaktywacji wzmacniacza. Dezaktywację wzmacniacza można uratować za pomocą inhibitorów HDAC, co sugeruje, że główny mechanizm dezaktywacji jest zależny od HDAC. W przeciwieństwie do interferencji CRISPR z dCas9-KRAB, Enhancer-i nie prowadzi do osadzania się H3K9me3. Jest to prawdopodobnie spowodowane faktem, że Enhancer-i opiera się na przejściowym wprowadzeniu przewodnikowych RNA, przy czym komórki są zbierane 3 dni po transfekcji. W interferencji CRISPR wzrost H3K9me3 obserwuje się po 7 dniach od transdukcji12. Wreszcie, protokół Enhancer-i zapewnia strategię kierowania na wiele witryn jednocześnie i monitorowania skuteczności kierowania. W Mosaic-seq17, dCas9-KRAB jest używany do jednoczesnego celowania w wiele wzmacniaczy, ale technika ta opiera się na sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki w celu identyfikacji zmian ekspresji, a wiele genów (takich jak geny reagujące na estrogeny) pozostaje niewykrytych ze względu na niską czułość sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Enhancer-i zapewnia wiarygodną metodę badania wzmacniaczy indywidualnie i w połączeniu dla dowolnego genu.
Najbardziej krytycznym etapem Enhancer-i jest transfekcja, która powinna być zoptymalizowana pod kątem interesującej nas linii komórkowej. Protokół ten opiera się na leczeniu puromycyną w celu wzbogacenia dla transfekowanych komórek, ale możliwe jest, że kotransfekcja przewodnikowych RNA z białkiem fluorescencyjnym i sortowanie komórek fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej może okazać się lepszą metodą wzbogacania dla niektórych typów komórek. Zalecamy monitorowanie poziomu ekspresji przewodnikowych RNA i SID4x-dCas9-KRAB za pomocą qPCR w celu rozwiązania problemów i potwierdzenia transfekcji. Jeśli poziomy przewodnikowego RNA są niskie (próg cyklu >30), użytkownicy mogą również rozważyć alternatywne strategie produkcji przewodnikowego RNA, takie jak transkrypcja in vitro 28. Możliwe jest również, że pomimo wysokich poziomów gRNA, celowanie w białko SID4x-dCas9-KRAB w przewodnikowym RNA jest nieefektywne, w takim przypadku może być konieczny wybór różnych sekwencji przewodnika RNA. Wykonując sekwencję ChIP-seq na białku fuzyjnym z chromatyną z komórek leczonych Enhancer-i, można monitorować skuteczność celowania. Jeśli w regionie zainteresowania występuje wysoki sygnał SID4x-dCas9-KRAB i nie zostaną wykryte żadne zmiany ekspresji w jego domniemanym genie docelowym, oznacza to, że region prawdopodobnie nie przyczynia się do ekspresji tego genu w badanych warunkach.
Jednym z potencjalnych ograniczeń Enhancer-i jest to, że efekty off-target mogą się kumulować, jeśli zbyt wiele miejsc jest celowanych jednocześnie. Niemniej jednak strategie interferencji CRISPR w celu knockdownu mają mniej efektów poza celem niż RNAi29, szczególnie gdy używana jest poliklonalna linia komórkowa eksprymująca dCas9-KRAB. Chociaż zaobserwowaliśmy niedocelowe wiązanie genomowe SID4X-dCas9-KRAB podczas jednoczesnego celowania w 10 miejsc, nie zidentyfikowaliśmy zmian ekspresji genów w wyniku tych zdarzeń wiązania. Ponieważ niektóre wzmacniacze mogą kontaktować się z wieloma promotorami i / lub innymi wzmacniaczami, możliwe jest, że wiele genów może zmienić ekspresję po skierowaniu na pojedynczy wzmacniacz, chociaż nie jest jasne, czy ta forma regulacji genów jest powszechna. Aby potwierdzić, że zaobserwowane zmiany ekspresji są spowodowane celowaniem w określony wzmacniacz, a nie efektami niezamierzonymi, użytkownicy mogą wykonać Enhancer-i z dwoma odrębnymi zestawami nienakładających się przewodnikowych RNA ukierunkowanych na ten sam region. Ponadto genetyczna delecja regionu za pomocą kompetentnego nukleazy Cas9 może dodatkowo potwierdzić jego wpływ na ekspresję genów.
Ponieważ Enhancer-i działa poprzez deacetylację histonów, możliwe jest, że jego zdolności dezaktywacji są ograniczone do wzmacniaczy, które mają znaczny poziom acetylacji histonów. Istnieje wiele alternatywnych fuzji represyjnych, które mogą być bardziej skuteczne w ukierunkowaniu na określone wzmacniacze. Fuzje metylotransferazy DNA z dCas9 mogą być stosowane w celu zmniejszenia ekspresji genów, gdy są ukierunkowane na dystalne wzmacniacze30, ale ta represja często nie jest przejściowa. Inna fuzja represyjna wykorzystuje domenę Przyjaciela GATA1 (FOG1), która prowadzi do trimetylacji histonu H3 lizyny 27 i hamuje ekspresję genów na poziomach podobnych do dCas9-KRAB w różnych liniach komórkowych i promotorach31. Co ciekawe, dodanie większej liczby kopii FOG1 do dCas9 zmniejszyło potencjał represyjny u promotorów, co sugeruje, że pojedyncza kopia domeny SID może zapewnić większą dezaktywację wzmacniacza niż 4 kopie obecnie używane w Enhancer-i. Możliwe, że niektóre loci mogą skorzystać z podwójnego celowania przez różne kombinacje powyższych fuzji dCas9. Na przykład, stabilną długotrwałą represję można osiągnąć poprzez jednoczesną transdukcję dCas9-DNMT3a i dCas9-KRAB32. Większość z tych represyjnych fuzji była ukierunkowana tylko na jedno locus na raz i pozostaje niejasne, który z nich jest najbardziej skuteczny w manipulowaniu wieloma wzmacniaczami jednocześnie.
Enhancer-i, choć jest odpowiednią metodą do badania kombinacji wzmacniaczy dla kilku genów, jest nadal nieco ograniczony pod względem przepustowości, jeśli użytkownik chce badać domniemane wzmacniacze dla setek genów. Przyszłe zastosowania tej techniki będą obejmować technologie oparte na obrazowaniu w celu ilościowego oznaczania wielu genów w wielu próbkach jednocześnie. Co ważne, technologie te są kompatybilne z bezpośrednią detekcją cząsteczek RNA z lizatu, eliminując potrzebę czasochłonnej izolacji RNA. Te adaptacje ułatwią przesłuchiwanie większych zestawów wzmacniaczy.

Duże projekty sekwencjonowania, takie jak ENCODE1, Roadmap Epigenomics2, oraz FANTOM3 zidentyfikowały miliony domniemanych wzmacniaczy w ludzkim genomie w setkach typów komórek. Szacuje się, że każdy promotor kojarzy się ze średnio 4,9 wzmacniaczami, a każdy wzmacniacz kontaktuje się średnio z 2,4 genami3, co sugeruje, że ekspresja genów jest często wynikiem integracji wielu rozproszonych interakcji regulacyjnych. Istotnym wyzwaniem pozostaje nie tylko określenie, w jaki sposób poszczególne wzmacniacze przyczyniają się do ekspresji genów, ale także w jaki sposób łączą się, aby wpływać na ekspresję. Podejścia genetyczne są powszechnie stosowane do identyfikacji relacji między wzmacniaczami w organizmach modelowych od Drosophila4 do myszy5. Jednak eksperymenty te są czasochłonne i niskoprzepustowe w przypadku badania wielu wzmacniaczy w wielu genach.
Jednym z podejść do badania funkcji wzmacniacza na dużą skalę są masowo równoległe testy reporterowe. Testy te pozwalają na jednoczesne badanie przesiewowe tysięcy sekwencji DNA pod kątem ich zdolności do kierowania ekspresją genu reporterowego6. Chociaż testy te wykazały, że sekwencja DNA sama w sobie może być wystarczająca do przekazania informacji o regulacji genów7, wiążą się one z zastrzeżeniami dotyczącymi ich przeprowadzania poza kontekstem natywnej chromatyny i z heterologicznym promotorem. Ponadto rozmiar sekwencji DNA analizowanej w masowo równoległych testach reporterowych jest zwykle mniejszy niż 200 par zasad, co może wykluczać odpowiednią sekwencję otaczającą. Co ważne, ponieważ testy reporterowe mierzą aktywność tylko jednej sekwencji na raz, nie uwzględniają złożonych relacji, które mogą istnieć między wzmacniaczami. Tak więc, podczas gdy masowo równoległe testy reporterowe mogą informować o wewnętrznej aktywności sekwencji DNA, niekoniecznie informują nas o funkcji tej sekwencji DNA w kontekście genomu.
Ostatnio opracowane narzędzia CRISPR/Cas98 ułatwiły badania nad regulacją genów, ponieważ pozwalają na delecję wzmacniaczy w endogennym locus. Jednak usunięcie wielu wzmacniaczy jednocześnie może prowadzić do niestabilności genomu, a generowanie kolejnych delecji wzmacniaczy w jednej linii komórkowej jest czasochłonne. Ponadto w miejscu delecji po naprawie tworzona jest nowa sekwencja genomowa, która może zyskać funkcję regulacyjną. Alternatywna wersja Cas9 została opracowana specjalnie do modulowania ekspresji genów, opierając się na fuzjach domen activating9,10 lub repressing11,12 do formy Cas9 (dCas9) z niedoborem nukleazy. Te białka fuzyjne są idealne do jednoczesnego badania wielu loci, ponieważ nie zmieniają fizycznie sekwencji DNA, a zamiast tego modulują epigenetykę w celu zbadania regionu regulatorowego. Najczęściej stosowaną fuzją represyjną jest KRAB, która rekrutuje kompleks korepresorowy KAP1, promując odkładanie się trymetylacji histonu H3 lizyny 9 związanego z represją (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, znany również jako interferencja CRISPR14, był używany do celowania i badania przesiewowego poszczególnych wzmacniaczy pod kątem ich wkładu w ekspresję genów15,16; Nie został jednak zoptymalizowany pod kątem jednoczesnego kierowania na wiele regionów. Jedna z wersji multipleksowej interferencji CRISPR dla wzmacniaczy, Mosaic-seq17, wykorzystuje sekwencję RNA pojedynczej komórki jako odczyt, ale ta technologia jest droga i nadaje się tylko do badania genów o wysokiej ekspresji ze względu na niską czułość sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.
Staraliśmy się opracować metodę opartą na interferencji CRISPR do analizy funkcji wzmacniacza kombinatorycznego w kontekście odpowiedzi transkrypcyjnej na estrogen. Około połowa genów reagujących na estrogen zawiera 2 lub więcej wzmacniaczy związanych przez receptor estrogenowy alfa (ER) w pobliżu18, co sugeruje, że wiele wzmacniaczy może uczestniczyć w odpowiedzi estrogenowej, a zrozumienie logiki regulacyjnej wymagałoby jednoczesnego ukierunkowania na wiele wzmacniaczy. Ponieważ wstępne badania z wykorzystaniem interferencji CRISPR u promotorów sugerowały, że nie wszystkie promotory są jednakowo wrażliwe na represję za pośrednictwem KRAB19, doszliśmy do wniosku, że dodanie odrębnej domeny represyjnej do dCas9 może ułatwić dezaktywację różnych wzmacniaczy. Wybraliśmy domenę interaktywną Sin3a z Mad1 (SID)20, ponieważ prowadzi to do rekrutacji deacetylaz histonowych21, które usuwają grupy acetylowe na histonach, które są związane z aktywnością transkrypcyjną. Co ważne, domena SID była skuteczna w zmniejszaniu ekspresji genów po połączeniu z dCas922 i TALEs23, a Sin3a okazał się silnym represyjnym kofaktorem w różnych kontekstach sekwencji wzmacniacza24. Użyliśmy SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i), aby celować w 10 różnych wzmacniaczy związanych przez ER i zidentyfikować miejsca wiązania ER (ERBS), które są niezbędne do odpowiedzi transkrypcyjnej estrogenu w 4 genach18. Skupiliśmy się również na kombinacjach wzmacniaczy, aby zidentyfikować miejsca, które współpracują w produkcji estrogenowej odpowiedzi transkrypcyjnej. Odkryliśmy, że nawet 50 miejsc może być potencjalnie atakowanych jednocześnie z wykrywalnymi zmianami ekspresji genów. Korzystając z ChIP-seq i RNA-seq, wykazaliśmy, że Enhancer-i jest wysoce specyficzną techniką do jednoczesnego badania wielu wzmacniaczy.
W tym protokole opisujemy kroki związane z wykonywaniem Enhancer-i, elastycznej techniki, która umożliwia funkcjonalne badanie wielu wzmacniaczy jednocześnie w warunkach hodowli tkankowej. Enhancer-i jest silnie skorelowany z delecją genetyczną, ale zapewnia przejściową dezaktywację, która jest zależna od deacetylaz histonowych (HDAC). Dostarczając przewodnikowe RNA poprzez transfekcję przejściową, w przeciwieństwie do stabilnej integracji za pośrednictwem wektorów wirusowych, protokół ten pozwala uniknąć osadzania się i potencjalnego rozprzestrzeniania się H3K9me3. Protokół ten szczegółowo opisuje projektowanie i klonowanie RNA za pomocą montażu Gibsona, transfekcję przewodnikowych RNA za pomocą lipofekcji oraz analizę wynikowych zmian ekspresji genów za pomocą qPCR. Uwzględniamy również metody oceny swoistości celowania w Enhancer-i na poziomie genomu i transkryptomu. Chociaż technika ta została opracowana do badania regulacji genów przez wzmacniacze związane z ER w ludzkich liniach komórkowych raka, ma ona zastosowanie do sekcji dowolnego wzmacniacza ssaków.

<table><tbody><tr><td>ZR 96-dołkowy zestaw Quick-RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Zielony RNA-to-CT 1-etapowy</td><td>stosowany biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>enzym restrykcyjny AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA Czyste & Zestaw koncentratora</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek: komórki Ishikawy</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac królik poliklonalny</td><td>Motyw aktywny&nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 królik poliklonalny</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Mysz FLAG monoklonalna</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER alfa królik poliklonalny</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro</td><td>plazmid Addgene&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen i wsp., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector plazmid</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali i wsp., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 plazmid puromycyny</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton i wsp., 2017</td></tr><tr><td>Addgene plazmid SID4X-dCas9-KRAB</td><td>&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton i wsp., 2017</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana bez DNazy/RNaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, z koralikami wychwytującymi mRNA KAPA</td><td>Biosytemy Kapa</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Inhibitor proteazy i fosfatazy Mini tabletki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Selektywny antybiotyk Geneticin (siarczan G418) (50 mg / ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep</td><td>Kit Zymo Research</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Szybko ładowana fioletowa drabina DNA z 2 kłódami</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie crispr w liniach komórkowych

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Wiele wzmacniaczy często reguluje dany gen, jednak dla większości genów nie jest jasne, które wzmacniacze są niezbędne do ekspresji genów i jak te wzmacniacze łączą się, aby wytworzyć odpowiedź transkrypcyjną. Ponieważ zidentyfikowano miliony wzmacniaczy, potrzebne są narzędzia o wysokiej przepustowości, aby określić funkcję wzmacniacza w skali całego genomu. Obecne metody badania funkcji wzmacniacza obejmują tworzenie delecji genetycznych przy użyciu Cas9 biegłego w nukleazie, ale trudno jest badać kombinatoryczne efekty wielu wzmacniaczy przy użyciu tej techniki, ponieważ należy wygenerować wiele kolejnych klonalnych linii komórkowych. Tutaj przedstawiamy Enhancer-i, metodę opartą na interferencji CRISPR, która pozwala na funkcjonalne badanie wielu wzmacniaczy jednocześnie w ich endogennych loci. Enhancer-i wykorzystuje dwie domeny represyjne połączone z niedoborem nukleazy Cas9, SID i KRAB, aby osiągnąć dezaktywację wzmacniacza poprzez deacetylację histonów w docelowych loci. Protokół ten wykorzystuje przejściową transfekcję przewodnikowych RNA, aby umożliwić przejściową inaktywację docelowych regionów i jest szczególnie skuteczny w blokowaniu indukowalnych odpowiedzi transkrypcyjnych na bodźce w warunkach hodowli tkankowej. Enhancer-i jest wysoce specyficzny zarówno pod względem ukierunkowania genomowego, jak i wpływu na globalną ekspresję genów. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu pomagają zrozumieć, czy wzmacniacz przyczynia się do ekspresji genów, wielkość tego wkładu oraz jak wpływają na ten wkład inne pobliskie wzmacniacze.

Rysunek 1 przedstawia schemat przepływu pracy opisany w protokole. Aby określić wkład enhancerów związanych z ER w pobliżu regulowanego przez estrogeny genu MMP17, który posiada 3 pobliskie miejsca wiązania zdefiniowane za pomocą ChIP-seq (Rysunek 2A), zaprojektowano gRNA dla każdego z tych regionów. W celu zaprojektowania gRNA wybrano okno sekwencji o długości 600 - 900 bp otaczające każde interesujące miejsce wiązania ER i wprowadzono je do programu do projektowania gRNA. Wynikowe sekwencje gRNA z 0-2 przewidywanymi miejscami off-target zostały dopasowane do ludzkiego genomu przy użyciu BLAT. Do targetowania wybrano cztery niezachodzące na siebie gRNA, które obejmowały region zdefiniowany przez ChIP-seq i nadwrażliwość na DNaseI (Rysunek 2B). Na każdym końcu dodano dodatkową sekwencję (Tabela 1), aby ułatwić późniejszy klonowanie, a następnie zamówiono otrzymane fragmenty o długości 59 nukleotydów. Po otrzymaniu gRNA zostały rozcieńczone i połączone w pule według miejsc, a następnie przeprowadzono krótką reakcję PCR w celu dodania regionów homologii przed montażem Gibsona. Rysunek 2C pokazuje oczekiwany produkt gRNA po krótkiej reakcji PCR z użyciem starterów „U6_internal” (Tabela 1), co dodaje 20 par zasad sekwencji na każdym końcu 59-pzp fragmentu gRNA, dając w efekcie sekwencję o długości ~100 pzp. Po montażu Gibsona pule gRNA przetransformowano do bakterii, a następnego dnia przygotowano miniprepy plazmidów. Rysunek 2D przedstawia wyniki eksperymentu z analizy enhancerów, w którym wiele enhancerów w pobliżu MMP17 jest targetowanych pojedynczo oraz w kombinacjach przy użyciu Enhancer-i. Miejsca targetowane przez Enhancer-i są oznaczone czarnym sześciokątem. Plazmidy gRNA targetujące wskazane miejsca przetransformowano do linii komórkowej Ishikawa pozbawionej estrogenów, stabilnie wykazującej ekspresję SID4X-dCas9-KRAB. Dwa dni później zmieniono medium i dodano puromycynę, aby wzbogacić populację o komórki przetransformowane. Następnego dnia komórki zebrano po 8 h traktowaniu 10 nM estradiolu. Izolowano RNA i przeprowadzono jednokrokowy qPCR. W tym przykładzie miejsca 1 i 2 są niezbędne do pełnej odpowiedzi estrogenowej MMP17, podczas gdy miejsce 3 nie wykazuje wkładu w tych warunkach (Rysunek 2D, ścieżki ii-iv). Gdy aktywne są tylko miejsca 2 lub 3 (vi i vii), odpowiedź na estrogen jest podobna do sytuacji, gdy żadne miejsca nie są aktywne (viii), co sugeruje, że miejsca te nie mogą przyczyniać się do ekspresji niezależnie. Miejsce 1 może samoistnie przyczyniać się do pewnego poziomu ekspresji (v), ale największą aktywność obserwuje się, gdy aktywne są miejsca 1 i 2 (iv).
Aby jednocześnie manipulować 10 enhancerami w pobliżu 4 różnych genów (Ryc. 3A), utworzono złożone pule gRNA zawierające 42 przewodniki dla enhancerów i 16 przewodników dla promotorów. Oligonukleotydy gRNA połączono w pule przed wstępną reakcją PCR w celu wydłużenia gRNA (Krok 3.3), a otrzymane produkty PCR oczyszczono i połączono z pustym wektorem klonującym puromycyny U6 za pomocą metody Gibson assembly. Po przeprowadzeniu Gibson assembly wykonano i wysiano wiele niezależnych transformacji. Płytki zeskrobano do medium LB i inkubowano przez 2 - 4 h przed przeprowadzeniem maxiprepu. Ryc. 3B przedstawia reprezentatywne spadki ekspresji genów określone za pomocą qPCR, gdy pule gRNA przetransfekowano do linii komórkowej Ishikawa pozbawionej estrogenu, stabilnie wykazującej ekspresję SID4X-dCas9-KRAB i traktowanej zgodnie z powyższym opisem (Ryc. 2D). Spadki wywołane przez Enhancer-i są podobne do tych uzyskanych poprzez celowanie w promotor domniemanego genu docelowego. Ryc. 3C pokazuje wpływ rozcieńczenia gRNA na redukcję odpowiedzi na estrogen z wykorzystaniem Enhancer-i. Rozcieńczenie 1:50 puli gRNA celującej w enhancer w pobliżu G0S2 nadal prowadzi do istotnej redukcji ekspresji genu, co sugeruje, że Enhancer-i może być stosowany do jednoczesnego celowania w maksymalnie 50 miejsc. Jednakże efekt dezaktywacji może zostać zniesiony przez rozcieńczenie, co wskazuje, że nie można jednocześnie celować w setki miejsc, chyba że zastosuje się bardziej czułe metody detekcji.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Schemat protokołu dla multipleksowej analizy enhancerów przy użyciu Enhancer-i. Przewodniki RNA (czerwone i niebieskie) są projektowane za pomocą narzędzia e-crisp i wybierane z wykorzystaniem przeglądarki genomu UCSC. Wybierane są cztery gRNA obejmujące regiony zainteresowania (miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych zdefiniowane przez ChIP-seq). Oligonukleotydy gRNA, zgrupowane według regionu zainteresowania (czerwone i niebieskie), są poddawane reakcji PCR w celu dodania regionów homologii (pomarańczowe) przed montażem Gibsona i transformacją. Powstałe pule plazmidów są transfekowane metodą lipofekcji do linii komórkowych stabilnie ekspresujących SID4X-dCas9-KRAB lub do komórek typu dzikiego wraz z plazmidem SID4X-dCas9-KRAB. Pule plazmidów gRNA mogą być transfekowane pojedynczo w celu celowania w jedno miejsce na raz lub w kombinacjach w celu jednoczesnego celowania w wiele miejsc. Transfekowane komórki są traktowane antybiotykami w celu wzbogacenia populacji komórek zawierających gRNA. Około 72 h po transfekcji komórki są zbierane. Kwasy nukleinowe mogą być ekstrahowane do analiz qPCR, RNA-seq lub ChIP-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg" /> 
Rycina 2. Projektowanie gRNA i analiza sekwencji enhancerów dla MMP17. (A) Zrzut ekranu z przeglądarki genomu przedstawiający enhancery związane z ER alfa (szare), które mają być celem w pobliżu MMP17. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Carleton et al.18. (B) Projekty gRNA dla 3 miejsc wiązania18. Celem jest miejsce wiązania ER zdefiniowane za pomocą ChIP-seq, a 4 gRNA pokrywają ten region. Sygnał wrażliwości na DNaseI, który obejmuje miejsce wiązania, może również służyć do zdefiniowania sekwencji docelowej dla projektu gRNA. Dane ChIP-seq i DNaseI HS uzyskano z komórek Ishikawa traktowanych 10 nM estradiolu przez 1 h. (C) Reprezentatywne sekwencje gRNA gotowe do montażu metodą Gibsona, po krótkiej reakcji PCR w celu dodania regionów homologii. (D) Względna ekspresja MMP17 zmierzona za pomocą qPCR po targetowaniu konkretnych regionów za pomocą Enhancer-i i 8-godzinnej inkubacji z 10 nM estradiolu. Ekspresja jest wyrażona względem CTCF oraz poziomu ekspresji MMP17 w komórkach nietraktowanych estradiolem. Kontrolne gRNA targetują promotor IL1RN. Wszystkie słupki błędów reprezentują SEM, podwójne gwiazdki oznaczają p &#60;0.01, a pojedyncze gwiazdki oznaczają p &#60;0.05 w sparowanym teście t. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Carleton et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg" /> 
Rysunek 3. Jednoczesne celowanie w wiele enhancerów w pobliżu różnych genów za pomocą puli Enhancer-i. (A) Schemat miejsc wiązania i promotorów będących celem w puli Enhancer-i. (B) Wpływ na ekspresję mierzony za pomocą qPCR po traktowaniu E2 komórek Ishikawa transfekowanych pulą plazmidów Enhancer-i (zielony), pulą plazmidów Promoter-i (niebieski) lub kontrolnymi gRNA (biały)18. W przypadku Enhancer-i obserwuje się znaczną redukcję we wszystkich genach. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Carleton et al.18. (C) Wpływ na poziomy ekspresji G0S2 po traktowaniu E2 komórek Ishikawa transfekowanych różnymi ilościami guide RNA celujących w G0S2. Znaczną redukcję można zaobserwować nawet przy niewielkich ilościach guide RNA (rozcieńczenie 1:50), co sugeruje, że jednocześnie można celować w maksymalnie 50 miejsc. Wszystkie słupki błędu reprezentują SEM, podwójne gwiazdki oznaczają p &#60;0,01, a pojedyncze gwiazdki oznaczają p &#60;0,05 w sparowanym teście t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Nazwa</td>
			<td >Sekwencja</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U6_internal_F</td>
			<td >TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U6_internal_R&#160;</td>
			<td >GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U6_PCR_F</td>
			<td >CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U6_PCR_R</td>
			<td >AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gRNA_qPCR_F</td>
			<td >GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gRNA_qPCR_R</td>
			<td >AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dCas9_qPCR_F</td>
			<td >GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dCas9_qPCR_R</td>
			<td >AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAC95_PCR_F</td>
			<td >AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAC95_PCR_R</td>
			<td >CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SID4X_PCR_F</td>
			<td >CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SID4X_PCR_R</td>
			<td >TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Startery użyte do elongacji gRNA i sekwencjonowania, qPCR oraz detekcji białka fuzyjnego.

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki i regulacji genów, takie jak to, w jaki sposób wiele regionów regulatorowych genów, znanych również jako wzmacniacze, współpracuje ze sobą w celu kontrolowania transkrypcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele wzmacniaczy w pobliżu wielu różnych genów może być testowanych jednocześnie w celu szybkiej identyfikacji regionów zaangażowanych w regulację genów. Aby rozpocząć projektowanie przewodnika RNA, najpierw wygeneruj sekwencje DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Użyj programu, takiego jak E-CRISP, na wygenerowanych sekwencjach DNA, aby znaleźć przewodnikowe RNA o niskim odchyleniu. Przewodnikowe RNA składają się z 20 nukleotydów znajdujących się przed motywem przylegającym do protospaceru, który przyjmuje postać NGG dla dCas9 z S. pyogenes. Na stronie internetowej E-CRISP wybierz interesujący Cię organizm za pomocą menu rozwijanego.Zespół genomu pojawia się po prawej stronie nazwy gatunku. Wybierz przycisk radiowy Wejście to sekwencja FASTA. Skopiuj sekwencje FASTA z góry i wklej je do okna dialogowego.Upewnij się, że nagłówek FASTA jest dołączony do każdej sekwencji. Wybierz średni przycisk radiowy i pojedynczy projekt z menu rozwijanego. Kliknij przycisk Rozpocznij wyszukiwanie pojedynczego gRNA.Otworzy się nowa karta przeglądarki i zostaną wyświetlone wyniki. Pobierz sekwencje kandydujące, klikając przycisk Pobierz raport tabelaryczny sformułowany w programie Excel dla wszystkich sekwencji zapytań razem. Następnie użyj przeglądarki genomu UCSC, aby kandydat na BLAT poprowadzić sekwencje RNA o pełnej długości do genomu.W przeglądarce przejdź do witryny internetowej przeglądarki genomu UCSC. W sekcji Nasze narzędzia znajdź słowo BLAT i kliknij na nie. Otworzy się wyszukiwarka BLAT.Użyj menu rozwijanych znajdujących się pod tekstem genomu wyszukiwania BLAT, aby wybrać interesujący organizm i zestaw genomu. Skopiuj przewodnikowe sekwencje RNA z raportu tabelarycznego wygenerowanego przez E-CRISP i wklej je do okna dialogowego. Upewnij się, że każda sekwencja ma unikatowy nagłówek FAPSA, a następnie kliknij przycisk Prześlij u dołu okna dialogowego.Na stronie wyników wyszukiwania BLAT pojawią się wyrównania każdej sekwencji przewodnika RNA, przy czym każda linia reprezentuje wyrównanie. Idealnie byłoby, gdyby dla każdego przewodnika RNA istniało jedno wyrównanie, wskazujące na unikalność tego przewodnika RNA. Jeśli to możliwe, unikaj przewodników, które mapują wiele lokalizacji w genomie.Aby sprawdzić lokalizację i dystrybucję przewodnika RNA w regionie zainteresowania, kliknij łącze przeglądarki w sekcji Działania dla jednego z poszukiwanych przewodnikowych RNA. Pojawi się przeglądarka genomu, która zostanie wyśrodkowana na wybranym przewodniku RNA. Użyj przycisków pomniejszania u góry strony, aby zobrazować rozkład innych przewodników RNA zidentyfikowanych przez E-CRISP w obszarze zainteresowania.Wybierz cztery, najlepiej nienakładające się, przewodnikowe RNA, które są rozmieszczone w całym regionie zainteresowania. Jeśli obszar zainteresowania przekracza 600 par zasad, rozważ dodanie jednego lub dwóch dodatkowych przewodników. Należy unikać przewodników RNA o rozciągnięciu homopolimerowym i ekstremalnej zawartości GC, ponieważ te cechy mogą utrudniać proces klonowania przewodnika RNA i zmniejszać skuteczność celowania w przewodnikowe RNA.Rozpuść przewodnikowe oligonukleotydy RNA w końcowym stężeniu 100 mikromolów w ultraczystej wodzie. Dla każdego regionu zainteresowania powinny istnieć co najmniej cztery oddzielne oligonukleotydy przewodnika RNA. Dla każdego regulacyjnego regionu zainteresowania utwórz pulę wszystkich oligonukleotydów odpowiadających regionowi zainteresowania.W probówce Eppendorfa połącz pięć mikrolitrów każdego odtworzonego oligo przewodnika RNA dla każdego regionu. Dobrze wymieszaj basen przez wirowanie, a następnie usuń jeden mikrolitr i rozcieńcz ten elokwat od 1 do 200 w ultraczystej wodzie. Wykonaj krótki PCR ze starterami USICS, aby przyłączyć regiony homologii do oligonukleotydów, jak opisano w protokole tekstowym.Około 40 zasad zostanie dodanych do każdego oligonukleotydu, co da około 100 iloczynów par zasad, który zawiera wystarczającą homologię do widma USIC na obu końcach. Następnie ustaw reakcje zespołu Gibsona na lodzie. Użyj 50 nanogramów strawionego wektora i siedmiu nanogramów wkładki w reakcji 20 mikrolitrów.Skonfiguruj również reakcję zespołu Gibsona tylko z trawionym wektorem, używając 50 nanogramów wektora i zastępując wkładkę wodą. Inkubować reakcje zespołu Gibsona przez 15 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po przeniesieniu zmontowanych produktów na lód, rozcieńcz je od 1 do 4 w ultra czystej wodzie na lodzie.Na przykład dodaj pięć mikrolitrów produktu Gibson Assembly do 15 mikrolitrów ultraczystej wody. Następnie przekształć rozcieńczone produkty Gibson Assembly. Upuść kompetentne komórki o wysokiej wydajności na lód i wykonaj 25 mikrolitrów elokwatów na każdą transformację.Jeśli pożądana jest złożona pula ukierunkowana na wiele lokalizacji, umieść wystarczającą liczbę komórek w różnych probówkach, aby wykonać wiele niezależnych transformacji. Umieść na płytce 50 mikrolitrów przekształconych komórek i umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. W przypadku mini-przygotowań basenów ukierunkowanych na poszczególne miejsca, umieść komórki bezpośrednio w trzech do pięciu mililitrach bulionu LB zawierającego ampicylinę lub karbenicylinę.Inkubuj komórki przez noc, wytrząsając przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. W przypadku dużych bibliotek użyj skrobaka do płytek, aby zebrać wszystkie kolonie z każdej pojedynczej płytki w jednym maxi-prep. Można to ułatwić, wlewając około pięciu mililitrów LB z odpowiednim antybiotykiem do 15-mililitrowej probówki Falcon i zeskrobując kolonie do probówki.Dzień przed transfekcją umieść komórki na 24-dołkowej płytce, przy 30 do 50% konfluencji. Płytkować wystarczającą liczbę komórek tak, aby transfekcje można było wykonywać w dwóch egzemplarzach, i zawierać studzienki do transfekcji za pomocą kontrolnych przewodnikowych RNA. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience, delikatnie potrząsając płytką po posianiu komórek.Wstrząsaj co pięć minut przez pierwsze 15 minut. Następnego dnia przygotuj transfekcję zgodnie z instrukcją wybranego odczynnika do transfekcji. W przypadku komórek Ishikawy użyj 550 nanogramów całkowitego plazmidu na każdą studzienkę 24-dołkowej płytki.Rozcieńczyć plazmidy do końcowego stężenia 020 mikrogramów na mililitr w pożywce bez surowicy. Użyj trzech mikrolitrów odczynnika do transfekcji na każdy mikrogram DNA, delikatnie wiruj i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 25 mikrolitrów końcowej mieszanki do każdej studzienki.Przygotować odpowiednią objętość buforu do lizy z 1% beta-merkaptoetanolem. Zassać pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego. Umyj komórki raz równą objętością 1x PBS i odessać, aby usunąć jak najwięcej PBS.Dodaj 300 mikrolitrów roztworu BME do lizy do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Pipetować roztwór do lizy w górę i w dół osiem do dziesięciu razy i przenieść na płytkę z głębokim dołkiem lub 1,7 mililitrowe probówki Eppendorfa na lodzie. RNA można wyekstrahować natychmiast lub lizaty można zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przyszłego przetworzenia.Przedstawiono projekty przewodnikowego RNA dla trzech miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego w pobliżu MMP17. Region docelowy jest miejscem wiązania dla ER alfa zgodnie z definicją ChiP-seq, a cztery przewodnikowe RNA kafelkują się w tym regionie. Pokazano tutaj oczekiwany produkt przewodnika RNA po krótkim PCR, przy użyciu wewnętrznych starterów USIC.Reakcja doda 20 par zasad sekwencji do każdego końca 59 par zasad przewodnika RNA, co daje około 100 par par zasad. Przedstawiono jakościowe wyniki PCR z eksperymentu Enhancer-I przy MMP17. Miejsca, na które atakowany jest Enhancer-I, są oznaczone czarnym sześciokątem.Miejsca 1 i 2 są niezbędne do pełnej odpowiedzi estrogenowej MMP17, podczas gdy miejsce 3 nie przyczynia się. Witryna 1 może sama w sobie przyczynić się do pewnej ekspresji, ale największą aktywność obserwuje się, gdy witryny 1 i 2 są aktywne. Po zoptymalizowaniu pod kątem interesującej nas linii komórkowej, technikę tę można wykonać w ciągu pięciu do siedmiu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować przewodnikowe RNA dla Enhancer-I, tworzyć i transfekować złożone pule przewodników RNA oraz zbierać transfekowane komórki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać sterylne środowisko hodowli tkankowej i używać materiałów wolnych od RNaz i DNaz. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak ChiP-seq i RNA-seq, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak miejsce w genomie wiązania Enhancer-I i jak wpływa to na globalną ekspresję genów.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania indukowanej estrogenem regulacji genów w endogennych loci w ludzkim genomie, zamiast stosowania reporterów epizodycznych. Nie zapominaj, że praca w warunkach hodowli tkankowej ssaków może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę interferencji wzmacniacza opartą na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych. Technika ta umożliwia jednoczesne testowanie wielu wzmacniaczy regulujących ekspresję genów w badaniach genomiki.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Przeglądaj więcej filmów