Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki i regulacji genów, takie jak to, w jaki sposób wiele regionów regulatorowych genów, znanych również jako wzmacniacze, współpracuje ze sobą w celu kontrolowania transkrypcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele wzmacniaczy w pobliżu wielu różnych genów może być testowanych jednocześnie w celu szybkiej identyfikacji regionów zaangażowanych w regulację genów. Aby rozpocząć projektowanie przewodnika RNA, najpierw wygeneruj sekwencje DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Użyj programu, takiego jak E-CRISP, na wygenerowanych sekwencjach DNA, aby znaleźć przewodnikowe RNA o niskim odchyleniu. Przewodnikowe RNA składają się z 20 nukleotydów znajdujących się przed motywem przylegającym do protospaceru, który przyjmuje postać NGG dla dCas9 z S. pyogenes. Na stronie internetowej E-CRISP wybierz interesujący Cię organizm za pomocą menu rozwijanego.

Zespół genomu pojawia się po prawej stronie nazwy gatunku. Wybierz przycisk radiowy Wejście to sekwencja FASTA. Skopiuj sekwencje FASTA z góry i wklej je do okna dialogowego.

Upewnij się, że nagłówek FASTA jest dołączony do każdej sekwencji. Wybierz średni przycisk radiowy i pojedynczy projekt z menu rozwijanego. Kliknij przycisk Rozpocznij wyszukiwanie pojedynczego gRNA.

Otworzy się nowa karta przeglądarki i zostaną wyświetlone wyniki. Pobierz sekwencje kandydujące, klikając przycisk Pobierz raport tabelaryczny sformułowany w programie Excel dla wszystkich sekwencji zapytań razem. Następnie użyj przeglądarki genomu UCSC, aby kandydat na BLAT poprowadzić sekwencje RNA o pełnej długości do genomu.

W przeglądarce przejdź do witryny internetowej przeglądarki genomu UCSC. W sekcji Nasze narzędzia znajdź słowo BLAT i kliknij na nie. Otworzy się wyszukiwarka BLAT.

Użyj menu rozwijanych znajdujących się pod tekstem genomu wyszukiwania BLAT, aby wybrać interesujący organizm i zestaw genomu. Skopiuj przewodnikowe sekwencje RNA z raportu tabelarycznego wygenerowanego przez E-CRISP i wklej je do okna dialogowego. Upewnij się, że każda sekwencja ma unikatowy nagłówek FAPSA, a następnie kliknij przycisk Prześlij u dołu okna dialogowego.

Na stronie wyników wyszukiwania BLAT pojawią się wyrównania każdej sekwencji przewodnika RNA, przy czym każda linia reprezentuje wyrównanie. Idealnie byłoby, gdyby dla każdego przewodnika RNA istniało jedno wyrównanie, wskazujące na unikalność tego przewodnika RNA. Jeśli to możliwe, unikaj przewodników, które mapują wiele lokalizacji w genomie.

Aby sprawdzić lokalizację i dystrybucję przewodnika RNA w regionie zainteresowania, kliknij łącze przeglądarki w sekcji Działania dla jednego z poszukiwanych przewodnikowych RNA. Pojawi się przeglądarka genomu, która zostanie wyśrodkowana na wybranym przewodniku RNA. Użyj przycisków pomniejszania u góry strony, aby zobrazować rozkład innych przewodników RNA zidentyfikowanych przez E-CRISP w obszarze zainteresowania.

Wybierz cztery, najlepiej nienakładające się, przewodnikowe RNA, które są rozmieszczone w całym regionie zainteresowania. Jeśli obszar zainteresowania przekracza 600 par zasad, rozważ dodanie jednego lub dwóch dodatkowych przewodników. Należy unikać przewodników RNA o rozciągnięciu homopolimerowym i ekstremalnej zawartości GC, ponieważ te cechy mogą utrudniać proces klonowania przewodnika RNA i zmniejszać skuteczność celowania w przewodnikowe RNA.

Rozpuść przewodnikowe oligonukleotydy RNA w końcowym stężeniu 100 mikromolów w ultraczystej wodzie. Dla każdego regionu zainteresowania powinny istnieć co najmniej cztery oddzielne oligonukleotydy przewodnika RNA. Dla każdego regulacyjnego regionu zainteresowania utwórz pulę wszystkich oligonukleotydów odpowiadających regionowi zainteresowania.

W probówce Eppendorfa połącz pięć mikrolitrów każdego odtworzonego oligo przewodnika RNA dla każdego regionu. Dobrze wymieszaj basen przez wirowanie, a następnie usuń jeden mikrolitr i rozcieńcz ten elokwat od 1 do 200 w ultraczystej wodzie. Wykonaj krótki PCR ze starterami USICS, aby przyłączyć regiony homologii do oligonukleotydów, jak opisano w protokole tekstowym.

Około 40 zasad zostanie dodanych do każdego oligonukleotydu, co da około 100 iloczynów par zasad, który zawiera wystarczającą homologię do widma USIC na obu końcach. Następnie ustaw reakcje zespołu Gibsona na lodzie. Użyj 50 nanogramów strawionego wektora i siedmiu nanogramów wkładki w reakcji 20 mikrolitrów.

Skonfiguruj również reakcję zespołu Gibsona tylko z trawionym wektorem, używając 50 nanogramów wektora i zastępując wkładkę wodą. Inkubować reakcje zespołu Gibsona przez 15 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po przeniesieniu zmontowanych produktów na lód, rozcieńcz je od 1 do 4 w ultra czystej wodzie na lodzie.

Na przykład dodaj pięć mikrolitrów produktu Gibson Assembly do 15 mikrolitrów ultraczystej wody. Następnie przekształć rozcieńczone produkty Gibson Assembly. Upuść kompetentne komórki o wysokiej wydajności na lód i wykonaj 25 mikrolitrów elokwatów na każdą transformację.

Jeśli pożądana jest złożona pula ukierunkowana na wiele lokalizacji, umieść wystarczającą liczbę komórek w różnych probówkach, aby wykonać wiele niezależnych transformacji. Umieść na płytce 50 mikrolitrów przekształconych komórek i umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. W przypadku mini-przygotowań basenów ukierunkowanych na poszczególne miejsca, umieść komórki bezpośrednio w trzech do pięciu mililitrach bulionu LB zawierającego ampicylinę lub karbenicylinę.

Inkubuj komórki przez noc, wytrząsając przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. W przypadku dużych bibliotek użyj skrobaka do płytek, aby zebrać wszystkie kolonie z każdej pojedynczej płytki w jednym maxi-prep. Można to ułatwić, wlewając około pięciu mililitrów LB z odpowiednim antybiotykiem do 15-mililitrowej probówki Falcon i zeskrobując kolonie do probówki.

Dzień przed transfekcją umieść komórki na 24-dołkowej płytce, przy 30 do 50% konfluencji. Płytkować wystarczającą liczbę komórek tak, aby transfekcje można było wykonywać w dwóch egzemplarzach, i zawierać studzienki do transfekcji za pomocą kontrolnych przewodnikowych RNA. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience, delikatnie potrząsając płytką po posianiu komórek.

Wstrząsaj co pięć minut przez pierwsze 15 minut. Następnego dnia przygotuj transfekcję zgodnie z instrukcją wybranego odczynnika do transfekcji. W przypadku komórek Ishikawy użyj 550 nanogramów całkowitego plazmidu na każdą studzienkę 24-dołkowej płytki.

Rozcieńczyć plazmidy do końcowego stężenia 020 mikrogramów na mililitr w pożywce bez surowicy. Użyj trzech mikrolitrów odczynnika do transfekcji na każdy mikrogram DNA, delikatnie wiruj i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 25 mikrolitrów końcowej mieszanki do każdej studzienki.

Przygotować odpowiednią objętość buforu do lizy z 1% beta-merkaptoetanolem. Zassać pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego. Umyj komórki raz równą objętością 1x PBS i odessać, aby usunąć jak najwięcej PBS.

Dodaj 300 mikrolitrów roztworu BME do lizy do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Pipetować roztwór do lizy w górę i w dół osiem do dziesięciu razy i przenieść na płytkę z głębokim dołkiem lub 1,7 mililitrowe probówki Eppendorfa na lodzie. RNA można wyekstrahować natychmiast lub lizaty można zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przyszłego przetworzenia.

Przedstawiono projekty przewodnikowego RNA dla trzech miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego w pobliżu MMP17. Region docelowy jest miejscem wiązania dla ER alfa zgodnie z definicją ChiP-seq, a cztery przewodnikowe RNA kafelkują się w tym regionie. Pokazano tutaj oczekiwany produkt przewodnika RNA po krótkim PCR, przy użyciu wewnętrznych starterów USIC.

Reakcja doda 20 par zasad sekwencji do każdego końca 59 par zasad przewodnika RNA, co daje około 100 par par zasad. Przedstawiono jakościowe wyniki PCR z eksperymentu Enhancer-I przy MMP17. Miejsca, na które atakowany jest Enhancer-I, są oznaczone czarnym sześciokątem.

Miejsca 1 i 2 są niezbędne do pełnej odpowiedzi estrogenowej MMP17, podczas gdy miejsce 3 nie przyczynia się. Witryna 1 może sama w sobie przyczynić się do pewnej ekspresji, ale największą aktywność obserwuje się, gdy witryny 1 i 2 są aktywne. Po zoptymalizowaniu pod kątem interesującej nas linii komórkowej, technikę tę można wykonać w ciągu pięciu do siedmiu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować przewodnikowe RNA dla Enhancer-I, tworzyć i transfekować złożone pule przewodników RNA oraz zbierać transfekowane komórki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać sterylne środowisko hodowli tkankowej i używać materiałów wolnych od RNaz i DNaz. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak ChiP-seq i RNA-seq, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak miejsce w genomie wiązania Enhancer-I i jak wpływa to na globalną ekspresję genów.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania indukowanej estrogenem regulacji genów w endogennych loci w ludzkim genomie, zamiast stosowania reporterów epizodycznych. Nie zapominaj, że praca w warunkach hodowli tkankowej ssaków może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.