Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Protokół ten pokazuje, jak ustanowić platformę iCRISPR do szybkiej edycji genomu w hPSC oraz jak włączyć linie edytowane genomem z różnicowaniem trzustki kierowanym przez hPSC w celu badania rozwoju i choroby trzustki u człowieka. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju trzustki u człowieka, takie jak genetyczna kontrola prawidłowego rozwoju trzustki oraz molekularne podstawy cukrzycy. Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają nam one na efektywną modyfikację genów będących przedmiotem zainteresowania w hPSC i wykorzystanie tych zmodyfikowanych linii komórkowych do badań nad rozwojem i chorobami trzustki u ludzi in vitro.

Hodowla hPSC w warunkach zdefiniowanych chemicznie i wolnych od karmienia na obciętych ludzkich naczyniach pokrytych witronektyną. Dzień przed elektroporacją dodać 10 mikromolowy inhibitor ROCK podczas wymiany podłoża. W dniu elektroporacji przygotuj wcześniej 10-centymetrowe naczynia pokryte witronektyną.

Następnie usuń pożywkę hodowlaną z komórek, przemyj raz PBS bez wapnia i magnezu, a następnie potraktuj komórki odczynnikiem dysocjacyjnym 1X w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około trzy minuty. Następnie odessać odczynnik dysocjacyjny przed odłączeniem komórek i dodać 10,5 mililitra kompletnego podłoża. Delikatnie pipetować w celu utworzenia zawiesiny jednokomórkowej przed przeniesieniem do probówek wirówkowych.

Wykonaj liczenie komórek na 500 mikrolitrach zawiesiny komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie osadzać hPSC w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w zimnym PBS w ilości 12,5 razy 10 do szóstej komórki na mililitr i podzielić na objętości 800 mikrolitrów.

Dodaj plazmidy do każdej 800-mikrolitrowej zawiesiny hPSC i dobrze wymieszaj. Przenieś mieszaninę do kuwety do elektroporacji o średnicy 0,4 centymetra i trzymaj na lodzie przez około pięć minut. Elektroporuj ogniwa za pomocą systemu elektroporacji o napięciu 250 woltów i 500 mikrofaradach.

Bardzo ważne jest, aby używać zdrowych i proliferujących hPSC do edycji genomu. Po elektroporacji przenieś ogniwa do 15-mililitrowej stożkowej rurki z pięcioma mililitrami wstępnie podgrzanego, kompletnego podłoża, a następnie zagnieźdź ogniwa. Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach kompletnego podłoża z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK i płytkę jeden razy 10 do szóstej, 2,5 razy 10 do szóstej i pięć razy 10 do szóstej komórki z każdej elektroporacji na szalkach pokrytych witronektyną, tak aby co najmniej jedna z płytek miała wystarczającą ilość kolonii pojedynczych komórek do pobrania.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Drugiego dnia rozpocznij selekcję neomycyny od dodania pożywki zawierającej 500 mikrogramów na mililitr siarczanu G418. Szóstego dnia rozpocznij selekcję puromycyny od dodania pożywki zawierającej jeden mikrogram na mililitr dichlorowodorku puromycyny.

W dniach od 10 do 12 kolonie pojedynczych komórek hPSC osiągną średnicę od jednego do dwóch milimetrów. W tym momencie wybierz od 12 do 24 kolonii pod mikroskopem stereoskopowym. Mechanicznie zdezagregować kolonie hPSC na małe kawałki za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i przenieść komórki bezpośrednio na 24-dołkowe płytki pokryte witronektyną.

Na 24 godziny przed transfekcją przewodnika RNA należy potraktować hPSC iCas9 dwoma mikrogramami na mililitr doksycykliny. W dniu transfekcji przygotuj 24-dołkowe płytki pokryte witronektyną i zdysocjuj komórki iCas9 na pojedyncze komórki za pomocą odczynnika dysocjacyjnego 1X, jak poprzednio. Następnie osadzaj komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut i ponownie zawieś komórki w ilości 0,5 razy 10 do szóstej komórki na mililitr w kompletnym pożywce uzupełnionej dwoma mikrogramami na mililitr doksycykliny i 10 mikromolowym inhibitorem ROCK.

Umieść 500 mikrolitrów zawieszonych komórek w indywidualnych dołkach płytki 24-dołkowej. Dla każdego przewodnika RNA należy wykonać następujące mieszaniny transfekcyjne. Wymieszać A, 50 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy plus jeden mikrolitr przewodnika RNA.

Wymieszać B, 50 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy plus trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji. Połącz mieszankę A i B, aby uzyskać mieszaninę o pojemności 100 mikrolitrów i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodać 50 mikrolitrów mieszaniny do komórek w zduplikowanych dołkach płytki 24-dołkowej i dobrze wymieszać.

Po czterech dniach wyekstrahuj genomowe DNA, PCR amplifikuj regiony docelowe flankujące sekwencje docelowe RNA przewodnika i oszacuj wydajność edycji za pomocą trawienia T7E1. Rozpocznij różnicowanie linii hPSC, gdy komórki osiągną 80% konfluencji dwa dni po wysiewie. Dodaj pożywkę różnicowania dnia zerowego, a następnie zmieniaj pożywkę codziennie, korzystając z przedstawionych tutaj wzorów.

W dniu 10 zbadaj późniejsze markery progenitorowe PP2 trzustki, PDX1 i NKX6.1 poprzez barwienie immunofluorescencyjne podzbioru komórek. Następnie przejdź do hodowli granicy faz powietrze-ciecz, najpierw traktując komórki PP2 10 mikromolowym inhibitorem ROCK przez cztery godziny. Po upływie czasu inkubacji oddziel komórki jak poprzednio.

Zminimalizuj czas trwania odczynnika dysocjacyjnego, aby zmaksymalizować przeżycie komórek do wysiewu na etapie różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Odessać odczynnik dysocjacyjny, zanim komórki się odłączą. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki boo-lah do płytki i rozprowadź komórki PP2 na pojedyncze komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.

Zebrać zawiesinę jednokomórkową. Policz liczbę komórek i ułóż komórki. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w pożywce różnicującej S5, umieść od pięciu do 10 mikrolitrów komórek na miejsce na filtrze wkładanym przez transwell.

Dodać pożywkę S5 na dno każdej wkładki transwell i inkubować ze zmianami pożywki, aż markery endokrynne trzustki będą wykrywalne przez barwienie immunofluorescencyjne. Ten rysunek przedstawia niehomologiczne łączenie końców za pośrednictwem iCRISPR w hPSC. Nokaut genów jest bardzo skuteczny, ponieważ nie jest zaangażowany żaden proces selekcji, a 20% do 50% mutantów biallelicznych można łatwo osiągnąć.

W celu uzyskania wydajnych i precyzyjnych zmian genetycznych, przewodnikowe RNA są kotransfekowane z jednoniciowym dawcą DNA przenoszącym specyficzną zmianę sekwencji, pokazaną na czerwono. Często, aby zapobiec ponownemu cięciu zmodyfikowanych alleli, zaleca się włączenie cichej mutacji do sekwencji PAM, pokazanej tutaj na zielono. Dzięki temu systemowi można osiągnąć około 10% klonów posiadających pożądaną modyfikację genomu za pośrednictwem naprawy ukierunkowanej na homologię, bez dodatkowych zmian w obu allelach.

Po opanowaniu zajmuje mniej niż dwa miesiące, aby stworzyć nową linię iCas9 hPSC. Następnie w ciągu jednego do dwóch miesięcy można wygenerować różne linie kolonii mutantów hPSC. Po wygenerowaniu zmutowanych linii genetycznych hPSC, stopniowe różnicowanie in vitro zmutowanych linii komórkowych w komórki beta trzustki pozwala nam badać konkretne etapy rozwojowe, na które wpływają te mutacje, co pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw choroby.