Name: Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Odkryj metodę edycji genomu hPSC za pomocą platformy iCRISPR i ich różnicowania w komórki trzustkowe. To podejście pozwala badać genetyczne kontrolę rozwoju trzustki i mechanizmy cukrzycy in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH/NIDDK (R01DK096239) i New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). Z.Z. był wspierany przez NYSTEM postdoctoral fellowship z Center for Stem Cell Biology of the Sloan Kettering Institute.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>González, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iCRISPR+Platform+for+Rapid%2C+Multiplexable%2C+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li>
<li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li>
<li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li>
<li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , in press (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zagadnienia czasowe dotyczące generowania linii mutantów
Chociaż niedawne podejścia oparte na systemach CRISPR/Cas do edycji genomu doprowadziły do udanego ukierunkowania, bardziej skuteczna i uniwersalna platforma byłaby lepsza w przypadku analiz funkcji genów na większą skalę. Platforma iCRISPR oferuje szybką i skuteczną metodę wprowadzania mutacji do dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania 5,9. Po pierwsze, metoda syntezy gRNA oparta na PCR pozwala na produkcję setek gRNA w formacie macierzowym w ciągu jednego dnia bez czasochłonnych etapów klonowania. Po drugie, przy indukowanej doksycykliną ekspresji Cas9 w hPSC iCas9, etap obejmujący transfekcję gRNA wymaga tylko minimalnego nakładu pracy, a zatem można jednocześnie przeprowadzić wiele eksperymentów celujących w gRNA. Po trzecie, ze względu na wysoką skuteczność celowania, którą można osiągnąć za pomocą naszego systemu, analiza ~ 24 - 48 kolonii na transfekowane gRNA powinna być wystarczająca do ustalenia wielu monoallelicznych i biallelicznych linii mutantów dla jednego genu, chociaż wydajność różni się w zależności od locus docelowego. Ponieważ wyszkolona osoba jest w stanie mechanicznie wybrać 384 kolonie (płytki 4 x 96-dołkowe) za jednym posiedzeniem, co powinno zająć ~ 4 godziny pod mikroskopem preparacyjnym, można oczekiwać, że wyszkolona osoba wygeneruje zmutowane linie wpływające na 12 genów w ciągu 1 - 2 miesięcy. Usprawnione generowanie mutantów hPSC w krótkim czasie pozwala na systematyczną analizę szeregu czynników transkrypcyjnych i/lub komponentów szlaku sygnałowego, które oddziałują ze sobą, regulując proces rozwojowy9. Ponadto skuteczne multipleksowane celowanie w geny otwiera również drzwi do badania interakcji genetycznych leżących u podstaw złożonych cech ludzkich.
Generowanie precyzyjnych modyfikacji genetycznych
Wyprowadzenie specyficznych dla pacjenta iPSC z łatwo dostępnych typów komórek somatycznych i różnicowanie się w typy komórek istotne dla choroby stanowi doskonałą okazję do funkcjonalnej walidacji mutacji związanych z chorobą. Jednak ze względu na znaczną zmienność tła genetycznego między osobami, bezpośrednie porównania między iPSC od pacjentów i od zdrowych dawców mogą nie pozwolić na odróżnienie fenotypów choroby od skutków tła. W związku z tym konieczne jest wygenerowanie izogenicznych kontrolnych iPSC poprzez skorygowanie mutacji choroby z powrotem do sekwencji typu dzikiego lub wprowadzenie mutacji specyficznych dla pacjenta na tle hPSC typu dzikiego, jak proponują inni 25,26. Oprócz mutacji powodujących utratę funkcji (mutacje zerowe) można teraz dokładniej analizować mechanizmy choroby poprzez wprowadzenie specyficznych dla pacjenta zmian sekwencji do endogennego locus w hPSC, w tym mutacji hipermorficznych, hipomorficznych, neomorficznych lub dominująco-ujemnych.
Precyzyjna modyfikacja genetyczna wykorzystuje HDR do naprawy DSB w obecności szablonu naprawczego. Ponieważ jest znacznie mniej wydajny niż naprawa DNA za pośrednictwem NHEJ, plazmid dawcy zawierający mutację specyficzną dla pacjenta, kasetę selekcyjną i ramiona homologiczne były wcześniej używane jako matryca naprawcza2. Po doborze leku i weryfikacji mutacji specyficznej dla pacjenta, zazwyczaj potrzebny jest drugi krok, aby usunąć kasetę wyboru leku. Podczas gdy najczęściej stosowane systemy Cre-loxP i FLP-FRT pozostawiają sekwencję resztkową w endogennym locus, zastosowanie transpozonu PiggyBac pozwoliło na bezproblemowe usunięcie kasety selekcyjnej27 leku. Ostatnio wykazano również, że krótkie matryce ssDNA wspierają wydajny HDR z zaprojektowanymi endonukleazami DNA28. W porównaniu z plazmidem dawcy, ssDNA może być bezpośrednio syntetyzowany, a tym samym omija czasochłonny etap klonowania. W tym przypadku wykazano, że poprzez jednoczesną transfekcję gRNA i matrycy ssDNA w celu wywołania naprawy ukierunkowanej na homologię, iCRISPR może być używany do wprowadzania specyficznych modyfikacji nukleotydów z wysoką wydajnością. Ma to kluczowe znaczenie nie tylko dla analizy roli niezbędnych nukleotydów w domenach funkcjonalnych białek, ale także dla modelowania mutacji chorób u ludzi i potencjalnej korekty tych mutacji związanych z chorobą w celu interwencji terapeutycznej. Ze względu na dużą liczbę loci podatności, z których każdy jest związany z wieloma wariantami sekwencji, modelowanie złożonych i wielogenowych chorób, takich jak cukrzyca, było wyzwaniem dla genetyków. Ponieważ platforma iCRISPR jest dopuszczalna do szybkiego generowania serii alleli lub do multipleksowania genów, może ułatwić badanie wielu loci związanych z chorobą, zarówno indywidualnie, jak i w połączeniu z tłami izogenicznymi.
Skuteczność kierowania i efekty niezgodne z celem
Znaleźliśmy dobrą korelację między wynikami testu T7E1 i RFLP a liczbą zmutowanych linii zidentyfikowanych przez sekwencjonowanie. Podkreśla to znaczenie wykonywania tych testów równolegle z ustanawianiem linii klonalnych. Podczas gdy osiągnięta skuteczność celowania może się różnić w zależności od loci genomu, w większości eksperymentów z pojedynczym genem stwierdzono u 20 do 60% klonów ze zmutowanymi obydwoma allelami (w tym mutacjami w ramce i przesunięciem ramki odczytu)9. W przypadkach, w których przeprowadzono celowanie genowe w multipleksy, uzyskano potrójne zmutowane klony bialleliczne o skuteczności 5-10%5. Przeprowadzono również HDR kilku genów za pośrednictwem ssDNA, aby uzyskać precyzyjne zmiany genetyczne, przy czym skuteczność otrzymywania homozygotycznych klonów knock-in wahała się od 1 do 10%5. Pracując z CRISPR/Cas w hPSC, wszelkie mutacje w potencjalnych miejscach poza celem, które nie mają tej samej sekwencji docelowej gRNA, nie zostały jeszcze wykryte 5,9,12. Sekwencjonowanie całego genomu przeprowadzone w niedawnym badaniu również nie zidentyfikowało istotnych mutacji poza celem w klonalnych liniach hPSC wygenerowanych przy użyciu CRISPR/Cas29. Niemniej jednak, aby zminimalizować potencjalny efekt zakłócających fenotypów wprowadzonych przez mutacje w miejscach efektu poza celem, sugeruje się generowanie niezależnych linii mutantów przy użyciu co najmniej dwóch niezależnych gRNA ukierunkowanych na różne sekwencje w obrębie tego samego genu. Podobne fenotypy obserwowane w wielu liniach generowanych przy użyciu różnych gRNA mogą zasadniczo wykluczyć możliwość, że fenotyp pochodzi z efektu off-target.
Kultura zależna od feedera a kultura niezależna i targetowanie
Tradycyjne metody hodowli hPSC polegają na ich utrzymywaniu i namnażaniu na komórkach żywiciela w pożywkach zawierających surowicę lub zamiennik surowicy, który obejmuje produkty pochodzenia zwierzęcego, takie jak albumina surowicy bydlęcej. Komórki zasilające, surowica, wymiana surowicy i albumina zawierają złożone, niezdefiniowane składniki i wykazują znaczną zmienność partii. Przystosowanie się do warunków wolnych od karmów i zdefiniowanych chemicznie znacznie zmniejsza wysiłek związany z utrzymaniem hPSC i, co ważniejsze, zwiększa spójność eksperymentów różnicujących. Obecnie istnieje bardzo niewiele badań, które opisują procedury edycji genomu na hPSC hodowanych w całkowicie określonych warunkach hodowli30. Odkryliśmy wyższą skuteczność celowania w CRISPR, gdy transfekcja gRNA i depozycja klonalna przeprowadzono w warunkach wolnych od karmnika w porównaniu z warunkami hodowli zależnymi od karmnika. Uważamy, że wynika to ze zwiększonej przeżywalności komórek po transfekcji i wysiewie pojedynczych komórek w celu utworzenia kolonii. Co więcej, wcześniej wykazano, że komórki zasilające sekwestrują odczynniki transfekcji, obniżając w ten sposób wydajność transfekcji.
Połączenie edycji genomu z ukierunkowanym różnicowaniem
Poprzednie protokoły różnicowania dały tylko niewielką frakcję komórek insulinododatnich, z których większość była polihormonalna i przypominała płodowe komórki endokrynne23. Niedawny postęp pozwolił na różnicowanie hPSC w bardziej dojrzałe komórki beta-podobne reagujące na glukozę 16,17,19,20. Możemy rutynowo uzyskać co najmniej 75% ostatecznych komórek endodermy, 40% komórek progenitorowych trzustki PDX1 + NKX6.1 + i około 20% komórek beta reagujących na glukozę NKX6.1 + CPEP + za pomocą HUES8 hPSCs9. W połączeniu z systemem edycji genomu iCRISPR, ten bardziej niezawodny protokół różnicowania ułatwił analizę czynników transkrypcyjnych, które mają kluczowe znaczenie dla progenitorowych i endokrynologicznych etapów różnicowania trzustki. Umożliwi to, w przyszłych badaniach, zbadanie dużej liczby genów kandydujących na chorobę w celu walidacji funkcjonalnej i zbadania mechanizmów leżących u podstaw cukrzycy9.
Przyszłe zastosowania lub wskazówki
Nasz system iCRISPR może ułatwić generowanie bardziej złożonych modyfikacji genomu, takich jak tworzenie alleli reporterowych poprzez celowanie genowe za pośrednictwem HDR przy użyciu długich szablonów DNA dawcy kodujących znaczniki białkowe lub reporterów fluorescencyjnych12. Wykazaliśmy, że ze względu na wysoką skuteczność celowania w CRISPR osiągniętą w systemie, proces ten może być przeprowadzany w hPSC, bez konieczności dalszej selekcji leków12. Co więcej, multipleksowane celowanie genowe może być wykorzystywane do badania interakcji genetycznych leżących u podstaw złożonej choroby ludzkiej, jak wykazano w naszym niedawnym badaniu, które naszym zdaniem jest pierwszym przykładem takiej pracy31. iCRISPR może być również wykorzystany do zrozumienia kontroli regulacyjnej genów poprzez tworzenie delecji w niekodujących RNA lub w regionach regulatorowych genów, takich jak promotory i wzmacniacze. Aby skutecznie generować mutanty regulatorowe za pomocą iCRISPR, gRNA można zaprojektować tak, aby zakłócały miejsce wiązania białka wiążącego DNA, w tym między innymi podstawową maszynerię transkrypcyjną lub specyficzny tkankowo czynnik transkrypcyjny. HDR za pośrednictwem matrycy ssDNA może być również stosowany do mutacji określonych miejsc wiązania białek. Wreszcie, przewidujemy, że dalsza optymalizacja umożliwi wykorzystanie platformy iCRISPR w hPSC do bardziej przepustowych analiz genetycznych fenotypów pluripotencji lub fenotypów choroby w połączeniu z protokołem różnicowania in vitro . Te badania za pośrednictwem iCRISPR mogą pozwolić na szybszą identyfikację potencjalnych genów związanych z chorobą i badania ich znaczenia funkcjonalnego.

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają zdolność zarówno do samoodnawiania, jak i dają początek wszystkim pochodnym trzech linii zarodkowych embrionalnych. Stanowią one cenne źródło informacji dla terapii zastępczej komórek i modelowania chorób, służąc jako unikalna platforma do podsumowania procesów komórkowych w kontekście rozwoju człowieka. Są one również źródłem komórek eksperymentalnych do skalowalnych, wysokoprzepustowych analiz. Postęp ten jest jednak ograniczony ze względu na dwa główne wyzwania: brak skutecznych narzędzi do modyfikacji genetycznej oraz trudności w odtworzeniu złożonych etapów rozwoju embrionalnego w naczyniu hodowlanym.
Modyfikacja genetyczna jest niezbędnym narzędziem do badania funkcji genów w normalnym rozwoju i chorobie. Jednakże, podczas gdy klasyczne podejścia do celowania w geny poprzez rekombinację homologiczną okazały się potężnym narzędziem do analizy funkcji genów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (mESC)1, podejście to było wyjątkowo nieefektywne, gdy zastosowano je do hPSCs2,3. Niedawny szybki dostęp programowalnych, specyficznych dla miejsca nukleaz z natury do zastosowań laboratoryjnych, w tym nukleaz palca cynkowego (ZFN), nukleaz efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALEN) oraz systemów zgrupowanych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)4, oznacza, że inżynieria genomu stała się znacznie łatwiejszym zadaniem w szerokim zakresie organizmów i linii komórkowych, w tym w hPSC. Te narzędzia do edycji genów wykorzystują fakt, że chimeryczne nukleazy, takie jak endonukleaza Cas9, mogą umożliwiać cały szereg modyfikacji genetycznych poprzez indukowanie dwuniciowych pęknięć (DSB) w precyzyjnych lokalizacjach, uruchamiając endogenną maszynerię naprawy DNA w celu aktywacji niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR). Oba mechanizmy mogą być wykorzystane do manipulacji genetycznej poprzez indukowanie losowych mutacji insercji i delecji (indels; przez NHEJ), w celu tworzenia mutacji z przesunięciem ramki odczytu, które neutralizują allele genów, lub precyzyjnych podstawień nukleotydów (za pomocą HDR), w celu podsumowania mutacji pacjenta w celu modelowania choroby u ludzi lub skorygowania mutacji powodującej chorobę w terapii genowej.
Inżynieria genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas wymaga dwóch komponentów: stałej endonukleazy Cas9 kierowanej przez RNA, niezbędnej do rozszczepienia DNA oraz zmiennego dupleksu CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującego (tracrRNA), który określa rozpoznawanie celu DNA. Duplex crRNA/tracrRNA można zastąpić pojedynczym chimerycznym przewodnikiem RNA (gRNA), który, jak stwierdzono, działa wydajniej5,6,7. Podczas gdy system CRISPR/Cas9 został dostosowany do większości organizmów eksperymentalnych i linii komórkowych, dostarczanie i ekspresja Cas9 i gRNA różni się znacznie i musi być dalej optymalizowana, aby osiągnąć wydajną edycję genomu w wielu systemach, w tym hPSCs8. Wydajna platforma do edycji genomu, iCRISPR, została stworzona w hPSCs5. W tym systemie zastosowano podejście oparte na TALEN, aby celować w oba allele "locus bezpiecznej przystani transgenu" AAVS1 w trans, jeden allel z odwróconym transaktywatorem kontrolowanym przez tetracyklinę (M2rtTA), a drugi z elementem odpowiedzi tetracykliny (TRE) napędzającym ekspresję Cas9 (iCas9) w hPSC. W ustalonych liniach klonalnych (hPSC iCas9) Cas9 ulega silnej ekspresji podczas leczenia doksycykliną. Tymczasem, ze względu na niewielki rozmiar (100 nt), pojedyncze lub wielokrotne gRNA mogą być łatwo dostarczane do hPSC iCas9 z wysoką wydajnością i mogą kierować Cas9 do cięcia specyficznego dla miejsca, umożliwiając skuteczne rozrywanie genów za pośrednictwem NHEJ, a także precyzyjne modyfikacje nukleotydów za pośrednictwem HDR w obecności krótkich matryc dawcy jednoniciowego DNA (ssDNA). System iCRISPR może być z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania panelu naśladujących chorobę linii hPSC z biallelicznymi (homozygotycznymi lub złożonymi heterozygotycznymi) lub heterozygotycznymi mutacjami utraty funkcji w ważnych genach rozwojowych5,9. Podczas gdy wiele grup zgłosiło wydajną edycję genów przy użyciu CRISPR/Cas w hPSC, sukces pozostaje ograniczony do niewielkiej liczby laboratoriów biegłych technologicznie. Platforma iCRISPR oferuje wydajne, ale proste rozwiązanie do rutynowej edycji genów przez badaczy o różnych poziomach umiejętności i została już wykorzystana w wielu opublikowanych badaniach przez naszą grupę i inne podmioty9,10,11,12. Podejście to zostało również rozszerzone na indukowane wyciszanie oparte na wyrażeniu dCas9-KRAB13.
Wraz z postępem w technologii edycji genomu, osiągnięto również znaczące ulepszenia w utrzymaniu hPSC i ukierunkowanym różnicowaniu. Warunki hodowli hPSC ewoluowały od napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych (iMEF) zależnych od żywienia do warunków wolnych od żywienia na zdefiniowanych składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej oraz od złożonych preparatów pożywek do chemicznie zdefiniowanych warunków pożywki14. Takie ulepszenia zmniejszyły zmienność hPSC wynikającą z różnic między partiami w przygotowaniu iMEF i składnikach zastępujących surowicę nokautującą, a tym samym zapewniły bardziej powtarzalne środowisko do różnicowania hPSC. Tymczasem lepsza wiedza na temat szlaków sygnałowych rządzących rozwojem embrionalnym człowieka, a także odkrycia wynikające z wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, doprowadziły do ulepszenia protokołów różnicowania15,16,17,18. Protokoły te bardziej naśladują etapy rozwoju in vivo i generują typy komórek, które ściśle przypominają ich odpowiedniki in vivo. W przypadku różnicowania hPSC w linii trzustkowej, początkowe protokoły stosunkowo dobrze naśladowały wczesny rozwój trzustki, ale ostatecznie wygenerowały polihormonalne komórki β, które miały niedojrzałe fenotypy płodu i słabo reagowały na stymulację glukozy. Ostatnie osiągnięcia16,17,19,20 pozwoliły na wytworzenie reagujących na glukozę komórek trzustkowych podobnych do β, co pozwoli nam zbadać późniejsze zdarzenia, takie jak tworzenie i dalsze dojrzewanie monohormonalnych komórek β.
Tutaj szczegółowo opisujemy zastosowanie linii modyfikowanych genomem do badania rozwoju trzustki, łącząc system iCRISPR z platformą różnicowania in vitro opartą na hPSC w kierunku reagujących na glukozę komórek trzustki β-podobnych. To połączenie potężnych narzędzi do edycji genomu z ulepszonym protokołem różnicowania hPSC nie tylko oferuje szybkość i skalę niezbędną do zaspokojenia rosnącego zapotrzebowania na walidację przyczynowości choroby, ale także umożliwia zaawansowane manipulacje genetyczne w celu dalszych mechanistycznych badań nad kontrolą transkrypcji leżącą u podstaw normalnego rozwoju i choroby9.

<table><tbody><tr><td>Chemicznie zdefiniowane podłoże (E8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Essential 8 podłoże podstawowe i suplement Essential 8 w zestawie</td></tr><tr><td>Skrócona rekombinowana ludzka forma witronektyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor ROCK Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik dysocjacyjny (enzym TrypLE Select)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, bez pochodzenia zwierzęcego, rekombinowany enzym</td></tr><tr><td>Siarczan G418</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Geneticin Selektywny antybiotyk</td></tr><tr><td>Chlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Puromycin Selektywna antybiotykowa</td></tr><tr><td>polimeraza DNA (fuzja Herculase II)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>Zestaw do PCR</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transkrypcja zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Zestaw do czyszczenia transkrypcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Hyklan doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Reduced Serum</td></tr><tr><td>Medium Lipofectamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy Krew & Zestaw tkanek</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Wykonane na zamówienie z opublikowanym preparatem (Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>Suplement L-glutaminy (GlutaMAX)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Laboratoria biologiczne</td><td>7500855</td><td>Bez kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Inhibitor GSK-3</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Witamina C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Inhibitor jeża</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Kwas retinowy</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>Inhibitor BMP</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Antagonista Wnt&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Aukcje internetowe TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>Aktywator</td></tr><tr><td>PKC 3,3',5-Triiodo-L-tyronina (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-445</td><td>Inhibitor ALK5 II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX EMD</td><td>Milipory</td><td>565789</td><td>Inhibitor sekretazy gamma XX, inhibitor sygnalizacji NOTCH</td></tr><tr><td>N-Cys (N-acetylocysteina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore</td><td>648471</td><td>Analog witaminy E</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2841</td><td>Kinaza tyrozynowa receptora AXL inhibitor</td></tr><tr><td>24 mm Transwell z wkładką</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell System elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Kuwety do elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza T7 I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Bufor 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Długi oligonukleotyd</td><td>Eton Bioscience lub IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało FOXA2</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało CXCR4-APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Przeciwciało PDX1</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało NKX6.1</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało NKX2.2</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało NEUROD1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało insuliny</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało peptydu C</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało glukagonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1,000</td></tr></tbody></table>

edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hpsc w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Badanie funkcji genu w samoodnawiających się lub różnicujących ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) stanowi cenną platformę do zrozumienia rozwoju człowieka i analizy mechanizmów chorobowych w naczyniu. Aby wykorzystać ten potencjalny zastosunek, potrzebne są wydajne narzędzia do edycji genomu w celu wygenerowania mutantów hPSC w genach związanych z chorobą, a także protokoły różnicowania hPSC in vitro w celu wytworzenia typów komórek istotnych dla choroby, które ściśle przypominają ich odpowiedniki in vivo. Wydajna platforma do edycji genomu hPSC o nazwie iCRISPR została opracowana dzięki celowaniu za pośrednictwem TALEN w kasetę ekspresji Cas9 w locus AAVS1. W tym miejscu opisano protokoły generowania indukowalnych linii Cas9 hPSC przy użyciu komórek hodowanych w chemicznie zdefiniowanej pożywce i w warunkach wolnych od pożywki. Zamieszczono szczegółowe procedury wykorzystania systemu iCRISPR do nokautowania genów lub precyzyjnych zmian genetycznych w hPSC, odpowiednio poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub precyzyjne zmiany nukleotydowe przy użyciu szablonu naprawy kierowanej homologią (HDR). Te procedury techniczne obejmują opisy projektowania, produkcji i transfekcji przewodnikowych RNA CRISPR (gRNA); pomiar wskaźnika mutacji CRISPR za pomocą testów T7E1 lub RFLP; oraz ustanawianie i walidacja zmutowanych linii klonów. Na koniec opisujemy procedury różnicowania hPSC w reagujące na glukozę komórki podobne do β trzustki, naśladując rozwój embrionalny trzustki in vivo. Połączenie technologii iCRISPR z ukierunkowanym różnicowaniem hPSC umożliwia systematyczne badanie funkcji genów w celu pogłębienia naszej wiedzy na temat rozwoju trzustki i mechanizmów choroby cukrzycowej.

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Niniejszy protokół demonstruje sposób ustanowienia platformy iCRISPR do szybkiej edycji genomu w hPSC oraz sposób wykorzystania linii z edytowanym genomem w procesie różnicowania hPSC w kierunku trzustkowym w celu badania rozwoju i chorób trzustki u ludzi. Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju ludzkiej trzustki, takie jak genetyczna kontrola prawidłowego rozwoju trzustki oraz molekularne podstawy cukrzycy. Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają one na efektywną modyfikację interesujących nas genów w hPSC i wykorzystanie tych zmodyfikowanych linii komórkowych do badań nad rozwojem i chorobami ludzkiej trzustki in vitro.Hoduj hPSC w warunkach chemicznie zdefiniowanych i bez komórek karmicieli na szalkach pokrytych skróconą ludzką witronektyną. Dzień przed elektroporacją, podczas wymiany pożywki, dodaj 10 µM inhibitora ROCK. W dniu elektroporacji przygotuj wcześniej szalki 10-centymetrowe pokryte witronektyną.Następnie usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, przemyć je raz PBS bez wapnia i magnezu, a następnie poddać komórki działaniu 1X odczynnika dysocjującego w temperaturze 37 °C przez około trzy minuty. Następnie odessać odczynnik dysocjujący przed odłączeniem się komórek i dodać 10,5 ml pełnej pożywki. Delikatnie pipetować w celu utworzenia zawiesiny pojedynczych komórek przed przeniesieniem ich do probówek do wirowania.Przeprowadź zliczenie komórek w 500 µL zawiesiny komórkowej za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie odwiruj hPSC przy 200 ×g przez pięć minut. Resuspenduj komórki w zimnym PBS do stężenia 12,5 × 10⁶ komórek/mL i podziel na alikwoty o objętości 800 µL.Dodaj plazmidy do każdej zawiesiny hPSC o objętości 800 µL i dokładnie wymieszaj. Przenieś mieszaninę do kuwety do elektroporacji o szerokości 0,4 cm i przechowuj na lodzie przez około pięć minut. Przeprowadź elektroporację komórek przy użyciu systemu do elektroporacji przy napięciu 250 V i pojemności 500 µF.Kluczowe jest użycie zdrowych i proliferujących hPSC do edycji genomu. Po elektroporacji przenieść komórki do 15 ml probówki stożkowej zawierającej 5 ml uprzednio ogrzanej, pełnej pożywki, a następnie odwiruj komórki do uzyskania osadu. Resuspenduj komórki w 10 ml pełnej pożywki z dodatkiem 10 µM inhibitora ROCK i wysiej 1×10⁶, 2,5×10⁶ oraz 5×10⁶ komórek z każdej elektroporacji na płytki pokryte witronektyną, aby przynajmniej na jednej z płytek uzyskać wystarczającą liczbę kolonii pojedynczych komórek do selekcji.Hodować komórki w temperaturze 37 °C. Drugiego dnia rozpocząć selekcję neomycyną, dodając pożywkę zawierającą 500 µg/mL siarczanu G418. Szóstego dnia rozpocząć selekcję puromycyną, dodając pożywkę zawierającą 1 µg/mL dihydrochlorku puromycyny.W dniach od 10 do 12 pojedyncze kolonie hPSC osiągną średnicę od jednego do dwóch milimetrów. W tym momencie należy wybrać od 12 do 24 kolonii pod mikroskopem stereoskopowym. Mechanicznie rozbić kolonie hPSC na małe fragmenty za pomocą końcówki do pipety 200 µL, a następnie przenieść komórki bezpośrednio na płytki 24-dołkowe pokryte witronektyną.Na 24 godziny przed transfekcją przewodniego RNA, potraktuj iCas9 hPSCs doksycykliną w stężeniu 2 µg/mL. W dniu transfekcji przygotuj 24-dołkowe płytki pokryte witronektyną i zdysocjuj komórki iCas9 do pojedynczych komórek, używając 1X odczynnika do dysocjacji, jak opisano wcześniej. Następnie odwiruj komórki przy 200 ×g przez pięć minut i resuspenduj je w pożywce kompletnej uzupełnionej o 2 µg/mL doksycykliny i 10 µM inhibitora ROCK, aby uzyskać stężenie 0,5 × 10⁶ komórek/mL.Przenieś 500 µL resuspenderowanych komórek do poszczególnych studzienek płytki 24-dołkowej. Dla każdego guide RNA przygotuj następujące mieszaniny do transfekcji. Mieszanina A: 50 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy oraz jeden mikrolitr guide RNA.Mieszanina B: 50 µL medium z zredukowaną zawartością surowicy oraz trzy µL odczynnika do transfekcji. Połączyć mieszaniny A i B, aby uzyskać 100 µL mieszaniny, a następnie inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodać 50 µL mieszaniny do komórek w dubletach studzienek płytki 24-dołkowej i dokładnie wymieszać.Po czterech dniach należy wyizolować genomowe DNA, przeprowadzić amplifikację PCR regionów docelowych flankujących sekwencje celowane przez gRNA oraz oszacować wydajność edycji za pomocą trawienia enzymem T7E1. Różnicowanie linii hPSC należy rozpocząć, gdy komórki osiągną 80% konfluencji dwa dni po wysianiu. Należy dodać pożywkę dla dnia zero różnicowania, a następnie codziennie wymieniać pożywkę zgodnie z przedstawionymi tutaj formułami.W dniu 10. sprawdź markery późniejszych progenitorów trzustki PP2, PDX1 oraz NKX6.1, stosując barwienie immunofluorescencyjne na podzbiorze komórek. Następnie przystąp do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz, traktując najpierw komórki PP2 inhibitorem ROCK w stężeniu 10 µM przez cztery godziny. Po upływie czasu inkubacji zdysocjuj komórki w sposób opisany wcześniej.Należy zminimalizować czas ekspozycji na odczyn dysocjujący, aby zmaksymalizować przeżywalność komórek podczas ich wysiewu na etapie różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Odessać odczyn dysocjujący, zanim komórki całkowicie się oddzielą. Następnie dodać do płytki 10 ml pożywki boo-lah i rozbić skupiska komórek PP2 do pojedynczych komórek poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół.Zebrać zawiesinę pojedynczych komórek. Policzyć komórki, a następnie je scentrygować. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w medium różnicującym S5, nanieść od 5 do 10 µL komórek na każdą plamkę na filtrze wkładki transwell.Dodaj pożywkę S5 do dna każdego wkładu transwell i inkubuj, wymieniając pożywkę, aż markery endokrynne trzustki staną się wykrywalne za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Rysunek ten przedstawia niehomologiczne łączenie końców za pośrednictwem iCRISPR w hPSCs. Nokaut genu jest bardzo wydajny, ponieważ nie wymaga procesu selekcji, a mutantów biallelicznych w zakresie 20% do 50% można łatwo uzyskać.W celu wydajnego i precyzyjnego wprowadzania zmian genetycznych, gRNAs są kotrasfekowane z jednoniciowym donorem DNA zawierającym specyficzną zmianę sekwencji, zaznaczoną na czerwono. Często, aby zapobiec ponownemu cięciu w zmodyfikowanych allelach, zaleca się wprowadzenie mutacji synonimicznej w sekwencji PAM, zaznaczonej tutaj na zielono. Dzięki temu systemowi można uzyskać około 10% klonów z pożądaną modyfikacją genomu opartą na naprawie kierowanej homologią, bez dodatkowych zmian w obu allelach.Po opanowaniu metody utworzenie nowej linii iCas9 hPSC zajmuje mniej niż dwa miesiące. Następnie, w ciągu jednego do dwóch miesięcy, można wygenerować różnorodne linie kolonii mutantów hPSC. Po utworzeniu genetycznych linii mutantów hPSC, stopniowe różnicowanie in vitro tych linii komórkowych w komórki przypominające beta pancreaticzne pozwala na badanie konkretnych etapów rozwojowych, na które wpływają te mutacje, co umożliwi lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw choroby.

genome-editing-directed-differentiation-hpscs-for-interrogating

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Odkryj metodę edycji genomu hPSC za pomocą platformy iCRISPR i ich różnicowania w komórki trzustkowe. To podejście pozwala badać genetyczne kontrolę rozwoju trzustki i mechanizmy cukrzycy in vitro.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Przeglądaj więcej filmów