Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG
7 stycznia 2019
Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.
Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące roli mikrośrodowiska szpiku kostnego i przeżywalności wszczepionych guzów szpiczaka. Główną zaletą tej procedury jest to, że można ją zastosować do podłużnych badań przeciwlekowych i wykorzystać do nieinwazyjnego oznaczania wielu szlaków biochemicznych. W dniu eksperymentu najpierw umyj komórki transfakultatywne 8226 Lucyferazy trzy razy w lodowatym PBS przy 200 RCF przez pięć minut na odwirowanie i ponownie zawieś osad w świeżym, lodowatym PBS przy pięć razy dziesięć do szóstych komórek na 200 mikrolitrów lodowatego PBS na mysz.
Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy NOG w wieku od czterech do sześciu tygodni i nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia. Załaduj komórki do jednomililitrowej strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 26. Wstrzyknij całą objętość komórek do żyły ogonowej zwierzęcia przed powrotem myszy do klatki, monitorując aż do pełnego wyzdrowienia.
Dziesięć do dwudziestu dni po prowokacji wstrzyknąć każdemu wszczepionemu zwierzęciu 200 mikrolitrów substratu D-lucyferyny in vivo w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dootrzewnowo. W ciągu 5 do 10 minut od wstrzyknięcia należy umieścić znieczulone zwierzęta w pozycji leżącej na plecach w systemie obrazowania małych zwierząt. Zmierz średnie promieniowanie w wybranych obszarach zainteresowania w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania.
W przypadku terapii celowanej guzów lucyferazy 8226, po zmierzeniu wyjściowej bioluminescencji u każdego zwierzęcia, jak właśnie pokazano, losowo podziel zwierzęta na grupy leczenia i potraktuj każdą mysz serią 200 mikrolitrowych wstrzyknięć IP temsyrolimusu lub kontroli soli fizjologicznej. Mierz aktywność lucyferazy dwa razy w tygodniu i wykreślaj zmiany bioluminescencji w czasie. Aby zmierzyć zmiany w metabolizmie guza, najpierw usuń pokarm z domowej klatki myszy na 24 godziny, aby uniknąć nadmiernego niespecyficznego wychwytu fludeoksyglukozy znakowanej radioaktywnie.
Następnego dnia rozcieńczyć od 500 do 100 mikrokiurów 18 znakowanej radioaktywnie fluorowej sondy fludeoksyglukozy w sterylnej soli fizjologicznej do końcowej objętości 100 mikrolitrów na mysz i zarejestrować czas i aktywność sond za pomocą kalibratora dawki. Gdy sondy są gotowe, umieść pierwsze znieczulone zwierzę na poduszce grzewczej z głową skierowaną na zewnątrz i użyj osłoniętej strzykawki insulinowej o pojemności jednego mililitra, wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby wstrzyknąć 100 mikrolitrów sondy do żyły ogonowej. Zmierzyć radioaktywność resztkową w igle i strzykawce za pomocą kalibratora dawki i zanotować aktywność i czas.
Następnie zmierz znakowaną radioaktywnie aktywność fludeoksyglukozy w wybranych obszarach zainteresowania, które odpowiadają przeszczepionym guzom w systemie obrazowania PET CT dla małych zwierząt. Udane wszczepienie guza szpiku kostnego można potwierdzić za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, jak pokazano. Obrazowanie seryjne wielu zwierząt może być wykorzystane do wizualizacji rozmieszczenia guzów szpiczaka mnogiego przeszczepionych szpikowi kostnemu.
Dodatkowo obrazowa analiza rentgenowska pokazuje szybkie i nieinwazyjne określenie dokładnej lokalizacji i rozmieszczenia guzów szpiczaka mnogiego w szkielecie myszy. Bioluminescencja wytwarzana przez te wszczepione komórki nowotworowe może być mierzona seryjnie i nieinwazyjnie w celu oceny zmian we wzroście guza. Ponadto można monitorować przeżywalność myszy leczonych inhibitorem mTOR temsyrolimusem, a emisję pozytonów i analizę tomografii komputerowej pod kątem wychwytu fludeoksyglukozy znakowanego radioizotopem guza można wykorzystać do wykazania zmian w metabolizmie glukozy za pośrednictwem temsyrolimusu.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wstrzyknąć komórkom IEV. Odkryliśmy, że niepowodzenie w wstrzyknięciu komórek do żyły powoduje powstawanie komórek nowotworowych niewszczepionych szpikiem w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia i mikrotomografia komputerowa, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wpływu guza na architekturę kości oraz nienowotworowe składniki komórkowe i molekularne środowiska szpiku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano obrazowanie bioluminescencyjne, rentgenowskie oraz tomografię emisyjną pozytonów połączoną z tomografią komputerową, aby zbadać wpływ inhibicji mTOR na guzy szpiczaka mnogiego wszczepione do szpiku kostnego w modelu ksenograftu. Podejście to umożliwia nieinwazyjne, multimodalne analizy efektów terapeutycznych w guzach szpiczaka in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Immunologia
- Obrazowanie biomedyczne
Wstęp
- Mikrośrodowisko szpiku kostnego odgrywa kluczową rolę w przeżyciu nowotworu.
- Guzy szpiczaka można przeszczepić do modeli zwierzęcych w celu przeprowadzenia badań.
- Nieinwazyjne techniki obrazowania są niezbędne do badań podłużnych.
- Zrozumienie roli mTOR może prowadzić do lepszych strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Ocena wpływu inhibicji mTOR na guzy szpiczaka.
- Zbadanie wpływu szpiku kostnego na zachowanie guza.
- Opracowanie metody do podłużnych badań nad lekami przeciwlekowymi.
Zastosowane metody
- Obrazowanie bioluminescencyjne przeszczepionych komórek szpiczaka wielokrotnego.
- Obrazowanie rentgenowskie w celu wizualizacji anatomicznej.
- Pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa do oceny metabolicznej.
- Iniekcja komórek z transfekcją lucyferazą u myszy NOG.
Główne wyniki
- Inhibicja aktywności mTOR wykazała istotny wpływ na wzrost guza.
- Nieinwazyjne obrazowanie dostarczyło informacji na temat dynamiki guza.
- Badania podłużne ujawniły rolę mikrośrodowiska szpiku kostnego.
- Metodyka pozwala na ocenę wielu szlaków biochemicznych.
Wnioski
- Inhibicja mTOR może skutecznie zmienić charakterystykę guza szpiczaka wielokrotnego.
- Obrazowanie nieinwazyjne jest potężnym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania implikacji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
To multimodalne podejście obrazowe umożliwia podłużną, nieinwazyjną ocenę wzrostu i metabolizmu guza w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku szpiku kostnego, co wypełnia krytyczną lukę w przedklinicznych modelach szpiczaka. Dzięki połączeniu odczytów bioluminescencyjnych oraz PET/CT, metoda ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów terapeutycznych ukierunkowanych na interakcje między guzem a zrąbem. Zapewnia ona pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez powiązanie inhibicji mTOR z mierzalnymi zmianami w bioluminescencji guza i metabolizmie glukozy w czasie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez pomiar zmian w bioluminescencji guza jako bezpośredniego odczytu żywotności komórek szpiczaka wykazujących ekspresję lucyferazy in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu za pomocą seryjnego, nieinwazyjnego obrazowania, co zmniejsza zależność od histologii końcowej.
- Wartość predykcyjna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez korelację inhibicji mTOR z trwałym obniżeniem sygnału guza, co wskazuje na zaangażowanie celu i modulację szlaku.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane modele ksenoprzeszczepów do późniejszego przesiewu związków poprzez ustalenie bazowej bioluminescencji i strumienia metabolicznego w przeszczepionych guzach.
- Wyniki ilościowe: Generuje podłużne metryki bioluminescencji oraz standaryzowaną wartość pobrania (SUV) z obrazowania PET/CT, co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź i analizę przebiegu czasowego.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wspiera skalowalną ocenę wielu szlaków biochemicznych w wielu cyklach terapeutycznych bez konieczności powtarzanego uśmiercania zwierząt.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje niszę szpiku kostnego w ludzkim szpiczaku mnogim, w której przeżycie guza zależy od interakcji ze stromą, których nie da się odtworzyć in vitro.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wczesną modulację celu (poprzez BLI) z późniejszymi efektami metabolicznymi (poprzez FDG-PET), co wspiera decyzje go/no-go oparte na biomarkerach.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podłużny monitoring wpływu terapeutycznego, ograniczając ryzyko niepowodzenia w późnych etapach poprzez potwierdzenie mechanizmu działania w klinicznie istotnym mikrośrodowisku.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, zapewniając ortogonalną walidację aktywności farmakologicznej w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez kwantyfikację masy guza i aktywności metabolicznej w odpowiedzi na inhibitory szlaków, wyjaśniając zależność od celu w niszy szpiku kostnego.
- Przesiewanie: Dostarcza modeli gotowych do analizy z powtarzalnym przeżyciem przeszczepu i wykrywalnym sygnałem, umożliwiając wysokowierną ocenę związków w wielu punktach czasowych.
- Analityka: Zapewnia odczyty dwumodalne — bioluminescencję dla objętości guza oraz FDG-PET dla strumienia metabolicznego — co pozwala zespołom odróżnić efekty cytostatyczne od cytotoksycznych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne zmiany farmakodynamiczne z przedklinicznymi punktami końcowymi skuteczności, wspierając ciągłość od mechanizmu do wyniku.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do oceny celów zależnych od stromy w portfelach onkologicznych, maksymalizując zwrot z inwestycji (ROI) w rozwój modeli.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez korelację inhibicji celu z jednoczesnymi zmianami w obrębie wzrostu guza i metabolizmu glukozy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje podłużne gromadzenie danych dzięki powtarzalnym protokołom obrazowania, co minimalizuje zmienność międzyzwierzęcą.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, dostarczając wczesnych, ilościowych dowodów na modulację guza za pośrednictwem celu, co ogranicza inwestycje w nieefektywne kandydaty.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w przypadku tych, które wykazują trwałe zaangażowanie celu w modelu wiernie oddającym mikrośrodowisko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w modelowaniu ksenoprzeszczepów, obrazowaniu bioluminescencyjnym oraz obsłudze i analizie wyników PET/CT dla małych zwierząt.
- Zależne od dostępu do systemów obrazowania umożliwiających bioluminescencję i PET/CT, a także infrastruktury do obsługi znakowanego radioizotopem FDG oraz D-lucyferyny.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie farmakologii in vivo, obrazowania i analizy danych, aby zapewnić spójny wybór i kwantyfikację obszarów zainteresowania (ROI).
- Wymaga rozważenia adaptacji przy rozszerzaniu metody na inne modele nowotworów, ponieważ wydajność przyjęcia przeszczepu i stabilność sygnału mogą się różnić w zależności od linii komórkowej i mikrośrodowiska.
- Ograniczenia praktyczne obejmują tłumienie sygnału przez tkanki nadległe oraz wymóg postu przed wstrzyknięciem FDG w celu zminimalizowania nieswoistego wychwytu, zgodnie z opisem w protokole.
