Name: Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Poznaj multimodalną bioluminescencyjną i pozytroniczną tomografię emisyjną szpiczaka mnogiego u myszy NOG. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne badanie wpływu hamowania mTOR na guzy szpiku kostnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem VA MERIT1I01BX001532 od Departamentu Stanów Zjednoczonych ds. Weteranów Biomedical Laboratory Research and Development Service (BLRDS) dla P.F., a E.C. dziękuje za wsparcie od VA Clinical Science R&D Service (Merit Award I01CX001388) oraz VA Rehabilitation R&D Service (Merit Award I01RX002604). Dalsze wsparcie pochodziło z grantu zalążkowego UCLA dla J.K. Treści te niekoniecznie reprezentują poglądy Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych lub rządu Stanów Zjednoczonych.

Wszystkie procedury opisane poniżej na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) systemu opieki zdrowotnej VA w Los Angeles i były wykonywane w sterylnych i wolnych od patogenów warunkach.
1. Przygotowanie komórek 8226 wykazujących ekspresję lucyferazy (8226-LUC)
<ol>
	<li>Utrzymuj ludzką linię komórkową MM, 8226, w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla (CO2).</li>
	<li>Wygeneruj stabilne komórki reporterowe 8226 z ekspresją LUC przez transfekcję 1 x 106 komórek 8226 wektorem reporterowym lucyferazy, a następnie selekcją za pomocą higromycyny (100 - 350 mg / ml), jak opisano wcześniej6.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w standardowych sterylnych warunkach hodowli przez 2 - 3 tygodnie, zmieniając pożywkę co drugi dzień, aż do wytworzenia stabilnie transfekowanej linii komórkowej 8226.</li>
	<li>Potwierdź aktywność lucyferazy in vitro w 1 x 106 transfekowanych komórkach / 100 μL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), dodając substrat lucyferazy, D-lucyferynę (150 μg / ml roztworu roboczego we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej) i mierząc bioluminescencję komórek w probówce lub 96-dołkowej płytce za pomocą luminometru6.</li>
</ol>
2. Ortotopowy model ksenoprzeszczepu
<ol>
	<li>Trzymaj myszy NOG (w wieku 4-6 tygodni, samce lub samice) w sterylnych/wolnych od patogenów warunkach w odpowiedniej placówce opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Przygotuj 8226 komórek transfekowanych LUC do wstrzyknięcia dożylnego myszom NOG (~5 x 106 komórek / mysz) w dniu eksperymentu. Umyj komórki 3x w lodowatym PBS, policz je i ponownie zawieś w lodowatym PBS (bez antybiotyków i FBS) w końcowym stężeniu 5 x 106 komórek/200 μL PBS) w sterylnej probówce. Trzymaj komórki na lodzie i rzuć wyzwanie myszom tak szybko, jak to możliwe (w ciągu 30 - 120 minut).</li>
	<li>Znieczulić mysz (izofluranem, 1% - 3% w powietrzu w tempie 0,5 - 1 l/min) i ułożyć zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej z głową skierowaną na zewnątrz. Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy.</li>
	<li>Wstrzyknąć komórki 8226-LUC myszom przez żyłę ogonową (200 μl/wstrzyknięcie) za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły 26-G. 
	Uwaga: Lampa grzewcza może być używana do ogrzewania ogona, rozszerzając w ten sposób żyłę i zwiększając skuteczność zastrzyków.</li>
	<li>Zwróć zwierzę do jego klatki domowej i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją.</li>
	<li>Potwierdź wszczepienie komórek 8226-LUC do szkieletu myszy, mierząc BLI u znieczulonych myszy (opisanych poniżej i pokazanych w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). 
	Uwaga: Wysięki BM mogą być również barwione pod kątem ekspresji ludzkiego CD45 za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) lub za pomocą immunohistochemii pobranej kości (<silna klasa = "xfig" >Figura 1C).</li>
</ol>
3. Pomiar BLI In Vivo
Uwaga: Zazwyczaj, mierzalne BLI z wszczepionych guzów u myszy można zaobserwować po raz pierwszy między 10 - 20 dniem po prowokacji, ale może to wymagać eksperymentalnego ustalenia.
<ol>
	<li>Znieczulić mysz (izofluranem, 1% - 3% w powietrzu w tempie 0,5 - 1 l/min) i sprawdzić poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy.</li>
	<li>Podać zwierzęciu wstrzyknięcie IP (200 μl/wstrzyknięcie) substratu D-lucyferyny "in vivo" (30 mg/ml rozcieńczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej).</li>
	<li>Zmierz BLI w ciągu 5 - 10 minut, po wstrzyknięciu substratu lucyferyny (chociaż aktywność BLI można obserwować u myszy do 45 - 60 minut), umieszczając znieczulone zwierzę w pozycji leżącej w systemie obrazowania małych zwierząt (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Wybierz analizę luminescencyjną i rentgenowską i uzyskaj obrazy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Zmierz średnie promieniowanie (fotony/s/cm2/steradian) w wybranych obszarach zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania do obrazowania (Rysunek 4).</li>
		<li>Umieść zwierzę z powrotem w klatce domowej i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieje (około 15 - 20 minut).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Leczenie myszy terapią celowaną
<ol>
	<li>Zmierz wyjściowy BLI i losowo podziel zwierzęta na grupy poddane działaniu substancji (4 - 8 myszy/grupę).</li>
	<li>Leczenie myszy polegało na wstrzyknięciu IP (200 μl/wstrzyknięcie) temsyrolimusu (0,2 - 40 mg/kg myszy), stosując schemat pięciu codziennych wstrzyknięć IP, po których następują 2 dni odpoczynku i dodatkowe pięć codziennych wstrzyknięć11.</li>
	<li>Zmierz aktywność lucyferazy (fotony/s/cm2/steradian) 2 razy w tygodniu, jak opisano w sekcji 3 i wykreśl zmianę BLI w czasie. Zmiany w BLI guza można przedstawić jako seryjne obrazy myszy (<silna klasa="xfig">Ryc. 5B). 
	Uwaga: Zaleca się codzienne monitorowanie zwierząt do momentu, gdy wystąpią u nich następujące objawy (zazwyczaj w ciągu 45 - 60 dni od początkowego wyzwania): utrata masy ciała (utrata masy ciała o więcej niż 10% w stosunku do masy ciała przed implantacją) i/lub paraliż kończyn tylnych, w którym to czasie powinny zostać poddane eutanazji przy użyciu komory CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
5. Analiza PET/CT z użyciem 18F-FDG do pomiaru zmian w metabolizmie guza
<ol>
	<li>Pościć zwierzęta w ich klatce domowej, usuwając im pokarm na 24 godziny przed eksperymentem, aby uniknąć nadmiernego nieswoistego wychwytu 18F-FDG.</li>
	<li>Przygotować 18sond PET FDG znakowanych radioizotopem F (50 - 100 μCi/wstrzyknięcie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej) w dniu eksperymentu. Rejestruj czas i aktywność sondy 18F-FDG za pomocą kalibratora dawki. 
	Uwaga: Ponieważ 18F ma stosunkowo krótki okres półtrwania (~2 h), należy starannie przygotować i zaplanować użycie tych sond.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę (izofluranem, 1% - 3% w powietrzu w tempie 0,5 - 1 l/min) i umieścić je w pozycji leżącej na poduszce grzewczej z głową skierowaną na zewnątrz. Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy.</li>
	<li>Wstrzyknąć sondę przez żyłę ogonową (100 μl/wstrzyknięcie) za pomocą osłoniętej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły 26 G. 
	Uwaga: Lampa grzewcza może być używana do ogrzewania ogona, rozszerzając w ten sposób żyłę i zwiększając skuteczność zastrzyków.</li>
	<li>Zmierzyć radioaktywność resztkową w igle/strzykawce w kalibratorze dawki i zanotować aktywność oraz czas. 
	Uwaga: Standaryzacja inkubacji, dawkowania i czasu inkubacji myszy jest niezbędna do zapewnienia odtwarzalności i porównywalności danych.</li>
	<li>Utrzymuj myszy w znieczuleniu i w temperaturze 37 °C za pomocą poduszki grzewczej przez cały okres pobierania sondy (~ 45 - 90 min). 
	Uwaga: Ważne jest, aby myszy pozostawały w stanie spoczynku i w temperaturze 37 °C, aby uniknąć niespecyficznego pobrania sondy.</li>
	<li>Wstrzykiwanie sondy 18F-FDG należy rozłożyć w czasie w odstępach około 20 do 30 minut, aby zapewnić podobny czas znakowania u myszy. 
	Uwaga: Prawidłowy przebieg pracy i czas wstrzykiwania sondy spowodują optymalne i powtarzalne warunki obrazowania.</li>
	<li>Zmierz aktywność 18F-FDG w systemie obrazowania małych zwierząt PET/CT w wybranych regionach zainteresowania, które odpowiadają wszczepionym guzom (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6). 
	Uwaga: Początkowo zalecana jest 10-minutowa statyczna ekspozycja PET i 2-minutowa ekspozycja na CT, ale dokładne czasy ekspozycji mogą wymagać eksperymentalnego określenia.</li>
	<li>Zwróć zwierzęta do ich domowych klatek i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją. Umieść myszy w dedykowanym pomieszczeniu zwrotnym przez 24 godziny, podczas gdy sonda rozpada się do poziomu tła. 
	Uwaga: Ze względu na krótki okres półtrwania wynoszący 18F, wielokrotne pomiary przy użyciu nowej sondy można wykonywać nawet 2 razy w tygodniu.</li>
</ol>

<ol><li>Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19541364">Multiple Myeloma.</a> The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).</li>
<li>Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Multiple+Myeloma+Bone+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease.</a> BoneKEy Reports. 1, 135(2012).</li>
<li>Anderson, K. C., Carrasco, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Myeloma.</a> Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).</li>
<li>Reagan, M. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+Bone+Marrow+Niche%3A+Translational+Insights+and+Cancer-Driven+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).</li>
<li>Frost, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Target+of+Rapamycin+Inhibitors+Induce+Tumor+Cell+Apoptosis+in+Vivo+Primarily+by+Inhibiting+Vegf+Expression+and+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis.</a> Journal of Oncology. 2013, 897025(2013).</li>
<li>Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-Binding+Molecule+Targeting+the+Adaptive+Hypoxic+Response+in+Multiple+Myeloma+Has+Potent+Antitumor+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity.</a> Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).</li>
<li>Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow+Microenvironment+and+the+Identification+of+New+Targets+for+Myeloma+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy.</a> Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).</li>
<li>Campbell, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laglambda-1%3A+A+Clinically+Relevant+Drug+Resistant+Human+Multiple+Myeloma+Tumor+Murine+Model+That+Enables+Rapid+Evaluation+of+Treatments+for+Multiple+Myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma.</a> International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+New+Model+of+Human+Multiple+Myeloma+Using+Nod%2FScid%2FGammac%28Null%29+%28Nog%29+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod%2FScid%2FGamma%28C%29%28Null%29+Mouse%3A+An+Excellent+Recipient+Mouse+Model+for+Engraftment+of+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Frost, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Antitumor+Effects+of+the+Mtor+Inhibitor+Cci-779+against+Human+Multiple+Myeloma+Cells+in+a+Xenograft+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model.</a> Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).</li>
<li>Asosingh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Hypoxic+Bone+Marrow+Microenvironment+in+5t2mm+Murine+Myeloma+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression.</a> Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).</li>
<li>Storti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Inducible+Factor+%28Hif%29-1alpha+Suppression+in+Myeloma+Cells+Blocks+Tumoral+Growth+in+Vivo+Inhibiting+Angiogenesis+and+Bone+Destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction.</a> Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).</li>
<li>Fryer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Novel+Mouse+Model+of+Multiple+Myeloma+and+Its+Use+in+Preclinical+Therapeutic+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment.</a> PLoS One. 8 (2), e57641(2013).</li>
<li>Gould, S. J., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+Luciferase+as+a+Tool+in+Molecular+and+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology.</a> Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).</li>
<li>Czernin, J., Phelps, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positron+Emission+Tomography+Scanning%3A+Current+and+Future+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Medicine%22%5BJournal%5D)">Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications.</a> Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).</li>
<li>Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. <a target="_blank" href="https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/circ.122.suppl_21.A12657">Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition.</a> Circulation. 122 (21), (2010).</li>
<li>Wang, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+Vivo+Molecular+Imaging+Probe+%2818%29F-Annexin+B1+for+Apoptosis+Detection+by+Pet%2FCt%3A+Preparation+and+Preliminary+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation.</a> Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).</li>
</ol>

Autor Kevin Francis jest pracownikiem firmy Perkin-Elmer.

Pomimo różnorodności przedklinicznych modeli ksenoprzeszczepów MM 6,9,11,12,13, możliwość badania interakcji guza/BM w mikrośrodowisku BM pozostaje trudna14. Opisane tutaj techniki pozwalają na szybkie i powtarzalne wszczepienie komórek nowotworowych 8226-LUC w szkielecie myszy NOG.
Kluczowe kroki w tym proto...

MM to nieuleczalna choroba składająca się ze złośliwych komórek B osocza, które infiltrują BM i powodują zniszczenie kości, anemię, zaburzenia czynności nerek i infekcje. Mnogi szpikowe stanowią 10% - 15% wszystkich nowotworów hematologicznych1 i jest najczęstszym nowotworem obejmującym szkielet2. Rozwój MM wynika z onkogennej transformacji długożyciowych komórek plazmatycznych, które są zakładane w centrach rozrodczych tkanek limfatycznych, zanim ostatecznie trafią do klasy BM<sup="xref">3. BM charakteryzuje się wysoce niejednorodnymi niszami; w tym różnorodne i krytyczne składniki komórkowe, regiony o niskim pO2 (niedotlenienie), rozległe unaczynienie, złożone matryce zewnątrzkomórkowe oraz sieci cytokin i czynników wzrostu, z których wszystkie przyczyniają się do nowotworu MM 4. W związku z tym opracowanie rozproszonego modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka szpiczałkowego charakteryzującego się guzami, które są ściśle wszczepione w BM, byłoby bardzo potężnym i klinicznie istotnym narzędziem do badania patologii szpiczaka szpiczakanego mnogiego in vivo5,6. Jednak liczne przeszkody techniczne mogą ograniczać skuteczność większości modeli ksenoprzeszczepów, co sprawia, że są one kosztowne i trudne do zastosowania. Obejmuje to problemy związane ze spójnym i powtarzalnym wszczepianiem guza w niszy BM, wydłużony czas do rozwoju guza oraz ograniczenia w możliwości bezpośredniego obserwowania i mierzenia zmian wzrostu/przeżycia guza bez konieczności poświęcania myszy w trakcie eksperymentu7,8.
Ten protokół wykorzystuje zmodyfikowany model ksenoprzeszczepu, który został początkowo opracowany przez Miyakawę i wsp.9, w którym dożylne (IV) prowokowanie komórkami szpiczaka skutkuje "rozsianymi" nowotworami, które konsekwentnie i powtarzalnie wszczepiają się w BM myszy NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG)10. Wizualizacja tych guzów in situ jest osiągana poprzez stabilną transfekcję ludzkiej linii komórkowej 8226 MM z allelem LUC i seryjny pomiar zmian w BLI wytwarzanym przez te wszczepione komórki nowotworowe6. Co ważne, model ten można rozszerzyć w celu wykorzystania różnych innych linii ludzkich komórek MM wykazujących ekspresję LUC (np. U266 i OPM2) o podobnej skłonności do specyficznego wszczepiania się w szkielecie myszy NOG. Po identyfikacji nowotworów za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego myszy następuje pomiar wychwytu sond radiofarmaceutycznych (takich jak 18F-FDG) za pomocą PET/CT. Razem pozwala to na dodatkową charakterystykę krytycznych szlaków biochemicznych (tj. zmian w metabolizmie, zmian w hipoksji i indukcji apoptozy) w mikrośrodowisku guza/BM. Główne zalety tego modelu można podkreślić poprzez dostępność szerokiej gamy znakowanych radioizotopowo, bioluminescencyjnych i fluorescencyjnych sond i markerów, które można wykorzystać do badania progresji i patologii MM in vivo.

<table><tbody><tr><td>8226 ludzka linia komórkowa szpiczaka</td><td>ATCC</td><td>CCL-155</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Myszy (NOG)</td><td>Jackson Labs</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo Substrate Lucyferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxyprobe-1Kit</td><td>HPL</td><td>HP1-100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45 (klon H130)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555483</td><td>Używany do cytometrii przepływowej w celu identyfikacji ludzkich komórek nowotworowych CD45 + w wysięku królika BM</td></tr><tr><td>anty-ludzkiego CD45 (klon D3F8Q)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa Technologia</td><td>70527</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w immunohistochemii wyciętej kości</td></tr><tr><td>Kozia IgG anty-królicza (sprzężona HRP)</td><td>ABCAM</td><td>ab205718</td><td>Przeciwciało seconday stosowane do immunohistochemii wyciętej kości</td></tr><tr><td>System testów reporterowych z podwójną lucyferazyą</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.5 Lucyferazy Reporter Vector</td><td>Promega</td><td>E1310</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS In System obrazowania Vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania PET/CT Sofie G8</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy nog

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Guzy szpiczaka mnogiego (MM) wszczepiają się do szpiku kostnego (BM), a ich przeżycie i progresja zależą od złożonych interakcji molekularnych i komórkowych, które istnieją w tym mikrośrodowisku. Jednak mikrośrodowisko BM nie może być łatwo odtworzone in vitro, co potencjalnie ogranicza fizjologiczne znaczenie wielu modeli eksperymentalnych in vitro i ex vivo. Problemy te można przezwyciężyć, wykorzystując model ksenoprzeszczepu, w którym transfekowane lucyferazy (LUC) komórki 8226 MM zostaną specyficznie wszczepione w szkielet myszy. Gdy myszom tym podaje się odpowiedni substrat, D-lucyferynę, wpływ terapii na wzrost guza i przeżycie można przeanalizować, mierząc zmiany w obrazach bioluminescencyjnych (BLI) wytwarzanych przez guzy in vivo. Te dane BLI w połączeniu z analizą pozytronicznej tomografii emisyjnej/tomografii obliczeniowej (PET/CT) przy użyciu markera metabolicznego 2-deoksy-2-(18F)fluoro-D-glukozy (18F-FDG) służą do monitorowania zmian w metabolizmie guza w czasie. Te platformy obrazowania pozwalają na wiele nieinwazyjnych pomiarów w mikrośrodowisku guza/BM.

W wstępnych badaniach pilotażowych wstrzyknięcia dożylne (IV) komórek 8226-LUC myszom NOD/SCID nie doprowadziły do rozwoju guzów MM z przerzutami do szpiku kostnego (BM), mimo że guzy MM typu płaskiego powstawały łatwo (100% skuteczności). W przeciwieństwie do tego, wyzwania IV komórkami 8226 u myszy NOG generowały (w ciągu 15 – 25 dni) guzy w szkielecie (a jedynie rzadko tworzyły guzy w tkankach pozaszkieletowych, takich jak wątroba czy śledziona). Ponieważ guzów w szkielecie nie można b...

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące roli mikrośrodowiska szpiku kostnego i przeżywalności wszczepionych guzów szpiczaka. Główną zaletą tej procedury jest to, że można ją zastosować do podłużnych badań przeciwlekowych i wykorzystać do nieinwazyjnego oznaczania wielu szlaków biochemicznych. W dniu eksperymentu najpierw umyj komórki transfakultatywne 8226 Lucyferazy trzy razy w lodowatym PBS przy 200 RCF przez pięć minut na odwirowanie i ponownie zawieś osad w świeżym, lodowatym PBS przy pięć razy dziesięć do szóstych komórek na 200 mikrolitrów lodowatego PBS na mysz.Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy NOG w wieku od czterech do sześciu tygodni i nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia. Załaduj komórki do jednomililitrowej strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 26. Wstrzyknij całą objętość komórek do żyły ogonowej zwierzęcia przed powrotem myszy do klatki, monitorując aż do pełnego wyzdrowienia.Dziesięć do dwudziestu dni po prowokacji wstrzyknąć każdemu wszczepionemu zwierzęciu 200 mikrolitrów substratu D-lucyferyny in vivo w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dootrzewnowo. W ciągu 5 do 10 minut od wstrzyknięcia należy umieścić znieczulone zwierzęta w pozycji leżącej na plecach w systemie obrazowania małych zwierząt. Zmierz średnie promieniowanie w wybranych obszarach zainteresowania w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania.W przypadku terapii celowanej guzów lucyferazy 8226, po zmierzeniu wyjściowej bioluminescencji u każdego zwierzęcia, jak właśnie pokazano, losowo podziel zwierzęta na grupy leczenia i potraktuj każdą mysz serią 200 mikrolitrowych wstrzyknięć IP temsyrolimusu lub kontroli soli fizjologicznej. Mierz aktywność lucyferazy dwa razy w tygodniu i wykreślaj zmiany bioluminescencji w czasie. Aby zmierzyć zmiany w metabolizmie guza, najpierw usuń pokarm z domowej klatki myszy na 24 godziny, aby uniknąć nadmiernego niespecyficznego wychwytu fludeoksyglukozy znakowanej radioaktywnie.Następnego dnia rozcieńczyć od 500 do 100 mikrokiurów 18 znakowanej radioaktywnie fluorowej sondy fludeoksyglukozy w sterylnej soli fizjologicznej do końcowej objętości 100 mikrolitrów na mysz i zarejestrować czas i aktywność sond za pomocą kalibratora dawki. Gdy sondy są gotowe, umieść pierwsze znieczulone zwierzę na poduszce grzewczej z głową skierowaną na zewnątrz i użyj osłoniętej strzykawki insulinowej o pojemności jednego mililitra, wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby wstrzyknąć 100 mikrolitrów sondy do żyły ogonowej. Zmierzyć radioaktywność resztkową w igle i strzykawce za pomocą kalibratora dawki i zanotować aktywność i czas.Następnie zmierz znakowaną radioaktywnie aktywność fludeoksyglukozy w wybranych obszarach zainteresowania, które odpowiadają przeszczepionym guzom w systemie obrazowania PET CT dla małych zwierząt. Udane wszczepienie guza szpiku kostnego można potwierdzić za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, jak pokazano. Obrazowanie seryjne wielu zwierząt może być wykorzystane do wizualizacji rozmieszczenia guzów szpiczaka mnogiego przeszczepionych szpikowi kostnemu.Dodatkowo obrazowa analiza rentgenowska pokazuje szybkie i nieinwazyjne określenie dokładnej lokalizacji i rozmieszczenia guzów szpiczaka mnogiego w szkielecie myszy. Bioluminescencja wytwarzana przez te wszczepione komórki nowotworowe może być mierzona seryjnie i nieinwazyjnie w celu oceny zmian we wzroście guza. Ponadto można monitorować przeżywalność myszy leczonych inhibitorem mTOR temsyrolimusem, a emisję pozytonów i analizę tomografii komputerowej pod kątem wychwytu fludeoksyglukozy znakowanego radioizotopem guza można wykorzystać do wykazania zmian w metabolizmie glukozy za pośrednictwem temsyrolimusu.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wstrzyknąć komórkom IEV. Odkryliśmy, że niepowodzenie w wstrzyknięciu komórek do żyły powoduje powstawanie komórek nowotworowych niewszczepionych szpikiem w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia i mikrotomografia komputerowa, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wpływu guza na architekturę kości oraz nienowotworowe składniki komórkowe i molekularne środowiska szpiku.

multimodal-bioluminescent-positronic-emission-tomographycomputational

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Eksperymentalny model przerzutów do kości u myszy został ustanowiony po dokardialnym podaniu komórek guza piersi wykazujących ekspresję lucyferazy. Rozwój guza oraz powstałe zmiany osteolityczne monitorowano podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz mikro-CT.

Monitorowanie przerzutów nowotworowych i zmian osteolitycznych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i mikro-tomografii komputerowej

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

W tym filmie opisujemy fluorescencyjną tomografię molekularną lub FMT do obrazowania in vivo fluorescencyjnych ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem w modelach mysich. Technika ta jest przydatna do wyjaśnienia efektów terapii przeciwnowotworowych na poziomie molekularnym.

Fluorescencyjna tomografia molekularna: technika obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem fluorescencyjnym w modelu mysim

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Poznaj multimodalną bioluminescencyjną i pozytroniczną tomografię emisyjną szpiczaka mnogiego u myszy NOG. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne badanie wpływu hamowania mTOR na guzy szpiku kostnego.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG (Wideo) | JoVE Journal

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Przeglądaj więcej filmów