Tomografia fluorescencji rozproszonej w dziedzinie czasu pod kontrolą tomografii komputerowej u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie obrazów fluorescencyjnych ekspresji receptora naskórkowego czynnika wzrostu w mysim modelu glejaka ortotopowego. Osiąga się to poprzez zaszczepienie lewej półkuli mózgowej myszy A IIC zielonym białkiem fluorescencyjnym eksprymującym ludzkie komórki glejaka U2 51. Po tym, jak guz rośnie przez dwa tygodnie, myszy wstrzykuje się koktajl dwóch fluorescencyjnych znaczników.

Mysz jest następnie obrazowana w systemie rentgenowskim dla małych zwierząt w celu zebrania danych anatomicznych niezbędnych do dokładnej rekonstrukcji obrazu. Dane są wykorzystywane do anatomicznego pozycjonowania źródła i wykrywania lokalizacji systemu tomografii optycznej, a dostosowane oprogramowanie służy do zbierania danych fluorescencyjnych i konstruowania końcowego obrazu. Ostatecznie metoda ta może skonstruować obraz guza na podstawie nadekspresji naskórkowego czynnika wzrostu przy użyciu zarówno obrazowania fluorescencyjnego, jak i rentgenowskiego, których dokładność można porównać z obrazowaniem rezonansu magnetycznego wzmocnionego kontrastem.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak para ładunków, tomografia fluorescencyjna małych zwierząt oparta na urządzeniu, jest to, że wykrywanie zliczania pojedynczych fotonów za pomocą lamp powielających zdjęcia oferuje znacznie wyższą czułość i zakres dynamiczny wykrywania światła. Metoda ta może być ostatecznie wykorzystana do monitorowania, mierzenia sukcesu terapii molekularnych poprzez pomiar ekspresji ich celów, podczas gdy guzy podskórne można łatwo obrazować za pomocą metod nietomograficznych wykorzystujących obrazowanie powierzchniowe. System ten jest przeznaczony do obrazowania przez tkankę o grubości do kilku centymetrów, dzięki czemu szczególnie dobrze nadaje się do obrazowania, kontrastu, dostarczania środka i przeciekania do guzów mózgu.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ekspresję biomarkerów raka, może być również stosowana w innych badaniach nad chorobami, takimi jak infekcje, otyłość lub elementy starzenia, takie jak choroba Alzheimera. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności ze względu na rozproszony charakter rozchodzenia się światła w tkance biologicznej i trudności w zastosowaniu tomografii rentgenowskiej do rekonstrukcji rozproszonego światła. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Ponieważ etapy zbierania danych i rekonstrukcji obrazu mogą być trudne do nauczenia, ważne jest, aby dane zebrane z systemu fluorescencyjnego były dobrze skalibrowane. Pakiet oprogramowania został zaprojektowany do odczytywania danych optycznych i wykorzystywania obrazów tomografii rentgenowskiej do tworzenia siatki elementów skończonych, która jest używana jako szablon przestrzenny do rekonstrukcji fluorescencji. Na początek umieść znieczuloną, atymiczną nagą mysz na sterylnej serwety chirurgicznej i potwierdź głębokość znieczulenia przed przystąpieniem do czyszczenia i dezynfekcji skóry w obszarze nacięcia.

Za pomocą Betadine umieść sterylną serwetę chirurgiczną na miejscu nacięcia za pomocą skalpela, wykonaj małe nacięcie nieco na lewo od linii środkowej i 0,5 centymetra za linią wewnątrzgałkową. Oczyść powierzchnię czaszki, usuwając tkankę łączną, aby można było zidentyfikować punkty orientacyjne. Po odsłonięciu czaszki użyj wiertła o dużej prędkości ze sterylnym wiertłem o długości jednego milimetra, aby zrobić otwór, który znajduje się dwa milimetry na lewo od linii środkowej i dwa milimetry za bgma.

Załadować strzykawkę Hamilton Micros igłą o rozmiarze 27 z komórkami, które mają być wszczepione. Następnie umieść mysz na ramce stereotaktycznej. Następnie potwierdź głęboką płaszczyznę chirurgiczną i estetyczną za pomocą uszczypnięcia palca u nogi i załóż serwetę chirurgiczną na zwierzę.

Następnie przymocuj załadowaną strzykawkę do ramy stereotaktycznej. Umieścić strzykawkę nad otworem w czaszce i umieścić końcówkę igły trzy milimetry poniżej powierzchni czaszki. Następnie wycofaj igłę o jeden milimetr, aby utworzyć kieszeń.

Następnym krokiem jest powolne wstrzykiwanie komórek do lewej półkuli mózgu przez okres pięciu minut. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy wyjąć igłę i przetrzeć otwór za pomocą leku Betadine. Aby zapobiec rozwojowi komórek poza miejscem wstrzyknięcia, wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i wypełnij odsłonięty otwór wstępnie ciepłym woskiem kostnym.

Na koniec zamknij miejsce nacięcia sterylnym nylonowym szwem z pięciu och. Umieść mysz z powrotem w podgrzewanej klatce i monitoruj do czasu wyzdrowienia po wyzdrowieniu, wstrzyknij myszy 130 mikrolitrów 0,1 miligrama na kilogram buprenorfiny IP i pozwól guzowi rosnąć przez 14 dni przed obrazowaniem. W dniu obrazowania za pomocą myszy należy uruchomić system, aby umożliwić rozgrzanie laserów i detektorów światła przez około 20 minut.

Aby uniknąć dryftów i czułości systemu, umieść dyfuzor liniowy o wymiarach 100 stopni na cztery stopnie w bezpośrednim środku suwnicy obrazowania, aby rozproszyć lasery wzbudzające między kanałami detekcji systemu z równą intensywnością. Ręcznie wyreguluj kąt dyfuzora, aby zmaksymalizować ilość sygnału wykrywanego przez wszystkie pięć kanałów zbierania światła. Następne miejsce gęstość optyczna.

Dwa filtry o neutralnej gęstości przed wszystkimi fotopowielaczami do wykrywania fluorescencji, zwane PMT i gęstością optyczną. Jeden filtr o neutralnej gęstości przed wszystkimi detekcjami transmitancji. PMT zbierają 100 funkcji rozpraszania impulsów czasowych lub T psf lasera, z których każda ma jednosekundowy czas integracji dla każdego lasera sekwencyjnie, normalizują każdy TPSF przez odniesienie lasera, korygując dryft czasowy w odniesieniu do lasera i uśredniając ze wszystkich iteracji dla każdego detektora i każdego lasera osobno.

Te średnie TPS są specyficznymi dla detektora funkcjami odpowiedzi instrumentu wykorzystywanymi w optycznej rekonstrukcji obrazu na 12 godzin przed procedurą obrazowania. Wstrzyknij myszowi testowemu koktajl fluorescencyjnych znaczników. Dokładna kalibracja systemu tomografii fluorescencyjnej i ograniczenie ruchu zwierząt to najtrudniejsze aspekty tej procedury.

Rekonstrukcja zobrazowania jest na tyle nieprzemyślana, że nawet drobne błędy w zbieraniu danych mogą prowadzić do znacznych błędów w zrekonstruowanym obrazie. Aby zapewnić zbieranie dokładnych danych, unieruchamiamy mysz tak dobrze, jak to możliwe i powtarzamy kalibrację przed i po skanowaniu, aby zwiększyć szansę na uzyskanie dokładnej kalibracji Gdy będzie gotowy. Umieść znieczulone zwierzę na wspornikach z włókna szklanego łóżka do obrazowania.

Po umieszczeniu głowy w stożku nosowym w celu ciągłego znieczulenia gazowego, zabezpiecz zęby na belce gryzowej i przyklej zwierzę taśmą. Mysz należy umieścić w przybliżonym środku gantry obrazowania. Pozycjonowanie to można kierować, obracając laser wzbudzający o 180 stopni wokół myszy, zapewniając, że punkt ogniskowy lasera oświetla punkt mniej więcej na środku myszy z perspektywy lasera pod wszystkimi kątami.

Po prawidłowym ustawieniu ostrożnie przenieś stół obrazowania i mysz do mikrotomografu komputerowego i zbierz informacje anatomiczne w rozdzielczości 93 mikrometrów izotropowych dla całej głowy myszy. Zwizualizuj stos obrazów CT i wybierz wycinki, które mają być obrazowane za pomocą systemu tomografii fluorescencyjnej. Ostrożnie przenieś stół obrazowania i mysz z powrotem do systemu tomografii fluorescencyjnej.

Wybierz liczbę pozycji źródła dla każdego wycinka obrazu, czas integracji dla każdego pomiaru TPSF, liczbę iteracji dla każdej pozycji źródła oraz pozycję i liczbę żądanych wycinków obrazowania z utworzonego wcześniej stosu obrazów CT. Następnie umieść filtry przed PMT do detekcji fluorescencji, aby zablokować całe światło wzbudzenia i gęstość optyczną do filtrów o neutralnej gęstości przed PMT do detekcji transmitancji. Aby uniknąć nasycenia tych detektorów, uruchom oprogramowanie do akwizycji danych zbierające fluorescencję i transmitancję t psf w każdej zdefiniowanej pozycji detektora źródłowego na obu długościach fal wzbudzenia.

Dla każdego zebranego zestawu T psfs monitoruj i rejestruj intensywność lasera za pomocą referencyjnego kanału PMT. Określ zewnętrzną powierzchnię myszy i położenie stołu do obrazowania. Podeprzyj pręty z obrazów CT i twórz maski, które zakrywają granice myszy i pręta obrazowania.

Oddzielnie użyj maski myszy, aby utworzyć siatkę elementów skończonych zwierzęcia za pomocą prawie szybkiego oprogramowania. Lokalizuj pozycje źródła i detektora z systemu tomografii fluorescencyjnej na powierzchni siatki na podstawie mikro CT i fluorescencyjnych współrzędnych rejestracji przestrzennej. Usuń optyczne punkty danych skojarzone z pozycjami źródła lub detektora, które oddziałują z lokalizacją stołu obrazowania.

Pręty nośne normalizują dane zebrane w każdej pozycji detektora źródła przez odniesienie lasera, korygując dryft czasowy w odniesieniu laserowym i korygując czułość filtra, które zostały określone na podstawie testów eksperymentalnych w momencie zakupu. Weź współczynnik borny danych dla każdej pozycji detektora źródła i pomnóż go przez symulację transmitancji w modelu do przodu opartą na siatce zwierzęcej elementów skończonych w celu uzyskania jednolitych właściwości optycznych. Ma to na celu złagodzenie błędów związanych ze sprzężeniem tkanek źródła lub detektora, skalibrowanie danych do modelu i dostosowanie danych do innych aspektów niedopasowania danych modelu, skonstruowanie wektora danych złożonego ze skalowanej różnicy danych współczynnika urodzonego zebranych na obu długościach fali.

Współczynnik skalowania jest wybierany tak, aby zmaksymalizować kontrast wiązania EGFR, przeprowadzić rekonstrukcję obrazu w dziedzinie czasu ze skalibrowanymi danymi różnicowymi przy użyciu TPSF dla każdego kanału detekcji jako danych wejściowych i utworzyć mapy fluorescencji widocznego docelowego znacznika wzmocnionego kontrastem. Oto przykład rekonstrukcji fluorescencyjnej nałożonej na współzarejestrowany obraz anatomiczny CT od myszy z guzem glejaka ortotopowego U2 51. Środek masy glejaka wyznaczony przez rekonstrukcję fluorescencyjną znajdował się w odległości jednego milimetra od środka masy guza, określonego przez kontrastowy rezonans magnetyczny

Oprogramowanie do akwizycji danych zostało zbudowane na zamówienie dla tego urządzenia, ale większość technik przetwarzania obrazu można wykonać za pomocą oprogramowania prawie szybkiego available@nearfasts.org. Dlatego podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że zarówno system, jak i dane są dokładnie skalibrowane przed rekonstrukcją obrazu. Kalibracja ta wymaga uwzględnienia czułości i różnic czasowych między detektorami Po rekonstrukcji obrazu znacznika docelowego biomarkera.

Podobne obrazowanie nieukierunkowanego znacznika zapewnia sposób korygowania wychwytu bez pośrednictwa receptora. Pozwala to na ilościowe określenie stopnia wiązania znacznika, a także gęstości receptora in vivo po jego opracowaniu. Technika ta zainspirowała innych badaczy do zaprojektowania systemów tomografii fluorescencyjnej pod kontrolą obrazowania rentgenowskiego i utorowała drogę do obrazowania całego ciała większych zwierząt.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment z rozlaną tomografią fluorescencyjną, który łączy rentgenowskie obrazowanie anatomiczne i systemy obrazowania optycznego do obrazowania biomarkerów raka.