Ilościowa metoda autoradiograficzna do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo

Pomiar regionalnych wskaźników syntezy białek w mózgu może śledzić reakcję mózgu na długoterminowe zmiany, takie jak te, które zachodzą podczas rozwoju i neuroplastyczności. Nasza metoda ma tę zaletę, że pomiary są w pełni ilościowe i są wykonywane na przytomnym zwierzęciu. Ilościowa technika autoradiograficzna pozwala na pomiary we wszystkich obszarach mózgu jednocześnie.

Procedurę zademonstrują Anita Torossian, absolwentka studiów podyplomowych w moim laboratorium, oraz Tianjian Huang, nasz chirurg zwierząt. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania do zabiegu, jak opisano w protokole tekstowym. Na etapie operacji użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać jednocentymetrowe nacięcie od górnej środkowej części lewego uda w kierunku linii środkowej, odsłaniając tętnicę i żyłę udową.

Wycofaj luźną skórę za pomocą chirurgicznych haczyków do skóry powyżej i po obu stronach nacięcia. Zabezpiecz haczyki skórne, przyklejając je taśmą do etapu operacji. Nałóż sterylny 0,9% chlorek sodu na odsłonięty obszar, aby utrzymać odpowiednią wilgotność.

Użyj kleszczy, aby stępić preparację, oddzielając tkankę łączną wokół niewielkiego odcinka tętnicy udowej i żyły. Ostrożnie oddziel tętnicę i żyłę. Teraz za pomocą kleszczy przeciągnij jedno pasmo wchłanialnego szwu zarówno pod żyłą udową, jak i tętnicą w najbardziej bocznym punkcie nacięcia.

Przeciągnij szew do połowy, aby końce były równe. W bardziej proksymalnym punkcie pachwiny użyj kleszczy, aby nawlec drugi szew tylko pod żyłą udową. Delikatnie zawiąż pół węzła, który będzie używany do ograniczania przepływu krwi.

W punkcie między pasmem A a pasmem B użyj kleszczy, aby przewlec trzeci szew tylko pod żyłę udową. Delikatnie zawiąż pełny węzeł, który będzie służył do ograniczania przepływu krwi. Uważaj, aby nie rozerwać żyły.

Delikatnie pociągnij za pasmo B, aby ograniczyć przepływ krwi. Użyj hemostatu, aby delikatnie pociągnąć pasmo B, aby utrzymać ograniczenie krwi. Teraz podłącz nieprzecięty koniec rurki PE do igły o rozmiarze 32 i jednomilimetrowej strzykawki wypełnionej heparynizowaną solą fizjologiczną.

Przepłucz cewnik, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wytnij mały otwór w ograniczonym obszarze żyły udowej za pomocą mikronożyczek i ostrożnie włóż kątowy koniec przepłukanej rurki PE ósemki w kierunku pasma B. Po włożeniu zwolnij napięcie pasma B i poprowadź cewnik dalej w górę żyły. Zaciśnij pasmo B wokół żyły zawierającej cewnik.

Za pomocą pasma C zawiąż dodatkowy węzeł wokół cewnika. Upewnij się, że ten węzeł nie chwyta tętnicy udowej. Delikatnie pociągnij do tyłu cylinder strzykawki, aby częściowo napełnić rurkę krwią, aby upewnić się, że cewnik został prawidłowo wszczepiony przed wprowadzeniem cewnika PE 10 do lewej tętnicy udowej przy użyciu tej samej procedury.

Po zabezpieczeniu cewników do żyły udowej i tętnicy zawiąż pasmo A w węzeł wokół obu cewników. Po przecięciu wszystkich nadmiaru szwów i usunięciu haczyków skórnych, przepłucz cewnik tętniczy heparynizowaną solą fizjologiczną, aby zapobiec zakrzepom. Kauteryzuj końce obu cewników, aby utworzyć uszczelnienie.

Umieść mysz w pozycji leżącej i wykonaj małe nacięcie u podstawy szyi, nakładając sól fizjologiczną na odsłonięty obszar. Włóż pusty metalowy pręt podskórnie od nacięcia szyi do nacięcia kości udowej. Przeprowadź cewniki przez pusty pręt i wyjdź z nacięcia szyi.

Po usunięciu wydrążonego pręta należy zamknąć nacięcie kości udowej szwem, a następnie zastosować analgezję pooperacyjną. Przełóż cewniki przez 30-centymetrową elastyczną pustą rurkę, aby zawiązać sprężynę, a następnie zszyj guzik sprężyny pod skórą, a następnie wykonaj znieruchomienie pooperacyjne. Przenieś mysz do przezroczystego cylindrycznego pojemnika z obrotowym uchwytem i ramieniem, aby pomieścić mysz w okresie rekonwalescencji.

Umieść ogrzewacz do rąk pod pojemnikiem, aby mysz była ciepła. Upewnij się, że mysz jest w normalnym stanie fizjologicznym na początku eksperymentu, pobierając próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby podać znacznik dożylnie, użyj łącznika Y ze strzykawką zawierającą znacznik leucyny znakowany C 14 podłączoną do jednego ramienia oraz strzykawki ze 100 do 200 mikrolitrami sterylnego roztworu soli fizjologicznej do przepłukania przewodu żylnego połączonego z drugim ramieniem.

Podłącz łącznik Y do przewodu żylnego. Rozpocznij badanie, jednocześnie uruchamiając stoper, wstrzykując znacznik i pobierając próbki krwi tętniczej w określonym czasie. Natychmiast po wstrzyknięciu przepłukać linię żylną solą fizjologiczną.

Pobieraj próbki krwi od jednej do siedmiu w sposób ciągły przez pierwsze dwie minuty eksperymentu w ten sam sposób. Po zebraniu siedmiu próbek zbierz 30 mikrolitrów martwej krwi kosmicznej przed każdą pozostałą próbką. Próbki od ósmej do czternastej pobiera się odpowiednio po trzech, pięciu, 10, 15, 30, 45 i 60 minutach.

W pewnym momencie eksperymentu przetrzyj trzy probówki na wzorce wewnętrzne zawierające trityowaną leucynę i norleucynę, jak wyszczególniono w protokole tekstowym. Aby określić ilościowo stężenia leucyny w osoczu, należy użyć systemu HPLC z kolumną kationowymienną sodu i derywatyzacją po kolumnie z aldehydem ortoftalowym i detekcją fluorometryczną. Powierzchnia pod krzywą leucyny jest proporcjonalna do stężenia leucyny w próbce.

Porównaj z wzorcami, aby określić ilościowo stężenia leucyny w próbkach. Następnie użyj licznika scyntylacyjnego cieczy, aby określić ilościowo rozpady trytu i C 14 na minutę w próbkach osocza. Wykorzystać te stężenia do skonstruowania krzywej klirensu leucyny znakowanej C14 z krążenia i przebiegu w czasie jej specyficznej aktywności w osoczu tętniczym.

Na wykresie oblicz zintegrowaną aktywność specyficzną dla leucyny znakowaną C 14 w osoczu tętniczym. Aby wykonać autoradiografię ilościową, przygotuj skrawki mózgu o grubości 20 mikronów. Przekrój mózgu za pomocą kriostatu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Rozmrozić sekcje montażowe na szkiełkach pokrytych żelatyną. Po utrwaleniu preparatów należy ułożyć preparaty w kasecie z kliszą rentgenowską wraz z zestawem wcześniej skalibrowanych wzorców metakrylanu metylu znakowanych znakiem C 14. W ciemnym pomieszczeniu i przy bezpiecznym świetle umieść kawałek filmu rentgenowskiego emulsją do dołu po bokach i wzorcach.

Zamknij kasetę i umieść ją w czarnej torbie do przewijania. Wywołaj filmy zgodnie z instrukcjami producenta. Automatyczne wywoływanie filmów nie jest zalecane, ponieważ tło może być nierówne i może wpływać na kwantyfikację.

Skonstruuj krzywą kalibracyjną gęstości optycznej w funkcji stężenia tkanki C 14 w oparciu o wartości gęstości optycznej zestawu skalibrowanych wzorców na folii. Dopasuj te dane do równania wielomianowego. Równanie wielomianowe drugiego lub trzeciego stopnia pasuje bardzo dobrze.

Aby przeanalizować określone regiony mózgu, zlokalizuj obszar zainteresowania lub ROI w sześciu do ośmiu sekcjach w porównaniu z atlasem mózgu. Zapisz gęstość optyczną pikseli w ROI we wszystkich sekcjach. Na podstawie krzywej kalibracyjnej oblicz stężenie C 14 w tkance w każdym pikselu.

Na koniec oblicz regionalne szybkości syntezy białek mózgowych na podstawie średniego stężenia C 14 w tkance w ROI w całki ze stosunków stężeń nieznakowanej i znakowanej leucyny w osoczu tętniczym w czasach t i lamba. Frakcja leucyny w puli prekursorów tkankowych, która pochodzi z osocza. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy zwierzęcia leczonego nośnikiem w porównaniu ze zwierzęciem leczonym anizomycyną, inhibitorem syntezy białek.

Tempo syntezy białek jest proporcjonalne do poziomu ciemności obrazu. Anizomycyna drastycznie zmniejsza mierzone tempo syntezy białek mózgowych, co wskazuje na specyficzność tej metody. Tutaj pokazano zdigitalizowane autoradiogramy od przytomnej, zachowującej się myszy na poziomie hipokampa i podwzgórza.

Ciemniejsze regiony mają wyższe regionalne wskaźniki syntezy białek mózgowych. Pokazany tutaj jest zdigitalizowany autoradiogram od przytomnej, zachowującej się myszy kontrolnej na poziomie grzbietowego hipokampa. Tempo syntezy białek mózgowych jest pokryte kolorem na obrazach zgodnie z kolorowym paskiem.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że zwierzęta są w normalnym stanie fizjologicznym podczas pomiarów. Nasza metodologia wykazała już rozregulowanie syntezy białek w zaburzeniach neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X. Może być również przydatnym markerem zmian zwyrodnieniowych i stanów, takich jak choroba Alzheimera.

Metoda syntezy białek może być stosowana w połączeniu z histochemią immunologiczną w naprzemiennych sekcjach w celu skorelowania zmian w syntezie białek ze zmianami regionalnymi w określonych białkach. Podsumowując, ilościowa autoradiograficzna metoda leucyny L-1 C 14 jest idealna do dokładnego określania regionalnych szybkości syntezy białek in vivo. Oferuje znaczne korzyści pod względem dokładności i możliwości zastosowania w warunkach in vivo.