Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji
January 29th, 2019
Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.
Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący immunofluorescencję, mikroskopię konfokalną i analizę komputerową w celu określenia rozkładu białka synaptycznego względem białka odniesienia. Nasza metoda pozwala obejść nieodłączną zmienność barwień immunofluorescencyjnych poprzez zastosowanie stosunku, a nie bezwzględnych poziomów fluorescencji. Dodatkowo za pomocą tej metody można analizować niejednorodność dystrybucji białek na różnych poziomach.
Od całych wycinków mózgu, przez regiony mózgu, po nawet podregiony, takie jak różne warstwy hipokampa. Technikę tę można dostosować do określenia rozmieszczenia białek w różnych tkankach innych niż mózg i systemach modelowych innych niż myszy. Rozpocznij od umycia wcześniej wyizolowanego i unieruchomionego mózgu myszy, jak opisano w manuskrypcie.
Następnie przenieś mózg do 15-mililitrowej rurki reakcyjnej z 30% sacharozą 0,1 molową PB.To kriochronią mózg, inkubuj go w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 48 godzin lub do momentu, gdy zatonie. Następnie użyj ostrego ostrza, aby przyciąć mózg chroniony kriogenicznie w zależności od obszaru zainteresowania. Następnie umieść mózg w formie kriogenicznej i dodaj związek o optymalnej temperaturze cięcia, aby go osadzić, upewniając się, że unikasz pęcherzyków i odpowiednio orientujesz mózg, aby mieć koronalną płaszczyznę cięcia.
Umieść formę kriogeniczną w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż zamarznie na stałe. Zamontuj zamrożoną tkankę na mikrotomie kriogenicznym i odczekaj co najmniej 15 minut przed przecięciem, aby wyrównać ją z temperaturą mikrotomu. Zacznij kroić mózg na plastry koronalne o grubości 25 mikrometrów.
Użyj szklanego haczyka do OCT pierwszego plastra ostrożnie, nie dotykając tkanki mózgowej. OCT przyklei się do szklanego haczyka. Użyj szklanego haczyka, aby przenieść plasterek mózgu do pierwszej studzienki.
Zbierz trzy sąsiednie plasterki na dołek na 24-dołkowej płytce wypełnionej 0,1 molomierza PB.Store plasterki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż do barwienia przez okres do dwóch tygodni. Aby przygotować plastry do barwienia immunologicznego, użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z jednego dołka bez wciągania wycinków mózgu. Następnie użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów świeżego PB, aby zmyć je z nadmiaru OCT.
Powtórz to mycie dla każdej studzienki na raz, aby uniknąć wysuszenia plastrów. Następnie użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z pierwszego dołka. Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów buforu blokującego na studzienkę, która działa dobrze do studni.
Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej na shakerze przez trzy godziny. Podczas inkubacji dodać 250 mikrolitrów buforu przeciwciał na studzienkę do probówki reakcyjnej. Następnie za pomocą pipety o pojemności 2 mikrolitrów dodaj odpowiednią ilość przeciwciała, pipetując je bezpośrednio do roztworu i delikatnie pipetuj kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać.
Następnie wiruj to rozcieńczone przeciwciało, aby upewnić się, że mieszanie jest prawidłowe. Działa dobrze, usuwając bufor blokujący za pomocą plastikowej pipety i dodając 250 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do studzienki. Inkubuj płytkę na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciała za pomocą plastikowej pipety. Umyj plastry 300 mikrolitrami bufora do mycia, po jednym na studzienkę, trzy razy po dziesięć minut, po każdym myciu na shakerze w temperaturze pokojowej. Podczas mycia, pracując w ciemności, rozcieńczyć fluor przez kilka sekund przeciwciała w probówce reakcyjnej w taki sam sposób, jak poprzednio robiono to z przeciwciałem pierwszorzędowym.
Po zakończeniu mycia usunąć bufor płuczący plastikową pipetą i dodać 250 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na studzienkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Po zakończeniu inkubacji usunąć roztwór przeciwciała za pomocą plastikowej pipety.
Umyć sekcje trzykrotnie buforem myjącym numer dwa w taki sam sposób, jak w przypadku buforu myjącego numer jeden. Podczas tego prania rozcieńczyć barwnik DAPI w 0,1 molowym PB, aby uzyskać stężenie od jednego do 2000. Po wyjęciu buforu myjącego z płytki dodać 250 mikrolitrów roztworu DAPI i inkubować w temperaturze pokojowej na shakerze przez 5 minut.
Po usunięciu roztworu DAPI za pomocą plastikowej pipety, użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 500 mikrolitrów 0,1 molowej PB na studzienkę. Umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem. Użyj cienkiego pędzla, aby dodać trzy oddzielne krople 0,1 mola PB na szkiełko.
Za pomocą pędzla umieść jeden plasterek na kroplę na szkiełku, a następnie spłaszcz i ustaw plastry. Po prawidłowym ułożeniu wszystkich plastrów użyj papierowej chusteczki, aby usunąć nadmiar PB i ostrożnie wysusz, nie susząc ich całkowicie. Następnie dodaj 80 mikrolitrów podłoża do osadzania na szkiełku i ostrożnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym, aby osadzić plastry mózgu.
Przykryj szkiełka, aby uniknąć ekspozycji na światło i pozostaw je do wyschnięcia w dygestoriach na jedną do dwóch godzin, a następnie przechowuj je w pudełku ze szkiełkami mikroskopowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do mikroskopii konfokalnej. Po pobraniu wirtualnych tkanek całego wycinka mózgu dla różnych kanałów, jak opisano w manuskrypcie, załaduj wszystkie pojedyncze kanały lub jeden obraz do FIDŻI, klikając plik, a następnie otwórz. Następnie użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby wyznaczyć jedną półkulę w kanale DAPI.
Kliknij edytuj, następnie zaznaczenie, a następnie utwórz maskę, aby utworzyć maskę wybranego regionu. Następnie kliknij analizuj, a następnie zmierz cząstki, aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów. Upewnij się, że wybrałeś pojedyncze kanały, aby określić średnie wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału.
Następnie skopiuj średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów do arkusza kalkulacyjnego. Aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów w obszarze zainteresowania, wyznacz obszar za pomocą narzędzia wyboru z wolnej ręki. Po barwieniu DAPI, które barwi jądra, sekcje mózgu mają punktowy wzór, a regiony o dużej gęstości komórek są jaśniejsze niż obszary o niskiej gęstości komórek.
Barwienie przeciwciałem Mover ujawniło niejednorodną dystrybucję z jasnymi obszarami gorących punktów i ciemniejszymi obszarami w całym mózgu, gdzie jako synaptofizyna ujawniła bardziej jednorodną dystrybucję. Nakładka obrazów pokazała zróżnicowany rozkład czerwonej fluorescencji wskazującej na białko Mover w porównaniu z zieloną fluorescencją wskazującą na synaptofizynę. Po analizie ilościowej określono średnie wartości intensywności fluorescencji dla różnych kanałów na półkulach i w obszarach zainteresowania zarówno dla Mover, jak i Synaptophysin.
Stosunki wartości fluorescencji Mover do wartości fluorescencji Synaptophysin pokazują niejednorodny rozkład Mover z obszarami o wysokim i niskim poziomie Mover w stosunku do pęcherzyków synaptycznych. Względna liczebność przeprowadzek: stosunek w jednym obszarze zainteresowania w porównaniu z tym na całej półkuli i przeliczony na procent, pokazał, ile osób poruszających jest obecnych w jednym obszarze zainteresowania w stosunku do średniej. Względną liczebność Movera określono dla różnych warstw w subpolach hipokampa.
Trzy obszary zainteresowania określa się ilościowo, porównując stosunek w odpowiednich warstwach do stosunku odpowiadającej im półkuli. Procedurę tę można łatwo dostosować i połączyć z różnymi technikami obrazowania, takimi jak mikroskopia superrozdzielcza, aby dodatkowo określić subkomórkową dystrybucję interesującego białka. Technika ta może być również stosowana do różnych systemów modelowych, takich jak zwierzęta modyfikowane genetycznie lub leczone lekami.
Może to pozwolić na podejście porównawcze w odniesieniu do różnych warunków doświadczalnych, a nawet gatunków.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia ilościową metodę analizy rozmieszczenia białka synaptycznego z wykorzystaniem immunofluorescencji i mikroskopu konfokalnego. Metoda ta pozwala na ocenę stosunków rozmieszczenia białek, a nie poziomów absolutnej fluorescencji, co sprawia, że jest przystosowana do różnych tkanek biologicznych poza mózgiem.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki immunofluorescencji
Tło
- Wykrywanie białek synaptycznych jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronów.
- Barwienie immunofluorescencyjne jest podatne na zmienność, którą ta metoda zmniejsza.
- Technika ta może być stosowana w różnych tkankach i modelach organizmów.
Cel badania
- Opracowanie dokładnej metody ilościowego określania rozmieszczenia białek synaptycznych.
- Ocena heterogeniczności w rozmieszczeniu białek na różnych poziomach mózgu.
- Udoskonalenie technik analizy białek odpowiednich dla wielu kontekstów biologicznych.
Stosowane metody
- Imunofluorescencja połączona z mikroskopem konfokalnym na krosnach mózgu.
- Wykorzystanie wcześniej izolowanych tkanek mózgu myszy jako modelu biologicznego.
- Kriokonserwacja i przekrojowanie tkanki mózgowej o grubości 25 mikrometrów.
- Krokowe procedury mycia i inkubacji do aplikacji przeciwciał i barwienia.
- Analiza obrazów za pomocą oprogramowania FIJI do ilościowego określania intensywności fluorescencji.
Główne wyniki
- Metoda ta zapewnia jasne przedstawienie rozmieszczenia białka w różnych obszarach mózgu.
- Różne białka synaptyczne wykazują heterogeniczne i jednorodne wzorce rozmieszczenia.
- Obszary o wysokiej gęstości komórek wykazywały jaśniejsze sygnały, co wskazuje na skuteczność barwienia DAPI.
Wnioski
- To badanie poprawia zdolność ilościowej oceny rozmieszczenia białek synaptycznych.
- Metoda ta jest wszechstronna, umożliwiając analizy w różnych tkankach i systemach modelowych.
- Rozumienie tych wzorców rozmieszczenia może dostarczyć wglądu w mechanizmy neuronowe i potencjalne modele chorobowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of synaptic protein distribution using immunofluorescence and confocal microscopy addresses a critical need for reproducible, comparative protein localization in neurobiology and CNS drug discovery. By leveraging ratio-based fluorescence analysis, this method enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity across preclinical models. The approach enables robust cross-study and cross-platform comparisons, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of synaptic protein localization relative to reference markers.
- Supports functional target validation by revealing heterogeneous protein distribution across brain regions and subregions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing region-specific protein abundance patterns.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain tissue systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes immunofluorescence outputs by using ratio metrics, reducing inter-experiment variability.
- Enables reproducible, scalable quantification of protein distribution for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on synaptic protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein distribution data with disease-relevant brain regions and subfields.
- Enables comparative studies across genetically modified or drug-treated animal models.
- Supports translational biomarker identification by quantifying protein heterogeneity at multiple anatomical levels.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative spatial protein data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment in CNS-focused R&D.
- Discovery Biology: Provides quantitative, region-specific protein distribution data for hypothesis-driven target validation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates ratio-based fluorescence measurements for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-model and cross-condition analyses.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable workflow for diverse tissues, antibodies, and imaging platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of protein localization studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Depends on access to high-quality antibodies and advanced imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to various tissues, model systems, and imaging platforms with protocol optimization.
- Potential limitations include antibody specificity and photobleaching during imaging.
