Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący immunofluorescencję, mikroskopię konfokalną i analizę komputerową w celu określenia rozkładu białka synaptycznego względem białka odniesienia. Nasza metoda pozwala obejść nieodłączną zmienność barwień immunofluorescencyjnych poprzez zastosowanie stosunku, a nie bezwzględnych poziomów fluorescencji. Dodatkowo za pomocą tej metody można analizować niejednorodność dystrybucji białek na różnych poziomach.

Od całych wycinków mózgu, przez regiony mózgu, po nawet podregiony, takie jak różne warstwy hipokampa. Technikę tę można dostosować do określenia rozmieszczenia białek w różnych tkankach innych niż mózg i systemach modelowych innych niż myszy. Rozpocznij od umycia wcześniej wyizolowanego i unieruchomionego mózgu myszy, jak opisano w manuskrypcie.

Następnie przenieś mózg do 15-mililitrowej rurki reakcyjnej z 30% sacharozą 0,1 molową PB.To kriochronią mózg, inkubuj go w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 48 godzin lub do momentu, gdy zatonie. Następnie użyj ostrego ostrza, aby przyciąć mózg chroniony kriogenicznie w zależności od obszaru zainteresowania. Następnie umieść mózg w formie kriogenicznej i dodaj związek o optymalnej temperaturze cięcia, aby go osadzić, upewniając się, że unikasz pęcherzyków i odpowiednio orientujesz mózg, aby mieć koronalną płaszczyznę cięcia.

Umieść formę kriogeniczną w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż zamarznie na stałe. Zamontuj zamrożoną tkankę na mikrotomie kriogenicznym i odczekaj co najmniej 15 minut przed przecięciem, aby wyrównać ją z temperaturą mikrotomu. Zacznij kroić mózg na plastry koronalne o grubości 25 mikrometrów.

Użyj szklanego haczyka do OCT pierwszego plastra ostrożnie, nie dotykając tkanki mózgowej. OCT przyklei się do szklanego haczyka. Użyj szklanego haczyka, aby przenieść plasterek mózgu do pierwszej studzienki.

Zbierz trzy sąsiednie plasterki na dołek na 24-dołkowej płytce wypełnionej 0,1 molomierza PB.Store plasterki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż do barwienia przez okres do dwóch tygodni. Aby przygotować plastry do barwienia immunologicznego, użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z jednego dołka bez wciągania wycinków mózgu. Następnie użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów świeżego PB, aby zmyć je z nadmiaru OCT.

Powtórz to mycie dla każdej studzienki na raz, aby uniknąć wysuszenia plastrów. Następnie użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z pierwszego dołka. Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów buforu blokującego na studzienkę, która działa dobrze do studni.

Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej na shakerze przez trzy godziny. Podczas inkubacji dodać 250 mikrolitrów buforu przeciwciał na studzienkę do probówki reakcyjnej. Następnie za pomocą pipety o pojemności 2 mikrolitrów dodaj odpowiednią ilość przeciwciała, pipetując je bezpośrednio do roztworu i delikatnie pipetuj kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać.

Następnie wiruj to rozcieńczone przeciwciało, aby upewnić się, że mieszanie jest prawidłowe. Działa dobrze, usuwając bufor blokujący za pomocą plastikowej pipety i dodając 250 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do studzienki. Inkubuj płytkę na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciała za pomocą plastikowej pipety. Umyj plastry 300 mikrolitrami bufora do mycia, po jednym na studzienkę, trzy razy po dziesięć minut, po każdym myciu na shakerze w temperaturze pokojowej. Podczas mycia, pracując w ciemności, rozcieńczyć fluor przez kilka sekund przeciwciała w probówce reakcyjnej w taki sam sposób, jak poprzednio robiono to z przeciwciałem pierwszorzędowym.

Po zakończeniu mycia usunąć bufor płuczący plastikową pipetą i dodać 250 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na studzienkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Po zakończeniu inkubacji usunąć roztwór przeciwciała za pomocą plastikowej pipety.

Umyć sekcje trzykrotnie buforem myjącym numer dwa w taki sam sposób, jak w przypadku buforu myjącego numer jeden. Podczas tego prania rozcieńczyć barwnik DAPI w 0,1 molowym PB, aby uzyskać stężenie od jednego do 2000. Po wyjęciu buforu myjącego z płytki dodać 250 mikrolitrów roztworu DAPI i inkubować w temperaturze pokojowej na shakerze przez 5 minut.

Po usunięciu roztworu DAPI za pomocą plastikowej pipety, użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 500 mikrolitrów 0,1 molowej PB na studzienkę. Umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem. Użyj cienkiego pędzla, aby dodać trzy oddzielne krople 0,1 mola PB na szkiełko.

Za pomocą pędzla umieść jeden plasterek na kroplę na szkiełku, a następnie spłaszcz i ustaw plastry. Po prawidłowym ułożeniu wszystkich plastrów użyj papierowej chusteczki, aby usunąć nadmiar PB i ostrożnie wysusz, nie susząc ich całkowicie. Następnie dodaj 80 mikrolitrów podłoża do osadzania na szkiełku i ostrożnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym, aby osadzić plastry mózgu.

Przykryj szkiełka, aby uniknąć ekspozycji na światło i pozostaw je do wyschnięcia w dygestoriach na jedną do dwóch godzin, a następnie przechowuj je w pudełku ze szkiełkami mikroskopowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do mikroskopii konfokalnej. Po pobraniu wirtualnych tkanek całego wycinka mózgu dla różnych kanałów, jak opisano w manuskrypcie, załaduj wszystkie pojedyncze kanały lub jeden obraz do FIDŻI, klikając plik, a następnie otwórz. Następnie użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby wyznaczyć jedną półkulę w kanale DAPI.

Kliknij edytuj, następnie zaznaczenie, a następnie utwórz maskę, aby utworzyć maskę wybranego regionu. Następnie kliknij analizuj, a następnie zmierz cząstki, aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów. Upewnij się, że wybrałeś pojedyncze kanały, aby określić średnie wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału.

Następnie skopiuj średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów do arkusza kalkulacyjnego. Aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów w obszarze zainteresowania, wyznacz obszar za pomocą narzędzia wyboru z wolnej ręki. Po barwieniu DAPI, które barwi jądra, sekcje mózgu mają punktowy wzór, a regiony o dużej gęstości komórek są jaśniejsze niż obszary o niskiej gęstości komórek.

Barwienie przeciwciałem Mover ujawniło niejednorodną dystrybucję z jasnymi obszarami gorących punktów i ciemniejszymi obszarami w całym mózgu, gdzie jako synaptofizyna ujawniła bardziej jednorodną dystrybucję. Nakładka obrazów pokazała zróżnicowany rozkład czerwonej fluorescencji wskazującej na białko Mover w porównaniu z zieloną fluorescencją wskazującą na synaptofizynę. Po analizie ilościowej określono średnie wartości intensywności fluorescencji dla różnych kanałów na półkulach i w obszarach zainteresowania zarówno dla Mover, jak i Synaptophysin.

Stosunki wartości fluorescencji Mover do wartości fluorescencji Synaptophysin pokazują niejednorodny rozkład Mover z obszarami o wysokim i niskim poziomie Mover w stosunku do pęcherzyków synaptycznych. Względna liczebność przeprowadzek: stosunek w jednym obszarze zainteresowania w porównaniu z tym na całej półkuli i przeliczony na procent, pokazał, ile osób poruszających jest obecnych w jednym obszarze zainteresowania w stosunku do średniej. Względną liczebność Movera określono dla różnych warstw w subpolach hipokampa.

Trzy obszary zainteresowania określa się ilościowo, porównując stosunek w odpowiednich warstwach do stosunku odpowiadającej im półkuli. Procedurę tę można łatwo dostosować i połączyć z różnymi technikami obrazowania, takimi jak mikroskopia superrozdzielcza, aby dodatkowo określić subkomórkową dystrybucję interesującego białka. Technika ta może być również stosowana do różnych systemów modelowych, takich jak zwierzęta modyfikowane genetycznie lub leczone lekami.

Może to pozwolić na podejście porównawcze w odniesieniu do różnych warunków doświadczalnych, a nawet gatunków.