Name: Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji niejednorodnego rozmieszczenia białek synaptycznych w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Technika wykorzystuje stosunki intensywności fluorescencji zamiast wartości bezwzględnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Irmgard Weiss za doskonałą pomoc techniczną. Autorzy dziękują za wsparcie Hermesa Pofantisa i Andoniyi Petkovej. Autorzy dziękują również Europejskiemu Instytutowi Neuronauki za korzystanie z LSM800 i pomoc techniczną, zwłaszcza ze strony dr Nilsa Halbsguta. Praca ta została sfinansowana przez Uniwersyteckie Centrum Medyczne w Getyndze. JSV dziękuje za wsparcie ze strony Centrum Mikroskopii Nanoskalowej i Fizjologii Molekularnej Mózgu (CNMPB).

Ten protokół nie obejmuje eksperymentów na żywych zwierzętach. Eksperymenty polegające na eutanazji zwierząt w celu pobrania próbek mózgu zostały zatwierdzone przez lokalne organy ochrony zwierząt (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) pod numerem zatwierdzenia T 10/30.
UWAGA: Do tego protokołu użyto 3 dorosłych samców myszy C57BL/6.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotować utrwalacz i 0,1 M bufor fosforanowy (PB; patrz Tabela 1).</li>
	<li>Unieruchom zwierzę przez perfuzję przezsercową, jak opisano w Gage i wsp.28. Najpierw przepłukać krew 0,9% roztworem NaCl, a następnie przelać 30 ml 4% paraformaldehydu (PFA).</li>
	<li>Otwórz czaszkę nożyczkami i ostrożnie odizoluj mózg za pomocą łyżki o krawędziach, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.</li>
	<li>Napełnij 50 ml probówki reakcyjnej utrwalaczem i umieść mózg w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i umyć mózg w 50 ml 0,1 M PB na wytrząsarce przez 30 minut.</li>
	<li>Po umyciu inkubować mózg w probówce reakcyjnej o pojemności 50 ml w 30% sacharozie w 0,1 M PB przez 48 godzin lub do momentu, gdy mózg zanurzy się w probówce w temperaturze 4 °C w celu krioprotekcji.</li>
	<li>Przytnij kriochroniony mózg ostrym ostrzem, umieść go w krioformie i zanurz w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Unikaj bąbelków. Zorientuj mózg i zamroź kriomold w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zamontuj zamrożoną tkankę do cięcia. Wyrównać tkankę z temperaturą kriomikrotomu przez co najmniej 15 minut przed cięciem.</li>
	<li>Podziel mózg na plastry koronalne o grubości 25 μm. Ostrożnie dotykaj OCT szklanym haczykiem, nie dotykając tkanki mózgowej. Zebrać 3 sąsiadujące ze sobą plastry na dołku na płytce 24-dołkowej i przechowywać je w 0,1 M PB w temperaturze 4 °C do momentu zabarwienia. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do dwóch tygodni. Dłuższy czas przechowywania może wpływać na jakość tkanki, a tym samym wpływać na wynik eksperymentu.</li>
</ol>
2. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Przygotować roztwory zawierające bufor blokujący, bufor przeciwciał, bufor płuczący 1 i bufor płuczący 2 (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Opłucz plastry raz PB, aby usunąć nadmiar OCT.
	<ol>
		<li>Usuń roztwór plastikową pipetą bez zasysania plasterków mózgu. Dodać 250 μl świeżego PB za pomocą pipety 1000 μL. 
		UWAGA: Plastry nie powinny wysychać, więc dobrze usuń i dodaj płyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć PB za pomocą plastikowej pipety i dodać 250 μl buforu blokującego do studzienki za pomocą pipety 1000 μl. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce.</li>
	<li>W czasie inkubacji rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w buforze przeciwciał w probówce reakcyjnej. Użyć 250 μl buforu przeciwciał na studzienkę i dodać odpowiednią ilość przeciwciała (patrz Tabela 2), pipetując je bezpośrednio do roztworu za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wkrótce potem przemieszaj wir, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. 
	UWAGA: Aby określić fluorescencję tła, barwienie należy również wykonywać bez dodawania przeciwciała pierwszorzędowego. W tym celu należy inkubować plasterek w roztworze przeciwciał bez przeciwciał pierwszorzędowych zgodnie z protokołem.</li>
	<li>Po czasie inkubacji usunąć bufor blokujący za pomocą plastikowej pipety i dodać 250 μl roztworu przeciwciała zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe do studzienki. Inkubować plastry z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.</li>
	<li>Następnego dnia umyj plastry buforem myjącym 1 3x przez 10 min w temperaturze RT na shakerze.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę plastikową pipetą i dodać 300 μl buforu myjącego 1 do dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas etapów przemywania rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w buforze przeciwciał w probówce reakcyjnej. Użyć 250 μl buforu przeciwciał na studzienkę i dodać odpowiednią ilość przeciwciała (patrz Tabela 2), pipetując je bezpośrednio do roztworu za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wkrótce potem przemieszaj wir, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. 
	UWAGA: Ponieważ przeciwciała są wrażliwe na światło, wszystkie czynności od tego momentu muszą być wykonywane w ciemności.</li>
	<li>Po zakończeniu płukania należy usunąć bufor płuczący plastikową pipetą i dodać 250 μl roztworu przeciwciał zawierających przeciwciała drugorzędowe do studzienki drobnoustrojowej. Inkubować plastry z przeciwciałami drugorzędowymi przez 90 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Plastry myć buforem myjącym 2 3x przez 10 min w temperaturze RT.</li>
	<li>Podczas etapów płukania rozcieńczyć 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) w 0,1 M PB w stężeniu 1:2000.</li>
	<li>Usunąć bufor płuczący 2 plastikową pipetą i dodać 250 μl roztworu DAPI do studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Usunąć roztwór DAPI plastikową pipetą i dodać 500 μl 0,1 M PB na studzienkę za pomocą pipety 1000 μl.</li>
	<li>Zamontuj plastry na szkiełkach mikroskopowych.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem. Za pomocą cienkiego pędzelka nałóż na szkiełko trzy oddzielne krople po 0,1 mln PB. Umieść jedną plasterkę na kroplę na szkiełku mikroskopowym.</li>
		<li>Użyj cienkiego pędzelka, aby spłaszczyć i zorientować plastry na szkiełku mikroskopowym.</li>
		<li>Gdy wszystkie plastry zostaną prawidłowo ułożone, usuń nadmiar PB chusteczką i dokładnie wysusz szkiełko. 
		UWAGA: Unikaj całkowitego suszenia plastrów mózgu.</li>
		<li>Dodać 80 μl podłoża do zatapiania na szkiełku. Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na szkiełko, osadzając w ten sposób plastry mózgu.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w dygestoria na 1-2 godziny (przykryj je, aby uniknąć ekspozycji na światło) i przechowuj je w pojemniku na szkiełka mikroskopowe w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Po całkowitym utwardzeniu podłoża zatapiającego umieścić szkiełko mikroskopowe pod mikroskopem konfokalnym. 
	UWAGA: Mikroskopia epifluorescencyjna w połączeniu z oprogramowaniem do dekonwolucji powinna dać podobną jakość obrazu.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia lasera, zwiększając lub zmniejszając intensywność lasera dla każdego kanału, tak aby kilka pikseli było prześwietlonych i zapewniało maksymalny rozkład wartości szarości.</li>
	<li>Zdobądź wirtualne tkanki całego wycinka mózgu dla różnych kanałów.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu do obrazowania (patrz Spis materiałów) wybierz opcję Płytki i ręcznie wyznacz wycinek mózgu za pomocą ustawień regionu kafelków.</li>
		<li>Rozmieść punkty podparcia w całym regionie kafelka i dostosuj fokus dla różnych punktów podparcia, naciskając przycisk Sprawdź regiony/pozycje kafelków....</li>
		<li>Dostosuj ustawienia w trybie akwizycji zgodnie z żądaną rozdzielczością i rozmiarem pliku wynikowego obrazu, a następnie rozpocznij skanowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania użyj funkcji Stitching, aby przetworzyć wirtualną tkankę. Wyeksportuj plik jako .tif za pomocą funkcji Eksport obrazu.</li>
</ol>
4. Analiza komputerowa
<ol>
	<li>Załaduj wszystkie pojedyncze kanały dla jednego obrazu do FIJI29, klikając Plik| Otwarty.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego nakreśl jedną półkulę w kanale DAPI. Utwórz maskę zaznaczenia, klikając Edytuj| Wybór| Utwórz maskę.</li>
	<li>Określ średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów (Mover i synaptofizyna), klikając Analizuj| Środek. 
	UWAGA: Upewnij się, że wybrałeś różne kanały, aby określić średnie wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału.</li>
	<li>Skopiuj średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Określ średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów w obszarze zainteresowania, wyznaczając obszar również za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego. Użyj atlasu mózgu myszy jako odniesienia.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.5 dla wszystkich półkul i wszystkich obszarów zainteresowania. 
	UWAGA: Określ wartości dla każdej półkuli osobno, aby później porównać wartości w obszarze zainteresowania z obszarem na półkuli (patrz krok 5.2).</li>
</ol>
5. Obsługa danych
<ol>
	<li>W przypadku, gdy fluorescencja tła jest wysoka (patrz Dyskusja), może być konieczne odjęcie tła. W tym celu należy określić średnią intensywność fluorescencji dla wycinka przetworzonego bez pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku referencyjnemu (tutaj: synaptofizynie) i odjąć tę wartość od wszystkich wartości uzyskanych dla obszarów mózgu i półkul.</li>
	<li>Po ustaleniu średnich intensywności fluorescencji dla pojedynczych kanałów dla każdej półkuli i każdego obszaru zainteresowania (patrz Tabela 3), należy obliczyć stosunek Mover do synaptofizyny, dzieląc wartość Mover przez wartość dla synaptofizyny (żółty w Tabeli 3). Wykonaj tę czynność dla każdej półkuli i każdego obszaru zainteresowania osobno.</li>
	<li>Podziel stosunek uzyskany dla jednego obszaru zainteresowania przez współczynnik uzyskany dla odpowiedniej półkuli (kolor pomarańczowy w tabeli 3), aby określić stosunek obszaru zainteresowania do półkuli.</li>
	<li>Aby określić względną liczebność Mover, należy przeliczyć stosunek uzyskany w 5.2 na procent, określając jego odchylenie od 1 (kolor czerwony w tabeli 3). Współczynnik 1,25 dałby zatem względną liczebność Ruchu o 25% powyżej średniej, a współczynnik 0,75 dałby względną liczebność Ruchu o 25% poniżej średniej.</li>
</ol>

<ol><li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).</li>
<li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li>
<li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li>
<li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li>
<li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li>
<li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+p38%3A+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li>
<li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li>
<li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li>
<li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vesicular+GABA+transporter%2C+VGAT%2C+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic%2C+Presynaptic%2C+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li>
<li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+%3A+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li>
<li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li>
<li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li>
<li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirby%2C+M+%22Understanding+the+molecular+diversity+of+GABAergic+synapses%22">Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses</a>. 5, 1-12 (2011).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li>
<li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li>
<li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network%3A+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li>
<li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tprg%2C+a+gene+predominantly+expressed+in+skin%2C+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li>
<li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation%3A+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li>
<li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Körber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li>
<li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+in+brain+sections%3A+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , ACADEMIC PRESS. (2001).</li>
<li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li>
<li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda ma na celu ilościowe określenie rozmieszczenia białka będącego przedmiotem zainteresowania w stosunku do obfitości białka markerowego o znanym rozmieszczeniu. Barwienie immunofluorescencyjne może wykazywać dużą zmienność intensywności barwienia między różnymi plastrami. Opisane tutaj podejście do kwantyfikacji pozwala obejść ten problem poprzez określenie stosunku białka będącego przedmiotem zainteresowania do średniej na całej półkuli. W związku z tym różne intensywności barwienia na różnych p...

Komunikacja między neuronami odbywa się w wyspecjalizowanych miejscach kontaktu zwanych synapsami. Synapsy zawierają niezliczoną ilość różnych białek, które koordynują transmisję synaptyczną. Niektóre z tych białek wykazują niejednorodną dystrybucję w całym układzie nerwowym i nie są obecne we wszystkich synapse1. Jednym z przykładów takiego białka jest Munc13, które bierze udział w procesie pobudzania pęcherzyków synaptycznych. Istnieją różne izoformy Munc13, które są niejednorodnie rozmieszczone w mózgu2, a obecność lub brak określonych izoform może wpływać na krótkoterminową plastyczność synaptyczną i dynamikę pęcherzyków synaptycznych3,4,5. Dlatego tak ważne jest, aby móc zidentyfikować obecność różnych białek synaptycznych w różnych obszarach mózgu.
Metody wyboru do oznaczania ilościowego białek synaptycznych - jak dotąd - to spektrometria mas i Western blot, a nie immunohistochemia6,7,8,9. W niektórych przypadkach stosuje się kilka metod, które wzajemnie się uzupełniają, aby ocenić zarówno ilość, jak i lokalizację określonych białek (np. Wilhelm i wsp.10). Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwala na lokalizację i kwantyfikację interesujących białek bez potrzeby stosowania jakiejkolwiek metody biochemicznej, po prostu wykorzystując barwienie immunofluorescencyjne. Kolejną zaletą jest to, że kwantyfikacja może być przeprowadzona na obszarach znacznie mniejszych, a zatem bardziej szczegółowych, niż te uzyskane innymi metodami. Należy jednak wziąć pod uwagę, że do oceny dystrybucji białka będącego przedmiotem zainteresowania potrzebne jest wiarygodne białko referencyjne.
Barwienie fluorescencyjne za pomocą immunohistochemii pozwala nam rutynowo identyfikować lokalizację białek w różnych obszarach mózgu, jak również w różnych przedziałach neuronalnych. Aby zidentyfikować różne przedziały, stosuje się specjalne znaczniki. Zazwyczaj przeciwciała przeciwko synapsynie i synaptofizynie11 mogą być używane do oznaczania pęcherzyków synaptycznych, podczas gdy przeciwciała przeciwko fagotowi oznaczają strefę aktywną zakończenia presynaptycznego12. Transportery pęcherzykowe, takie jak pęcherzykowe transportery glutaminianu (vGluT) lub pęcherzykowy transporter GABA (vGAT), są używane do oznaczania odpowiednio zakończeń presynaptycznych excitatory13 i hamujących14. Po stronie postsynaptycznej przeciwciała przeciwko białku Homera mogą być stosowane do oznaczania zakończeń postsynaptycznych, a przeciwciała przeciwko białku gęstości postsynaptycznej 95 (PSD95)15,16,17 lub gephyrin18,19,20 może oznaczać odpowiednio pobudzające lub hamujące zakończenia postsynaptyczne. Stosując przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania i markery, takie jak te opisane powyżej, można określić lokalizację takiego białka. Wiele dotychczasowych badań zrobiło to w sposób jakościowy21. Jednak, aby wiarygodnie określić zróżnicowany rozkład określonego białka synaptycznego, należy nie tylko określić jego obecność lub brak, ale także jego względne stężenie. Niejednorodność rozmiarów i gęstości synaps sprawia, że ważne jest ustalenie stosunku między markerem synaptycznym a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W przeciwnym razie regiony bogate w synapsy, takie jak niepiramidalne warstwy hipokampa i warstwa molekularna móżdżku, będą wykazywać dużą gęstość białek synaptycznych, tylko ze względu na większą gęstość synaps, ale nie ze względu na silną obecność tego białka w każdej synapsie (np. Wallrafen i Dresbach1). Z drugiej strony, białka w somie neuronalnej (np. TGN3822) zwykle wykazują silną obecność w warstwie komórek piramidowych hipokampa lub warstwie komórek ziarnistych hipokampa lub móżdżku ze względu na wysoką koncentrację ciał komórek neuronalnych w tych obszarach. Dlatego ten niejednorodny rozkład struktur, w tym przypadku synaps, może prowadzić do fałszywego oszacowania rozmieszczenia samego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto istnieje wewnętrzna zmienność intensywności barwienia w próbkach w barwieniach immunohistochemicznych. Opisany tutaj protokół uwzględnia to i unika takich uprzedzeń, a także innych zastrzeżeń wynikających z metod immunohistochemicznych.
W naszym ostatnim badaniu użyliśmy tej metody do opisania różnicowego wyrażenia Mover (zwanego również TPRGL23 lub SVAP3024) w 16 różnych obszarach mózgu1. Mover jest białkiem synaptycznym specyficznym dla kręgowców, które można znaleźć w połączeniu z pęcherzykami synaptycznymi i wpływa na uwalnianie neuroprzekaźników25,26,27. Powiązaliśmy ekspresję Mover z obfitością pęcherzyków synaptycznych, poprzez barwienie synaptofizyny jako markera referencyjnego pęcherzyków synaptycznych. Stwierdziliśmy wysoki poziom Mover, szczególnie w jądrach przegrody, brzusznej części palidum i ciele migdałowatym. W obrębie hipokampa znaleźliśmy niejednorodny rozkład Mover, z wysokimi poziomami w warstwach związanych z obliczeniami wewnątrz hipokampa i niskimi poziomami w warstwach wejściowych i wyjściowych.

<table><tbody><tr><td>Probówki reakcyjne 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki reakcyjne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 dołki</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Pipeta plastikowa 087721H</td><td></td></tr><tr><td>(jednorazowa)</td><td>Pipeta Sarstedt</td><td>861,176</td><td></td></tr><tr><td>1000 ml</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; </td><td></td>17014382</tr><tr><td>Pipeta 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>Szkiełka mikroskopowe IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Menzel</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>zamrażanie mikrotomu</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Roche</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>11666789001</tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>neoFroxx</td><td>1104KG001</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek</td><td>Sakura&nbsp;</td><td>4583</td><td>PAŹ</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Merck</td><td>1,063,460,500</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>Merck Millipore</td><td>S26-100ML</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica osła</td><td>Merck</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>królicze systemy synaptyczne anty-Mover</td><td></td><td>RRID: AB_10804285</td><td></td></tr><tr><td>świnka morska anty-Synaptophysin</td><td>Synaptic Systems</td><td>RRID: AB_1210382</td><td></td></tr><tr><td>osła anty-królika AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2492288</td><td></td></tr><tr><td>koza anty-mysia AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID: AB_2337438</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td>475904</tr><tr><td>Oprogramowanie ZEN2 niebieskie Oprogramowanie</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopy</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>analityczne Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Obecność, brak lub poziom określonych białek synaptycznych może poważnie wpłynąć na transmisję synaptyczną. Oprócz wyjaśnienia funkcji białka, ważne jest również określenie jego rozmieszczenia. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący immunofluorescencję, mikroskopię konfokalną i analizę komputerową w celu określenia dystrybucji białka synaptycznego Mover (zwanego również TPRGL lub SVAP30). Porównujemy rozkład Movera z rozkładem białka pęcherzyków synaptycznych synaptofizyny, określając w ten sposób rozkład Movera w sposób ilościowy w stosunku do obfitości pęcherzyków synaptycznych. Warto zauważyć, że metoda ta może potencjalnie zostać wdrożona, aby umożliwić porównanie dystrybucji białek przy użyciu różnych przeciwciał lub mikroskopów lub w różnych badaniach. Nasza metoda pozwala obejść nieodłączną zmienność barwień immunofluorescencyjnych, uzyskując stosunek, a nie bezwzględny poziom fluorescencji. Dodatkowo, opisana przez nas metoda umożliwia badaczowi analizę rozkładu białka na różnych poziomach: od całych wycinków mózgu do regionów mózgu do różnych podregionów w jednym obszarze mózgu, takich jak różne warstwy hipokampa lub kory czuciowej. Mover jest białkiem specyficznym dla kręgowców, które jest związane z pęcherzykami synaptycznymi. Dzięki tej metodzie pokazujemy, że Mover jest niejednorodnie rozmieszczony w obszarach mózgu, z wysokimi poziomami w brzusznej części pallidum, jądrach przegrody i ciele migdałowatym, a także w pojedynczych obszarach mózgu, takich jak różne warstwy hipokampa.

Reprezentatywne wzorce barwienia różnych markerów przedstawiono na Rysunku 1. Wzorzec zmienia się w zależności od rozmieszczenia białka. Przykłady dla pięciu poziomów w osi rostro-kaudalnej pokazano w kolumnach (A)-(E). Reprezentatywne barwienie DAPI przedstawiono w pierwszym rzędzie: DAPI wiąże się z DNA komórki, w związku z czym barwione są jądra. Skutkuje to wzorcem punktowym. Obszary o wysokiej gęstości komórek są jaśniej...

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący immunofluorescencję, mikroskopię konfokalną i analizę komputerową w celu określenia rozkładu białka synaptycznego względem białka odniesienia. Nasza metoda pozwala obejść nieodłączną zmienność barwień immunofluorescencyjnych poprzez zastosowanie stosunku, a nie bezwzględnych poziomów fluorescencji. Dodatkowo za pomocą tej metody można analizować niejednorodność dystrybucji białek na różnych poziomach.Od całych wycinków mózgu, przez regiony mózgu, po nawet podregiony, takie jak różne warstwy hipokampa. Technikę tę można dostosować do określenia rozmieszczenia białek w różnych tkankach innych niż mózg i systemach modelowych innych niż myszy. Rozpocznij od umycia wcześniej wyizolowanego i unieruchomionego mózgu myszy, jak opisano w manuskrypcie.Następnie przenieś mózg do 15-mililitrowej rurki reakcyjnej z 30% sacharozą 0,1 molową PB.To kriochronią mózg, inkubuj go w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 48 godzin lub do momentu, gdy zatonie. Następnie użyj ostrego ostrza, aby przyciąć mózg chroniony kriogenicznie w zależności od obszaru zainteresowania. Następnie umieść mózg w formie kriogenicznej i dodaj związek o optymalnej temperaturze cięcia, aby go osadzić, upewniając się, że unikasz pęcherzyków i odpowiednio orientujesz mózg, aby mieć koronalną płaszczyznę cięcia.Umieść formę kriogeniczną w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż zamarznie na stałe. Zamontuj zamrożoną tkankę na mikrotomie kriogenicznym i odczekaj co najmniej 15 minut przed przecięciem, aby wyrównać ją z temperaturą mikrotomu. Zacznij kroić mózg na plastry koronalne o grubości 25 mikrometrów.Użyj szklanego haczyka do OCT pierwszego plastra ostrożnie, nie dotykając tkanki mózgowej. OCT przyklei się do szklanego haczyka. Użyj szklanego haczyka, aby przenieść plasterek mózgu do pierwszej studzienki.Zbierz trzy sąsiednie plasterki na dołek na 24-dołkowej płytce wypełnionej 0,1 molomierza PB.Store plasterki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż do barwienia przez okres do dwóch tygodni. Aby przygotować plastry do barwienia immunologicznego, użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z jednego dołka bez wciągania wycinków mózgu. Następnie użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów świeżego PB, aby zmyć je z nadmiaru OCT.Powtórz to mycie dla każdej studzienki na raz, aby uniknąć wysuszenia plastrów. Następnie użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z pierwszego dołka. Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów buforu blokującego na studzienkę, która działa dobrze do studni.Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej na shakerze przez trzy godziny. Podczas inkubacji dodać 250 mikrolitrów buforu przeciwciał na studzienkę do probówki reakcyjnej. Następnie za pomocą pipety o pojemności 2 mikrolitrów dodaj odpowiednią ilość przeciwciała, pipetując je bezpośrednio do roztworu i delikatnie pipetuj kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać.Następnie wiruj to rozcieńczone przeciwciało, aby upewnić się, że mieszanie jest prawidłowe. Działa dobrze, usuwając bufor blokujący za pomocą plastikowej pipety i dodając 250 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do studzienki. Inkubuj płytkę na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciała za pomocą plastikowej pipety. Umyj plastry 300 mikrolitrami bufora do mycia, po jednym na studzienkę, trzy razy po dziesięć minut, po każdym myciu na shakerze w temperaturze pokojowej. Podczas mycia, pracując w ciemności, rozcieńczyć fluor przez kilka sekund przeciwciała w probówce reakcyjnej w taki sam sposób, jak poprzednio robiono to z przeciwciałem pierwszorzędowym.Po zakończeniu mycia usunąć bufor płuczący plastikową pipetą i dodać 250 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na studzienkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Po zakończeniu inkubacji usunąć roztwór przeciwciała za pomocą plastikowej pipety.Umyć sekcje trzykrotnie buforem myjącym numer dwa w taki sam sposób, jak w przypadku buforu myjącego numer jeden. Podczas tego prania rozcieńczyć barwnik DAPI w 0,1 molowym PB, aby uzyskać stężenie od jednego do 2000. Po wyjęciu buforu myjącego z płytki dodać 250 mikrolitrów roztworu DAPI i inkubować w temperaturze pokojowej na shakerze przez 5 minut.Po usunięciu roztworu DAPI za pomocą plastikowej pipety, użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 500 mikrolitrów 0,1 molowej PB na studzienkę. Umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem. Użyj cienkiego pędzla, aby dodać trzy oddzielne krople 0,1 mola PB na szkiełko.Za pomocą pędzla umieść jeden plasterek na kroplę na szkiełku, a następnie spłaszcz i ustaw plastry. Po prawidłowym ułożeniu wszystkich plastrów użyj papierowej chusteczki, aby usunąć nadmiar PB i ostrożnie wysusz, nie susząc ich całkowicie. Następnie dodaj 80 mikrolitrów podłoża do osadzania na szkiełku i ostrożnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym, aby osadzić plastry mózgu.Przykryj szkiełka, aby uniknąć ekspozycji na światło i pozostaw je do wyschnięcia w dygestoriach na jedną do dwóch godzin, a następnie przechowuj je w pudełku ze szkiełkami mikroskopowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do mikroskopii konfokalnej. Po pobraniu wirtualnych tkanek całego wycinka mózgu dla różnych kanałów, jak opisano w manuskrypcie, załaduj wszystkie pojedyncze kanały lub jeden obraz do FIDŻI, klikając plik, a następnie otwórz. Następnie użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby wyznaczyć jedną półkulę w kanale DAPI.Kliknij edytuj, następnie zaznaczenie, a następnie utwórz maskę, aby utworzyć maskę wybranego regionu. Następnie kliknij analizuj, a następnie zmierz cząstki, aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów. Upewnij się, że wybrałeś pojedyncze kanały, aby określić średnie wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału.Następnie skopiuj średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów do arkusza kalkulacyjnego. Aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów w obszarze zainteresowania, wyznacz obszar za pomocą narzędzia wyboru z wolnej ręki. Po barwieniu DAPI, które barwi jądra, sekcje mózgu mają punktowy wzór, a regiony o dużej gęstości komórek są jaśniejsze niż obszary o niskiej gęstości komórek.Barwienie przeciwciałem Mover ujawniło niejednorodną dystrybucję z jasnymi obszarami gorących punktów i ciemniejszymi obszarami w całym mózgu, gdzie jako synaptofizyna ujawniła bardziej jednorodną dystrybucję. Nakładka obrazów pokazała zróżnicowany rozkład czerwonej fluorescencji wskazującej na białko Mover w porównaniu z zieloną fluorescencją wskazującą na synaptofizynę. Po analizie ilościowej określono średnie wartości intensywności fluorescencji dla różnych kanałów na półkulach i w obszarach zainteresowania zarówno dla Mover, jak i Synaptophysin.Stosunki wartości fluorescencji Mover do wartości fluorescencji Synaptophysin pokazują niejednorodny rozkład Mover z obszarami o wysokim i niskim poziomie Mover w stosunku do pęcherzyków synaptycznych. Względna liczebność przeprowadzek: stosunek w jednym obszarze zainteresowania w porównaniu z tym na całej półkuli i przeliczony na procent, pokazał, ile osób poruszających jest obecnych w jednym obszarze zainteresowania w stosunku do średniej. Względną liczebność Movera określono dla różnych warstw w subpolach hipokampa.Trzy obszary zainteresowania określa się ilościowo, porównując stosunek w odpowiednich warstwach do stosunku odpowiadającej im półkuli. Procedurę tę można łatwo dostosować i połączyć z różnymi technikami obrazowania, takimi jak mikroskopia superrozdzielcza, aby dodatkowo określić subkomórkową dystrybucję interesującego białka. Technika ta może być również stosowana do różnych systemów modelowych, takich jak zwierzęta modyfikowane genetycznie lub leczone lekami.Może to pozwolić na podejście porównawcze w odniesieniu do różnych warunków doświadczalnych, a nawet gatunków.

quantifying-heterogeneous-distribution-synaptic-protein-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne wycinka mózgu myszy w celu ilościowego określenia rozkładu określonego białka presynaptycznego. Proces ten polega na blokowaniu miejsc niespecyficznych, zastosowaniu pierwszorzędowych przeciwciał dla białka docelowego i markera referencyjnego, a następnie wtórnym znakowaniu przeciwciał i przeciwbarwieniu jądrowym. Marker referencyjny zapewnia dokładną kwantyfikację, zapewniając spójną linię wyjściową, a dystrybucja białka presynaptycznego...

Kwantyfikacja rozmieszczenia białka presynaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Poznaj metodę kwantyfikacji niejednorodnego rozmieszczenia białek synaptycznych w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Technika wykorzystuje stosunki intensywności fluorescencji zamiast wartości bezwzględnych.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów