Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Autoradiografia jest potężną i prostą techniką badania rozkładu miejsc wiązania białek w tkankach przy użyciu specyficznego radioligandu dla celu. Jest to również odpowiednia alternatywa dla immunohistochemii. Technika ta wizualizuje ekspresję białek z rozdzielczością przestrzenną za pomocą obrazów cyfrowych, która jest szybsza niż tradycyjna ekspozycja na kliszy.

Może być również stosowany do analizy farmakologicznej docelowych białek. Metoda obejmuje tkanki myszy osadzone na szkle, ale może być rozszerzona na inne gatunki, a nawet na komórki hodowane na szkiełkach nakrywkowych. Procedurę zademonstruje Nane Griem-Krey, doktorantka w moim laboratorium.

Na początek zanurz tkankę w sproszkowanym suchym lodzie, aby ją zamrozić. Przenieś zamrożoną tkankę bezpośrednio do kriostatu ustawionego na minus 20 stopni Celsjusza. Pozwól tkance zaaklimatyzować się do minus 20 stopni Celsjusza w kriostacie przez 20 minut.

Następnie przykryj uchwyt na chusteczki podłożem do zatapiania na zewnątrz kriostatu i szybko umieść zamrożoną próbkę tkanki w pożądanej orientacji, gdy podłoże do zatapiania jest jeszcze płynne. Przenieś uchwyt na chusteczki z powrotem do kriostatu i wystawij pożywkę do zatapiania na działanie temperatur poniżej minus 10 stopni Celsjusza w celu stwardnienia. Umieść uchwyt na chusteczki w mikrotomie kriostatu.

Dostosuj orientację tkanki, aby uniknąć nachylonych odcinków. Przetnij tkankę pod kierunkiem atlasu stereotaktycznego na odcinki o pożądanej grubości i w razie potrzeby rozłóż wycinek małym pędzelkiem. Rozmrozić Zamontuj sekcję na szkiełku mikroskopowym.

Następnie kolejno zbierz sekcje z obszaru zainteresowania, aby uzyskać pożądane powtórzenie techniczne. Pozostaw sekcje na szkiełkach do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę przed dalszym obchodzeniem się. W certyfikowanym laboratorium promieniotwórczym należy za pomocą ołówka oznaczyć szkiełka warunkami doświadczalnymi.

Umieść szkiełka poziomo w plastikowych tacach. Ostrożnie nanieść odpowiednią objętość bufora SA dostosowaną do danego celu do sekcji zamontowanych na szkiełkach. Upewnij się, że każda sekcja jest całkowicie zakryta.

W celu określenia niespecyficznego wiązania należy uzupełnić bufor SA odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku. Następnie przykryj tace pokrywkami, aby uniknąć parowania. Wstępną inkubację w odpowiedniej temperaturze przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej ustawionej na 20 obr./min.

Następnie odlej płyn do wstępnej inkubacji z każdego szkiełka i przenieś szkiełka z powrotem do plastikowej tacy. Natychmiast całkowicie pokryć skrawki odpowiednim stężeniem radioligandu w buforze SA. W celu oznaczenia niespecyficznego wiązania należy uzupełnić roztwór radioligandu odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku.

Przykryj tace pokrywkami i inkubuj w żądanych warunkach, stale delikatnie potrząsając przy 20 obr./min. Następnie odlej roztwór inkubacyjny i przenieś szkiełka do stojaka na szkiełka mikroskopowe. Natychmiast umyj szkiełka.

W przypadku protokołu GHB umyj dwukrotnie lodowatym buforem SA przez 20 sekund, a następnie spłucz dwukrotnie, zanurzając ruszt szkiełkowy w tacach wypełnionych lodowatą wodą destylowaną. Ustaw szkiełka pionowo w stojakach i susz na powietrzu przez co najmniej godzinę. Następnie przenieś szkiełka do stabilizatora zawierającego paraformaldehyd w celu utrwalenia przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia przenieść szkiełka do pudełka eksykatora zawierającego żel krzemionkowy o temperaturze pokojowej. Pozostaw szkiełka w pojemniku eksykatora na trzy godziny, aby usunąć wilgoć. Najpierw umieść skrawki w kasecie z płytką obrazową osłoniętą promieniowaniem, tkanką skierowaną do góry.

Do każdej kasety należy dołączyć radioaktywną mikroskalę w celu późniejszego ilościowego określenia wiązania radioligandu. Bezpośrednio przed użyciem załaduj wrażliwą na tryt płytkę obrazową z luminoforem do maszyny do obrazowania luminoforem i wystaw ją na działanie widzialnego światła podczerwonego zgodnie z instrukcjami producenta, aby ją usunąć. Następnie wyjmij płytkę obrazową z maszyny do obrazowania luminoforowego i natychmiast umieść ją na sekcjach kasety.

Upewnij się, że kaseta jest całkowicie zamknięta. Wystaw sekcje na płytkę obrazową z luminoforem, aby zoptymalizować czas ekspozycji w temperaturze pokojowej, gdy są chronione przed światłem. Po naświetleniu ostrożnie otwórz kasetę w ciemności i natychmiast przenieś płytkę obrazową do ciemnego pudełka kamery luminoforowej.

Zeskanuj płytę w najwyższej możliwej rozdzielczości, aby uzyskać obraz cyfrowy. Aby rozpocząć, otwórz odpowiedni program do analizy obrazu. Określ względne gęstości optyczne dla każdego wzorca kalibracji, wybierając z menu opcję Określanie regionu.

Wybierz narzędzie do tworzenia regionu i użyj go, aby wybrać obszar o równej wielkości dla każdego punktu mikroskali promieniotwórczej. Przypisz numer do każdego wybranego obszaru, klikając numer pod etykietą pozycji menu. Kliknij opcję Eksport pliku, a następnie Raport regionu 2D, aby wyeksportować wartości OD dla każdego punktu wzorca kalibracji.

W zastrzeżonym oprogramowaniu do obrazowania użyj narzędzia do tworzenia regionów, aby wybrać obszar zainteresowania w każdej sekcji i zmierzyć jego OD, aby rozpocząć kwantyfikację autoradiogramów. Wybierz ten sam region w każdej sekcji, tworząc szablon dla obszaru zainteresowania, a następnie skopiuj go i dostosuj do drobnych zmian w anatomii mózgu w każdym autoradiogramie. Następnie kliknij Plik Eksportuj raport regionów 2D, aby wyeksportować wartości ROD i rozmiary wybranych obszarów do arkusza kalkulacyjnego.

Określić wiązanie radioligandu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu anatomiczny rozkład miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie jest wizualizowany za pomocą znakowanego radioaktywnie analogowego radioaktywnego HOCPCA GHB w mózgu myszy, który został pocięty na odcinki czołowe, strzałkowe i poziome. Wysokie poziomy wiązania obserwuje się w hipokampie i korze, podczas gdy niższe poziomy wiązania obserwuje się w prążkowiu, a w móżdżku nie wykrywa się wiązania.

Jak pokazano tutaj, struktury anatomiczne mogą być wizualizowane przy użyciu różnych płaszczyzn, a integralność anatomiczna może być wspierana przez barwienie fioletem krezylowym. Reprezentatywne autoradiogramy szczura, myszy i świni ilustrują ewolucyjne zachowanie miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie w mózgu ssaków. Radioaktywne miejsca wiązania HOCPCA są wykrywane u wszystkich trzech gatunków, co umożliwia porównanie ogólnej anatomii mózgu między nimi.

Miejsca wiązania GHB o wysokim powinowactwie są badane za pomocą radioligandów GHB, które wykazują różne powinowactwa do miejsc wiązania, ale porównywalne specyficzne działania. Radioaktywna HOCPCA charakteryzuje się wysoką czułością i doskonałym stosunkiem sygnału do szumu. Ze względu na niższą czułość radioaktywnego NCS-382, w celu uzyskania podobnych poziomów wiązania należy stosować wyższe stężenia radioligandów.

Jeszcze wyższe stężenia radioligandów są niezbędne, aby radioaktywny GHB osiągnął porównywalne poziomy wiązania. Jednak wyższe stężenia radioligandów zwiększają również poziom niespecyficznego wiązania, a w konsekwencji niższy stosunek sygnału do szumu. Ważne jest, aby zoptymalizować warunki testu, takie jak stężenie radioligandu, czas mycia i ekspozycji, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu, a także bardzo ważne jest, aby pamiętać o wcześniejszym usunięciu płytki.

Procedura może zostać rozszerzona na warunki in vivo, aby uzyskać wyobrażenie o wiązaniu związków w żywym zwierzęciu, co może być przydatne w projektach odkrywczych. Należy pamiętać o pracy w laboratorium z certyfikowanym pełnym materiałem radioaktywnym oraz o noszeniu odzieży ochronnej podczas pracy z radioaktywnością lub paraformaldehydem.