Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych
March 12th, 2019
Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.
Autoradiografia jest potężną i prostą techniką badania rozkładu miejsc wiązania białek w tkankach przy użyciu specyficznego radioligandu dla celu. Jest to również odpowiednia alternatywa dla immunohistochemii. Technika ta wizualizuje ekspresję białek z rozdzielczością przestrzenną za pomocą obrazów cyfrowych, która jest szybsza niż tradycyjna ekspozycja na kliszy.
Może być również stosowany do analizy farmakologicznej docelowych białek. Metoda obejmuje tkanki myszy osadzone na szkle, ale może być rozszerzona na inne gatunki, a nawet na komórki hodowane na szkiełkach nakrywkowych. Procedurę zademonstruje Nane Griem-Krey, doktorantka w moim laboratorium.
Na początek zanurz tkankę w sproszkowanym suchym lodzie, aby ją zamrozić. Przenieś zamrożoną tkankę bezpośrednio do kriostatu ustawionego na minus 20 stopni Celsjusza. Pozwól tkance zaaklimatyzować się do minus 20 stopni Celsjusza w kriostacie przez 20 minut.
Następnie przykryj uchwyt na chusteczki podłożem do zatapiania na zewnątrz kriostatu i szybko umieść zamrożoną próbkę tkanki w pożądanej orientacji, gdy podłoże do zatapiania jest jeszcze płynne. Przenieś uchwyt na chusteczki z powrotem do kriostatu i wystawij pożywkę do zatapiania na działanie temperatur poniżej minus 10 stopni Celsjusza w celu stwardnienia. Umieść uchwyt na chusteczki w mikrotomie kriostatu.
Dostosuj orientację tkanki, aby uniknąć nachylonych odcinków. Przetnij tkankę pod kierunkiem atlasu stereotaktycznego na odcinki o pożądanej grubości i w razie potrzeby rozłóż wycinek małym pędzelkiem. Rozmrozić Zamontuj sekcję na szkiełku mikroskopowym.
Następnie kolejno zbierz sekcje z obszaru zainteresowania, aby uzyskać pożądane powtórzenie techniczne. Pozostaw sekcje na szkiełkach do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę przed dalszym obchodzeniem się. W certyfikowanym laboratorium promieniotwórczym należy za pomocą ołówka oznaczyć szkiełka warunkami doświadczalnymi.
Umieść szkiełka poziomo w plastikowych tacach. Ostrożnie nanieść odpowiednią objętość bufora SA dostosowaną do danego celu do sekcji zamontowanych na szkiełkach. Upewnij się, że każda sekcja jest całkowicie zakryta.
W celu określenia niespecyficznego wiązania należy uzupełnić bufor SA odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku. Następnie przykryj tace pokrywkami, aby uniknąć parowania. Wstępną inkubację w odpowiedniej temperaturze przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej ustawionej na 20 obr./min.
Następnie odlej płyn do wstępnej inkubacji z każdego szkiełka i przenieś szkiełka z powrotem do plastikowej tacy. Natychmiast całkowicie pokryć skrawki odpowiednim stężeniem radioligandu w buforze SA. W celu oznaczenia niespecyficznego wiązania należy uzupełnić roztwór radioligandu odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku.
Przykryj tace pokrywkami i inkubuj w żądanych warunkach, stale delikatnie potrząsając przy 20 obr./min. Następnie odlej roztwór inkubacyjny i przenieś szkiełka do stojaka na szkiełka mikroskopowe. Natychmiast umyj szkiełka.
W przypadku protokołu GHB umyj dwukrotnie lodowatym buforem SA przez 20 sekund, a następnie spłucz dwukrotnie, zanurzając ruszt szkiełkowy w tacach wypełnionych lodowatą wodą destylowaną. Ustaw szkiełka pionowo w stojakach i susz na powietrzu przez co najmniej godzinę. Następnie przenieś szkiełka do stabilizatora zawierającego paraformaldehyd w celu utrwalenia przez noc w temperaturze pokojowej.
Następnego dnia przenieść szkiełka do pudełka eksykatora zawierającego żel krzemionkowy o temperaturze pokojowej. Pozostaw szkiełka w pojemniku eksykatora na trzy godziny, aby usunąć wilgoć. Najpierw umieść skrawki w kasecie z płytką obrazową osłoniętą promieniowaniem, tkanką skierowaną do góry.
Do każdej kasety należy dołączyć radioaktywną mikroskalę w celu późniejszego ilościowego określenia wiązania radioligandu. Bezpośrednio przed użyciem załaduj wrażliwą na tryt płytkę obrazową z luminoforem do maszyny do obrazowania luminoforem i wystaw ją na działanie widzialnego światła podczerwonego zgodnie z instrukcjami producenta, aby ją usunąć. Następnie wyjmij płytkę obrazową z maszyny do obrazowania luminoforowego i natychmiast umieść ją na sekcjach kasety.
Upewnij się, że kaseta jest całkowicie zamknięta. Wystaw sekcje na płytkę obrazową z luminoforem, aby zoptymalizować czas ekspozycji w temperaturze pokojowej, gdy są chronione przed światłem. Po naświetleniu ostrożnie otwórz kasetę w ciemności i natychmiast przenieś płytkę obrazową do ciemnego pudełka kamery luminoforowej.
Zeskanuj płytę w najwyższej możliwej rozdzielczości, aby uzyskać obraz cyfrowy. Aby rozpocząć, otwórz odpowiedni program do analizy obrazu. Określ względne gęstości optyczne dla każdego wzorca kalibracji, wybierając z menu opcję Określanie regionu.
Wybierz narzędzie do tworzenia regionu i użyj go, aby wybrać obszar o równej wielkości dla każdego punktu mikroskali promieniotwórczej. Przypisz numer do każdego wybranego obszaru, klikając numer pod etykietą pozycji menu. Kliknij opcję Eksport pliku, a następnie Raport regionu 2D, aby wyeksportować wartości OD dla każdego punktu wzorca kalibracji.
W zastrzeżonym oprogramowaniu do obrazowania użyj narzędzia do tworzenia regionów, aby wybrać obszar zainteresowania w każdej sekcji i zmierzyć jego OD, aby rozpocząć kwantyfikację autoradiogramów. Wybierz ten sam region w każdej sekcji, tworząc szablon dla obszaru zainteresowania, a następnie skopiuj go i dostosuj do drobnych zmian w anatomii mózgu w każdym autoradiogramie. Następnie kliknij Plik Eksportuj raport regionów 2D, aby wyeksportować wartości ROD i rozmiary wybranych obszarów do arkusza kalkulacyjnego.
Określić wiązanie radioligandu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu anatomiczny rozkład miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie jest wizualizowany za pomocą znakowanego radioaktywnie analogowego radioaktywnego HOCPCA GHB w mózgu myszy, który został pocięty na odcinki czołowe, strzałkowe i poziome. Wysokie poziomy wiązania obserwuje się w hipokampie i korze, podczas gdy niższe poziomy wiązania obserwuje się w prążkowiu, a w móżdżku nie wykrywa się wiązania.
Jak pokazano tutaj, struktury anatomiczne mogą być wizualizowane przy użyciu różnych płaszczyzn, a integralność anatomiczna może być wspierana przez barwienie fioletem krezylowym. Reprezentatywne autoradiogramy szczura, myszy i świni ilustrują ewolucyjne zachowanie miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie w mózgu ssaków. Radioaktywne miejsca wiązania HOCPCA są wykrywane u wszystkich trzech gatunków, co umożliwia porównanie ogólnej anatomii mózgu między nimi.
Miejsca wiązania GHB o wysokim powinowactwie są badane za pomocą radioligandów GHB, które wykazują różne powinowactwa do miejsc wiązania, ale porównywalne specyficzne działania. Radioaktywna HOCPCA charakteryzuje się wysoką czułością i doskonałym stosunkiem sygnału do szumu. Ze względu na niższą czułość radioaktywnego NCS-382, w celu uzyskania podobnych poziomów wiązania należy stosować wyższe stężenia radioligandów.
Jeszcze wyższe stężenia radioligandów są niezbędne, aby radioaktywny GHB osiągnął porównywalne poziomy wiązania. Jednak wyższe stężenia radioligandów zwiększają również poziom niespecyficznego wiązania, a w konsekwencji niższy stosunek sygnału do szumu. Ważne jest, aby zoptymalizować warunki testu, takie jak stężenie radioligandu, czas mycia i ekspozycji, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu, a także bardzo ważne jest, aby pamiętać o wcześniejszym usunięciu płytki.
Procedura może zostać rozszerzona na warunki in vivo, aby uzyskać wyobrażenie o wiązaniu związków w żywym zwierzęciu, co może być przydatne w projektach odkrywczych. Należy pamiętać o pracy w laboratorium z certyfikowanym pełnym materiałem radioaktywnym oraz o noszeniu odzieży ochronnej podczas pracy z radioaktywnością lub paraformaldehydem.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie demonstruje autoradiografię jako skuteczną technikę ilościowego określania wiązania radioligandów w sekcjach tkanek. Stosując tkanki myszy, metoda wizualizuje miejsca wiązania z wysoką rozdzielczością przestrzenną, oferując szybszą alternatywę dla tradycyjnych metod obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Farmakologia
- Neuronauki
- Techniki obrazowania
Tło
- Autoradiografia pozwala na badanie dystrybucji miejsc wiązania białek.
- Służy jako odpowiednia alternatywa dla immunohistologii.
- Ta metoda zapewnia wizualne przedstawienia szybciej niż tradycyjne metody.
- Technika ta może być również wykorzystana do analizy farmakologicznej.
Cel badania
- Zobrazować procedurę autoradiografii w próbkach tkankowych.
- Pokażać rozdzielczość przestrzenną w wizualizowanie ekspresji białek.
- Podkreślić różnice w lokalizacji wiązania w różnych regionach mózgu.
Stosowane metody
- Wykorzystano tkanki myszy, które zostały natychmiastowo zamrożone i przecięte na sekcje.
- Metoda autoradiografii polegała na znakowaniu i inkubacji sekcji tkankowych z radioligandami.
- Ważne kroki obejmują przygotowanie tkanki, inkubację, płukanie i obrazowanie.
- Cyfrowe obrazowanie wykonano z płyt fosforowanych do ilościowego określania wiązania.
Główne wyniki
- Obserwowano wyraźną anatomiczną dystrybucję miejsc wiązania GHB o wysokiej afinicji.
- Wysokie poziomy wiązania zidentyfikowano w hipokampie i korze.
- Niższe poziomy wiązania zauważono w prążkowiu, bez wykrycia wiązania w móżdżku.
- Badanie dostarczyło kluczowych wizualizacji struktur anatomicznych na różnych płaszczyznach.
Wnioski
- Badanie podkreśla autoradiografię jako potężne narzędzie do wizualizowania wiązania białek w tkankach.
- Poprawia zrozumienie dystrybucji miejsc wiązania w różnych regionach mózgu.
- Ta metoda może informować o ocenach farmakologicznych i zrozumieniu mechanizmów neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Autoradiography enables precise visualization and quantification of pharmacological target distribution in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides spatially resolved binding data that informs ligand selectivity and affinity measurements, directly impacting lead identification and portfolio triage decisions. Its compatibility with multiple species and tissue types enhances translational continuity from discovery through preclinical assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Visualizes anatomical distribution of high-affinity binding sites to interrogate therapeutic hypotheses and clarify target engagement.
- Operational Value: Enables pharmacological characterization of ligand affinity through Kd, Ki, and Bmax measurements in selected tissues.
- Strategic Value: Supports predictive confidence by quantifying target density and selectivity across brain regions for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative autoradiograms with high spatial resolution for reliable compound evaluation in validated biological systems.
- Operational Value: Standardizes binding assay parameters including radioligand concentration, washing, and exposure time to optimize signal-to-noise ratios.
- Strategic Value: Facilitates assay reproducibility and scalability across species (mouse, rat, pig) demonstrating evolutionary conservation of targets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates evolutionary conservation of high-affinity GHB binding sites across mammalian species, supporting cross-species target validation.
- Operational Value: Enables comparison of gross brain anatomy between species using consistent radioligand binding patterns.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing binding site distribution data relevant to neurological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative binding data that supports mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing target distribution in distinct anatomical structures.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, washing, and imaging protocols that yield reproducible quantitative outputs.
- Analytics: Enables measurement of relative optical densities and region-of-interest quantification for comparing binding levels across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by demonstrating target conservation across species and anatomical planes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for pharmacological target characterization applicable to diverse discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target localization and ligand selectivity characterization reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding assays across tissue types and species.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative binding site density and distribution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radioligand handling, tissue sectioning, and radioactive material safety protocols.
- Dependent on specialized instrumentation including cryostat, phosphor imaging plates, and image analysis software for quantification.
- Necessitates cross-team standardization of binding assay parameters such as incubation temperature, washing steps, and exposure times.
- Involves adaptation considerations across model systems including tissue mounting, section thickness, and blocking agents for non-specific binding.
- Includes practical limitations such as the need for certified radioactivity laboratories, signal-to-noise optimization, and careful selection of radioligand concentration to minimize non-specific binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Tissue Preparation by Cryosectioning
2:13
In vitro Autoradiography
4:44
Exposure to Phosphor Imaging Plates and Scanning
6:04
Densitometric Analysis of Digital Image
7:34
Results: Visualization and Characterization of Pharmacological Targets Using Radiography
9:34
Conclusion
![Techniczny aspekt automatycznej syntezy i oceny kinetycznej w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59557.jpg%3Fv%3D2026-07-04T06%253A55%253A47.000Z&w=384&q=75)
