Name: Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj autoradiografię jako prostą metodę wizualizacji miejsc wiązania ligandów w tkankach myszy. Technika ta oferuje wysoką rozdzielczość przestrzenną i stanowi szybszą alternatywę dla tradycyjnych metod obrazowania w farmakologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Fundację Lundbeck (Grant R133-A12270) oraz Fundację Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Autorzy dziękują dr. Alešowi Markowi za dostarczenie [3H]radioligandu.

Wszystkie czynności związane z hodowlą i wykorzystaniem zwierząt były wykonywane zgodnie z wytycznymi duńskiego Inspektoratu Doświadczeń na Zwierzętach (The Danish Animal Experimentation Inspectorate).
UWAGA: Opisany tutaj protokół obejmuje przygotowanie tkanki (tj. tkanki mózgu myszy), analizę autoradiograficzną in vitro w stopniu szczegółowości wystarczającym do wdrożenia metody w nowym laboratorium, naświetlanie płyt obrazujących z fosforem oraz późniejszą analizę densytometryczną autoradiogramów (Rysunek 2>) w celu lokalizacji i ilościowego oznaczenia wiązania radioligandu w poszczególnych strukturach anatomicznych. Dla porównania histologicznego dołączono protokół barwienia fioletem krez 저lowym. Ponadto w protokole zawarto oznaczenie wiązania niespecyficznego z wykorzystaniem ligandu konkurencyjnego. Szczegółowy opis sposobu wyznaczania Kd, Bmax lub Ki znajduje się w poprzedniej publikacji4.
1. Przygotowanie tkanki poprzez kriosekcjonowanie
<ol>
	<li>Uśmierć mysz poprzez zwichnięcie szyi i natychmiast wypreparuj mózg, używając nożyczek i pęsety. Przejdź bezpośrednio do następnego kroku, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.</li>
	<li>Szybko zamroź tkankę poprzez zanurzenie w sproszkowanym suchym lodzie, gazowym CO2 lub izopentanie. Przenieś zamrożoną tkankę bezpośrednio do kriostatu z temperaturą ustawioną na -20 °C. Alternatywnie przechowuj tkankę w temperaturze -80 °C do czasu przetwarzania. 
	UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, aby ograniczyć uszkodzenia tkanki.</li>
	<li>Pozostaw tkankę w kriostacie w temperaturze -20 °C przez 20 min przed dalszą obróbką, aby zapobiec pękaniu tkanki.</li>
	<li>Pokryj uchwyt do tkanki medium do zatapiania poza kriostatem i szybko umieść zamrożony preparat tkanki w pożądanej orientacji, gdy medium do zatapiania jest jeszcze w stanie ciekłym. Na przykład, umieść mózg myszy pionowo na móżdżku, aby uzyskać koronalne przekroje rostralne. Przenieś uchwyt do tkanki z powrotem do kriostatu i wystaw medium do zatapiania na temperaturę poniżej -10 °C w celu utwardzenia. 
	UWAGA: Kruche preparaty tkankowe powinny zostać pokryte medium do zatapiania w formach do tkanek przed montażem.</li>
	<li>Umieść uchwyt do tkanki w mikrotomie kriostatu. Dostosuj orientację tkanki, aby uniknąć skośnych przekrojów.</li>
	<li>Wykonaj cięcia tkanki zgodnie z atlasem stereotaksycznym18, przygotowując przekroje o pożądanej grubości (zalecane 12 µm dla ligandów znakowanych [3H]). Jeśli to konieczne, ostrożnie wyprostuj i rozprostuj przekrój małym pędzlem, a następnie zamontuj go metodą rozmrażania na szkiełku mikroskopowym. Kolejno zbieraj przekroje z obszaru zainteresowania dla wymaganej liczby powtórzeń technicznych (np. 4 przekroje na szkiełko).</li>
	<li>Pozostaw przekroje na szkiełkach do wyschnięcia na powietrzu przez 1 h przed dalszą obróbką. 
	UWAGA: Dodanie materiału osuszającego do kasetek na szkiełka minimalizuje gromadzenie się wilgoci na przekrojach tkankowych. Protokół można w tym miejscu przerwać, przechowując przekroje długoterminowo w kasetkach na szkiełka w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Autoradiografia in vitro
OSTROŻNIE: Promieniotwórczość. Pracować w certyfikowanym laboratorium zgodnie z lokalnymi przepisami. Stosować odzież ochronną. Utylizować zgodnie z zasadami rozpadu promieniotwórczego lub przekazać certyfikowanej firmie zewnętrznej.
<ol>
	<li>Rozmrozić skrawki przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej (RT). Opisać szkiełka, podając warunki eksperymentalne. Do opisu należy użyć ołówka, ponieważ szkiełka będą kąpane w etanolu podczas późniejszego barwienia.</li>
	<li>Umieścić preparaty poziomo w plastikowych kuwetach. 
	UWAGA: Umieszczenie szkiełek na podwyższeniu wewnątrz plastikowych tacek ułatwia ich manipulację.</li>
	<li>Preinkubować sekcje zamocowane na szkiełkach w buforze do analizy dostosowanym do analizowanego celu (w przypadku protokołu dla GHB: 50 mM KHPO4 stosuje się bufor o pH 6,0) poprzez ostrożne naniesienie odpowiedniej objętości na preparat (700 µL (dla 3–4 koronalnych przekrojów mózgu gryzoni). 
	UWAGA: Należy upewnić się, że każda sekcja jest całkowicie pokryta cieczą.
	<ol>
		<li>Przykryć plastikowe tacki pokrywką, aby uniknąć parowania, i przeprowadzić preinkubację w odpowiedniej temperaturze (w przypadku protokołu GHB preinkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej) przy stałym, łagodnym wstrząsaniu (20 obr./min) na wstrząsarce do płytek.</li>
		<li>W celu oznaczenia wiązania niespecyficznego należy uzupełnić bufor do analizy odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku (w przypadku protokołu dla GHB: 1 mM GHB). 
		UWAGA: Preinkubacja może nie być konieczna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlać płyn po inkubacji wstępnej z każdego preparatu i przenieść preparaty z powrotem do plastikowej tacki.</li>
	<li>Aby uniknąć odwodnienia, należy niezwłocznie inkubować skrawki z odpowiednim stężeniem radioligandu w buforze do analizy w wybranych warunkach (dla protokołu GHB, 1 nM [3H]HOCPCA przez 1 h w temperaturze pokojowej), całkowicie pokrywając skrawki roztworem radioliganda (700 µL dla 3–4 koronalnych przekrojów gryzoni).
	<ol>
		<li>Inkubować w plastikowych kuwetach z zamkniętą pokrywą przy stałym, łagodnym wytrząsaniu (20 obr./min). 
		UWAGA: Stężenie radioliganda można zweryfikować poprzez pomiar alikwoty w scintillation counter (liczniku scyntylacyjnym).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć roztwór inkubacyjny, odlewając ciecz, a następnie przenieść preparaty na statyw do szkiełek przedmiotowych. Natychmiast przejść do następnego kroku, aby zapobiec odwodnieniu przekrojów.</li>
	<li>Umyj preparaty. W przypadku protokołu GHB dwukrotnie przemyj preparaty lodowatym buforem do testu przez 20 s, a następnie dwukrotnie opłucz, zanurzając statyw z preparatami w kuwetach z lodowatą wodą destylowaną w celu usunięcia soli. Umieść preparaty pionowo w statywach i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej lub wysusz preparaty przez 5 min za pomocą dmuchawy ustawionej na zimny nawiew. 
	UWAGA: Proces płukania musi zostać zoptymalizowany, np.obfite przemywanie może być pomocne w celu zmniejszenia wiązania niespecyficznego.</li>
	<li>Przenieść preparaty na slajdach do utrwalacza zawierającego proszek paraformaldehydu (PFA), aby przeprowadzić nocną fiksację oparami PFA w temperaturze pokojowej w celu zachowania integralności kompleksu ligand-cel. 
	OSTROŻNIE: PFA jest toksyczne. Należy umieścić utrwalacz w dygestorium i unikać kontaktu PFA ze skórą i oczami.</li>
	<li>Następnego dnia przenieść preparaty do pudełka z deskrykatorem zawierającym żel krzemionkowy na 3 h w temperaturze pokojowej w celu usunięcia wilgoci.</li>
</ol>
3. Naświetlanie płyt obrazujących z fosforem i skanowanie
<ol>
	<li>Umieść skrawki w osłoniętej przed promieniowaniem kasecie z płytą obrazową, tak aby tkanka była skierowana do góry. W celu późniejszej kwantyfikacji wiązania radioliganda, do każdej kasety dołącz skalę mikro dla [3H]. Rozmieść skrawki losowo i poddaj je ekspozycji w tej samej kasecie w celu bezpośredniego porównania.</li>
	<li>Wymaż czułą na tryt płytę obrazową fosforową bezpośrednio przed użyciem, aby usunąć sygnały nagromadzone podczas przechowywania oraz wyeliminować sygnały tła. W tym celu włóż płytę do urządzenia do obrazowania fosforowego i naświetl ją światłem widzialnym/podczerwonym zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Wyjmij płytę z urządzenia do obrazowania fosforowego i natychmiast połóż ją na skrawkach w kasecie. Upewnij się, że kaseta jest całkowicie zamknięta. Poddaj skrawki ekspozycji na płytę obrazową fosforową przez 3 dni w RT, osłonięte przed światłem.</li>
	<li>Ponieważ światło wymazuje sygnał z płyty obrazowej, ostrożnie otwórz kasetę w ciemności i natychmiast przenieś płytę obrazową do ciemnej komory skanera fosforowego lub umieść skaner w ciemni. 
	UWAGA: Pamiętaj o zanotowaniu rozmieszczenia slajdów podczas ekspozycji, aby móc zidentyfikować poszczególne preparaty na obrazie cyfrowym po analizie. Dlatego płyty obrazowe fosforowe mają również jeden narożnik ścięty pod charakterystycznym kątem, co pozwala zidentyfikować prawidłową orientację płyty na obrazie cyfrowym.</li>
	<li>Zeskanuj płytę z najwyższą możliwą rozdzielczością, aby uzyskać obraz cyfrowy.</li>
</ol>
4. Opcjonalnie: barwienie preparatów tkankowych fioletem krezylowym
<ol>
	<li>Przygotować 1% roztwór fioletu krezylowego, mieszając 5 g octanu fioletu krezylowego w 500 mL wody dejonizowanej (dH2O) aż do całkowitego rozpuszczenia (około 2 h). Przefiltrować roztwór przez papier filtracyjny za pomocą lejka do nowej butelki o pojemności 50 mL. Dostosować pH do poziomu 3,5-3,8.</li>
	<li>Umieścić zestaw do barwienia preparatów pod wyciągiem (dygestorium). Przygotować kuwety z następującymi roztworami w białych kuwetach z polipropylenu (z wyjątkiem ksylenu): 
	a. 50% etanolu/50% dH2O 
	b. 70% etanolu/30% dH2O 
	c. 10% etanolu 
	d. 10% etanolu 
	e. 10% dH2O 
	f. 1% fioletu krezylowego 
	g. 0,07% kwasu octowego (dodać 175 µL kwasu octowego do 250 mL dH2O). 
	h. 100% ksylenu w zielonych kuwetach odpornych na rozpuszczalniki 
	i. 10% ksylenu w zielonych kuwetach odpornych na rozpuszczalniki</li>
	<li>Przenieść preparaty pod wyciąg i umieścić je w statywie na szkiełka.</li>
	<li>Rozpuścić lipidy, zanurzając szkiełka na 1 min w szeregu roztworów etanolu w dH2O o rosnącym stężeniu, aż do 10% etanolu (kuwety a-d).</li>
	<li>Rehydratować preparaty w dH2O, zanurzając szkiełka na 1 min w roztworach etanolu o malejącym stężeniu (kuwety a-d w kolejności odwrotnej, a następnie kuweta e).</li>
	<li>Zanurzyć preparaty w roztworze fioletu krezylowego na 10 min.</li>
	<li>Przepłukać preparaty w 0,07% kwasie octowym, delikatnie unosząc i opuszczając szkiełka przez 4-8 s. Przemyć szkiełka, zanurzając je w dH2O na 1 min.</li>
	<li>Odwodnić preparaty, zanurzając szkiełka na 30 s w rosnących stężeniach etanolu (kuwety a-d).</li>
	<li>Przenieść preparaty przez dwie kuwety z 10% ksylenem (kuwety h i), aby usunąć etanol.</li>
	<li>Rehydratować preparaty w dH2O, zanurzając szkiełka na 1 min w roztworach etanolu o malejącym stężeniu (kuwety a-d w kolejności odwrotnej, a następnie kuweta e).</li>
	<li>Wyjąć szkiełka z soli fizjologicznej za pomocą pęsety. Nanieść na każde szkiełko po kilka kropli organicznego medium montażowego i nałożyć na wierzch szkiełko coverglass o wymiarach 24 x 60 mm w celu zabezpieczenia preparatów. Usunąć pęcherzyki powietrza między preparatem a szkiełkiem coverglass, delikatnie naciskając na nie. 
	UWAGA: Pozostałe szkiełka przechowywać w ksylenie podczas montowania, aby zapobiec ich wyschnięciu.</li>
	<li>Suszyć szkiełka przez noc pod wyciągiem w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Wykonać zdjęcie preparatu za pomocą mikroskopu z obiektywem 1,25X.</li>
</ol>
5. Analiza densytometryczna obrazu cyfrowego
<ol>
	<li>Zmierz względne gęstości optyczne (ROD) każdego standardu kalibracyjnego z [3H]skala mikro z wykorzystaniem oprogramowania do analizy obrazu.
	<ol>
		<li>Wybierz obszar o tej samej wielkości dla każdego punktu [3H] w skali mikro przy użyciu narzędzia do Tworzenie regionu z pozycji menu Wyznaczanie regionuPrzypisz numer do każdego wybranego obszaru, klikając na Numer w punkcie menu Etykieta.</li>
		<li>Wyeksportuj wartości OD dla każdego punktu standardu kalibracyjnego, klikając Plik | Eeksport | raport z obszaru 2DPrzenieś wartości ROD do arkusza kalkulacyjnego i znormalizuj je względem wielkości wybranego obszaru. Wykonaj regresję liniową w celu uzyskania krzywej standardowej do dalszych analiz densytometrycznych. 
		UWAGA: Należy upewnić się, że wybrane obszary zostały oznakowane, aby umożliwić identyfikację odpowiadających im wartości ROD oraz próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź kwantyfikację autoradiogramów przy użyciu dedykowanego oprogramowania do obrazowania, wybierając obszar zainteresowania (ROI) za pomocą Tworzenie obszaru narzędzie w każdym przekroju i pomiar jego gęstości optycznej (OD). Wybierz ten sam obszar w każdym przekroju poprzez utworzenie szablonu dla obszaru zainteresowania (ROI), który jest kopiowany i ręcznie dostosowywany do niewielkich różnic w anatomii mózgu dla każdego autoradiogramu. Zidentyfikuj anatomię ROI poprzez porównanie autoradiogramów z atlasem mózgu18W przypadku porównywania wielu grup badawczych analizę należy przeprowadzić w sposób zaślepiony i zrandomizowany, aby uniknąć stronniczego wyboru obszarów zainteresowania (ROI).</li>
	<li>Wyeksportuj wartości ROD oraz rozmiary wybranych obszarów do arkusza kalkulacyjnego, klikając Plik | Eeksport | raport z obszaru 2D.</li>
	<li>Podziel zmierzone ROD wybranego ROI przez jego pole powierzchni, aby uzyskać gęstość na jednostkę powierzchni.</li>
	<li>Zmierz ROD tła płytki, a następnie wyeksportuj odpowiadające wartości ROD oraz wielkość obszaru do arkusza kalkulacyjnego. Od każdej wartości ROD z każdego ROI odejmij średni sygnał tła.</li>
	<li>Oblicz średnią wartości ROD dla powtórzeń technicznych, t. j.próbek sekcji wykonanych z tkanki pochodzącej od tego samego zwierzęcia.</li>
	<li>Należy użyć krzywej wzorcowej, aby przeliczyć ROD na jednostki wiązania radioliganda, t. j.., nCi/mg równoważników tkankowych (TE). 
	UWAGA: Termin TE jest stosowany, ponieważ wzorce są generowane z materiałów symulujących tkankę.</li>
	<li>Wyrazić wiązanie poprzez przeliczenie nCi/mg na nmol/mg TE zgodnie z aktywnością właściwą radioliganda (Równanie 1). 
	<img alt="Wzór obliczeniowy wiązania ligandu, równanie analizy aktywności specyficznej, badania biochemiczne." src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> (1)</li>
	<li>Aby uzyskać wartości wiązania specyficznego, należy odjąć wiązanie niespecyficzne od wiązania całkowitego.</li>
	<li>Oblicz średnią wiązania dla każdego powtórzenia biologicznego, wykorzystując średnią z powtórzeń technicznych dla każdego zwierzęcia (uzyskaną w kroku 5.6).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Jakość testu autoradiograficznego jest najczęściej określana przez czułość radioligandu. Głównym czynnikiem przyczyniającym się do tego jest wybrany izotop promieniotwórczy, który wynika z dostępności znanych ligandów lub wykonalności określonych technik znakowania w celu uzyskania ligandów o odpowiedniej aktywności właściwej (tj. ilości promieniotwórczości na jednostkę mola radioligandu)23i przy ograniczonych ilościach degradacji chemicznej. Duża liczba radioligandów znanych ligandów jes...

Autoradiografia to metoda, która dostarcza obrazów rozpadu radioaktywnego. Technika ta jest rutynowo stosowana do badania rozmieszczenia tkankowego białka będącego przedmiotem zainteresowania in vitro w oparciu o specyficzną interakcję farmakologiczną między związkiem znakowanym radioaktywnie a jego celem. Dostarcza to bezpośrednich informacji o selektywności liganda dla celu. Autoradiografia in vitro może być również stosowana do ilościowego oznaczania farmakologicznych parametrów wiązania radioligandów, takich jak stała dysocjacji (Kd) i gęstość miejsc wiązania (Bmax), a także do wyznaczania stałej inhibicji (Ki) konkurujących ligandów1,2. W porównaniu z tradycyjnym wiązaniem radioligandów homogenatowych, autoradiografia ma tę zaletę, że jest w stanie uwidocznić anatomię przestrzenną i dostarczyć zwięzłych szczegółów regionalnych wzorców ekspresji3. Metoda autoradiografii jest zatem istotną alternatywą dla immunocytochemii, zwłaszcza w przypadku braku zwalidowanego przeciwciała. Autoradiografia jest łatwo wdrażana w standardowym laboratorium radioizotopowym, biorąc pod uwagę dostępność odpowiedniego radioligandu o wymaganej swoistości farmakologicznej, dostęp do kriostatu mikrotomowego do przygotowania skrawków tkanek oraz odpowiedniego urządzenia do obrazowania, które jest w stanie analizować rozkład radioaktywności w odpowiednich skrawkach tkanki. Warto zauważyć, że ważnym kryterium wyboru radioligandu jest ograniczona ilość wiązania z miejscami niedocelowymi. Może to dotyczyć innych białek, błon lub materiałów, takich jak tworzywa sztuczne lub filtry, i jest zbiorczo określane jako wiązanie niespecyficzne. Zazwyczaj wiązanie niespecyficzne jest nienasycone, ale może być nasycone, jeśli obejmuje określone białko poza celem. Najlepszym sposobem sprawdzenia prawdziwego specyficznego wiązania jest porównanie z tkankami pozbawionymi celu, np. genetycznie modyfikowana (knock-out) tkanka4.
Tutaj metodologia jest zilustrowana autoradiograficzną charakterystyką miejsca wiązania kwasu γ-hydroksymasłowego (GHB) o wysokim powinowactwie w mózgu ssaków. Zrozumienie interakcji farmakologicznej między GHB a jego miejscem wiązania ma znaczenie, ponieważ GHB jest zarówno klinicznie użytecznym lekiem w leczeniu narkolepsji i alkoholizmu5, ale także naturalnym składnikiem mózgu ssaków i lekiem rekreacyjnym6. Miejsca wiązania GHB o wysokim powinowactwie zostały po raz pierwszy opisane przy użyciu [3H]GHB wiązania z mózgiem szczura homogenate7. Z biegiem lat, dalsze badania autoradiograficzne z [3H]GHB i analogiem [3H]NCS-382 wykazały duże zagęszczenie miejsc wiązania w obszarach przodomózgowia szczura8,9,10, mouse9, pig11i małpa/ludzka brain12. Jednak tożsamość molekularna i dokładne znaczenie funkcjonalne tych miejsc wiązania pozostały nieuchwytne.
Z zamiarem dalszego scharakteryzowania miejsc wiązania i ułatwienia badań nad fizjologiczną rolą GHB, opracowano wiele radioligandów zawierających różne izotopy o różnym powinowactwie ([3H]GHB, [3H]NCS-382, [3H]HOCPCA i [125I]BnOPh-GHB)13,14,15,16(sprawdzone w17) (Rysunek 1). Połączenie selektywnych radioligandów o wysokim powinowactwie i bardzo dużej gęstości tkanek miejsc wiązania pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości obrazów przy użyciu techniki obrazowania luminoforowego9,11. Wraz z zarysem praktycznych punktów związanych z przygotowaniem eksperymentu autoradiograficznego i ilustracją ilustrującą szczegóły, sekcja dyskusyjna położy nacisk na i) wybór radionuklidów, ii) wybór warunków oznaczania oraz iii) użycie płytek do obrazowania luminoforowego w porównaniu z kliszą rentgenowską. Ogólnym celem niniejszej pracy jest dostarczenie szczegółów technicznych, metodologicznych i naukowych dotyczących techniki autoradiografii w celu informowania o rozmieszczeniu tkanek i analizie farmakologicznej docelowych białek.

<table><tbody><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 Płytka obrazowa</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td></td><td>28956481 20x40 cm - Wrażliwy na tryt</td></tr><tr><td>Octan fioletu krezylowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (niewodne podłoże montażowe do mikroskopii)</td><td>Merck Związek Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T., 12 x 125 ml</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Szkiełka podstawowe Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Szkiełka</td><td>mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>631-9483</td></tr><tr><td>Manualny zestaw do barwienia szkiełek Tissue-Tek</td><td>Sakura Finetek Denmark ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tryt Standard na szkle</td><td>Amerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie, Inc.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>Substytut ksylenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiografia in vitro ma na celu wizualizację anatomicznego rozmieszczenia interesującego białka w tkance zarówno od zwierząt doświadczalnych, jak i od ludzi. Metoda opiera się na specyficznym wiązaniu radioligandu z jego celem biologicznym. Dlatego zamrożone skrawki tkanek inkubuje się z roztworem radioligandu, a wiązanie z celem jest następnie lokalizowane przez wykrycie rozpadu promieniotwórczego, na przykład za pomocą światłoczułej folii lub płytek do obrazowania luminoforowego. Uzyskane w ten sposób autoradiogramy cyfrowe charakteryzują się niezwykłą rozdzielczością przestrzenną, co umożliwia kwantyfikację i lokalizację wiązania radioligandów w różnych strukturach anatomicznych. Ponadto kwantyfikacja pozwala na farmakologiczne scharakteryzowanie powinowactwa ligandów za pomocą stałych dysocjacji (Kd), stałych inhibicji (Ki) oraz gęstości miejsc wiązania (Bmax) w wybranych tkankach. W ten sposób metoda dostarcza informacji zarówno o lokalizacji docelowej, jak i selektywności ligandów. W tym przypadku technika ta jest zilustrowana autoradiograficzną charakterystyką miejsc wiązania kwasu γ-hydroksymasłowego (GHB) o wysokim powinowactwie w tkance mózgowej ssaków, ze szczególnym naciskiem na rozważania metodologiczne dotyczące parametrów oznaczania wiązania, wyboru radioligandu i metody wykrywania.

Zastosowanie opisanego protokołu pozwoliło na wizualizację anatomicznego rozkładu wysokopowinowactwowych miejsc wiązania GHB z wykorzystaniem radioznaczonego analogu GHB [3H]HOCPCA w mózgu myszy, który pocięto na przekroje wieńcowe, strzałkowe i poziome (Rycina 3). Zaobserwowano wysoki poziom wiązania w hipokampie i korze, niższe wiązanie w prążkowiu, natomiast w móżdżku nie wykryto wiązania, co odpowiada wcześniej raportowanym wzorcom ekspresji wy...

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiografia jest potężną i prostą techniką badania rozkładu miejsc wiązania białek w tkankach przy użyciu specyficznego radioligandu dla celu. Jest to również odpowiednia alternatywa dla immunohistochemii. Technika ta wizualizuje ekspresję białek z rozdzielczością przestrzenną za pomocą obrazów cyfrowych, która jest szybsza niż tradycyjna ekspozycja na kliszy.Może być również stosowany do analizy farmakologicznej docelowych białek. Metoda obejmuje tkanki myszy osadzone na szkle, ale może być rozszerzona na inne gatunki, a nawet na komórki hodowane na szkiełkach nakrywkowych. Procedurę zademonstruje Nane Griem-Krey, doktorantka w moim laboratorium.Na początek zanurz tkankę w sproszkowanym suchym lodzie, aby ją zamrozić. Przenieś zamrożoną tkankę bezpośrednio do kriostatu ustawionego na minus 20 stopni Celsjusza. Pozwól tkance zaaklimatyzować się do minus 20 stopni Celsjusza w kriostacie przez 20 minut.Następnie przykryj uchwyt na chusteczki podłożem do zatapiania na zewnątrz kriostatu i szybko umieść zamrożoną próbkę tkanki w pożądanej orientacji, gdy podłoże do zatapiania jest jeszcze płynne. Przenieś uchwyt na chusteczki z powrotem do kriostatu i wystawij pożywkę do zatapiania na działanie temperatur poniżej minus 10 stopni Celsjusza w celu stwardnienia. Umieść uchwyt na chusteczki w mikrotomie kriostatu.Dostosuj orientację tkanki, aby uniknąć nachylonych odcinków. Przetnij tkankę pod kierunkiem atlasu stereotaktycznego na odcinki o pożądanej grubości i w razie potrzeby rozłóż wycinek małym pędzelkiem. Rozmrozić Zamontuj sekcję na szkiełku mikroskopowym.Następnie kolejno zbierz sekcje z obszaru zainteresowania, aby uzyskać pożądane powtórzenie techniczne. Pozostaw sekcje na szkiełkach do wyschnięcia na powietrzu przez godzinę przed dalszym obchodzeniem się. W certyfikowanym laboratorium promieniotwórczym należy za pomocą ołówka oznaczyć szkiełka warunkami doświadczalnymi.Umieść szkiełka poziomo w plastikowych tacach. Ostrożnie nanieść odpowiednią objętość bufora SA dostosowaną do danego celu do sekcji zamontowanych na szkiełkach. Upewnij się, że każda sekcja jest całkowicie zakryta.W celu określenia niespecyficznego wiązania należy uzupełnić bufor SA odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku. Następnie przykryj tace pokrywkami, aby uniknąć parowania. Wstępną inkubację w odpowiedniej temperaturze przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej ustawionej na 20 obr./min.Następnie odlej płyn do wstępnej inkubacji z każdego szkiełka i przenieś szkiełka z powrotem do plastikowej tacy. Natychmiast całkowicie pokryć skrawki odpowiednim stężeniem radioligandu w buforze SA. W celu oznaczenia niespecyficznego wiązania należy uzupełnić roztwór radioligandu odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku.Przykryj tace pokrywkami i inkubuj w żądanych warunkach, stale delikatnie potrząsając przy 20 obr./min. Następnie odlej roztwór inkubacyjny i przenieś szkiełka do stojaka na szkiełka mikroskopowe. Natychmiast umyj szkiełka.W przypadku protokołu GHB umyj dwukrotnie lodowatym buforem SA przez 20 sekund, a następnie spłucz dwukrotnie, zanurzając ruszt szkiełkowy w tacach wypełnionych lodowatą wodą destylowaną. Ustaw szkiełka pionowo w stojakach i susz na powietrzu przez co najmniej godzinę. Następnie przenieś szkiełka do stabilizatora zawierającego paraformaldehyd w celu utrwalenia przez noc w temperaturze pokojowej.Następnego dnia przenieść szkiełka do pudełka eksykatora zawierającego żel krzemionkowy o temperaturze pokojowej. Pozostaw szkiełka w pojemniku eksykatora na trzy godziny, aby usunąć wilgoć. Najpierw umieść skrawki w kasecie z płytką obrazową osłoniętą promieniowaniem, tkanką skierowaną do góry.Do każdej kasety należy dołączyć radioaktywną mikroskalę w celu późniejszego ilościowego określenia wiązania radioligandu. Bezpośrednio przed użyciem załaduj wrażliwą na tryt płytkę obrazową z luminoforem do maszyny do obrazowania luminoforem i wystaw ją na działanie widzialnego światła podczerwonego zgodnie z instrukcjami producenta, aby ją usunąć. Następnie wyjmij płytkę obrazową z maszyny do obrazowania luminoforowego i natychmiast umieść ją na sekcjach kasety.Upewnij się, że kaseta jest całkowicie zamknięta. Wystaw sekcje na płytkę obrazową z luminoforem, aby zoptymalizować czas ekspozycji w temperaturze pokojowej, gdy są chronione przed światłem. Po naświetleniu ostrożnie otwórz kasetę w ciemności i natychmiast przenieś płytkę obrazową do ciemnego pudełka kamery luminoforowej.Zeskanuj płytę w najwyższej możliwej rozdzielczości, aby uzyskać obraz cyfrowy. Aby rozpocząć, otwórz odpowiedni program do analizy obrazu. Określ względne gęstości optyczne dla każdego wzorca kalibracji, wybierając z menu opcję Określanie regionu.Wybierz narzędzie do tworzenia regionu i użyj go, aby wybrać obszar o równej wielkości dla każdego punktu mikroskali promieniotwórczej. Przypisz numer do każdego wybranego obszaru, klikając numer pod etykietą pozycji menu. Kliknij opcję Eksport pliku, a następnie Raport regionu 2D, aby wyeksportować wartości OD dla każdego punktu wzorca kalibracji.W zastrzeżonym oprogramowaniu do obrazowania użyj narzędzia do tworzenia regionów, aby wybrać obszar zainteresowania w każdej sekcji i zmierzyć jego OD, aby rozpocząć kwantyfikację autoradiogramów. Wybierz ten sam region w każdej sekcji, tworząc szablon dla obszaru zainteresowania, a następnie skopiuj go i dostosuj do drobnych zmian w anatomii mózgu w każdym autoradiogramie. Następnie kliknij Plik Eksportuj raport regionów 2D, aby wyeksportować wartości ROD i rozmiary wybranych obszarów do arkusza kalkulacyjnego.Określić wiązanie radioligandu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu anatomiczny rozkład miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie jest wizualizowany za pomocą znakowanego radioaktywnie analogowego radioaktywnego HOCPCA GHB w mózgu myszy, który został pocięty na odcinki czołowe, strzałkowe i poziome. Wysokie poziomy wiązania obserwuje się w hipokampie i korze, podczas gdy niższe poziomy wiązania obserwuje się w prążkowiu, a w móżdżku nie wykrywa się wiązania.Jak pokazano tutaj, struktury anatomiczne mogą być wizualizowane przy użyciu różnych płaszczyzn, a integralność anatomiczna może być wspierana przez barwienie fioletem krezylowym. Reprezentatywne autoradiogramy szczura, myszy i świni ilustrują ewolucyjne zachowanie miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie w mózgu ssaków. Radioaktywne miejsca wiązania HOCPCA są wykrywane u wszystkich trzech gatunków, co umożliwia porównanie ogólnej anatomii mózgu między nimi.Miejsca wiązania GHB o wysokim powinowactwie są badane za pomocą radioligandów GHB, które wykazują różne powinowactwa do miejsc wiązania, ale porównywalne specyficzne działania. Radioaktywna HOCPCA charakteryzuje się wysoką czułością i doskonałym stosunkiem sygnału do szumu. Ze względu na niższą czułość radioaktywnego NCS-382, w celu uzyskania podobnych poziomów wiązania należy stosować wyższe stężenia radioligandów.Jeszcze wyższe stężenia radioligandów są niezbędne, aby radioaktywny GHB osiągnął porównywalne poziomy wiązania. Jednak wyższe stężenia radioligandów zwiększają również poziom niespecyficznego wiązania, a w konsekwencji niższy stosunek sygnału do szumu. Ważne jest, aby zoptymalizować warunki testu, takie jak stężenie radioligandu, czas mycia i ekspozycji, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu, a także bardzo ważne jest, aby pamiętać o wcześniejszym usunięciu płytki.Procedura może zostać rozszerzona na warunki in vivo, aby uzyskać wyobrażenie o wiązaniu związków w żywym zwierzęciu, co może być przydatne w projektach odkrywczych. Należy pamiętać o pracy w laboratorium z certyfikowanym pełnym materiałem radioaktywnym oraz o noszeniu odzieży ochronnej podczas pracy z radioaktywnością lub paraformaldehydem.

autoradiography-as-simple-powerful-method-for-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.

Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Przedstawiono protokół badań przesiewowych leków małocząsteczkowych oparty na syntezie in-situ ultramałych fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) przy użyciu białka obciążonego lekiem jako matrycy. Metoda ta jest prosta do określenia powinowactwa wiązania leków z białkiem docelowym za pomocą widzialnego sygnału fluorescencyjnego emitowanego z matrycami białkowymi Au NC.

Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka

Tutaj prezentujemy protokół opisujący lokalizację receptorów angiotensyny II typu 1 w mózgu szczura za pomocą ilościowej, densytometrycznej autoradiografii receptorów in vitro przy użyciu analogu angiotensyny II, znakowanego jodem-125.

Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II

Tutaj opisaliśmy metodę obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia transportu mutantów rodopsyny związanych z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki. Do ilościowego określenia białka rodopsyny na powierzchni komórki lub w całej komórce wykorzystano analizę punktacji na wielu długościach fali.

Test transportu rodopsyny za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości

Tutaj reprezentujemy protokół do w pełni zautomatyzowanego znakowania radioaktywnego [11C]SNAP-7941 i analizy kinetyki w czasie rzeczywistym tego znacznika PET na komórkach wykazujących ekspresję i nieeksprymujących P-gp.

Techniczny aspekt automatycznej syntezy i oceny kinetycznej w czasie rzeczywistym [11C]SNAP-7941

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Prezentujemy protokół do bezpośredniej wizualizacji aktywności metabolicznej w komórkach regulowanych przez aminokwasy za pomocą mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (ciężka wodaD2O), która jest zintegrowana z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego (2PEF).

Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania czterech radioznaczników węgla-11 za pomocą "metody pętlowej" [11C]metylacji. Opisujemy procedurę syntezy [11C]ER-176, z danymi dla trzech dodatkowych radioznaczników: [11C]MRB, [11C]mHED i [11C]PiB. Metoda pętlowa zapewnia wydajną syntezę ze zwiększoną wydajnością radiochemiczną w porównaniu z tradycyjną metylacją naczynia reakcyjnego [11C].

Zwiększenie wydajności i wydajności znakowania radioligandów węgla-11 w badaniach klinicznych z wykorzystaniem metody pętli

Poznaj autoradiografię jako prostą metodę wizualizacji miejsc wiązania ligandów w tkankach myszy. Technika ta oferuje wysoką rozdzielczość przestrzenną i stanowi szybszą alternatywę dla tradycyjnych metod obrazowania w farmakologii.

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Przeglądaj więcej filmów