Badania przesiewowe genotypów bawełny pod kątem odporności na nicienie Reniform

Tutaj przedstawiono protokół szybkiego, nieniszczącego badania przesiewowego genotypów bawełny pod kątem odporności na nicienie reniform. Protokół obejmuje wizualne badanie korzeni sadzonek bawełny zakażonych nicieniami w celu określenia odpowiedzi na infekcję. Pęd wegetatywny z każdej rośliny jest następnie rozmnażany w celu odzyskania roślin do produkcji nasion.

Metoda ta może pomóc w opracowaniu odmian bawełny odpornych na nicienie reniform. Poprzez identyfikację odpornych genotypów innych gatunków bawełny oraz ocenę populacji hodowlanych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia prostą i nieniszczącą metodę badania przesiewowego nicieni reniform.

Zacznij od umieszczenia kłębka bawełny na dnie jednej stożkowej plastikowej doniczki o średnicy 4 centymetrów i wysokości środkowej 21 na ziarno. I napełnianie doniczek parową pasteryzowaną mieszanką gleby do około dwóch centymetrów od górnej części doniczki. Umieść plastikowy kołek w każdej doniczce oznaczający genotyp do posadzenia i posadź jedno nasiono odpowiedniego genotypu bawełny w każdej doniczce.

Wypełnij każdą doniczkę dodatkową ziemią, aby przykryć nasiona i umieść doniczki w komorze wzrostowej ustawionej na stałą temperaturę 28 stopni Celsjusza z 16-godzinnym okresem fotograficznym świetlówki i żarówki. Następnie umieść emitery wody w każdej doniczce i użyj automatycznego systemu nawadniania, aby podlewać doniczki dwa razy dziennie. Siedem dni po posadzeniu utwórz małe zagłębienie w glebie obok każdej rośliny i dodaj jeden mililitr zawiesiny nicieni reniform do każdego zagłębienia.

Po zaszczepieniu woda w doniczce musi być dokładnie kontrolowana, aby zapobiec wypłukaniu nicieni ze strefy korzeniowej. 28 dni po zaszczepieniu użyj nożyczek, aby usunąć większość w pełni rozwiniętych liści z roślin, a następnie ściśnij każdą doniczkę i wsuń ziemię do jednej ręki, aby usunąć rośliny. Delikatnie wymieszaj system korzeniowy w wodzie z kranu w 10-litrowym pojemniku, aby usunąć ziemię z korzeni, a następnie krótko spłucz w pojemniku z czystą wodą z kranu.

Użyj nożyczek, aby usunąć oczyszczony system korzeniowy z rośliny około jednego centymetra poniżej linii gleby. Umieść korzenie w plastikowym, niesterylnym jednorazowym pojemniku na próbki o pojemności 120 mililitrów. Następnie całkowicie przykryj system korzeniowy około 30 mililitrami czerwonego roztworu barwiącego żywność i umieść pojemnik na próbkę w kuchence mikrofalowej w celu podgrzania roztworu barwiącego, aż zacznie wrzeć.

Gdy próbka ostygnie do temperatury pokojowej, zastąp czerwony roztwór barwnika spożywczego 100 mililitrami wody z kranu, aby usunąć nadmiar plam. Następnie umieść pokrywę na pojemniku na próbkę i przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy infekcji korzeni. Aby odzyskać rośliny do produkcji nasion, umieść kłębek bawełny na dnie nowej stożkowej plastikowej doniczki i częściowo wypełnij doniczkę podłożem doniczkowym z mchu torfowego.

Umieść jeden pęd wegetatywny zebrany w systemie korzeniowym w doniczce i mocno dodaj podłoże doniczkowe, aby wypełnić doniczkę. Umieść nowy, oznaczony plastikowy kołek w każdej doniczce, aby oznaczyć genotyp bawełny i umieść tacę z doniczkami w plastikowym pojemniku z wodą. Krótko podlej rośliny, aby zwilżyć podłoże doniczkowe i umieść doniczki w komorze wzrostowej ustawionej na stałą temperaturę 28 stopni Celsjusza i 16-godzinny okres zdjęciowy.

Po około 30 dniach częściowo napełnij jedną sześciolitrową plastikową doniczkę na roślinę podłożem doniczkowym. Przenieś każdą roślinę do sześciolitrowej doniczki, mocno dodając podłoże doniczkowe do każdej doniczki podczas sadzenia każdej sadzonki. Następnie umieść rośliny w szklanym domku i dodaj wodę, aby zwilżyć podłoże doniczkowe.

Aby ocenić infekcję korzenia R.reniformis, wyjmij próbkę korzenia z pojemnika na próbkę. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby policzyć liczbę samic nicieni przyczepionych do systemu korzeniowego pod 20-krotnym powiększeniem. Na udaną infekcję systemu korzeniowego nicieni może mieć wpływ kilka czynników, w tym żywotność nicienia użytego do inokulacji i zmienność sezonowa, ponieważ nicienie są mniej aktywne w miesiącach zimowych.

Następnie umieść system korzeniowy na ręcznikach papierowych na około 10 minut, aby usunąć nadmiar wilgoci. Zważ system korzeniowy, aby określić masę świeżego korzenia. Różnice we wzroście korzeni są powszechne między wycięciami.

Różnice te, mierzone masą świeżych korzeni, można również zaobserwować między roślinami o tym samym genotypie. Stosunkowo mniej samic nicieni reniform jest w stanie stworzyć miejsce żerowania dla opornego genotypu bawełny w porównaniu z genotypem podatnym. Dane dotyczące masy świeżych korzeni można wykorzystać do obliczenia liczby samic nicieni reniform na gram tkanki korzeniowej dla każdego genotypu.

Liczba żeńskich nicieni reniform na gram korzenia dla odpornych genotypów jest na ogół mniejsza niż 10, podczas gdy podatne genotypy mają zazwyczaj więcej niż 30 nicieni na gram korzenia. W tym miejscu przedstawiono podzbiór danych z segregującej populacji F2, która obejmowała 300 roślin. Te zakresy zmienności wzrostu korzeni i infekcji systemów korzeniowych nicieniami są powszechnie obserwowane w przypadku oceny nicieni, co ilustruje zdolność tej procedury do wykorzystania do badania przesiewowego dużej liczby roślin w jednym eksperymencie, w celu zminimalizowania tej zmienności i ułatwienia dokładnej oceny genetyki odporności.

Po tej procedurze można określić genetykę odporności nicieni reniform w celu zidentyfikowania markerów DNA związanych z opornością. Markery te mogą być następnie wykorzystywane do hodowli wspomaganej markerami oraz do przenoszenia odporności na nicienie na bawełnę wyżynną. Po opracowaniu technika ta zapewniła nieniszczącą metodę umożliwiającą naukowcom odzyskanie roślin po ponownym badaniu przesiewowym na obecność nicieni, aby pomóc w hodowli odpornych odmian bawełny.