Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenomiki, pokazując, jak zaprojektować i wdrożyć narzędzie oparte na sekwencjonowaniu do oceny wpływu czynników środowiskowych na metylację DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zapewnić bardziej kompleksową i ilościową metodę oceny poziomów metylacji DNA w porównaniu z platformami opartymi na tablicach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku identyfikacji zmian metylacji DNA spowodowanych różnymi typami procesów fizjologicznych w każdym organizmie, którego dane dotyczące sekwencji są dostępne.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wpływ stresu na metylację DNA, może być również stosowana do innych czynników środowiskowych lub warunków fizjologicznych, takich jak narażenie na toksyny środowiskowe w diecie wysokotłuszczowej oraz stany takie jak cukrzyca i choroby sercowo-naczyniowe. Po ścięciu DNA i zweryfikowaniu wielkości za pomocą bioanalizatora, dodaj 180 mikrolitrów kulek magnetycznych wiążących DNA do każdej próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść koraliki na płytce magnetycznej i usuń supernatant.

Zawiesić granulat w 200 mikrolitrach 70% etanolu. Następnie użyj płytki magnetycznej, aby granulować kulki i usunąć jak najwięcej etanolu. Suszyć koraliki w bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut.

Następnie ponownie zawieś osad w 44 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i zbierz około 42 mikrolitry supernatantu. Po podwiązaniu adapterów i zweryfikowaniu ligacji za pomocą bioanalizatora, należy przenieść próbki do probówek mikrowirówek o niskim poziomie wiązania DNA. Następnie użyj podgrzanego koncentratora próżniowego, aby zmniejszyć objętość próbki poniżej 3,4 mikrolitra.

Następnie dodaj 5,6 mikrolitra mieszanki blokowej Methyl-Seq do każdej próbki i inkubuj je w termocyklerze. Przygotuj Capture Library Hybridization Mix zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj 20 mikrolitrów mieszanki hybrydyzacyjnej Capture Library do każdej próbki i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 godzin.

Pod koniec okresu inkubacji przygotuj kulki magnetyczne streptawidyny, dodając 50 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę do nowej ośmiodołkowej probówki paskowej. Umyj kulki 200 mikrolitrami buforu wiążącego Methyl-Seq. Umieść probówkę z paskiem na płytce magnetycznej i usuń supernatant z kulek.

Następnie ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu wiążącego Methyl-Seq. Dodaj próbki do umytych kulek streptawidyny i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 30 minut na mieszalniku obrotowym. Podczas mieszania próbek należy podać 200 mikrolitrów buforu płuczącego Methyl-Seq Wash Two do potrójnych studzienek 96-dołkowej płytki i wstępnie ogrzać do 65 stopni Celsjusza.

Po inkubacji próbek należy zagnieździć kulki magnetyczne płytką magnetyczną i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach Methyl-Seq Wash Buffer One. Inkubuj kulki przez 15 minut w temperaturze pokojowej i użyj płytki magnetycznej, aby usunąć supernatant.

Następnie ponownie zawieś granulkę kulki w 200 mikrolitrach wstępnie podgrzanego buforu myjącego dwa. Następnie inkubuj kulki w termocyklerze przed użyciem płytki magnetycznej do granulowania kulek. Dodaj 20 mikrolitrów buforu elucyjnego Methyl-Seq do umytych kulek i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Użyj płytki magnetycznej, aby ogrzać kulki i przenieś supernatant do nowej probówki paskowej. Najpierw dodaj 130 mikrolitrów odczynnika konwersyjnego wodorosiarczynu do wcześniej zebranego supernatantu. Podziel 150-mikrolitrowe reakcje równo na dwie studzienki.

Następnie inkubuj reakcje w termocyklerze. Użyj 600 mikrolitrów buforu wiążącego, aby związać próbki z kolumnami wirującymi i umyj kolumny 100 mikrolitrami buforu do mycia. Następnie odwirować kolumny i wyrzucić przepływ.

Następnie dodać 200 mikrolitrów buforu odsiarczającego do kolumn. Inkubować kolumny przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć kolumny dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu do mycia.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu elucyjnego do kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej i odwirować. Przygotować główną mieszaninę reakcji PCR zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie dodać 82 mikrolitry mieszanki wzorcowej do każdej próbki i inkubować próbki w termocyklerze. Najpierw przygotuj PCR Master Mix Two na lodzie zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie do każdej próbki dodaj 25,5 mikrolitra PCR Master Mix Dwa i pięć mikrolitrów komercyjnych starterów indeksujących i inkubuj próbki w termocyklerze.

Oceń stężenie DNA w próbkach za pomocą odczynników do wykrywania DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze. Biblioteki Methyl-Seq są następnie przesyłane do sekwencjonowania w sekwenatorze nowej generacji. Po konwersji wodorosiarczynu i amplifikacji PCR próbek walidacyjnych należy przygotować mieszankę wzorcową z buforem wiążącym, wodą i kulkami sefarozy pokrytymi streptawidyną.

Następnie dodać 75 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i pięć mikrolitrów zagnieżdżonego produktu PCR do 96-dołkowej płytki i wstrząsać płytką na wytrząsarce przez 15 do 60 minut. Podczas gdy płytka się trzęsie, dodaj 12 mikrolitrów startera do studzienek płytki do pirosekwencjonowania. Po wstrząśnięciu umieść narzędzie próżniowe w korycie wypełnionym wodą, a następnie umieść narzędzie w płytce z reakcjami wiążącymi.

Następnie zanurz narzędzie próżniowe w częściowo wypełnionych korytach zawierających 70% etanol, wodorotlenek sodu i bufor tris-octanu. Odłącz próżnię i umieść narzędzie próżniowe na płytce testowej HS do pirosekwencjonowania, aby przenieść kulki. Umieść płytkę na bloku grzewczym i inkubuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Na koniec pozwól płycie ostygnąć przez pięć minut przed rozpoczęciem programu pirotechnicznego. W tym protokole analiza bibliotek Methyl-Seq dostarczyła uszeregowaną listę zróżnicowanych regionów metylowanych lub DMR między zwierzętami zestresowanymi i niezestresowanymi oraz wykres graficzny DMR. Walidacja za pomocą pirosekwencjonowania wodorosiarczynów wykazała, że wszystkie zestresowane zwierzęta wykazywały wyższe poziomy metylacji we wszystkich CpG niż zwierzęta niezestresowane.

Poziomy metylacji na poziomie CpG 10 porównano również ze średnimi trzytygodniowymi poziomami CORT dla każdego zwierzęcia. Wyniki wskazują, że istnieje niewielka korelacja między danymi endokrynologicznymi a danymi dotyczącymi metylacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o porównaniu wzrostu średniego rozmiaru DNA między etapami ścinania DNA i ligacji adaptera oraz o zapewnieniu wystarczającej ilości biblioteki przed sekwencjonowaniem.

Zgodnie z tą procedurą można wdrożyć inne podobne podejścia w celu uzyskania odpowiedzi na nowe pytania, takie jak wpływ toksyn środowiskowych na rozwój neurologiczny szczurów. Po opracowaniu technika ta zapewniła naukowcom zajmującym się epigenetyką środki do badania zmian metylacji DNA w całym genomie we wszystkich organizmach niemodelowych lub modelowych, w których dostępne są sekwencje genomowe. Nie zapominaj, że praca z enzymami wrażliwymi na temperaturę wymaga przechowywania na lodzie podczas użytkowania i przechowywania w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni.

Kulki RNA używane do wychwytywania celów wymagają rozmrożenia i przechowywania na lodzie podczas użytkowania oraz długotrwałego przechowywania w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni.