Name: Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj platformę Methyl-Seq do analizy metylacji DNA u szczurów w kontekście stresu. Ta metoda pozwala identyfikować zmiany epigenetyczne związane z przewlekłym stresem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez NIH grant MH101392 (RSL) oraz wsparcie z następujących nagród i fundacji: NARSAD Young Investigator Award, Margaret Ann Price Investigator Fund, James Wah Mood Disorders Scholar Fund poprzez Charles T. Bauer Foundation, Baker Foundation i Project Match Foundation (RSL).

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+DNA+methylation+maps+of+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells.</a> Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).</li>
<li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+DNA+methylation+array+with+single+CpG+site+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">High density DNA methylation array with single CpG site resolution.</a> Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).</li>
<li>Naumov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+DNA+methylation+in+colorectal+cancer+using+Infinium+HumanMethylation450+BeadChips%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips.</a> Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).</li>
<li>Wockner, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+analysis+of+human+brain+tissue+from+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients.</a> Translational Psychiatry. 4, e339(2014).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+representation+bisulfite+sequencing+for+comparative+high-resolution+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).</li>
<li>Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bisulfite+sequencing+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes.</a> Methods. 48 (3), 226-232 (2009).</li>
<li>Slieker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+systematic+annotation+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+using+the+Illumina+450k+array%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26(2013).</li>
<li>Hing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+targeted+capture+Methyl-Seq+platform+for+the+mouse+genome+identifies+novel+tissue-specific+DNA+methylation+patterns+of+genes+involved+in+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment.</a> Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).</li>
<li>Seifuddin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Methyl-Seq+analysis+of+blood-brain+targets+of+glucocorticoid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure.</a> Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).</li>
<li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+colon+cancer+methylome+shows+similar+hypo-+and+hypermethylation+at+conserved+tissue-specific+CpG+island+shores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores.</a> Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+CHARM+DNA+methylation+platform+for+the+rat+genome+reveals+novel+brain+region-specific+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences.</a> Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).</li>
<li>Jankord, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+vulnerability+during+adolescent+development+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stress vulnerability during adolescent development in rats.</a> Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).</li>
<li>Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+open%3Aclosed+arm+entries+in+an+elevated+plus-maze+as+a+measure+of+anxiety+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSmooth%3A+from+whole+genome+bisulfite+sequencing+reads+to+differentially+methylated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions.</a> Genome Biology. 13 (10), R83(2012).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+corticosterone+exposure+increases+expression+and+decreases+deoxyribonucleic+acid+methylation+of+Fkbp5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice.</a> Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+measure+of+glucocorticoid+load+provided+by+DNA+methylation+of+Fkbp5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice.</a> Psychopharmacology. , (2011).</li>
<li>Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+obesity%3A+the+role+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes%2C+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).</li>
<li>Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%2C+coronary+heart+disease%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Platelets, coronary heart disease, and stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).</li>
<li>McKlveen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Stress+Increases+Prefrontal+Inhibition%3A+A+Mechanism+for+Stress-Induced+Prefrontal+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction.</a> Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).</li>
<li>Akalin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((methylKit%3A+a+comprehensive+R+package+for+the+analysis+of+genome-wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles.</a> Genome Biology. 13 (10), R87(2012).</li>
<li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol-dose-dependent+DNA+methylation+and+expression+in+the+nucleus+accumbens+identifies+coordinated+regulation+of+synaptic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes.</a> Translational Psychiatry. 7 (1), e994(2017).</li>
<li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low%2Fbinge+from+heavy+alcohol+drinking%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li>
</ol>

Rękopis jest częścią nagrody konkursowej przyznanej przez Agilent Technologies.

W tym badaniu zaprojektowaliśmy i wdrożyliśmy platformę Methyl-Seq dla genomu szczura. Demonstrując jego użyteczność za pomocą szczurzego modelu stresu, wykazaliśmy, że eksperymentalny i analityczny potok może zapewnić zróżnicowane metylowane regiony między dwiema grupami porównawczymi.
Aby zapewnić pomyślne wdrożenie platformy, należy przestrzegać kilku krytycznych kroków. Po pierwsze, początkowa jakość i ilość DNA ma znaczący wpływ na jakość i ilość końcowej biblioteki Methyl-Seq. Użyliśmy fluorometru, a nie spektrofotometru, aby upewnić się, że nasz pomiar DNA odzwierciedla ilość obecnego dwuniciowego DNA. Bioanalizator został użyty do pomiaru wielkości cząsteczkowej i ilości DNA po ścinaniu i po podwiązaniu adaptera. Weryfikacja "przesunięcia" wielkości cząsteczki między tymi etapami ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia obecności adapterów na końcach każdego fragmentu DNA, który zostanie poddany PCR za pośrednictwem adaptera w kolejnych etapach. Ilość DNA pozostała na końcu etapu ligacji adaptera jest również ważna, ponieważ na tym etapie potrzebne jest co najmniej 100 ng produktu bibliotecznego, aby zapewnić wystarczającą ilość po docelowych etapach wzbogacania i konwersji wodorosiarczynu. Końcowy pomiar wysokiej czułości został przeprowadzony na skonstruowanej bibliotece Methyl-Seq, tak aby biblioteka mogła być odpowiednio rozcieńczona w celu późniejszego grupowania na sekwencerze nowej generacji. Wreszcie, pirosekwencjonowanie wodorosiarczynu zastosowano jako wysoce ilościową, niezależną metodę oceny dokładności rurociągu analitycznego. Ostateczna walidacja z wykorzystaniem oryginalnych próbek i replikacja przy użyciu dodatkowych zwierząt są kluczowymi krokami zapewniającymi, że eksperyment może wykryć biologicznie istotne zmiany w metylacji DNA.
Zamieszczamy również kilka wskazówek w przypadku odstępstwa od protokołu lub napotkania problemów. Po pierwsze, możliwa jest utrata zbyt dużej ilości DNA podczas naprawy końcówki, podwiązania adaptera lub etapów oczyszczania kulek magnetycznych. Alternatywnie, początkowe ilości DNA mogą być małe (<200 ng) ze względu na ograniczoną dostępność tkanki/DNA lub zastosowanie różnych metod wzbogacania, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Zwiększenie liczby cyklu podczas dwóch etapów amplifikacji biblioteki może być w stanie zrekompensować nadmierną utratę DNA lub niską początkową ilość DNA w całym protokole budowy biblioteki. Zaleca się jednak nie więcej niż dodatkowe 2–3 cykle, ponieważ nadmierne wzmocnienie szablonu może prowadzić do wzrostu liczby sekwencjonowanych zduplikowanych odczytów. Te duplikaty są wykluczane na etapie wyrównywania, aby zapobiec odchyleniu w obliczeniach procentowej metylacji. Po drugie, jeśli średni rozmiar DNA nie zwiększa się o więcej niż 30 punktów bazowych, sprawdź, czy odczynniki są nowe, ponieważ polimeraza DNA T4, ligaza Klenowa i/lub ligaza T4 mogą być stare. Można stosować dostępne w handlu odczynniki zamienne.
Ponadto możliwe jest, że przewidywane DMR mogą nie zostać zweryfikowane przez pirosekwencjonowanie, w którym różnice w metylacji DNA nie występują lub są znacznie mniejsze niż te przewidywane przez analizę. Słaba walidacja regionów kandydujących jest problemem zbyt powszechnym w wielu analizach całego genomu, na przykład gdy wyniki pirosekwencjonowania nie potwierdzają zróżnicowanej metylacji lub wielkość efektu jest znacznie mniejsza niż przewidywana w analizie. BSmooth to jeden pakiet analityczny, który "wygładza" poziomy metylacji w oknie wielu CpG. W obecnym eksperymencie BSmooth zasugerował DMR, którego poziomy metylacji zostały potwierdzone przez pirosekwencjonowanie wodorosiarczynów. Jednak prawdopodobnie wystąpią rozbieżności między poziomami metylacji przewidywanymi przez BSmooth a tymi zweryfikowanymi przez pirosekwencjonowanie. Rozbieżności wynikają z funkcji wygładzania, która szacuje średnie wartości metylacji dla wszystkich CpG w DMR, w tym kolejnych CpG, które mogą różnić się metylacją DNA o więcej niż 50% lub CpG, których wartości metylacji zostały wykluczone ze względu na podprogową głębokość odczytu. Pakiety R, takie jak MethylKit24 , mogą być używane do identyfikacji mniejszych okien CpG, a nawet pojedynczych CpG, których poziomy metylacji silnie korelują z tymi zwalidowanymi przez pirosekwencjonowanie. Implementacja różnych pakietów i testowanie ich przewidywanych regionów lub CpG metylacji różnicowej za pomocą pirosekwencjonowania zapewni solidność danych. Alternatywnie, oryginalne biblioteki Methyl-Seq można ponownie sekwencjonować i dodawać do odczytywanych plików w celu zwiększenia głębokości odczytu. Ponieważ oznaczanie poziomów metylacji jest półilościowe i podyktowane liczbą odczytów [(# CpGs)/(# TpGs+CpGs)], zwiększenie głębokości odczytu dla danego CpG zwiększy dokładność jego procentowej wartości metylacji. W tym badaniu wzięliśmy pod uwagę tylko CpG, których wartości metylacji zostały określone przez co najmniej dziesięć odczytów i osiągnęliśmy ogólne pokrycie odczytu 19x dla każdego CpG.
Platforma Methyl-Seq dla szczurów nie jest pozbawiona ograniczeń. Chociaż jest bardziej opłacalna niż sekwencjonowanie wodorosiarczynu całego genomu, jest znacznie droższa niż inne metody. Niemniej jednak większość kosztów pochodziła z zakupu pasów ruchu w sekwencerze, a nie z systemu przechwytywania. W zależności od wymaganej głębokości odczytu, przy czym porównania między tkankami wymagają mniej ze względu na duże (25–70%) różnice12 w metylacji DNA, koszt można zmniejszyć poprzez multipleksowanie większej liczby próbek na linię i zastosowanie platformy o większej pojemności. Ponadto przygotowanie próbki jest bardziej czasochłonne niż inne metody. Chociaż podobnie jak w przypadku innych podejść pulldown, które obejmują sekwencjonowanie nowej generacji, dodatkowe etapy konwersji i oczyszczania wodorosiarczynu zwiększają obciążenie pracą. Ogólnie rzecz biorąc, platforma Methyl-Seq jest opłacalną alternatywą dla sekwencjonowania całego genomu i zapewnia rozdzielczość par zasad na poziomie ponad 2,3 miliona CpG, czyli znacznie więcej niż w przypadku platform opartych na mikromacierzach. Do tej pory dostępne na rynku platformy Methyl-Seq dla ludzi i myszy były wykorzystywane do dokumentowania zależnych od alkoholu zmian w mózgu makaków25,26, genów neurorozwojowych w mózgu myszy9 oraz celów glikokortykosteroidów krew-mózg10. Co więcej, możliwość celowania w określone regiony niezależnie od rozpoznawania sekwencji przez enzymy restrykcyjne sprawia, że jest to idealna platforma do porównań międzygatunkowych. Na potrzeby tego badania zaprojektowaliśmy platformę Methyl-Seq dla szczurów, dla której przeprowadza się wiele eksperymentów farmakologicznych, metabolicznych i behawioralnych bez korzystania z narzędzia metylomicznego obejmującego cały genom. Nasze dane pokazują, że można go wykorzystać do wykrywania DMR w szczurzym modelu stresu i skorelowania innych parametrów fizjologicznych, takich jak ogólny poziom CORT w osoczu.
Platforma Methyl-Seq jest idealna do eksperymentów epigenetycznych na zwierzętach ze zsekwencjonowanymi genomami, które mogą nie mieć wystarczających dowodów eksperymentalnych dokumentujących regiony regulatorowe. Gdy takie regiony zostaną udostępnione, dodatkowe regiony mogą zostać zaprojektowane i dołączone do bieżącej wersji. Co więcej, platforma idealnie nadaje się do genomiki porównawczej, ponieważ wzbogacenie docelowe nie jest ograniczone przez rozpoznawanie enzymów restrykcyjnych. Na przykład region promotorowy dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania może zostać uchwycony niezależnie od tego, czy zawiera określone miejsce ograniczenia. Podobnie można uchwycić wszelkie regiony regulatorowe, takie jak te zidentyfikowane u myszy lub ludzi, które są konserwatywne w genomie będącym przedmiotem zainteresowania.

Postępy w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym doprowadziły do bogactwa sekwencji genomowych zarówno dla organizmów modelowych, jak i niemodelowych. Dostępność takich sekwencji ułatwiła badania w dziedzinie genetyki, genomiki porównawczej i transkryptomiki. Na przykład, dostępne sekwencje genomowe są bardzo przydatne do ujednolicania danych sekwencjonowania z eksperymentów ChIP-Seq, które wzbogacają DNA na podstawie jego związku z modyfikacjami histonów1, lub sekwencjonowanie wodorosiarczynowe, które mierzy metylację DNA poprzez wykrywanie uracylu powstałego w wyniku konwersji wodorosiarczynu niemetylowanych cytozyn2. Wystąpiły jednak opóźnienia we wdrażaniu platform epigenomicznych, które uwzględniają w swoim projekcie dostępne dane z sekwencjonowania genomu, ze względu na brak danych z adnotacjami dotyczącymi sekwencji regulatorowych specyficznych dla gatunku, które mogą wpływać na funkcję genów. 
W szczególności, metylacja DNA jest jedną z najczęściej badanych modyfikacji epigenetycznych DNA, która może wykorzystać dostępne dane genomiczne do budowy platformy metylomicznej. Jednym z takich przykładów jest platforma oparta na tablicy dla ludzkiego methylome3, która jest szeroko stosowana w różnych dyscyplinach, od onkologii po psychiatrię4,5. Niestety, podobne platformy dla modeli zwierzęcych innych niż ludzie są rzadkie, ponieważ praktycznie nie ma powszechnie stosowanych platform, które wykorzystywałyby sekwencję genomową w swoim pierwotnym projekcie.
Powszechną metodą oceny krajobrazu metylomicznego modeli zwierzęcych innych niż ludzkie jest sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji (RRBS)6. Takie podejście pozwala przezwyciężyć koszty sekwencjonowania wodorosiarczynów całego genomu, które, zapewniając kompleksowy krajobraz metylomiki, zapewnia mniejsze pokrycie głębokości odczytu ze względu na koszty i ograniczoną ilość informacji funkcjonalnych w dużych obszarach genomu klasy ubogiej w geny<sup='xref'>2. RRBS obejmuje restrykcyjne, trawienie i selekcję wielkości genomowego DNA w celu wzbogacenia o wysoce bogate w GC sekwencje, takie jak wyspy CpG, które są powszechnie znajdowane w pobliżu promotorów genów i uważa się, że odgrywają rolę w regulacji genów7. Chociaż metoda RRBS została wykorzystana w wielu ważnych badaniach, jej zależność od enzymów restrykcyjnych nie jest pozbawiona znaczących wyzwań i ograniczeń. Na przykład wzbogacenie sekwencji bogatych w GC w RRBS jest całkowicie zależne od obecności określonych sekwencji rozpoznawanych przez enzym restrykcyjny, a następnie selekcji wielkości za pomocą elektroforezy. Oznacza to, że wszystkie obszary genomu, które nie zawierają tych miejsc ograniczenia, są wykluczane podczas wyboru rozmiaru. Ponadto porównania międzygatunkowe są trudne, chyba że te same miejsca ograniczeń występują w tych samych loci wśród różnych gatunków. 
Jednym z podejść do pokonania ograniczeń RRBS jest użycie metody wzbogacania, która wykorzystuje opublikowaną sekwencję genomową w projekcie platformy. Oparta na macierzy platforma ludzka wykorzystuje sondy starterowe zaprojektowane przeciwko określonym CpG do specyficznego dla alleli (CG vs. TG po konwersji wodorosiarczynu), docelowego wyżarzania i wydłużania startera. Jego konstrukcja odzwierciedla nie tylko dostępną sekwencję ludzkiego genomu, ale także eksperymentalnie zweryfikowane regiony regulatorowe uzyskane z wielu linii badawczych, takich jak ENCODE i ENSEMBL8. Pomimo szerokiego zastosowania w badaniach metylomicznych u ludzi, podobna platforma nie istnieje dla zwierząt modelowych. Ponadto format oparty na tablicy nakłada znaczne ograniczenia na powierzchnię dostępną do umieszczenia sondy. W ciągu ostatnich kilku lat podjęto wysiłki w celu połączenia specyficzności docelowej zapewnianej przez konstrukcję sondy wychwytującej z funkcją wysokiej przepustowości sekwencjonowania nowej generacji. Takie przedsięwzięcie zaowocowało opracowaniem opartego na sekwencjonowaniu systemu wzbogacania celu dla genomu myszy (mysi Methyl-Seq), który został wykorzystany do identyfikacji specyficznych dla mózgu lub wywołanych glikokortykosteroidami różnic w metylacji9,10. Podobne platformy dla innych zwierząt modelowych i niemodelowych są potrzebne, aby ułatwić badania epigenomiczne na tych zwierzętach.
Tutaj demonstrujemy implementację tej nowatorskiej platformy do przeprowadzania analizy metylomicznej na szczurze. Szczur służył jako ważny model zwierzęcy w farmakologii, metabolizmie, neuroendokrynologii i zachowaniu. Na przykład istnieje rosnąca potrzeba zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw toksyczności leków, otyłości, reakcji na stres lub uzależnienia od narkotyków. Wysokoprzepustowa platforma zdolna do wychwytywania zmian metylomomicznych związanych z tymi schorzeniami pogłębiłaby naszą wiedzę na temat tych mechanizmów. Ponieważ genom szczura nadal nie ma adnotacji dla regionów regulacyjnych, włączyliśmy nieredundantne promotory, wyspy CpG, wyspy wysp11 i wcześniej zidentyfikowaliśmy sekwencje bogate w GC do szczurzej platformy Methyl-Seq 12. 
Aby ocenić pomyślne zaprojektowanie i wdrożenie platformy SureSelect Target Enrichment (ogólnie określanej jako Methyl-Seq) dla genomu szczura, użyliśmy szczurzego modelu przewlekłego zmiennego stresu (CVS)13 do identyfikacji różnie metylowanych regionów między zwierzętami niezestresowanymi i zestresowanymi. Nasz projekt, protokół i implementacja platformy mogą być przydatne dla badaczy, którzy mogą chcieć przeprowadzić kompleksowe i bezstronne badanie epigenetyczne na organizmie, którego sekwencja genomowa jest już dostępna, ale pozostaje słabo opisana.

<table><tbody><tr><td>Test radioimmunologiczny (RIA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>7120126</td><td>Kortykosteron, 125I oznaczony</td></tr> Master <tr><td>Pure DNA Purification Kit</td><td>Epicentre/Illumina</td><td>MC85200</td><td></td></tr><tr><td>Thermal-LOK 2-pozycyjna sucha kąpiel termiczna</td><td>USA Scientific</td><td>2510-1102</td><td>Używany z probówkami 1,5 ml</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td>Vortex Mixer</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>100% etanol, wirówka klasy molekularnej</td></tr><tr><td>5424 R</td><td>Eppendorf-Musi</td><td></td> <td>być zdolna do 20 000 x g</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32866</td> Zestaw do oznaczania <td>fluorometru</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Odczynniki do wykrywania DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników SureSelectXT Rat Methyl-Seq</td><td>Odczynniki Agilent Technologies</td><td>G9651A</td><td>do przygotowania biblioteki Methyl-Seq</td></tr><tr><td>Biblioteka SureSelect Rat Methyl-Seq</td><td></td><td></td><td>Przynęty 931143 RNA do wzbogacania celów szczurzych</td></tr><tr><td>IDTE, pH 8.0</td><td>IDT DNA</td><td>11-05-01-09</td><td>10 mM TE, 0,1 mM EDTA</td></tr><tr><td>DNA LoBind Probówka 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Covaris E-series lub S-series</td><td>Covaris-Isothermal</td><td></td> <td>sonikator</td></tr><tr><td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>Woda, Ultra Pure (klasa biologii molekularnej)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-029-721</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 Well-Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Kulki magnetyczne wiążące DNA</td></tr><tr><td>96S Super Magnet</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td>Płytka magnetyczna do etapów oczyszczania</td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td>Bioanalizator oparty na elektroforezie</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape Agilent Technologies o wysokiej czułości</td><td></td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Odczynniki</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Wysoka czułość</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>DNA110 SpeedVac</td><td>ThermoFisher</td> <td>Scientific-Vacuum</td><td> Koncentrator</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Koraliki magnetyczne</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>Streptawidin</td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne Labquake Tube Rotator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>415110Q</td><td>Nutator jest również dopuszczalny</td></tr><tr><td>Zestaw do metylacji DNA EZ DNA</td> Zestaw do konwersji wodorosiarczynu <td>Zymo Research</td><td>D5006</td><td>. Zawiera wiążące, przemywające, odsulfonujące i elucyjne</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2500</td><td>Illumina-Maszyna</td><td></td> do <td>sekwencjonowania nowej generacji</td></tr><tr><td>Startery PCR i pirosekwencjonowania</td><td>IDT DNA</td><td>Zmienna</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq z buforem ThermoPol - 2,000 jednostek</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw roztworów deoksynukleotydu (dNTP)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark MD96</td><td>QIAGEN-Pirosekwencjonowanie</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alkohol etylowy 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>70% roztwór etanolu</td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>0,2 M roztwór buforowy denaturacji NaOH</td></tr><tr><td>Tris (baza) od J.T. Baker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-508</td><td>10 mM Tris Acetate Buffer roztwór buforowy do płukania</td></tr><tr><td>Odczynniki PyroMark Gold Q96 (50x96)</td><td>QIAGEN</td><td>972807</td><td>Odczynniki wymagane do pirosekwencjonowania</td></tr><tr><td>PyroMark Bufor do wyżarzania</td><td>QIAGEN</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Bufor wiążący (200 ml)</td><td>QIAGEN</td><td>979006</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Sepharose o wysokiej wydajności</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-01</td><td>Koraliki</td></tr> <tr><td>sefarozy pokryte streptawidynąPyroMark Q96 HS Plate</td><td>QIAGEN</td><td>979101</td><td>Płytka do pirosekwencjonowania</td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-205</td><td>Mieszarka płytkowa. Blok 96-dołkowy sprzedawany oddzielnie (kat. Nr 05-400-207)</td></tr><tr><td>Strona internetowa SureDesign</td><td>Agilent</td> <td>Technologies-Oprogramowanie</td> do <td>projektowania przechwytywania celów (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)</td></tr><tr><td>UCSC Przeglądarka genomu</td><td>Uniwersytet Kalifornijski Santa</td> <td>Cruz-rat</td> <td>listopad 2004 rn4 montaż</td></tr><tr><td>Agilent Methyl-Seq Protocol</td><td>Agilent</td> <td>Technologies-https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td><td></td></tr></tbody></table>

szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

W miarę jak genomy coraz szerszego rodzaju zwierząt stają się dostępne, rośnie zapotrzebowanie na narzędzia, które mogą uchwycić dynamiczne zmiany epigenetyczne w tych modelach zwierzęcych. Szczur jest szczególnym zwierzęciem modelowym, w przypadku którego narzędzie epigenetyczne może uzupełnić wiele badań farmakologicznych i behawioralnych, aby dostarczyć wnikliwych informacji mechanistycznych. W tym celu dostosowaliśmy system SureSelect Target Capture System (określany jako Methyl-Seq) dla szczura, który może oceniać poziomy metylacji DNA w całym genomie szczura. Projekt na szczurach był ukierunkowany na promotory, wyspy CpG, wybrzeża wysp i regiony bogate w GC ze wszystkich genów RefSeq. 
Aby wdrożyć platformę w eksperymencie na szczurach, samce szczurów Sprague Dawley były narażone na przewlekły zmienny stres przez 3 tygodnie, po czym pobrano próbki krwi do ekstrakcji genomowego DNA. Biblioteki Methyl-Seq zostały zbudowane z próbek DNA szczurów poprzez ścinanie, ligację adaptera, wzbogacanie celu, konwersję wodorosiarczynu i multipleksowanie. Biblioteki zsekwencjonowano na platformie sekwencjonowania nowej generacji, a sekwencjonowane odczyty przeanalizowano w celu zidentyfikowania DMR między DNA zestresowanych i niezestresowanych szczurów. Najlepsze kandydatury DMR zostały niezależnie zweryfikowane metodą pirosekwencjonowania wodorosiarczynowego, aby potwierdzić solidność platformy.
Wyniki pokazują, że szczurza platforma Methyl-Seq jest użytecznym narzędziem epigenetycznym, które może uchwycić zmiany metylacji wywołane ekspozycją na stres.

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenomiki, pokazując, jak zaprojektować i wdrożyć narzędzie oparte na sekwencjonowaniu do oceny wpływu czynników środowiskowych na metylację DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zapewnić bardziej kompleksową i ilościową metodę oceny poziomów metylacji DNA w porównaniu z platformami opartymi na tablicach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku identyfikacji zmian metylacji DNA spowodowanych różnymi typami procesów fizjologicznych w każdym organizmie, którego dane dotyczące sekwencji są dostępne.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wpływ stresu na metylację DNA, może być również stosowana do innych czynników środowiskowych lub warunków fizjologicznych, takich jak narażenie na toksyny środowiskowe w diecie wysokotłuszczowej oraz stany takie jak cukrzyca i choroby sercowo-naczyniowe. Po ścięciu DNA i zweryfikowaniu wielkości za pomocą bioanalizatora, dodaj 180 mikrolitrów kulek magnetycznych wiążących DNA do każdej próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść koraliki na płytce magnetycznej i usuń supernatant.Zawiesić granulat w 200 mikrolitrach 70% etanolu. Następnie użyj płytki magnetycznej, aby granulować kulki i usunąć jak najwięcej etanolu. Suszyć koraliki w bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut.Następnie ponownie zawieś osad w 44 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i zbierz około 42 mikrolitry supernatantu. Po podwiązaniu adapterów i zweryfikowaniu ligacji za pomocą bioanalizatora, należy przenieść próbki do probówek mikrowirówek o niskim poziomie wiązania DNA. Następnie użyj podgrzanego koncentratora próżniowego, aby zmniejszyć objętość próbki poniżej 3,4 mikrolitra.Następnie dodaj 5,6 mikrolitra mieszanki blokowej Methyl-Seq do każdej próbki i inkubuj je w termocyklerze. Przygotuj Capture Library Hybridization Mix zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj 20 mikrolitrów mieszanki hybrydyzacyjnej Capture Library do każdej próbki i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 godzin.Pod koniec okresu inkubacji przygotuj kulki magnetyczne streptawidyny, dodając 50 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę do nowej ośmiodołkowej probówki paskowej. Umyj kulki 200 mikrolitrami buforu wiążącego Methyl-Seq. Umieść probówkę z paskiem na płytce magnetycznej i usuń supernatant z kulek.Następnie ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu wiążącego Methyl-Seq. Dodaj próbki do umytych kulek streptawidyny i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 30 minut na mieszalniku obrotowym. Podczas mieszania próbek należy podać 200 mikrolitrów buforu płuczącego Methyl-Seq Wash Two do potrójnych studzienek 96-dołkowej płytki i wstępnie ogrzać do 65 stopni Celsjusza.Po inkubacji próbek należy zagnieździć kulki magnetyczne płytką magnetyczną i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach Methyl-Seq Wash Buffer One. Inkubuj kulki przez 15 minut w temperaturze pokojowej i użyj płytki magnetycznej, aby usunąć supernatant.Następnie ponownie zawieś granulkę kulki w 200 mikrolitrach wstępnie podgrzanego buforu myjącego dwa. Następnie inkubuj kulki w termocyklerze przed użyciem płytki magnetycznej do granulowania kulek. Dodaj 20 mikrolitrów buforu elucyjnego Methyl-Seq do umytych kulek i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Użyj płytki magnetycznej, aby ogrzać kulki i przenieś supernatant do nowej probówki paskowej. Najpierw dodaj 130 mikrolitrów odczynnika konwersyjnego wodorosiarczynu do wcześniej zebranego supernatantu. Podziel 150-mikrolitrowe reakcje równo na dwie studzienki.Następnie inkubuj reakcje w termocyklerze. Użyj 600 mikrolitrów buforu wiążącego, aby związać próbki z kolumnami wirującymi i umyj kolumny 100 mikrolitrami buforu do mycia. Następnie odwirować kolumny i wyrzucić przepływ.Następnie dodać 200 mikrolitrów buforu odsiarczającego do kolumn. Inkubować kolumny przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć kolumny dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu do mycia.Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu elucyjnego do kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej i odwirować. Przygotować główną mieszaninę reakcji PCR zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie dodać 82 mikrolitry mieszanki wzorcowej do każdej próbki i inkubować próbki w termocyklerze. Najpierw przygotuj PCR Master Mix Two na lodzie zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie do każdej próbki dodaj 25,5 mikrolitra PCR Master Mix Dwa i pięć mikrolitrów komercyjnych starterów indeksujących i inkubuj próbki w termocyklerze.Oceń stężenie DNA w próbkach za pomocą odczynników do wykrywania DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze. Biblioteki Methyl-Seq są następnie przesyłane do sekwencjonowania w sekwenatorze nowej generacji. Po konwersji wodorosiarczynu i amplifikacji PCR próbek walidacyjnych należy przygotować mieszankę wzorcową z buforem wiążącym, wodą i kulkami sefarozy pokrytymi streptawidyną.Następnie dodać 75 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i pięć mikrolitrów zagnieżdżonego produktu PCR do 96-dołkowej płytki i wstrząsać płytką na wytrząsarce przez 15 do 60 minut. Podczas gdy płytka się trzęsie, dodaj 12 mikrolitrów startera do studzienek płytki do pirosekwencjonowania. Po wstrząśnięciu umieść narzędzie próżniowe w korycie wypełnionym wodą, a następnie umieść narzędzie w płytce z reakcjami wiążącymi.Następnie zanurz narzędzie próżniowe w częściowo wypełnionych korytach zawierających 70% etanol, wodorotlenek sodu i bufor tris-octanu. Odłącz próżnię i umieść narzędzie próżniowe na płytce testowej HS do pirosekwencjonowania, aby przenieść kulki. Umieść płytkę na bloku grzewczym i inkubuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Na koniec pozwól płycie ostygnąć przez pięć minut przed rozpoczęciem programu pirotechnicznego. W tym protokole analiza bibliotek Methyl-Seq dostarczyła uszeregowaną listę zróżnicowanych regionów metylowanych lub DMR między zwierzętami zestresowanymi i niezestresowanymi oraz wykres graficzny DMR. Walidacja za pomocą pirosekwencjonowania wodorosiarczynów wykazała, że wszystkie zestresowane zwierzęta wykazywały wyższe poziomy metylacji we wszystkich CpG niż zwierzęta niezestresowane.Poziomy metylacji na poziomie CpG 10 porównano również ze średnimi trzytygodniowymi poziomami CORT dla każdego zwierzęcia. Wyniki wskazują, że istnieje niewielka korelacja między danymi endokrynologicznymi a danymi dotyczącymi metylacji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o porównaniu wzrostu średniego rozmiaru DNA między etapami ścinania DNA i ligacji adaptera oraz o zapewnieniu wystarczającej ilości biblioteki przed sekwencjonowaniem.Zgodnie z tą procedurą można wdrożyć inne podobne podejścia w celu uzyskania odpowiedzi na nowe pytania, takie jak wpływ toksyn środowiskowych na rozwój neurologiczny szczurów. Po opracowaniu technika ta zapewniła naukowcom zajmującym się epigenetyką środki do badania zmian metylacji DNA w całym genomie we wszystkich organizmach niemodelowych lub modelowych, w których dostępne są sekwencje genomowe. Nie zapominaj, że praca z enzymami wrażliwymi na temperaturę wymaga przechowywania na lodzie podczas użytkowania i przechowywania w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni.Kulki RNA używane do wychwytywania celów wymagają rozmrożenia i przechowywania na lodzie podczas użytkowania oraz długotrwałego przechowywania w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni.

a-rat-methyl-seq-platform-to-identify-epigenetic-changes-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy szczurzy model zespołu stresu pourazowego (PTSD), który wykazuje trwałe zmiany w funkcji neuroendokrynnej oraz opóźnioną, długotrwałą i nasiloną reakcję lękową, charakterystyczną dla pacjentów z PTSD. Opisany tutaj model zwierzęcy oraz metody są przydatne do korelacji biomarkerów w jądrach mózgu, które mają charakter mechanistyczny, ale nie mogą być mierzone u pacjentów, z biomarkerami w obwodowych leukocytach, które podlegają pomiarowi.

Biomarkery w modelu zwierzęcym służące do ujawnienia korelatów neuronalnych, hematologicznych i behawioralnych PTSD

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

Przedstawiono szczegółowe protokoły wprowadzania zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 (CiDER) do komórek ssaków w celu indukowania chemicznie indukowanego DNA hydroksymetylacji i epigenetycznej przebudowy.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Niniejsze badanie opisuje proces zarządzania danymi metylacji DNA uzyskanymi za pomocą technologii mikromacierzy. Protokół przedstawia kroki od przygotowania próbki do analizy danych. Wszystkie procedury są szczegółowo opisane, a film pokazuje istotne kroki.

Przygotowanie próbki do bioinformatycznej analizy metylacji DNA: strategia asocjacyjna dla otyłości i powiązane badania cech

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Ten artykuł omawia procedury wywoływania reakcji stresowych za pomocą fizycznego stresu powściągliwości u myszy i szczurów. Omówiono dodatkowe kwestie, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze i stosowaniu naprężenia utwierdzenia w modelach gryzoni.

Powściągliwość w wywoływaniu stresu u myszy i szczurów

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj platformę Methyl-Seq do analizy metylacji DNA u szczurów w kontekście stresu. Ta metoda pozwala identyfikować zmiany epigenetyczne związane z przewlekłym stresem.

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Przeglądaj więcej filmów