Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest badanie DNA. Metylacja i ekspresja genów zmieniają się pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Osiąga się to poprzez poddanie nowonarodzonych szczeniąt myszy separacji matki w celu wywołania stresu we wczesnym okresie życia jako drugiego kroku obszary zainteresowania mózgu, tutaj PVN uzyskuje się przez mikrosekcję in loco, a DNA i RNA są izolowane jednocześnie z pojedynczego stempla tkankowego.

Następnie uzyskane DNA poddaje się działaniu siarczynów, a obszar zainteresowania amplifikuje się za pomocą bisiarczynu PCR. Jest on następnie ligowany w wektor i przekształcany w bakterie. Udane transformacje są identyfikowane na podstawie ekspresji markera i wielkości fragmentu PCR.

I wreszcie, sekwencjonowanie bisiarczku służy do oceny stanu metylacji. Główną zaletą tego przepływu pracy jest to, że umożliwia wygodną analizę programowania epigenetycznego w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Metoda ta może zapewnić wgląd w programowanie epigenetyczne na podstawie przeciwności losu we wczesnym okresie życia.

Może być również stosowany w innych systemach. Wszędzie tam, gdzie metylacja i ekspresja genów są analizowane w środowisku wysoce specyficznym dla tkanek i wszędzie tam, gdzie dostępność tkanek jest ograniczona w celu wywołania stresu we wczesnym okresie życia. Separację matek przeprowadza się u młodych z ciężarnych w czasie C 57 czarnych matek sześciu N, aby wpłynąć na separację matki.

Przenieś każdy miot do ogrzewanej, czystej klatki na trzy godziny dziennie od pierwszego do 10 dnia po urodzeniu, pozostawiając niezakłócone młode kontrolne. Z wyjątkiem trzygodzinnej separacji, wszystkie mioty są pozostawiane z matkami do momentu odsadzenia w 21 dniu po porodzie. Następnie młode są trzymane w grupach dopasowanych płciowo, od trzech do pięciu myszy w klatce w standardowych warunkach trzymania, aby zainicjować pobieranie tkanki mózgowej, mózgi myszy są usuwane z czaszek i natychmiast zamrażane w suchym lodzie isop i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Gdy będziesz gotowy do zebrania stempli, wyjmij mózgi z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni i połóż je na suchym lodzie. Zacznij od kriosekcji mózgów na 10-mikronowe odcinki koronalne od rostralu do rozpieszcza. Zamontuj sekcje na szkiełkach super frosts i wysusz je, aby uzyskać fioletowe zabarwienie.

Dodatkowe preparaty mogą być pobierane i przechowywane w temperaturze minus 20 stopni do dalszych analiz, takich jak dwie hybrydyzacja in situ. Gdy będziesz gotowy do przyjęcia ciosów, zabarwij szkiełka fioletem wyrostka zębodołowego, aby zidentyfikować interesujące struktury mózgu. Następnie za pomocą igły do dziurkowania wykonaj 0,8 milimetra nakłucia obszarów zainteresowania za pomocą mikrodysekcji w loco.

Stemple należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Niezwykle ważne jest, aby mikrowykrawanie było wykonywane w ustandaryzowany sposób, ponieważ ekspresja genów i metylacja są wysoce specyficzne dla tkanki. Homogenizować stemple w 400 mikrolitrach buforu tiocyjanianu kadu za pomocą pipety, a następnie wirować w temperaturze pokojowej.

Następnie przepuść powstały lizat przez strzykawkę o rozmiarze 29. Kilka razy stempel nie powinien być już widoczny. Podziel lizat na równe części.

Jeden do przetwarzania RNA, który należy wykonać najpierw, a drugi do przetwarzania DNA, który może być przechowywany w temperaturze pokojowej do czasu, gdy RNA zostanie przetworzone do oczyszczania RNA w jednej 10 objętości octanu sodu, jednej objętości aquafenolu i połowie objętości 24 do jednego wiru chloroformu do izoamylu AML. Mieszaninę energicznie po każdym dodaniu i inkubować końcową miksturę na lodzie przez 10 minut. Następnie odwirować mieszaninę.

Zbierz fazę wodną i dodaj do niej równą objętość 70% etanolu. Korzystanie z zestawu kolumny wirowej RNA. Przeprowadzić trawienie DNA na kolumnie i przepłukać wymycie RNA w 25 mikrolitrach wody.

Teraz oczyść DNA za pomocą protokołu zestawu zmodyfikowanego tak, aby zawierał dodanie trawienia RN a i ogrzanie buforu elucian i kolumny elucian do 70 stopni Celsjusza przed ich użyciem. 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza wystarcza dla kolumn. Na koniec użyj spektrofotometru, aby określić stężenia DNA i RNA.

Typowy stempel PVN daje około 600 nanogramów DNA i około 400 nanogramów RA odłożonych na bok, około 100 nanogramów RNA do analizy ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR przed amplifikacją siarczynem. Potraktuj 200 nanogramów wyizolowanego DNA dostępnym na rynku zestawem do amplifikacji DNA z regionów metylowanych. Zamów startery zaprojektowane specjalnie dla DNA przekształconego w bi-siarczyn Optymalna konstrukcja startera w bi PCR jest niezbędna, ponieważ jakość i specyfika amplikonu PCR decyduje o powodzeniu kolejnych kroków.

Po przybyciu starterów określ ich optymalną temperaturę i temperaturę klęczącą za pomocą eksperymentów pilotażowych. Użyj dwóch mikrolitrów DNA poddanego działaniu siarczynu bis-u jako matrycy na każde 25 mikrolitrów. Mieszanina PCR.

Amplifikować mieszaninę, zaczynając od sześciominutowej denaturacji w temperaturze 95 stopni Celsjusza, następnie od 45 do 50 cykli amplifikacji, a następnie od końcowego pięciominutowego wydłużenia w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Przeanalizuj siedem mikrolitrów produktu PCR za pomocą elektroforezy żelowej Agros w celu sprawdzenia wielkości amplikonu. Pozostałą część produktu PCR należy oczyścić w celu późniejszej ligacji za pomocą dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia PCR.

W przypadku uzyskania niepożądanych produktów PCR należy zastosować oczyszczanie żelem w celu wyizolowania produktu będącego przedmiotem zainteresowania dla tego protokołu. Stosowany jest komercyjny zestaw do klonowania. Skuteczność klonowania zależy w dużej mierze od wkładki.

Jeśli więc wielokrotnie uzyskuje się małą liczbę rekombinowanych klonów, wypróbuj inny wektor klonowania. Ustaw 10 mikrolitrów reakcji ligacji z jednym mikrolitrem wektora i trzema mikrolitrami oczyszczonego produktu PCR. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.

Oczyść reakcję ligacji przez klasyczne wytrącanie etanolu i przekształć bakterie w produkt. Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki SOB bezpośrednio po podaniu impulsu i przenieś przekształcone bakterie do probówki reakcyjnej. Po odzyskaniu bakterii przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozprowadź 100 mikrolitrów każdej zawiesiny na płytce ampicyliny LB pokrytej IPTG.

Xal inkubuje płytki przez noc, gdy można zebrać kolonie. Ustaw 25 mikrolitrowych reakcji PCR kolonii na 96-dołkowej płytce, używając trzech mikrolitrów 2,5 milimolowego chlorku magnezu w każdej reakcji. Wybierz dodatnie białe klony za pomocą końcówki pipety i przenieś je do mieszanki PCR za pomocą prostego zanurzenia.

Rozpocznij PCR od czterominutowego cyklu topnienia. Następnie wykonaj 10 cykli amplifikacji z temperaturą molingu 56 stopni Celsjusza. Każdy krok tych cykli trwa 30 sekund.

Następnie zmniejsz temperaturę ealingu do 48 stopni Celsjusza na kolejne 30 cykli amplifikacji. Zakończ pięciominutowym cyklem wydłużania. Teraz załaduj pięć mikrolitrów każdego produktu na żel aros i zidentyfikuj reakcje, które zawierają wkładkę o odpowiedniej wielkości.

Użyj dostępnego w handlu zestawu, aby oczyścić interesujące Cię produkty PCR, aby można je było sekwencjonować przy użyciu sekwencjonowania cyklicznego z dużym terminatorem barwnika. W 96-dołkowej płytce załaduj studzienki trzema mikrolitrami dużej mieszanki wzorcowej reakcji DI, a następnie dwoma mikrolitrami oczyszczonego produktu PCR kolonii. Przeprowadź reakcję na termocyklerze, zaczynając od jednej minuty w temperaturze 96 stopni Celsjusza, a następnie 35 cykli po 10 sekund w temperaturze 96 stopni Celsjusza, pięć sekund w 50 stopniach Celsjusza i cztery minuty w 60 stopniach Celsjusza.

Po zakończeniu reakcji z dużą matrycą oczyść reakcję za pomocą dużej płytki oczyszczającej. Po uzyskaniu sekwencji przeanalizuj je za pomocą dużego analizatora online lub narzędzia B-I-S-M-A, aby uzyskać wzorzec metylacji badanego regionu DNA, aby uzyskać wgląd w wpływ stresu we wczesnym okresie życia lub ELS na ekspresję VP i stan metylacji. Czarne pałeczki i myszy C 57 przetworzono zgodnie z opisanym protokołem, jądro przykomorowe i jądro nadwzrokowe przebito w celu wyizolowania DNA, a R-N-A-D-N-A poddano działaniu bisiarczynu, amplifikowano starterami specyficznymi dla wzmacniacza VP, a produkty PCR sklonowano i zsekwencjonowano co najmniej 20 rekombinowanych klonów z każdej myszy.

PCR analizowano w celu określenia częstości metylacji CPG zawartych w amplikonie PCR w tkance z P-V-N-E-L-S wywołało znaczną hipometylację w czterech miejscach na wzmacniaczu A VP, co sugeruje epigenetyczne znakowanie tego regionu regulatorowego poprzez wczesne doświadczenia życiowe. W przeciwieństwie do metylacji PVN wzmacniacza A VP ELS w SON nie miała wpływu na swoistość tkankową efektu epigenetycznego u zwierząt kontrolnych, status metylacji DNA na poziomie CPG 10 korelował ujemnie z ekspresją genu VP, wskazując na rolę metylacji DNA w precyzyjnym dostrojeniu ekspresji genu VP. Po tej procedurze można łatwo przeprowadzić inne metody, takie jak UPCR, na wyizolowanym RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zmiany ekspresji genów w analizowanej tkance.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać zmiany metylacji DNA w odpowiedzi na bodźce środowiskowe lub doświadczane zależne.