Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest badanie zmian w metylacji DNA i ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Cel ten jest realizowany poprzez poddanie nowonarodzonych myszy separacji matczynej w celu wywołania stresu we wczesnym okresie życia, a w drugim kroku poprzez pobranie interesujących obszarów mózgu, w tym przypadku PVN, za pomocą mikrodysekcji in loco oraz jednoczesną izolację DNA i RNA z pojedynczego wycinka tkanki.

Następnie uzyskany DNA poddaje się traktowaniu siarczynem, a region zainteresowania jest powielany metodą bisulfitowego PCR. Następnie produkt ten liguje się do wektora i transformuje do bakterii. Pomyślne transformacje identyfikuje się na podstawie ekspresji markera oraz wielkości fragmentu PCR.

I na koniec, sekwencjonowanie bisulfitowe jest wykorzystywane do oceny stanu metylacji. Główną zaletą tego schematu postępowania jest to, że umożliwia on wygodną analizę programowania epigenetycznego w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat programowania epigenetycznego wywołanego przez niekorzystne doświadczenia we wczesnym dzieciństwie.

Metoda ta może być również zastosowana w innych systemach, w których analizuje się metylację i ekspresję genów w środowisku o wysokiej specyficzności tkankowej oraz w przypadkach ograniczonej dostępności tkanek. Aby wywołać stres we wczesnym okresie życia, przeprowadza się separację matczyną szczeniąt zTimed pregnant samic C 57 black six N w celu wywołania efektu separacji matczynej.

Przenosić każdy miot do ogrzewanej, czystej klatki na trzy godziny dziennie od 1. do 10. dnia po urodzeniu, pozostawiając niezakłócone szczęta kontrolne w stanie braku stresu. Poza wspomnianą trójgodzinną separacją, wszystkie mioty pozostają z matkami aż do odsadzenia w 21. dniu po urodzeniu. Następnie myszy są kwaterowane w grupach o tej samej płci, po trzy do pięciu osobników na klatkę, w standardowych warunkach chowu. Aby rozpocząć pobieranie tkanki mózgowej, mózgi myszy są usuwane z czaszek, a następnie bezzwłocznie zamrażane w suchym lodzie i przechowywane w temperaturze -80 °C.

Po przygotowaniu do pobrania wycinków tkankowych, należy wyjąć mózgi z zamrażarki -80 °C i umieścić je na suchym lodzie. Należy rozpocząć od kriosekcjonowania mózgów w celu uzyskania koronarnych przekrojów o grubości 10 µm, kierując się od strony rostralnej do caudalnej. Przekroje należy zamontować na szkiełkach SuperFrost i wysuszyć przed barwieniem krystalowym fioletem.

Dodatkowe preparaty mogą zostać wykonane i przechowywane w temperaturze -20 °C do dalszych analiz, takich jak hybrydyzacja in situ. Przed przystąpieniem do wycinania próbek, należy zabarwić preparaty fioletem krystalicznym, aby zidentyfikować interesujące struktury mózgu. Następnie, używając igły do wycinania, należy pobrać wycinki o średnicy 0,8 mm z obszarów zainteresowania, stosując mikrodysekcję in loco.

Wycięcia tkankowe należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Kluczowe jest, aby mikropunching był wykonywany w sposób ustandaryzowany, ponieważ ekspresja genów i metylacja są silnie specyficzne dla danej tkanki. Homogenizować wycięcia w 400 µL buforu z tiocyjanianem guanidyny za pomocą pipety, a następnie wymieszać w wirówce typu vortex w temperaturze pokojowej.

Następnie przepuść otrzymany lizat przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 29 G. Czynność tę powtórz kilka razy, aż do momentu, gdy fragmenty tkanki przestaną być widoczne. Podziel lizat na równe części.

Jedną próbkę należy przeznaczyć do izolacji RNA, co powinno zostać wykonane w pierwszej kolejności, a drugą do izolacji DNA, którą można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu przetworzenia RNA. Oczyszczanie RNA przeprowadza się przy użyciu 1/10 objętości octanu sodu, jednej objętości aqua-fenolu oraz połowy objętości chloroformu z izoamylololem (24:1). Po każdym dodaniu odczynnika mieszaninę należy energicznie wymieszać w wiruwarce, a końcowy roztwór inkubować na lodzie przez 10 minut. Następnie mieszaninę należy odwirować.

Zebrać fazę wodną i dodać do niej równą objętość 70% etanolu. Używając zestawu do oczyszczania RNA na kolumnach spinowych, przeprowadzić trawienie DNA na kolumnie, a następnie przemyć i eluować RNA do 25 µL wody.

Następnie należy oczyścić DNA, korzystając z protokołu zestawu zmodyfikowanego o dodatek trawienia RNazy oraz podgrzanie buforu do elucji i kolumny do elucji do 70 °C przed ich użyciem. W przypadku kolumn wystarczy 10 minut w 70 °C. Na koniec należy użyć spektrofotometru w celu oznaczenia stężeń DNA i RNA.

Typowy wycinek z PVN dostarcza około 600 ng DNA oraz około 400 ng RNA, z czego około 100 ng RNA odkłada się do analizy ekspresji genów metodą ilościowego PCR przed amplifikacją po konwersji siarczynowej. 200 ng wyizolowanego DNA należy poddać obróbce przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu w celu amplifikacji DNA z regionów zmetylowanych. Należy zamówić primery zaprojektowane specjalnie dla DNA konwertowanego siarczynem. Optymalny dobór primerów w bisulfitowym PCR jest kluczowy, ponieważ jakość i specyficzność amplikonu PCR determinują sukces kolejnych etapów.

Po otrzymaniu starterów należy wyznaczyć ich optymalną temperaturę przyłączania za pomocą eksperymentów pilotażowych. Jako matrycę dla każdej 25 µL mieszaniny do PCR należy wykorzystać 2 µL DNA poddanego działaniu pirosiarczynu sodu.

Przeprowadzić amplifikację mieszaniny, rozpoczynając od sześciominutowej denaturacji w 95 °C, a następnie wykonując od 45 do 50 cykli amplifikacji, kończąc proces pięciominutową elongacją w 72 °C. Przeanalizować 7 µL produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w celu weryfikacji wielkości amplikonu. Pozostały produkt PCR oczyścić do późniejszej ligacji, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania produktów PCR.

W przypadku uzyskania niepożądanych produktów PCR, należy zastosować oczyszczanie żelowe w celu wyizolowania produktu wymaganego do niniejszego protokołu. Wykorzystuje się komercyjny zestaw do klonowania. Wydajność klonowania zależy w znacznym stopniu od wstawki.

W przypadku powtarzającego się uzyskiwania niskiej liczby klonów rekombinowanych należy wypróbować inny wektor klonujący. Należy przygotować reakcję ligacji o objętości 10 µL, zawierającą 1 µL wektora i 3 µL oczyszczonego produktu PCR. Reakcję należy wymieszać poprzez pipetowanie, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

Oczyść reakcję ligacji poprzez klasyczne wytrącanie etanolem, a następnie przeprowadź transformację bakterii otrzymanym produktem. Bezpośrednio po impulsie elektrycznym dodaj jeden mililitr podgrzanego wcześniej medium SOB i przenieś transformowane bakterie do probówki reakcyjnej. Po regeneracji bakterii przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, wysej 100 µL każdej zawiesiny na płytkę z agarem LB z ampicyliną i IPTG.

Inkubuj płytki przez noc, aż pojawią się kolonie możliwe do nabrania. Przygotuj reakcje kolonialnego PCR w objętości 25 µL na płytce 96-dołkowej, dodając 3 µL 2,5 mM chlorku magnezu do każdej reakcji. Wyselekcjonuj pozytywne białe klony za pomocą końcówki pipety i przenieś je do mieszaniny PCR poprzez krótkie zanurzenie.

Reakcję PCR rozpocząć od czterominutowego cyklu denaturacji. Następnie przeprowadzić 10 cykli amplifikacji z temperaturą przyłączania 56 °C. Każdy etap tych cykli trwa 30 sekund.

Następnie obniż temperaturę annealingu do 48 °C na kolejne 30 cykli amplifikacji. Zakończ proces pięciominutowym cyklem elongacji. Teraz nanieś 5 µL każdego produktu na żel agarozowy i zidentyfikuj reakcje zawierające insert o odpowiedniej wielkości.

Należy użyć dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania wybranych produktów PCR w celu ich późniejszego sekwencjonowania metodą cyklicznego sekwencjonowania z użyciem terminatorów BigDye. W płytce 96-dołkowej należy do każdego dołka nanieść 3 µL gotowej mieszaniny reakcyjnej BigDye, a następnie 2 µL oczyszczonego produktu PCR z kolonii. Reakcję należy przeprowadzić w termocyklerze, rozpoczynając od 1 minuty w 96 °C, a następnie przez 35 cykli: 10 sekund w 96 °C, 5 sekund w 50 °C oraz 4 minuty w 60 °C.

Po zakończeniu reakcji bisulfitowej, należy oczyścić produkt reakcji, wykorzystując płytkę do oczyszczania po bisulfitowaniu. Po uzyskaniu sekwencji, należy przeanalizować je za pomocą internetowego analizatora bisulfitowego lub narzędzia B-I-S-M-A, aby określić wzór metylacji badanego regionu DNA i uzyskać wgląd w wpływ stresu we wczesnym życiu (ELS) na ekspresję i status metylacji aVP. Myszy szczepu C 57 black sticks były przetwarzane zgodnie z opisanym protokołem; wycinano jądra przykomorowe i nadwzrokowe w celu izolacji DNA i RNA, a następnie DNA poddawano traktowaniu bisulfitem i amplifikacji za pomocą starterów specyficznych dla enhancera aVP; produkty PCR klonowano i sekwencjonowano, analizując co najmniej 20 klonów rekombinowanych od każdej myszy.

Produkty PCR przeanalizowano w celu określenia częstotliwości metylacji wysp CpG zawartych w amplikonie PCR w tkance z P-V-N-E-L-S, co doprowadziło do znaczącej hipometylacji w czterech miejscach w enhancerze A VP, sugerując epigenetyczne znakowanie tego regionu regulacyjnego poprzez doświadczenia z wczesnego etapu życia. W przeciwieństwie do PVN, metylacja enhanceera A VP w SON nie uległa zmianie pod wpływem ELS, co ilustruje tkankową specyficzność efektu epigenetycznego. U zwierząt kontrolnych status metylacji DNA w pozycji CpG 10 korelował negatywnie z ekspresją genu a VP, wskazując na rolę metylacji DNA w precyzyjnym dostrajaniu ekspresji genu a VP. Po wykonaniu tej procedury można łatwo zastosować inne metody, takie jak UPCR, na wyizolowanym RNA w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące zmian w ekspresji genów w analizowanej tkance.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak badać zmiany metylacji DNA w odpowiedzi na bodźce środowiskowe lub zależne od doświadczeń.