Name: Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę analizy metylacji DNA i ekspresji genów z małych obszarów mózgu myszy. Protokół obejmuje separację macierzyńską, mikrodissekcję tkanek oraz izolację DNA i RNA z pojedynczego wycinka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana przez Max Planck Institute of Psychiatry oraz sieć szkoleniową Marie Curie Initial Training Network Unii Europejskiej (umowa NINA nr 238665).

1. Programowanie przez wczesnodziecięce przeciwności losu
Separację matczyną (MS) przeprowadza się w celu wywołania stresu we wczesnym stadium życia (ELS) u szczeniąt urodzonych z myszy C57BL/6N w określonym czasie ciąży (0. dzień postnatalny (P0) w dniu urodzenia).
<ol>
 <li>Poszczególne mioty umieszcza się w czystych klatkach (z matą grzewczą) na 3 h dziennie od P1 do P10.</li>
 <li>Szczęta kontrolne (bez ELS) pozostają niezakłócone w gnieździe matki przez cały ten czas.</li>
 <li>Szczętę utrzymuje się z matkami do czasu odsadzenia (P21), po czym są one kwaterowane w grupach tej samej płci (3-5 myszy na klatkę) w standardowych warunkach utrzymania zwierząt laboratoryjnych.</li>
</ol>
2. Izolacja i sekcja tkanki mózgowej
<ol>
 <li>Myszy są uśmiercane w pożądanym wieku poprzez zwichnięcie stawów szyjnych. Uwaga: ponieważ protokół ten obejmuje paradygmat stresowy, przed zwichnięciem stawów szyjnych nie podaje się znieczulenia, aby uniknąć zakłócenia normalnej regulacji fizjologicznej hormonów stresu. Czaszki są otwierane, a mózgi ostrożnie usuwane i natychmiast zamrażane szokowo poprzez zanurzenie w mieszaninie izopentanu i suchego lodu, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Mózgi są poddawane kriosekcjonowaniu (grubość 10 μm); skrawki są montowane na szkiełkach Superfrost i przechowywane w temperaturze -20 °C. W celu weryfikacji precyzji anatomicznej i zapewnienia uwzględnienia obszaru zainteresowania (np. dla neuronów w jądrze przykomorowym - PVN - pobiera się skrawki zaczynając od poziomu rostralnego PVN, bregma -0.75 do -0.85) stosuje się odniesienie do standardowego atlasu stereotaksycznego myszy (np. Paxinos 6).</li>
 <li>Skrawki są barwione fioletem krezylowym w celu ułatwienia identyfikacji różnych struktur mózgu. Wycinki (0,8 mm) z obszarów zainteresowania (np. PVN) są pobierane metodą mikrodysekcji in loco.</li>
</ol>
3. Izolacja kwasów nukleinowych z wycinków tkanki mózgowej
Opisano zoptymalizowany protokół jednoczesnej ekstrakcji DNA i RNA z niewielkich, zdefiniowanych neuroanatomicznie obszarów mózgu do analizy konwersji bisulfitowej oraz ekspresji genów 7.
Uwaga: Biorąc pod uwagę, że RNA jest mniej stabilne niż DNA w buforze GTC, zaleca się w pierwszej kolejności przetwarzanie RNA. Homogenat wykorzystywany do oczyszczania DNA może w tym czasie być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT).
<ol>
 <li>Homogenizować wycinki za pomocą pipety i vortexera w 400 μl buforu z tiocyjanianem guanidyny (GTC) (4,5 M tiocyjanianu guanidyny, 2% N-lauroylosarkozyny, 50 mM EDTA pH 8,25, mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-merkaptoetanolu, 0,2% przeciwpieniacza A) w temperaturze pokojowej (RT), przepuszczając zawiesinę kilka razy przez strzykawkę hipodermiczną (29G) (Rysunek 2).</li>
 <li>Podzielić lizat na równe części; RNA i DNA można ekstrahować jednocześnie lub osobno, w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.</li>
 <li>W celu oczyszczania RNA dodać do lizatu 1/10 objętości NaOAc, 1 objętość AquaPhenol (Appligene) (pH 4) oraz 1/2 objętości chloroformu:izoamylu (24:1). Po każdym etapie intensywnie mieszać na vortexerze i inkubować na lodzie przez 10 min, a następnie wirować (20 min przy 10 000 g w 4 °C); do fazy wodnej dodać równą objętość 70% EtOH.</li>
 <li>Przenieść mieszaninę do kolumny spinowej do RNA (np. Nucleospin RNA II firmy Macherey-Nagel) i przeprowadzić trawienie DNazą w kolumnie oraz etapy płukania (zgodnie z protokołem producenta); eluiować RNA w 25 μl H2O.</li>
 <li>Do oczyszczania DNA stosuje się zoptymalizowany protokół zestawu Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit. Zrównoważyć lizat równymi objętościami Buforu AL i 100% EtOH, nanieść na kolumnę spinową i wirować (1 min przy 10 000 g w RT), a następnie odrzucić filtrat.</li>
 <li>Dodać do kolumny 500 μl Buforu AW1 zawierającego 5 μl RNAzy (1 mg/ml) i inkubować przez 10 min w RT. Wirować (1 min przy 10 000 g w RT) i odrzucić filtrat.</li>
 <li>Przepłukać kolumnę 500 μl Buforu AW2, odrzucić filtrat i osuszyć pustą kolumnę przez wirowanie (1 min przy 15 000 g).</li>
 <li>Dodać uprzednio ogrzany (70 °C) Bufor AE i inkubować kolumny przez 10 min w 70 °C. Eluiować poprzez wirowanie (1 min przy 10 000 g), ponownie nanieść filtrat i powtórzyć etap wirowania.</li>
</ol>
Do oznaczenia stężeń DNA i RNA należy użyć spektrofotometru. Typowy wycinek PVN dostarcza ~600 ng DNA i ~400 ng RNA. Do analizy ekspresji genów za pomocą ilościowej PCR (qPCR) zazwyczaj wykorzystujemy ~100 ng RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji.
4. Konwersja bisulfitowa
Pirosiarczyn sodu jest używany do konwersji niezmetylowanych cytozyn w uracyle. Z kolei cytozyny zmetylowane są chronione przed tą konwersją. W związku z tym wszystkie cytozyny wykryte w końcowym sekwencjonowaniu amplikonu PCR po konwersji pirosiarczynowej reprezentują cytozyny zmetylowane.
Konwersja pirosiarczynowa powoduje znaczną degradację DNA, co może być czynnikiem ograniczającym w analizie PCR. Zoptymalizowane warunki reakcji, które maksymalizują konwersję cytozyny, ograniczają fragmentację DNA i utrzymują jednoniciowy charakter DNA nawet w niższych temperaturach, można osiągnąć przy użyciu zestawu EpiTect Bisulfite Kit firmy Qiagen. W naszych badaniach ok. 200 ng DNA oczyszczonego z mikrowykrojów zapewnia wystarczającą ilość materiału wyjściowego do reakcji pirosiarczynowej.
Aby zapobiec różnicom w wydajności reakcji konwersji, ilość matrycowego DNA powinna pozostać stała we wszystkich próbkach przetwarzanych podczas eksperymentu. Ponadto odczyty sekwencji należy poddać kontroli pod kątem wydajności konwersji, badając odsetek niekonwertowanych pozycji non-CpG. Wartość ta powinna przekraczać 98%. Niższe wartości wskazują na niepełną lub niewydajną konwersję pirosiarczynową, a odpowiadające im sekwencje powinny zostać wykluczone z analizy.
5. PCR z konwersją bisulfitową
<ol>
 <li>Zaprojektuj primery do sekwencjonowania pirosulfitowego, które są specyficzne dla DNA poddanego konwersji pirosulfitowej (patrz dyskusja); oprogramowanie Methyl Primer Express (<a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121</a>) ułatwi ten proces i pomoże określić optymalne temperatury przyłączania w eksperymentach pilotażowych.</li>
 <li>Przygotuj PCR-Master-Mix (na jedną reakcję) w następujący sposób:
 2,5 μl buforu PCR 10x 
 0,5 μl 10 mM dNTPs 
 1 μl 10 μM primera forward 
 1 μl 10 μM primera reverse 
 0,125 μl Qiagen Hotstart Taq Plus 
 uzupełnij H2O do objętości 23 μl </li>
 <li>Dodaj 2 μl DNA poddanego działaniu pirosulfitu do reakcji.</li>
 <li>Przeprowadź amplifikację w następujących warunkach:
 1 cykl 6 min 95 °C 
 45-50 cykli: 1 min 95 °C, 1 min w optymalnej temperaturze przyłączania, 1 min 72 °C 
 1 cykl 5 min 72 °C </li>
</ol>
Przeanalizuj 7 μl produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby zweryfikować wielkość amplikonu, a następnie oczyść pozostałą reakcję PCR do późniejszej ligacji, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania PCR (np. Macherey-Nagel Nucleospin Extract). W przypadku otrzymania dodatkowych, niepożądanych produktów PCR, zaleca się oczyszczanie z żelu.
6. Sekwencjonowanie z konwersją bisulfitową
Profile metylacji DNA o wysokiej rozdzielczości, uzyskane z odczytów pojedynczych klonów, pozwalają na wykrycie niewielkich zmian w metylacji DNA oraz identyfikację regionów regulacyjnych reagujących na leczenie (programowanie środowiskowe). Proces sekwencjonowania z użyciem bisulfitu obejmuje trzy następujące po sobie etapy robocze. Po pierwsze, produkty PCR uzyskane w poprzednim etapie PCR z bisulfitem są ligowane do wektora i transformowane do bakterii. Po drugie, w celu określenia prawidłowej wielkości insertu stosuje się PCR kolonii z pojedynczych klonów. Po trzecie, pozytywne produkty PCR kolonii są oczyszczane i poddawane reakcji sekwencjonowania Big-Dye. Po etapie oczyszczania produkty są poddawane elektroforezie w sekwencjonatorze kapilarnym.
6.1 Ligacja i transformacja
Uwaga: Rutynowo stosujemy zestaw do klonowania wektora pGEM-T (Promega). W naszym doświadczeniu wydajność klonowania zależy w sposób krytyczny od wstawki podlegającej ligacji. W przypadku powtarzającego się uzyskiwania niskiej liczby klonów rekombinowanych należy przetestować różne wektory.
<ol>
 <li>Przygotowanie reakcji ligacji:
 5 μl buforu do ligacji 2x 
 1 μl wektora pGEM-T 
 1 μl T4-ligazy 
 3 μl oczyszczonego produktu PCR </li>
 <li>Wymieszanie reakcji poprzez pipetowanie i inkubacja przez noc w temperaturze 4 °C.
 Uwaga: Ligację można przeprowadzić również przez 1 h w temperaturze pokojowej. Aby zwiększyć liczbę klonów rekombinacyjnych, zaleca się ligację przez noc w 4 °C. </li>
 <li>Oczyszczanie produktów ligacji poprzez wytrącanie etanolem:
 <ol class="lalpha">
 <li>Do reakcji ligacji dodać 1 μl glikogenu, 1 μl 3M NaAc oraz 25 μl 100% EtOH i wytrącać przez 1 min w ciekłym azocie.</li>
 <li>Wirować (15,000 g przez 30 min w 4 °C) i odlać nadsącz.</li>
 <li>Przemyć 300 μl 70% EtOH i wirować (15,000 g przez 20 min w 4 °C), odlać nadsącz i osuszyć osad w temperaturze pokojowej (10 min).</li>
 <li>Resuspendować osad w 10 μl H2O.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
6.2 Transformacja produktów ligacji w bakteriach elektrokompetentnych
<ol>
 <li>Schłodzić kuwety do elektroporacji (szerokość 1 mm) na lodzie i rozmrozić na lodzie alikwot bakterii DH5α kompetentnych do elektroporacji.</li>
 <li>Dodać 45 μl bakterii DH5α do 10 μl oczyszczonego produktu ligacji (patrz wyżej) i przenieść do kuwety.</li>
 <li>Przeprowadzić transformację bakterii przy parametrach 1,5 kV, 200 Ω, 15 μF i dodać 1 ml uprzednio ogrzanego podłoża SOB bezpośrednio po podaniu impulsu.</li>
 <li>Inkubować bakterie w celu regeneracji przez 1 h w 37 °C, a następnie wysiać 100 μl zawiesiny na płytki LB/ampicylina pokryte IPTG/X-Gal.</li>
 <li>Inkubować płytki przez noc w 37 °C.</li>
</ol>
6.3 PCR kolonii
Uwaga: PCR kolonii z pojedynczych klonów przeprowadza się w celu upewnienia się, że inserty mają przewidywaną wielkość. Opóźniony rozwój barwy podczas selekcji niebiesko-białej, niepożądane zdarzenia rekombinacji podczas ligacji, włączenie oligomerycznych par starterów lub skrócone produkty PCR mogą w przeciwnym razie prowadzić do błędnych wyników sekwencjonowania. Rutynowo stosujemy startery T7 i SP6 do amplifikacji sklonowanych insertów; podejście to skutkuje obecnością dodatkowych sekwencji wektora o długości około 150 bp. Starter T7 jest wykorzystywany w reakcji sekwencjonowania w późniejszym etapie.
<ol>
 <li>Przygotować reakcję colony PCR na płytce 96-dołkowej. Na jedną reakcję należy użyć:
 3 μl 2.5 mM MgCl2 
 2.5 μl 10x buforu Taq 
 1.5 μl 10 mM dNTP 
 2 μl 2.5 mM startera T7 
 2 μl 2.5 mM startera SP6 
 1 μl polimerazy Taq Fermentas 
 uzupełnić do 25 μl wodą H2O </li>
 <li>Rozdzielić po 25 μl master mixu do każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
 <li>Wybrać z płytki pozytywny (biały) klon za pomocą końcówki pipety i zanurzyć go w reakcji PCR.</li>
 <li>Przeprowadzić amplifikację według następujących warunków:
 1 cykl 4 min w 95 °C 
 10 cykli 30 s w 94 °C, 30 s w 56 °C i 30 s w 72 °C 
 30 cykli 30 s w 94 °C, 30 s w 48 °C i 30 s w 72 °C 
 1 cykl 5 min w 72 °C </li>
 <li>Naniesć 5 μl produktu colony PCR na żel agarozowy i wyznaczyć reakcje zawierające insert o prawidłowej wielkości.</li>
 <li>Produkty colony PCR zawierające pożądane amplikony należy oczyścić za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu (Machery Nagel Nucleofast).</li>
</ol>
6.4 Reakcja terminacyjna Big-Dye i sekwencjonowanie
<ol>
 <li>Przygotować mieszaninę Master mix do reakcji Big-Dye. Na jedną reakcję należy użyć:
 1 μl H2O 
 0.5 μl odczynnika Big-Dye 
 1.5 μl buforu do sekwencjonowania </li>
 <li>Do każdej studni płytki 96-dołkowej nanieść 3 μl mieszaniny, a następnie dodać 2 μl oczyszczonego produktu PCR kolonii i przeprowadzić reakcję w termocyklerze z następującymi parametrami:
 1 cykl: 1 min w 96 °C 
 35 cykli: 10 s w 96 °C, 5 s w 50 °C oraz 4 min w 60 °C </li>
 <li>Produkty reakcji Big-Dye oczyścić za pomocą komercyjnego zestawu (Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit) i poddać analizie w sekwenatorze kapilarnym (np. ABI 3100 DNA).</li>
 <li>Sekwencje analizować przy użyciu programu Biq Analyzer (<a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a>) lub narzędzia online BISMA (<a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a>) w celu określenia wzoru metylacji badanego regionu DNA (Rycina 4).</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Aby uzyskać wgląd w wpływ ELS na ekspresję i stan metylacji genu Avp, myszy C57BL/6N poddano procedurom zgodnie z opisanym powyżej schematem postępowania. W skrócie, grupa myszy C57BL/6N została poddana ELS, natomiast grupa kontrolna nie była niepokojona. Wycięto próbki z jądra przykomorowego (PVN) oraz jądra nadwzrokowego (SON), a następnie z pojedynczych wycinków jednocześnie wyizolowano DNA i RNA. RNA poddano odwrotnej transkrypcji, a poziomy transkryptów Avp zmierzono za pomocą analizy qPCR i znormalizowano względem ekspresji genów referencyjnych Hprt oraz Gapdh. DNA poddano konwersji bisulfitowej, amplifikowano za pomocą starterów specyficznych dla enhancera Avp (Rysunek 4a), a produkty PCR sklonowano i zsekwencjonowano. Przeanalizowano co najmniej 20 klonów rekombinowanych z każdej myszy/reakcji PCR, aby określić częstotliwość metylacji dla CpG zawartych w amplikonie PCR (Rysunek 4b). W porównaniu z grupą kontrolną, ELS wywołała istotną hipometylację w obrębie CpG10, CpG12, CpG13 i Cpg14 enhancera Avp (p &lt; 0,05, n = 6-8 zwierząt), co sugeruje epigenetyczne znakowanie tego regionu regulacyjnego poprzez doświadczenia z wczesnego etapu życia. W przeciwieństwie do PVN, metylacja enhancera Avp w SON nie była zmieniona przez ELS, co ilustruje tkankową specyficzność znakowania epigenetycznego (Rysunek 4c). Analiza stanu metylacji DNA w CpG10 i ekspresji genu Avp u zwierząt kontrolnych (n = 6) wykazała ujemną korelację, co wskazuje na rolę metylacji DNA w precyzyjnej regulacji ekspresji genu AVP (Rysunek 4d).
<img alt="Schemat przebiegu sekcji mózgu; ekspresja RNA, konwersja bisulfitowa, PCR, metylacja DNA." src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Mikropuncje pobrane z mózgów myszy z grupy kontrolnej oraz myszy poddanych stresowi we wczesnym okresie życia. Po izolacji DNA i RNA ekspresję genów określono za pomocą qRT-PCR, natomiast DNA poddane działaniu bisulfitu poddano amplifikacji, a oczyszczone produkty sklonowano w odpowiednim wektorze, co umożliwiło identyfikację klonów rekombinowanych za pomocą selekcji niebiesko-białej. Prawidłowe rozmiary wstawek zweryfikowano metodą colony PCR przed przeprowadzeniem reakcji Big-Dye i analizą na sekwenatorze kapilarnym. Wzory metylacji zwizualizowano za pomocą odpowiedniego oprogramowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Oś czasu sekwencjonowania bisulfitowego DNA; szczegółowe etapy przygotowania i PCR w ramach sześciodniowego procesu." src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Oś czasu od ekstrakcji DNA/RNA do sekwencjonowania bisulfitowego.
<img alt="Schemat ekstrakcji RNA/DNA; schemat blokowy sekwencyjnych kroków analizy ekspresji RNA i metylacji DNA." src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Schemat jednoczesnej ekstrakcji DNA i RNA. Wybiórczy fragment (punch) jądra przykomorowego podwzgórza, niewielkiego obszaru mózgu wykazującego ekspresję genu Avp, umieszcza się w 400 μl buforu GTA, miesza na wirówce do rozpadu tkanki, a następnie homogenizuje, przepuszczając przez strzykawkę (29G). Homogenizat jest następnie dzielony w celu oczyszczania RNA i DNA. Podział może wynosić 1:1 lub być w innych proporcjach, w zależności od konkretnego pytania badawczego. Homogenizaty należy przetworzyć w ciągu kilku godzin.
<img alt="Analiza metylacji genu; A: schemat miejsc CpG; B-C: wykresy słupkowe; D: wykres rozproszenia korelacji." src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Metylacja CpG w locus Avp u 6-tygodniowych zwierząt kontrolnych i zwierząt z ELS. (A) Schemat genów Avp i oxytocin zorientowanych ogon-do-ogona i oddzielonych regionem międzygenowym (IGR). Egzony przedstawiono jako otwarte (numerowane) prostokąty. Wskazano rozkład pozostałości CpG, a rozmiar i położenie odpowiedniego amplikonu PCR zawierającego CpG 10 do CpG14 zaznaczono pogrubioną linią. (B) Metylacja enhancera Avp w PVN u zwierząt kontrolnych i zwierząt z ELS (n = 6-8). (C) Metylacja enhancera Avp w SON u zwierząt kontrolnych i zwierząt z ELS (n = 8-10). (D) Ekspresja genu Avp została skorelowana z metylacją w CpG10 (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.

<ol><li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li>
<li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis%3A+Early+life+decides%5BTitle%5D)+AND+%22Stress+%28Amsterdam%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li>
<li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+learn+from+stress%3A+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact%3A+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%3A+Compact.+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams</a>. , Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Programowanie epigenetyczne jest coraz częściej uznawane za ważny mechanizm leżący u podstaw zdrowia i chorób. Przedstawiamy tutaj udoskonaloną metodę jednoczesnej izolacji DNA i RNA z mikropróbek (micropunches) oraz kolejne kroki prowadzące do uzyskania profili metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania z konwersją pirosulfitem. Zoptymalizowany schemat pracy umożliwia wygodną analizę programowania epigenetycznego w mózgu w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Ponadto podejście to ułatwia badanie funkcjonalnej zależności między metylacją DNA a ekspresją genów, ponieważ oba te parametry są analizowane z tej samej próbki. W konsekwencji liczba zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia eksperymentu może zostać znacznie zredukowana.
Podczas realizacji przedstawionego schematu postępowania należy przestrzegać określonych środków ostrożności i wytycznych. Biorąc pod uwagę nadzwyczajną złożoność i heterogeniczność mózgu oraz fakt, że wzorce metylacji i ekspresji mogą różnić się w zależności od komórki i tkanki, najwyższej wagi ma przeprowadzenie mikropunchingu w sposób standaryzowany. Jako przykład można podać programowanie epigenetyczne Avp, które wykrywa się w jądrze przykomorowym, ale nie w jądrze nadwzrokowym (Rysunek 4b-d), czyli dwóch obszarach podwzgórza wykazujących ekspresję Avp 4. W związku z tym korzystna jest dostępność DNA i RNA z tego samego wycięcia tkanki, ponieważ ekspresja RNA niektórych markerowych genów specyficznych dla danej tkanki może w niektórych przypadkach służyć do potwierdzenia, że pobrano próbkę z prawidłowego obszaru. Chociaż mikropunching może ograniczyć heterogeniczność komórkową, należy pamiętać, że podejście to nie prowadzi do izolacji pojedynczych typów lub populacji komórek. W celu rozwiązania tego problemu można rozważyć dodatkowe etapy oczyszczania.
W przypadku sekwencjonowania z użyciem siarczanów kluczowe jest optymalne zaprojektowanie starterów do amplifikacji PCR po obróbce pirosiarczynowej. Produkty PCR przekraczające 400 bp mogą być problematyczne ze względu na degradację DNA podczas obróbki pirosiarczynowej. Należy również zauważyć, że nested PCR może dawać obciążone wyniki, jeśli w proces amplifikacji włączy się tylko kilka nienaruszonych matryc. Należy zaprojektować pary starterów specyficzne dla zmodyfikowanego amplikonu; ich sekwencje nie powinny zawierać dinukleotydów CpG, aby uniknąć amplifikacji zależnej od metylacji. Dodatkowo startery powinny zawierać cytozyny niebędące w kontekście CpG, aby zapobiec amplifikacji DNA niezmodyfikowanego lub niecałkowicie konwertowanego. Amplifikacja niektórych matryc może przebiegać pomyślniej przy zastosowaniu Hot-start PCR. W każdym przypadku przydatność par starterów powinna zostać zweryfikowana w eksperymentach pilotażowych, aby zapobiec zmarnowaniu cennych próbek doświadczalnych.
Sekwencjonowanie bisulfitowe stanowi standardową metodę analizy metylacji w konkretnych miejscach, ponieważ pozwala na wiarygodne i precyzyjne wykrycie metylacji pojedynczych reszt CpG w sposób specyficzny dla allelu 8. Bezpośrednie sekwencjonowanie produktu PCR nie jest zalecane, ponieważ mieszana metylacja reszty CpG objawi się jako podwójny pik C/T na elektroferogramie, co może uniemożliwić ilościowe określenie stopnia metylacji w analizowanym miejscu. Z tego powodu przeprowadza się etap pośredniego klonowania i sekwencjonuje kilka klonów (~20-30), aby ustalić zakres metylacji. Pirosekwencjonowanie jest alternatywną metodą ilościowego oznaczania metylacji DNA. Wykorzystuje ono również konwersję bisulfitową oraz PCR po konwersji bisulfitowej, jednak zamiast klonowania i sekwencjonowania, amplikon poddawany jest bezpośredniej reakcji pirosekwencjonowania, w której stan metylacji reszty CpG jest odczytywany jako polimorfizm pojedynczego nukleotydu C/T, który można łatwo skwantyfikować. Obie metody wykrywają podobne poziomy metylacji 9, lecz dzięki możliwości pominięcia etapu klonowania, pirosekwencjonowanie jest bardziej efektywne czasowo. Jednak w zależności od matrycy, jednorazowo można zsekwencjonować jedynie od 40 do 100 nukleotydów, co sprawia, że konieczne jest przeprowadzenie kilku rund pirosekwencjonowania z użyciem różnych starterów sekwencyjnych. Jest to krytyczne ograniczenie, biorąc pod uwagę, że wymagane są większe ilości DNA (około 1 μg na reakcję), co prawdopodobnie przekracza ilości dostępne z niewielkich wycinków tkanki mózgowej. W związku z tym wstępne skanowanie obszarów o wielkości kilku kilobaz za pomocą pirosekwencjonowania wydaje się mniej odpowiednie niż odczyt pojedynczych klonów. Niemniej jednak, po zidentyfikowaniu niewielkiego obszaru zainteresowania, należy rozważyć zastosowanie pirosekwencjonowania.
Opisany powyżej protokół stanowi w swojej całości dokładne, wydajne i usprawnione podejście do szybkiej i kosztowo efektywnej analizy zmian epigenetycznych w mikropróbkach tkanki mózgowej. W jednym przebiegu można przetworzyć wiele próbek, a zastosowane metody są odpowiednie do analizy materiału pochodzącego z eksperymentów o średniej skali.

<table><tbody><tr><td>Zestaw DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.50</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Epitect Bisulfite Kit</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Extract</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania pGEM-T Vector Cloning Kit</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofast 96</td><td>Macherey-Nagel</td><td>743100.50</td><td></td></tr><tr><td>Montage 96 Sequencing Clean-Up</td><td>Millipore</td><td>LSK09624</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Hotstar Taq</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Taq</td><td>Fermentas</td><td>EP0401</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana analiza metylacji dna i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Ekspozycja na dietę, leki i niekorzystne doświadczenia we wczesnym dzieciństwie podczas wrażliwych okien rozwojowych 1,2 może prowadzić do trwałych zmian w ekspresji genów, które przyczyniają się do wystąpienia określonych fenotypów fizjologicznych i behawioralnych. Takie programowanie środowiskowe prawdopodobnie zwiększa podatność na choroby metaboliczne, sercowo-naczyniowe i psychiczne 3,4.
Metylacja DNA i modyfikacje histonów są uważane za kluczowe procesy w mediacji dialogu między genami a środowiskiem i wydają się również leżeć u podstaw programowania środowiskowego 5. U ssaków metylacja DNA zazwyczaj polega na kowalencyjnym przyłączeniu grupy metylowej w pozycji 5 cytozyny w obrębie dinukleotydów CpG.
Metylacja CpG zachodzi w sposób ściśle specyficzny dla tkanki i komórek, co stanowi wyzwanie w badaniu odrębnych, niewielkich obszarów mózgu, w których heterogeniczność komórkowa jest wysoka, a ilość tkanki ograniczona. Ponadto, ponieważ ekspresja genów i metylacja są zdarzeniami ściśle powiązanymi, większą wartość informacyjną można uzyskać poprzez porównanie obu tych parametrów w tej samej próbce.
W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół krok po kroku (Rycina 1) do badania programowania epigenetycznego w mózgu, wykorzystując w celach ilustracyjnych paradygmat „separacji matczynej” jako model wczesnodziecięcej przeciwności losu. Protokół opisuje przygotowanie mikropróbek (tzw. micropunches) z mózgów myszy w różnym wieku, z których można jednocześnie wyizolować DNA i RNA, co umożliwia analizę metylacji DNA oraz ekspresji genów w tej samej próbce.

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Ekspozycja na dietę, leki oraz niekorzystne doświadczenia wczesnodziecięce w okresach wrażliwości 1,2 może prowadzić do trwałych zmian w ekspresji genów, które przyczyniają się do ...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie zmian w metylacji DNA i ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Cel ten jest realizowany poprzez poddanie nowonarodzonych myszy separacji matczynej w celu wywołania stresu we wczesnym okresie życia, a w drugim kroku poprzez pobranie interesujących obszarów mózgu, w tym przypadku PVN, za pomocą mikrodysekcji in loco oraz jednoczesną izolację DNA i RNA z pojedynczego wycinka tkanki.Następnie uzyskany DNA poddaje się traktowaniu siarczynem, a region zainteresowania jest powielany metodą bisulfitowego PCR. Następnie produkt ten liguje się do wektora i transformuje do bakterii. Pomyślne transformacje identyfikuje się na podstawie ekspresji markera oraz wielkości fragmentu PCR.I na koniec, sekwencjonowanie bisulfitowe jest wykorzystywane do oceny stanu metylacji. Główną zaletą tego schematu postępowania jest to, że umożliwia on wygodną analizę programowania epigenetycznego w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat programowania epigenetycznego wywołanego przez niekorzystne doświadczenia we wczesnym dzieciństwie.Metoda ta może być również zastosowana w innych systemach, w których analizuje się metylację i ekspresję genów w środowisku o wysokiej specyficzności tkankowej oraz w przypadkach ograniczonej dostępności tkanek. Aby wywołać stres we wczesnym okresie życia, przeprowadza się separację matczyną szczeniąt zTimed pregnant samic C 57 black six N w celu wywołania efektu separacji matczynej.Przenosić każdy miot do ogrzewanej, czystej klatki na trzy godziny dziennie od 1. do 10. dnia po urodzeniu, pozostawiając niezakłócone szczęta kontrolne w stanie braku stresu. Poza wspomnianą trójgodzinną separacją, wszystkie mioty pozostają z matkami aż do odsadzenia w 21. dniu po urodzeniu. Następnie myszy są kwaterowane w grupach o tej samej płci, po trzy do pięciu osobników na klatkę, w standardowych warunkach chowu. Aby rozpocząć pobieranie tkanki mózgowej, mózgi myszy są usuwane z czaszek, a następnie bezzwłocznie zamrażane w suchym lodzie i przechowywane w temperaturze -80 °C.Po przygotowaniu do pobrania wycinków tkankowych, należy wyjąć mózgi z zamrażarki -80 °C i umieścić je na suchym lodzie. Należy rozpocząć od kriosekcjonowania mózgów w celu uzyskania koronarnych przekrojów o grubości 10 µm, kierując się od strony rostralnej do caudalnej. Przekroje należy zamontować na szkiełkach SuperFrost i wysuszyć przed barwieniem krystalowym fioletem.Dodatkowe preparaty mogą zostać wykonane i przechowywane w temperaturze -20 °C do dalszych analiz, takich jak hybrydyzacja in situ. Przed przystąpieniem do wycinania próbek, należy zabarwić preparaty fioletem krystalicznym, aby zidentyfikować interesujące struktury mózgu. Następnie, używając igły do wycinania, należy pobrać wycinki o średnicy 0,8 mm z obszarów zainteresowania, stosując mikrodysekcję in loco.Wycięcia tkankowe należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Kluczowe jest, aby mikropunching był wykonywany w sposób ustandaryzowany, ponieważ ekspresja genów i metylacja są silnie specyficzne dla danej tkanki. Homogenizować wycięcia w 400 µL buforu z tiocyjanianem guanidyny za pomocą pipety, a następnie wymieszać w wirówce typu vortex w temperaturze pokojowej.Następnie przepuść otrzymany lizat przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 29 G. Czynność tę powtórz kilka razy, aż do momentu, gdy fragmenty tkanki przestaną być widoczne. Podziel lizat na równe części.Jedną próbkę należy przeznaczyć do izolacji RNA, co powinno zostać wykonane w pierwszej kolejności, a drugą do izolacji DNA, którą można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu przetworzenia RNA. Oczyszczanie RNA przeprowadza się przy użyciu 1/10 objętości octanu sodu, jednej objętości aqua-fenolu oraz połowy objętości chloroformu z izoamylololem (24:1). Po każdym dodaniu odczynnika mieszaninę należy energicznie wymieszać w wiruwarce, a końcowy roztwór inkubować na lodzie przez 10 minut. Następnie mieszaninę należy odwirować.Zebrać fazę wodną i dodać do niej równą objętość 70% etanolu. Używając zestawu do oczyszczania RNA na kolumnach spinowych, przeprowadzić trawienie DNA na kolumnie, a następnie przemyć i eluować RNA do 25 µL wody.Następnie należy oczyścić DNA, korzystając z protokołu zestawu zmodyfikowanego o dodatek trawienia RNazy oraz podgrzanie buforu do elucji i kolumny do elucji do 70 °C przed ich użyciem. W przypadku kolumn wystarczy 10 minut w 70 °C. Na koniec należy użyć spektrofotometru w celu oznaczenia stężeń DNA i RNA.Typowy wycinek z PVN dostarcza około 600 ng DNA oraz około 400 ng RNA, z czego około 100 ng RNA odkłada się do analizy ekspresji genów metodą ilościowego PCR przed amplifikacją po konwersji siarczynowej. 200 ng wyizolowanego DNA należy poddać obróbce przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu w celu amplifikacji DNA z regionów zmetylowanych. Należy zamówić primery zaprojektowane specjalnie dla DNA konwertowanego siarczynem. Optymalny dobór primerów w bisulfitowym PCR jest kluczowy, ponieważ jakość i specyficzność amplikonu PCR determinują sukces kolejnych etapów.Po otrzymaniu starterów należy wyznaczyć ich optymalną temperaturę przyłączania za pomocą eksperymentów pilotażowych. Jako matrycę dla każdej 25 µL mieszaniny do PCR należy wykorzystać 2 µL DNA poddanego działaniu pirosiarczynu sodu.Przeprowadzić amplifikację mieszaniny, rozpoczynając od sześciominutowej denaturacji w 95 °C, a następnie wykonując od 45 do 50 cykli amplifikacji, kończąc proces pięciominutową elongacją w 72 °C. Przeanalizować 7 µL produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w celu weryfikacji wielkości amplikonu. Pozostały produkt PCR oczyścić do późniejszej ligacji, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania produktów PCR.W przypadku uzyskania niepożądanych produktów PCR, należy zastosować oczyszczanie żelowe w celu wyizolowania produktu wymaganego do niniejszego protokołu. Wykorzystuje się komercyjny zestaw do klonowania. Wydajność klonowania zależy w znacznym stopniu od wstawki.W przypadku powtarzającego się uzyskiwania niskiej liczby klonów rekombinowanych należy wypróbować inny wektor klonujący. Należy przygotować reakcję ligacji o objętości 10 µL, zawierającą 1 µL wektora i 3 µL oczyszczonego produktu PCR. Reakcję należy wymieszać poprzez pipetowanie, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.Oczyść reakcję ligacji poprzez klasyczne wytrącanie etanolem, a następnie przeprowadź transformację bakterii otrzymanym produktem. Bezpośrednio po impulsie elektrycznym dodaj jeden mililitr podgrzanego wcześniej medium SOB i przenieś transformowane bakterie do probówki reakcyjnej. Po regeneracji bakterii przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, wysej 100 µL każdej zawiesiny na płytkę z agarem LB z ampicyliną i IPTG.Inkubuj płytki przez noc, aż pojawią się kolonie możliwe do nabrania. Przygotuj reakcje kolonialnego PCR w objętości 25 µL na płytce 96-dołkowej, dodając 3 µL 2,5 mM chlorku magnezu do każdej reakcji. Wyselekcjonuj pozytywne białe klony za pomocą końcówki pipety i przenieś je do mieszaniny PCR poprzez krótkie zanurzenie.Reakcję PCR rozpocząć od czterominutowego cyklu denaturacji. Następnie przeprowadzić 10 cykli amplifikacji z temperaturą przyłączania 56 °C. Każdy etap tych cykli trwa 30 sekund.Następnie obniż temperaturę annealingu do 48 °C na kolejne 30 cykli amplifikacji. Zakończ proces pięciominutowym cyklem elongacji. Teraz nanieś 5 µL każdego produktu na żel agarozowy i zidentyfikuj reakcje zawierające insert o odpowiedniej wielkości.Należy użyć dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania wybranych produktów PCR w celu ich późniejszego sekwencjonowania metodą cyklicznego sekwencjonowania z użyciem terminatorów BigDye. W płytce 96-dołkowej należy do każdego dołka nanieść 3 µL gotowej mieszaniny reakcyjnej BigDye, a następnie 2 µL oczyszczonego produktu PCR z kolonii. Reakcję należy przeprowadzić w termocyklerze, rozpoczynając od 1 minuty w 96 °C, a następnie przez 35 cykli: 10 sekund w 96 °C, 5 sekund w 50 °C oraz 4 minuty w 60 °C.Po zakończeniu reakcji bisulfitowej, należy oczyścić produkt reakcji, wykorzystując płytkę do oczyszczania po bisulfitowaniu. Po uzyskaniu sekwencji, należy przeanalizować je za pomocą internetowego analizatora bisulfitowego lub narzędzia B-I-S-M-A, aby określić wzór metylacji badanego regionu DNA i uzyskać wgląd w wpływ stresu we wczesnym życiu (ELS) na ekspresję i status metylacji aVP. Myszy szczepu C 57 black sticks były przetwarzane zgodnie z opisanym protokołem; wycinano jądra przykomorowe i nadwzrokowe w celu izolacji DNA i RNA, a następnie DNA poddawano traktowaniu bisulfitem i amplifikacji za pomocą starterów specyficznych dla enhancera aVP; produkty PCR klonowano i sekwencjonowano, analizując co najmniej 20 klonów rekombinowanych od każdej myszy.Produkty PCR przeanalizowano w celu określenia częstotliwości metylacji wysp CpG zawartych w amplikonie PCR w tkance z P-V-N-E-L-S, co doprowadziło do znaczącej hipometylacji w czterech miejscach w enhancerze A VP, sugerując epigenetyczne znakowanie tego regionu regulacyjnego poprzez doświadczenia z wczesnego etapu życia. W przeciwieństwie do PVN, metylacja enhanceera A VP w SON nie uległa zmianie pod wpływem ELS, co ilustruje tkankową specyficzność efektu epigenetycznego. U zwierząt kontrolnych status metylacji DNA w pozycji CpG 10 korelował negatywnie z ekspresją genu a VP, wskazując na rolę metylacji DNA w precyzyjnym dostrajaniu ekspresji genu a VP. Po wykonaniu tej procedury można łatwo zastosować inne metody, takie jak UPCR, na wyizolowanym RNA w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące zmian w ekspresji genów w analizowanej tkance.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak badać zmiany metylacji DNA w odpowiedzi na bodźce środowiskowe lub zależne od doświadczeń.

optimized-analysis-dna-methylation-gene-expression-from-small

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Do niedawna badania nad ekspresją w ludzkim mózgu ograniczały się do ilościowego oznaczania RNA lub białek. Dzięki technikom immunoprecypitacji chromatyny opisanym w niniejszej pracy, możliwe będzie mapowanie metylacji histonów oraz innych epigenetycznych regulatorów ekspresji genów w materiale mózgu pobranym po śmierci.

Analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

Ten manuskrypt opisuje protokół, który stosuje kompleksowe profilowanie do analizy programów transkrypcyjnych indukowanych w określonych jądrach mózgowych gryzoni zgodnie z paradygmatami behawioralnymi. W niniejszym artykule podejście to zostało zilustrowane w kontekście profilowania genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę, z wykorzystaniem mikroprzepływowych macierzy qPCR.

Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Tutaj opisujemy procedurę analizy całego genomu metylacji DNA w nowotworach przewodu pokarmowego. Procedura ta ma znaczenie dla badań, które badają związki między wzorcami metylacji genów a czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy w nowotworach przewodu pokarmowego.

Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Niniejsze badanie opisuje proces zarządzania danymi metylacji DNA uzyskanymi za pomocą technologii mikromacierzy. Protokół przedstawia kroki od przygotowania próbki do analizy danych. Wszystkie procedury są szczegółowo opisane, a film pokazuje istotne kroki.

Przygotowanie próbki do bioinformatycznej analizy metylacji DNA: strategia asocjacyjna dla otyłości i powiązane badania cech

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj zoptymalizowaną metodę analizy metylacji DNA i ekspresji genów z małych obszarów mózgu myszy. Protokół obejmuje separację macierzyńską, mikrodissekcję tkanek oraz izolację DNA i RNA z pojedynczego wycinka.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Przeglądaj więcej filmów