Name: Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj metodę ERRBS do analizy metylacji DNA w rozdzielczości par zasad przy użyciu trawienia enzymatycznego i konwersji bisulfitem. Technika ta umożliwia badanie wzorców metylacji cytydyny w regionach bogatych w GC z minimalną ilością materiału wyjściowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim autorom oryginalnego raportu ERRBS. Dziękujemy Mame Fall za pomoc techniczną. Dziękujemy Weill Cornell Medical College Epigenomics Core za usługi techniczne i pomoc. Prace były wspierane przez Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, NCI K08CA169055 i ASH-AMFDP12005 dla FGB, NIH R01HG006798 i R01NS076465, finansowanie z Irma T. Hirschl i Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) dla CEM oraz grant LLS SCORE (7006-13) dla AMM.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony protokół dostarcza danych o rozdzielczości par zasad metylacji cytozyny w biologicznie istotnych regionach genomu. Protokół w takiej formie, w jakiej został napisany, jest zoptymalizowany pod kątem 50 ng materiału wyjściowego, jednak można go dostosować do obsługi różnych materiałów wejściowych (5 ng lub więcej)26. Będzie to wymagało dostosowania niektórych etapów protokołu, jak pokazano w tabeli 6. Biblioteki ERRBS są podatne na sekwencjonowanie sparowanych końców, a dalsze pokrycie genomu można również osiągnąć poprzez sekwencjonowanie odczytów dłuższych niż 51 cykli. Sekwencjonowanie multipleksowe zapewni niższy koszt protokołu na próbkę, jednak spowoduje to zmniejszenie pokrycia na miejsce CpG reprezentowane w danych (Rysunek 5 i Tabela 8) i nie zapewni wystarczającej głębokości pokrycia do przeprowadzenia analiz, które wymagają wysokiego pokrycia na miejsce CpG (np. zgodnie z opisem Landana i wsp.33). Wreszcie, ten protokół (lub jakikolwiek protokół oparty na wodorosiarczynach) nie może rozróżnić między metylo-cytozyną a hydroksymetylo-cytozyną46,47. Jednak wygenerowane dane można zintegrować z innymi wynikami protokołu48,49 w celu nakreślenia różnych modyfikacji i innych modyfikacji cytozyny zgłoszonych ostatnio50, jeśli są one interesujące.
Biblioteki wysokiej jakości pojawią się, jak pokazano na rysunku 3A-C, a po połączeniu w celu sekwencjonowania uzyskają ślad, jak pokazano na rysunku 3G (czerwony ślad) reprezentujący równy wkład molowy z obu frakcji bibliotecznych. Niepowodzenie przygotowania biblioteki może wynikać z dowolnego kroku podczas procedury. Jeśli zdegradowane DNA zostanie przetworzone, spowoduje to powstanie bibliotek, które nie są wzbogacone we fragmenty MspI, a tym samym niskie pokrycie CpG przy użyciu parametrów sekwencjonowania opisanych w tym protokole. Jeśli enzym jest niefunkcjonalny lub przypadkowo wykluczony z jednej z reakcji, protokół nie zapewni oczekiwanej biblioteki. Jeśli reakcja ligacji jest nieefektywna, adaptery mają wyższe stężenie niż oczekiwano i/lub stężenie użytych starterów jest odczynnikiem ograniczającym dla końcowych etapów amplifikacji, może wystąpić awaria biblioteki. Nadmiar adapterów (widziany jako szczyty przy ~150 pz w wynikach bioanalizatora; Rysunek 3D-F) w bibliotece będzie również zakłócać sekwencjonowanie ze względu na bezkrytyczne grupowanie zarówno biblioteki, jak i nadmiaru adapterów. Podczas gdy taka biblioteka może sekwencjonować pozornie normalnie, znaczna część odczytów będzie tylko sekwencjami adaptera. Jeśli w bibliotece zaobserwowano nadmiar adapterów, najlepiej jest powtórzyć przygotowanie biblioteki, jeśli materiał jest dostępny przy użyciu optymalnych proporcji materiału wejściowego do ilości adaptera. Wreszcie, aby zapewnić wydajną amplifikację bibliotek metodą PCR, dolna i wyższa frakcja biblioteki są utrzymywane jako oddzielne próbki na wszystkich etapach konwersji wodorosiarczynu i wzbogacania PCR. Niezastosowanie się do tego powoduje różnicową wydajność amplifikacji podczas reakcji PCR wyższych i niższych frakcji (jak widać na niebieskim śladzie na rysunku 3G ) oraz możliwość nierównej reprezentacji odpowiednich loci genomowych pokrytych w każdej frakcji biblioteki podczas sekwencjonowania. Użytkownik może zdecydować się na włączenie ilościowego etapu PCR bezpośrednio po konwersji wodorosiarczynu w celu dalszego miareczkowania optymalnych cykli PCR potrzebnych do amplifikacji generowanych bibliotek.
Protokół przygotowania biblioteki ERRBS składa się z kilku kluczowych kroków, w których zalecane są konkretne odczynniki. Na etapie naprawy końcowej zastosowanie czteronukleotydowej mieszaniny dNTP pozwala na naprawę końcową wszelkich produktów niezawierających zwisu CG, takich jak te wynikające z enzymatycznej aktywności gwiazdy MspI i ściętych fragmentów DNA obecnych w oryginalnej próbce DNA. Skutkuje to lepszą reprezentacją CpG w wynikach. Na etapie ligacji bardzo ważne jest użycie ligazy o wysokim stężeniu (2 000 000 jednostek/ml) i metylowanych adapterów, aby zapewnić wydajność reakcji ligacji i że konwersja wodorosiarczynu nie wpływa na sekwencje adapterów niezbędne do dokładnego wyrównania danych. Na etapie PCR konieczne jest użycie polimerazy zdolnej do amplifikacji fragmentów DNA bogatych w GC poddanych działaniu wodorosiarczynu w celu uzyskania wysokiej swoistości. Wreszcie, aby zapewnić eliminację nadmiaru adapterów i starterów, zaleca się oczyszczanie kulek SPRI (na przykład: Agencourt AMPure XP) zamiast testów kolumnowych do ligacji i izolacji produktów PCR.
W celu wygenerowania wysokiej jakości danych ważne jest zapewnienie wydajnej konwersji wodorosiarczynu. Prezentowany element sterujący daje użytkownikowi możliwość określenia wydajności konwersji przed sekwencjonowaniem. Alternatywnie, DNA inne niż ludzkie, takie jak DNA lambda, może być użyte jako kontrola wewnętrzna (spike-in). Ze względu na różnice gatunkowe ten rodzaj kontroli może być bezpośrednio włączony do sekwencjonowania na dalszych etapach (np. jak to zostało zastosowane przez Yu i wsp.34). Jednakże, jeśli wykorzystany jest skok, nie można go użyć do określenia wydajności konwersji przed sekwencjonowaniem biblioteki, chyba że zostanie jednoznacznie wzmocniony i niezależnie zsekwencjonowany przed sekwencjonowaniem biblioteki. Określone współczynniki konwersji są oparte na stanie metylacji w miejscach innych niż CpG. Może to nie być odpowiednie do stosowania w kontekście wysokiej metylacji cytozyny w kontekście innym niż CpG (na przykład embrionalne komórki macierzyste) i w tym celu można wykorzystać próbki równoległe lub inne sposoby oceny wydajności konwersji.
Istnieje kilka zastrzeżeń, które należy rozwiązać, a które są unikatowe dla sekwencjonowania bibliotek ERRBS. Pierwsze trzy zasady sekwencjonowanych frakcji bibliotecznych są prawie jednolicie nielosowe ze względu na miejsce cięcia rozpoznawania MspI (C^CGG; patrz rysunek 4B, C). Powoduje to możliwość znacznej utraty danych z powodu niskiej jakości odczytów wynikającej ze złej lokalizacji klastrów pomimo pozornej dużej gęstości klastrów podczas sekwencjonowania. Aby pokonać tę barierę, należy dołączyć bibliotekę o wysokim stopniu złożoności do niezależnego toru (kontrolka PhiX lub inny typ biblioteki) jako dedykowany pas sterowania. Biblioteki o wysokiej złożoności mają końce zawierające zrównoważoną reprezentację A, C, T i G w pierwszych czterech sekwencjonowanych zasadach. Odpowiednie tory kontrolne obejmują biblioteki, takie jak sekwencjonowanie RNA, sekwencjonowanie ChIP, sekwencjonowanie całego genomu lub kontrolę oferowaną przez producenta maszyny do sekwencjonowania (np. PhiX Control v3). Po wyznaczeniu jako pas kontrolny dla odpowiedniego przebiegu sekwencjonowania, może służyć jako podstawa do generowania matrycy, która jest wykorzystywana podczas pierwszych czterech baz sekwencjonowania do wykrywania pozycji klastrów. Wyższa jakość przechwyconych odczytów podniesie średni zasięg na witrynę CpG o 5,2 (n = 4). Alternatywnie, tę trudność techniczną można również przezwyciężyć za pomocą podejścia opartego na ciemnym sekwencjonowaniu, jak opisano wcześniej23. Inne kryteria sekwencjonowania są zgodne ze standardowymi procedurami operacyjnymi zgodnie z protokołami producenta. Wreszcie, zakres na CpG wybrany do analizy danych będzie kierowany przez użytkownika i częściowo przez interesujące go pytania biologiczne. 10-krotny próg pokrycia zapewnia podejście do analizy wysokiego pokrycia, jednak próg ten może zostać obniżony, jeśli jest to interesujące.
Pełne omówienie analizy danych ERRBS wykracza poza zakres tego artykułu, jednak różnicowo metylowane cytozyny i regiony można określić za pomocą narzędzi open source 31,51-53. Dodatkowe zagadnienia i podejścia analityczne zostały dobrze opisane54,55 i zachęca się czytelnika do przeszukania literatury w poszukiwaniu narzędzi najbardziej odpowiednich dla planowanej analizy.
W porównaniu z innymi opublikowanymi metodami, ERRBS oferuje czterodniowy protokół, który, gdy jest wykonywany zgodnie z opisem, zapewnia wysokie wskaźniki odtwarzalności. Został on zwalidowany w porównaniu ze złotym standardem MassARRAY EpiTYPER26, jest opłacalny w przypadku danych o dużym pokryciu i można go dostosować do różnych ilości materiału wejściowego (korzystne dla przetwarzania próbek klinicznych i innych typów komórek o niskiej częstotliwości) oraz podejść do sekwencjonowania. Oferuje rozdzielczość par zasad w biologicznie istotnych loci i może być stosowany w analizach integracyjnych z innymi technikami profilowania wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie, przebudowy chromatyny, znaczników epigenetycznych i innych modyfikacji cytozyny. Wykorzystanie danych ERRBS w takich badaniach może przyczynić się do kompleksowego podejścia molekularnego i umożliwić wielowymiarowe analizy w badaniu modeli biologicznych i chorób ludzkich.

Metylacja DNA w cytozynie (5-metylocytozyna) jest cechą epigenetyczną krytyczną w komórkach ssaków dla różnych procesów biologicznych, w tym, ale nie ograniczając się do imprintingu, inaktywacji chromosomu X, rozwoju i regulacji ekspresji genów1-8. Badanie wzorców metylacji DNA w chorobach nowotworowych i innych zaburzeniach określiło wzorce specyficzne dla choroby i przyczyniło się do zrozumienia patogenezy choroby i potencjalnych odkryć biomarkerów9-17. Istnieje wiele protokołów, które badają epigenom pod kątem statusu metylacji DNA. Można je podzielić na testy oparte na powinowactwie, enzymach restrykcyjnych i konwersji wodorosiarczynów, które wykorzystują mikromacierze lub platformy sekwencjonowania poniżej. Ponadto istnieje kilka protokołów, które łączą te ogólne kategorie, w tym między innymi Połączona Analiza Ograniczeń Wodorosiarczynu18 i Sekwencjonowanie Wodorosiarczynu o Zmniejszonej Reprezentacji (RRBS19).
RRBS został pierwotnie opisany przez Meissnera i wsp.19,20. W protokole wprowadzono etap mający na celu wzbogacenie regionów genomowych bogatych w GC, a następnie sekwencjonowanie wodorosiarczynów, co zaowocowało ilościowymi danymi o rozdzielczości par zasad, które są opłacalne21,22. Regiony bogate w GC są ukierunkowane na enzym restrykcyjny MspI (C^CGG), a metylacja cytozyny jest rozwiązywana przez konwersję cytozyn wodorosiarczynową (deaminacja niezmodyfikowanych cytozyn do uracylu), a następnie amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). RRBS objął większość promotorów genów i wysp CpG w ułamku sekwencjonowania wymaganego dla całego genomu; jednak RRBS miał ograniczony zasięg na wybrzeżach CpG i innych regionach międzygenowych o znaczeniu biologicznym. Kilka grup opublikowało zaktualizowane protokoły RRBS od czasu pierwotnego raportu, które ulepszają metodologię i wynikowe pokrycie tych regionów genomu23-25. Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynowe o zmniejszonej reprezentacji (ERRBS) obejmuje modyfikacje przygotowania biblioteki i alternatywne podejście do wyrównania danych26 w porównaniu z RRBS. ERRBS zaowocował większą liczbą CpG reprezentowanych w wygenerowanych danych i zwiększonym pokryciem wszystkich badanych regionów genomu26. Metoda ta została wykorzystana do wyjaśnienia wzorców metylacji DNA u ludzi, pacjentów i innych próbek zwierzęcych26-30.
Opisany protokół ERRBS oferuje szczegółowe informacje na temat wszystkich kroków potrzebnych do ukończenia, a dane zostały wygenerowane przy użyciu reprezentatywnego ludzkiego DNA (próbki zostały uzyskane z wcześniej zgłoszonych, zanonimizowanych próbek pacjentów31, oraz próbki szpiku kostnego CD34+ od normalnego ludzkiego dawcy). Protokół obejmuje zautomatyzowany proces wyboru rozmiaru, który skraca czas przetwarzania na próbkę i pozwala na zwiększenie dokładności w doborze rozmiaru biblioteki. Protokół łączy w sobie szereg uznanych technik biologii molekularnej. DNA o dużej masie cząsteczkowej jest trawione za pomocą niewrażliwego na metylację enzymu restrykcyjnego (MspI), a następnie następuje naprawa końców, ogon A i ligacja metylowanych adapterów. Po wyborze wielkości fragmentów bogatych w GC następuje konwersja wodorosiarczynu i amplifikacja PCR przed sekwencjonowaniem. Konwersja wodorosiarczynu została już wcześniej opisana32, a szczegółowy przegląd analizy danych i zastosowań wykracza poza zakres tego artykułu, jednak zawarto zalecenia i odniesienia do użytku czytelników. Protokół może być wykonywany przez cztery dni i jest podatny na niewielkie ilości materiału wejściowego (50 ng lub mniej). Opisany protokół dostarcza danych o wysokim pokryciu na miejsce CpG, wystarczających nie tylko do różnicowego oznaczania miejsca metylacji i regionu, ale także do wykrywania polimorfizmu epigenetycznego, jak opisano przez Landana i wsp.Lokal mieszkalny 33.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Bufor reakcyjny dla enzymu MspI; Krok protokołu 1.2</td></tr><tr><td>Roztwór fenolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Zrównoważony z 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0; patrz instrukcje dotyczące bezpieczeństwa i obsługi pod adresem http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Zobacz instrukcje dotyczące bezpieczeństwa i obsługi pod adresem http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5,2</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Bufor EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5</td></tr><tr><td>tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>przygotować 1 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>roztwór Tris-etylenodiaminotetraoctowy (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Rozcieńczyć do 1x roztworu buforowego zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny ligazy DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10-krotne stężenie</td></tr><tr><td>Trifosforan deoksynukleotydu (dNTP) Mieszanina roztworu</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM każdy nukleotyd</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3,000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I, duży (Klenow) Fragment</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5,000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 New</td><td>England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10 000 jednostek / ml</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Używany do oczyszczania produktu DNA w kroku protokołu 2.3</td></tr><tr><td>2'-deoksyadenozyno5'-trifosforan (dATP)</td> <td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3'&rzadko; 5' egzo-)</td> <td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5,000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Używany do oczyszczania produktu DNA w kroku protokołu 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza New</td><td>England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2,000,000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Adapter metylacji Zestaw Oligo Illumina</td><td></td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Używany w sekcjach protokołu, które implementują etapy oczyszczania kulek magnetycznych (kroki 4.3 i 8.2). Przed użyciem wyrównać do temperatury pokojowej.</td></tr><tr><td>Kasety żelowe Pippin Prep, 2% agarozy, bez barwników</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>z wewnętrznymi standardami</td></tr><tr><td>Certyfikowany niskozakresowy bufor Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA (TBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 pz Drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 pz Drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N3231S Żel ładujący barwnik,</td><td></td></tr><tr><td>pomarańczowy (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td> Skalpel&<td></td></tr><tr><td>nbsp; Nóż&nbsp; Nie.&nbsp; 11</td><td>Zestaw</td> do ekstrakcji żelu Fisher Scientific <td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do metylacji DNA EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Używany w kroku protokołu 6.2</td></tr><tr><td>Zestaw do metylacji i błyskawicy EZ DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternatywa dla kroku 6.2</td></tr><tr><td>Uniwersalny standard metylowanego ludzkiego DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Używany jako kontrola konwersji wodorosiarczynu</td></tr><tr><td>System FastStart High Fidelity PCR</td><td>Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów wysokiej czułości dsDNA</td><td>Technologie życia</td><td>Q32854</td><td>Test ilościowy DNA oparty na fluorescencji; używany w krokach protokołu 1.1, 9.1 i 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometr</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw klastrów TruSeq SR v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Przygotowanie próbek</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Adaptery z kodami kreskowymi używane do multipleksowania bibliotek; Zobacz Plik uzupełniający dla protokołu multipleksowania.</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik</td><td></td><td></td><td></td>wirowy</tr><tr><td>Grzałka</td><td></td><td></td><td></td>suchego bloku</tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>Żel system</td><td></td><td></td><td></td>elektroforezy</tr><tr>Zasilacz <td></td><td></td><td></td>do<td>elektroforezy</td></tr><tr><td>Żel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Nadajnik <td></td><td></td><td></td><td>UV lub światła niebieskiego</td></tr></tbody></table>

ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji dna w rozdzielczości par zasad

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Mapowanie wzorca metylacji DNA jest intensywnie badane w normalnych i chorych tkankach. Opracowano różne metody badania wzorców metylacji cytozyny w komórkach. Opracowano zmniejszoną reprezentację sekwencjonowania wodorosiarczynów całego genomu w celu wykrycia wzorców metylacji cytozyny o rozdzielczości par zasad w loci genomu bogatych w GC. Osiąga się to poprzez połączenie użycia enzymu restrykcyjnego, po którym następuje konwersja wodorosiarczynu. Sekwencjonowanie wodorosiarczynowe o zwiększonej reprezentacji (ERRBS) zwiększa pokrycie biologicznie istotnych loci genomowych i zostało wykorzystane do profilowania metylacji cytozyny w DNA organizmów ludzkich, mysich i innych. ERRBS rozpoczyna trawienie DNA przez enzym restrykcyjny w celu wygenerowania fragmentów o niskiej masie cząsteczkowej do wykorzystania w przygotowaniu biblioteki. Fragmenty te są poddawane standardowej konstrukcji biblioteki w celu sekwencjonowania nowej generacji. Konwersja wodorosiarczynów niemetylowanych cytozyn przed końcowym etapem amplifikacji pozwala na ilościową rozdzielczość bazową poziomów metylacji cytozyny w pokrytych loci genomu. Protokół może zostać wypełniony w ciągu czterech dni. Pomimo niskiej złożoności pierwszych trzech sekwencjonowanych baz, biblioteki ERRBS dostarczają danych wysokiej jakości przy użyciu wyznaczonego toru kontrolnego sekwencjonowania. Następnie przeprowadzane jest mapowanie i analiza bioinformatyczna, które uzyskują dane, które można łatwo zintegrować z różnymi platformami obejmującymi cały genom. ERRBS może wykorzystywać niewielkie ilości materiału wejściowego, co umożliwia przetwarzanie próbek klinicznych u ludzi i ma zastosowanie w wielu zastosowaniach badawczych. Wytworzony film demonstruje krytyczne kroki protokołu ERRBS.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie bibliotek sekwencjonowania dla rozdzielczości par zasad D-N-A-C-P-G, analiza metylacji oparta na trawieniu enzymem restrykcyjnym w połączeniu z cytozyną przez konwersję siarczynów. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie najpierw trawienia przez MSP jednego enzymu restrykcyjnego wysokiej jakości DNA, a następnie naprawę końca, ogonowanie i ligację metylowanych adapterów. Kolejnym krokiem jest wykonanie konwersji siarczynów na wielkości wybranych fragmentów po konwersji siarczynów.Fragmenty są amplifikowane za pomocą PCR. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie kontroli jakości i sekwencjonowania, a następnie wizualizacja i analiza danych. Ostatecznie, zwiększona zmniejszona reprezentacja sekwencjonowania bisiarczynów wykrywa ilościową rozdzielczość par zasad wzorców metylacji cytydyny w loci genomu bogatych w CG.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami metylacji DNA, takimi jak mikromacierze, jest to, że może wykorzystywać małe ilości materiału wejściowego do generowania danych metylacji D-N-A-C-P-G o wysokim pokryciu w rozdzielczości par zasad i biologicznie istotnych miejscach. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy byliśmy zainteresowani badaniem wzorców epigenetycznych poza regionami objętymi tradycyjnymi testami. Byliśmy zainteresowani opracowaniem tej techniki w celu przejścia od mikromacierzy do generowania danych o rozdzielczości metylacji DNA o rozdzielczości par zasad, które można zintegrować z danymi generowanymi za pomocą innych technik nowej generacji.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu epigenetyki. Na przykład wzorce epigenetyczne i heterogeniczność w próbkach biologicznych w porównaniu z normalną grupą kontrolną lub innymi stanami chorobowymi. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności ze względu na długość procedury, liczne specyficzne wymagania i unikalne cechy sekwencjonowania bibliotek generowanych przez Mamie.Specjalista ds. badań w naszym laboratorium będzie pomagał w demonstrowaniu procedury, aby rozpocząć ten protokół. Najpierw przygotuj oczyszczone porcje próbek genomowego DNA, które zostały poddane trawieniu enzymu restrykcyjnego MSP przez jeden enzym restrykcyjny, reakcji naprawy końców i pojedynczej addycji nukleotydu na trzech pierwszych końcach. W tym momencie produkty DNA będą gotowe do ligacji adaptera, aby rozpocząć przenoszenie 10 mikrolitrów próbki A-A-L-D-N-A do 0,2 mililitrowej probówki do PCR i umieszczenie probówki na lodzie.Ponadto umieść porcję cząsteczek adaptera na lodzie. Następnie przygotuj mieszankę odczynników do podwiązywania na lodzie. Dodaj zarówno odczynnik do ligacji, jak i cząsteczki adaptera do próbki DNA i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.Umieść probówkę PCR w termocyklerze i pozwól, aby reakcja ligacji przebiegała przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza następnego dnia. Oczyść produkty ligacji za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA do fazy stałej na bazie kulki magnetycznej lub kolumny krzemionkowej. Na ostatnim etapie procesu oczyszczania.Eluuj DNA, dodając 30 mikrolitrów wolnej wody DNA. Oczyszczony produkt DNA może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny do próbek, które zaczynały się od całkowitego DNA 25 nanogramów lub większego. Użyj zautomatyzowanego aparatu do ekstrakcji żelu, takiego jak PI i preparat, aby wybrać produkty podwiązane o długości od 150 par zasad do 400 par zasad.Pamiętaj, aby wykluczyć barwniki do wizualizacji DNA, takie jak bromek Ethereum lub cyber green z kasety agros, ponieważ mogą one zmienić właściwości migracji DNA fragmentów związanych z rozwidlonym adapterem. Standardowe protokoły wyboru rozmiaru na bazie żelu agros mogą być również wykorzystane na tym etapie protokołu, aby ustawić elektroforezę DNA na kasecie aros bez barwnika pippina 2%. Utwórz nowy protokół w konsoli Pippin Prep i wybierz opcję 2%DF marker L jako kasetę do wyboru.Następnie włącz opcję użyj wzorców wewnętrznych i sprawdź, czy numer pasa odniesienia jest zgodny z numerami pasów do izolowania fragmentów DNA w zakresie od 150 par zasad i 400 par zasad. Wybierz opcję zakresu jako tryb zbierania i wprowadź następujące parametry graniczne: 135 dla początku pary podstawowej, 410 dla końca pary zasad i 240 dla łap pary podstaw. To instruuje urządzenie, aby wyrównało pole elektroforetyczne z portem wyjściowym elektroelucji.Gdy fragmenty DNA w tym zakresie przemieszczają się w pobliżu ujścia. Po zapisaniu pliku protokołu przygotuj kasetę z żelem i studzienki do ładowania próbki urządzenia, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi Pippen Prep podczas konfiguracji urządzenia. Przygotować próbki DNA do elektroforezy, dodając 10 mikrolitrów markera DNA do 30 mikrolitrowej porcji danej próbki po podwiązaniu w celu załadowania mieszanin do kasety żelowej.Najpierw usuń 40 mikrolitrów buforu do elektroforezy z każdej próbki. Studzienkę należy następnie uzupełnić objętość, pipetując każdą mieszaninę markerów próbek o objętości 40 mikrolitrów do poszczególnych studzienek. Wracając do konsoli, załaduj zapisany protokół i naciśnij start, aby rozpocząć elektroforezę.Gdy program osiągnie parę zasad 240, ręcznie wykonaj krok pauzy i zbierz 40 mikrolitrów ouit z każdego portu wyjściowego za pomocą pipety. Oznacz te ułamki jako dolną frakcję biblioteki. Po zebraniu dolnych frakcji bibliotecznych należy natychmiast umyć porty wylotowe, dodając 40 mikrolitrów świeżego buforu do elektroforezy.Pipetowanie bufora w górę i w dół co najmniej trzy razy, a następnie zasysanie sieci. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy, aby usunąć wszystkie ślady krótkich gatunków DNA z wylotów. Teraz dodaj 40 mikrolitrów buforu do elektroforezy do próbki.Dobrze uszczelnij porty wyjaśnione i naciśnij przycisk uruchamiania, aby wznowić proces wyjaśniania. Po zakończeniu programu Ellucian przy ustawieniu pary zasad 410, zbierz 40 mikrolitrów Inuitów ze wszystkich portów wylotowych i oznacz te frakcje jako frakcję górnej biblioteki. W tym momencie obie frakcje biblioteczne są oczyszczone w żelu i już do konwersji dwusiarczynowej.Korzystając z dostępnego na rynku zestawu, wykonaj test konwersji bisiarczynów na obu frakcjach bibliotecznych. Na ostatnim etapie procesu konwersji eluuj próbki DNA w 40 mikrolitrach wolnej od DNA wody. Po konwersji bisiarczynu powstałe fragmenty biblioteki DNA zostaną poddane amplifikacji PCR wzbogacającej przy użyciu starterów, które hybrydyzują na końcach adaptera każdej cząsteczki DNA.Aby przygotować się do wzbogacania PCR, najpierw dodaj 160 mikrolitrów głównej mieszanki PCR do każdej 40 mikrolitrowej podwielokrotności podanej próbki przekształconej przez siarczek. Następnie podziel powstałą mieszaninę o objętości 200 mikrolitrów na cztery podwielokrotności o pojemności 50 mikrolitrów. W oddzielnych probówkach PCR.Umieść probówki w termocyklerze i amplifikuj przekształconą matrycę DNA. Po wzbogaceniu wyciągnij cztery produkty po PCR do jednej 1,5-mililitrowej probówki i oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia PCR. Jeśli do oczyszczania produktów PCR używany jest zestaw do ekstrakcji do fazy stałej z kulkami magnetycznymi, należy zmodyfikować standardowe procedury operacyjne, najpierw mieszając połączone produkty PCR z dolnej biblioteki z 1,7-krotnością ich całkowitej objętości w kulkach.Następnie wymieszaj połączone produkty PCR z górnej biblioteki z 1,1-krotnością ich całkowitej objętości w kulkach. Następnie postępuj zgodnie z protokołem producenta, aż do etapów mycia 70% etanolem, w których każda z objętości prania powinna zostać zmieniona na 800 mikrolitrów na ostatnim etapie procesu oczyszczania. Eluować DNA za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego wolnego od DNA.Przechowuj oczyszczone biblioteki w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza, dopóki nie będą potrzebne, używając testu opartego na fluorescencji selektywnego dla dwuniciowego DNA, aby określić ilościowo ilość zawartości DNA po wzbogaceniu dla każdej frakcji bibliotecznej. Ponadto oceń rozmiar i jakość biblioteki po wzbogaceniu za pomocą bioanalizatora. Oblicz efektywną molarność DNA określonej frakcji bibliotecznej, używając średniej długości DNA wyrażonej w parach zasad.Gdy molowość jest znana, użyj wolnej wody DNA, aby rozcieńczyć każdą odpowiadającą jej górną i dolną frakcję biblioteki do dwóch nanomolowych stężeń końcowych. Połącz dolną i górną parę biblioteki w jedną probówkę, aby stworzyć mieszaninę biblioteki z dwoma nanomolowymi otworami o pojemności 20 mikrolitrów każda. Próbka w puli jest teraz gotowa do sekwencjonowania.W testach związanych z sekwencjonowaniem, w tym E-R-R-B-S, jakość i rozkład wielkości cząsteczek z górnej i dolnej biblioteki są kluczowymi czynnikami określającymi jakość końcowych danych sekwencjonowania. W porównaniu z tradycyjnymi ręcznymi protokołami ekstrakcji żelu, zautomatyzowane urządzenie do ekstrakcji żelu stosowane w protokole E-R-R-B-S zapewni spójny rozkład wielkości i zminimalizuje ryzyko zanieczyszczenia próbki krzyżowej. Następnie, po wysłaniu cząsteczek z biblioteki konwersji siarczynów BIS do sekwencjonowania, surowe dane ze wszystkich nici DNA pokazują, że dla dowolnej nici jakość danych dla każdej pozycji nukleotydu dramatycznie wzrasta zaraz po pierwszych trzech nukleotydach.Ponieważ sekwencja konsensusu dla tych trzech nukleotydów zestawionych z CGG dla zdecydowanej większości cząsteczek bibliotecznych, dane sugerują, że protokół E-R-R-B-S wytworzył kolekcję biblioteczną, która zawiera pożądany zestaw fragmentów genomu, które są głównie flankowane. W przypadku MSP jeden z ograniczeń kończy się z punktu widzenia lotu ptaka. Protokół E-R-R-B-S może dostarczyć danych o rozdzielczości par zasad miejsc metylacji cytydyny w całym genomie.Na przykład chromosom 12 jest pokazany tutaj. Protokół obejmuje ograniczoną reprezentację CPG w całym genomie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować biblioteki E-R-R-B-S do generowania danych metylacji D-N-A-C-P-G o rozdzielczości bazowej po opanowaniu, technikę tę można wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zacząć od wysokiej jakości DNA, uwzględnić wszystkie opisane kroki, zweryfikować skuteczność konwersji i sekwencji dwusiarczanowej przy użyciu zalecanych parametrów. Nie zapominaj, że praca z fenylem i chloroformem może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować typowe środki ostrożności, takie jak praca w okapie chemicznym i odpowiednia utylizacja odpadów.Postępując zgodnie z tą procedurą. W celu walidacji wyników można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie spyro lub epitype z macierzą masową. Ponadto można przeprowadzić profilowanie ekspresji genów w celu określenia biologicznego znaczenia wykrytych wzorców metylacji DNA.Zdolność do generowania wzorców metylacji DNA o rozdzielczości par zasad z ograniczonych ilości materiałów wejściowych umożliwiła profilowanie rzadkich populacji komórek, które nigdy wcześniej nie było możliwe. Umożliwiło to również profilowanie dużych kohort próbek klinicznych w celu zbadania regulacji za pośrednictwem epigenetyki i heterogeniczności choroby.

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wzmocniona sekwencjonizacja zredukowanej reprezentacji z użyciem bisulfitu do oceny metylacji DNA na poziomie par zasad

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Ten film demonstruje procedurę modyfikacji wodorosiarczynu genomowego DNA z próbek raka przewodu pokarmowego. Technika ta jest korzystna dla badania związku między wzorcami metylacji genów i ustalania ich udziału w kancerogenezie.

Konwersja wodorosiarczynu genomowego DNA: metoda badania metylacji DNA w próbkach genomowego DNA z tkanki raka przewodu pokarmowego

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający dokładne ilościowe określenie metylacji mitochondrialnego DNA (mtDNA). W tym protokole opisujemy enzymatyczne trawienie DNA za pomocą BamHI w połączeniu z procesem analizy bioinformatycznej, który można wykorzystać do uniknięcia przeszacowania poziomów metylacji mtDNA spowodowanych drugorzędową strukturą mtDNA.

Metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego DNA

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Niniejsze badanie opisuje proces zarządzania danymi metylacji DNA uzyskanymi za pomocą technologii mikromacierzy. Protokół przedstawia kroki od przygotowania próbki do analizy danych. Wszystkie procedury są szczegółowo opisane, a film pokazuje istotne kroki.

Przygotowanie próbki do bioinformatycznej analizy metylacji DNA: strategia asocjacyjna dla otyłości i powiązane badania cech

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Poznaj metodę ERRBS do analizy metylacji DNA w rozdzielczości par zasad przy użyciu trawienia enzymatycznego i konwersji bisulfitem. Technika ta umożliwia badanie wzorców metylacji cytydyny w regionach bogatych w GC z minimalną ilością materiału wyjściowego.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Przeglądaj więcej filmów