Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie bibliotek sekwencjonowania dla rozdzielczości par zasad D-N-A-C-P-G, analiza metylacji oparta na trawieniu enzymem restrykcyjnym w połączeniu z cytozyną przez konwersję siarczynów. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie najpierw trawienia przez MSP jednego enzymu restrykcyjnego wysokiej jakości DNA, a następnie naprawę końca, ogonowanie i ligację metylowanych adapterów. Kolejnym krokiem jest wykonanie konwersji siarczynów na wielkości wybranych fragmentów po konwersji siarczynów.

Fragmenty są amplifikowane za pomocą PCR. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie kontroli jakości i sekwencjonowania, a następnie wizualizacja i analiza danych. Ostatecznie, zwiększona zmniejszona reprezentacja sekwencjonowania bisiarczynów wykrywa ilościową rozdzielczość par zasad wzorców metylacji cytydyny w loci genomu bogatych w CG.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami metylacji DNA, takimi jak mikromacierze, jest to, że może wykorzystywać małe ilości materiału wejściowego do generowania danych metylacji D-N-A-C-P-G o wysokim pokryciu w rozdzielczości par zasad i biologicznie istotnych miejscach. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy byliśmy zainteresowani badaniem wzorców epigenetycznych poza regionami objętymi tradycyjnymi testami. Byliśmy zainteresowani opracowaniem tej techniki w celu przejścia od mikromacierzy do generowania danych o rozdzielczości metylacji DNA o rozdzielczości par zasad, które można zintegrować z danymi generowanymi za pomocą innych technik nowej generacji.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu epigenetyki. Na przykład wzorce epigenetyczne i heterogeniczność w próbkach biologicznych w porównaniu z normalną grupą kontrolną lub innymi stanami chorobowymi. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności ze względu na długość procedury, liczne specyficzne wymagania i unikalne cechy sekwencjonowania bibliotek generowanych przez Mamie.

Specjalista ds. badań w naszym laboratorium będzie pomagał w demonstrowaniu procedury, aby rozpocząć ten protokół. Najpierw przygotuj oczyszczone porcje próbek genomowego DNA, które zostały poddane trawieniu enzymu restrykcyjnego MSP przez jeden enzym restrykcyjny, reakcji naprawy końców i pojedynczej addycji nukleotydu na trzech pierwszych końcach. W tym momencie produkty DNA będą gotowe do ligacji adaptera, aby rozpocząć przenoszenie 10 mikrolitrów próbki A-A-L-D-N-A do 0,2 mililitrowej probówki do PCR i umieszczenie probówki na lodzie.

Ponadto umieść porcję cząsteczek adaptera na lodzie. Następnie przygotuj mieszankę odczynników do podwiązywania na lodzie. Dodaj zarówno odczynnik do ligacji, jak i cząsteczki adaptera do próbki DNA i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.

Umieść probówkę PCR w termocyklerze i pozwól, aby reakcja ligacji przebiegała przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza następnego dnia. Oczyść produkty ligacji za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA do fazy stałej na bazie kulki magnetycznej lub kolumny krzemionkowej. Na ostatnim etapie procesu oczyszczania.

Eluuj DNA, dodając 30 mikrolitrów wolnej wody DNA. Oczyszczony produkt DNA może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny do próbek, które zaczynały się od całkowitego DNA 25 nanogramów lub większego. Użyj zautomatyzowanego aparatu do ekstrakcji żelu, takiego jak PI i preparat, aby wybrać produkty podwiązane o długości od 150 par zasad do 400 par zasad.

Pamiętaj, aby wykluczyć barwniki do wizualizacji DNA, takie jak bromek Ethereum lub cyber green z kasety agros, ponieważ mogą one zmienić właściwości migracji DNA fragmentów związanych z rozwidlonym adapterem. Standardowe protokoły wyboru rozmiaru na bazie żelu agros mogą być również wykorzystane na tym etapie protokołu, aby ustawić elektroforezę DNA na kasecie aros bez barwnika pippina 2%. Utwórz nowy protokół w konsoli Pippin Prep i wybierz opcję 2%DF marker L jako kasetę do wyboru.

Następnie włącz opcję użyj wzorców wewnętrznych i sprawdź, czy numer pasa odniesienia jest zgodny z numerami pasów do izolowania fragmentów DNA w zakresie od 150 par zasad i 400 par zasad. Wybierz opcję zakresu jako tryb zbierania i wprowadź następujące parametry graniczne: 135 dla początku pary podstawowej, 410 dla końca pary zasad i 240 dla łap pary podstaw. To instruuje urządzenie, aby wyrównało pole elektroforetyczne z portem wyjściowym elektroelucji.

Gdy fragmenty DNA w tym zakresie przemieszczają się w pobliżu ujścia. Po zapisaniu pliku protokołu przygotuj kasetę z żelem i studzienki do ładowania próbki urządzenia, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi Pippen Prep podczas konfiguracji urządzenia. Przygotować próbki DNA do elektroforezy, dodając 10 mikrolitrów markera DNA do 30 mikrolitrowej porcji danej próbki po podwiązaniu w celu załadowania mieszanin do kasety żelowej.

Najpierw usuń 40 mikrolitrów buforu do elektroforezy z każdej próbki. Studzienkę należy następnie uzupełnić objętość, pipetując każdą mieszaninę markerów próbek o objętości 40 mikrolitrów do poszczególnych studzienek. Wracając do konsoli, załaduj zapisany protokół i naciśnij start, aby rozpocząć elektroforezę.

Gdy program osiągnie parę zasad 240, ręcznie wykonaj krok pauzy i zbierz 40 mikrolitrów ouit z każdego portu wyjściowego za pomocą pipety. Oznacz te ułamki jako dolną frakcję biblioteki. Po zebraniu dolnych frakcji bibliotecznych należy natychmiast umyć porty wylotowe, dodając 40 mikrolitrów świeżego buforu do elektroforezy.

Pipetowanie bufora w górę i w dół co najmniej trzy razy, a następnie zasysanie sieci. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy, aby usunąć wszystkie ślady krótkich gatunków DNA z wylotów. Teraz dodaj 40 mikrolitrów buforu do elektroforezy do próbki.

Dobrze uszczelnij porty wyjaśnione i naciśnij przycisk uruchamiania, aby wznowić proces wyjaśniania. Po zakończeniu programu Ellucian przy ustawieniu pary zasad 410, zbierz 40 mikrolitrów Inuitów ze wszystkich portów wylotowych i oznacz te frakcje jako frakcję górnej biblioteki. W tym momencie obie frakcje biblioteczne są oczyszczone w żelu i już do konwersji dwusiarczynowej.

Korzystając z dostępnego na rynku zestawu, wykonaj test konwersji bisiarczynów na obu frakcjach bibliotecznych. Na ostatnim etapie procesu konwersji eluuj próbki DNA w 40 mikrolitrach wolnej od DNA wody. Po konwersji bisiarczynu powstałe fragmenty biblioteki DNA zostaną poddane amplifikacji PCR wzbogacającej przy użyciu starterów, które hybrydyzują na końcach adaptera każdej cząsteczki DNA.

Aby przygotować się do wzbogacania PCR, najpierw dodaj 160 mikrolitrów głównej mieszanki PCR do każdej 40 mikrolitrowej podwielokrotności podanej próbki przekształconej przez siarczek. Następnie podziel powstałą mieszaninę o objętości 200 mikrolitrów na cztery podwielokrotności o pojemności 50 mikrolitrów. W oddzielnych probówkach PCR.

Umieść probówki w termocyklerze i amplifikuj przekształconą matrycę DNA. Po wzbogaceniu wyciągnij cztery produkty po PCR do jednej 1,5-mililitrowej probówki i oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia PCR. Jeśli do oczyszczania produktów PCR używany jest zestaw do ekstrakcji do fazy stałej z kulkami magnetycznymi, należy zmodyfikować standardowe procedury operacyjne, najpierw mieszając połączone produkty PCR z dolnej biblioteki z 1,7-krotnością ich całkowitej objętości w kulkach.

Następnie wymieszaj połączone produkty PCR z górnej biblioteki z 1,1-krotnością ich całkowitej objętości w kulkach. Następnie postępuj zgodnie z protokołem producenta, aż do etapów mycia 70% etanolem, w których każda z objętości prania powinna zostać zmieniona na 800 mikrolitrów na ostatnim etapie procesu oczyszczania. Eluować DNA za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego wolnego od DNA.

Przechowuj oczyszczone biblioteki w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza, dopóki nie będą potrzebne, używając testu opartego na fluorescencji selektywnego dla dwuniciowego DNA, aby określić ilościowo ilość zawartości DNA po wzbogaceniu dla każdej frakcji bibliotecznej. Ponadto oceń rozmiar i jakość biblioteki po wzbogaceniu za pomocą bioanalizatora. Oblicz efektywną molarność DNA określonej frakcji bibliotecznej, używając średniej długości DNA wyrażonej w parach zasad.

Gdy molowość jest znana, użyj wolnej wody DNA, aby rozcieńczyć każdą odpowiadającą jej górną i dolną frakcję biblioteki do dwóch nanomolowych stężeń końcowych. Połącz dolną i górną parę biblioteki w jedną probówkę, aby stworzyć mieszaninę biblioteki z dwoma nanomolowymi otworami o pojemności 20 mikrolitrów każda. Próbka w puli jest teraz gotowa do sekwencjonowania.

W testach związanych z sekwencjonowaniem, w tym E-R-R-B-S, jakość i rozkład wielkości cząsteczek z górnej i dolnej biblioteki są kluczowymi czynnikami określającymi jakość końcowych danych sekwencjonowania. W porównaniu z tradycyjnymi ręcznymi protokołami ekstrakcji żelu, zautomatyzowane urządzenie do ekstrakcji żelu stosowane w protokole E-R-R-B-S zapewni spójny rozkład wielkości i zminimalizuje ryzyko zanieczyszczenia próbki krzyżowej. Następnie, po wysłaniu cząsteczek z biblioteki konwersji siarczynów BIS do sekwencjonowania, surowe dane ze wszystkich nici DNA pokazują, że dla dowolnej nici jakość danych dla każdej pozycji nukleotydu dramatycznie wzrasta zaraz po pierwszych trzech nukleotydach.

Ponieważ sekwencja konsensusu dla tych trzech nukleotydów zestawionych z CGG dla zdecydowanej większości cząsteczek bibliotecznych, dane sugerują, że protokół E-R-R-B-S wytworzył kolekcję biblioteczną, która zawiera pożądany zestaw fragmentów genomu, które są głównie flankowane. W przypadku MSP jeden z ograniczeń kończy się z punktu widzenia lotu ptaka. Protokół E-R-R-B-S może dostarczyć danych o rozdzielczości par zasad miejsc metylacji cytydyny w całym genomie.

Na przykład chromosom 12 jest pokazany tutaj. Protokół obejmuje ograniczoną reprezentację CPG w całym genomie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować biblioteki E-R-R-B-S do generowania danych metylacji D-N-A-C-P-G o rozdzielczości bazowej po opanowaniu, technikę tę można wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zacząć od wysokiej jakości DNA, uwzględnić wszystkie opisane kroki, zweryfikować skuteczność konwersji i sekwencji dwusiarczanowej przy użyciu zalecanych parametrów. Nie zapominaj, że praca z fenylem i chloroformem może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować typowe środki ostrożności, takie jak praca w okapie chemicznym i odpowiednia utylizacja odpadów.

Postępując zgodnie z tą procedurą. W celu walidacji wyników można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie spyro lub epitype z macierzą masową. Ponadto można przeprowadzić profilowanie ekspresji genów w celu określenia biologicznego znaczenia wykrytych wzorców metylacji DNA.

Zdolność do generowania wzorców metylacji DNA o rozdzielczości par zasad z ograniczonych ilości materiałów wejściowych umożliwiła profilowanie rzadkich populacji komórek, które nigdy wcześniej nie było możliwe. Umożliwiło to również profilowanie dużych kohort próbek klinicznych w celu zbadania regulacji za pośrednictwem epigenetyki i heterogeniczności choroby.