Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów
15 kwietnia 2015
Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.
Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnych, połączonych ze sobą obwodów neuronalnych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie szablonów PDMS w celu ułożenia warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Drugim krokiem jest oczyszczenie substratów hodowlanych.
W szczególności powierzchnie szalek Petriego, szkiełek nakrywkowych i układów wieloelektrodowych. Następnie szablony PDMS są osadzane na podłożu hodowlanym i tworzone są pożądane wzory warstw białka adhezyjnego. Ostatnim krokiem jest posiew neuronalnych komórek glejowych.
Ostatecznie, zapisy z matrycy wieloelektrodowej i obrazowanie wapnia są wykorzystywane do pokazania dynamiki osiągniętych modułowych sieci neuronowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe otwarte pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak badanie dynamiki komunikacji między zespołami neuronalnymi, a także przeciwdziałać warunkom eksperymentalnym. Polimethyl soane lub PDMS jest wytwarzany przez pierwsze zmieszanie jednej części utwardzacza z 10 częściami środka bazowego.
Po pięciu minutach mieszania przenieś mieszaninę do komory próżniowej na 15 minut. Po 15 minutach sprawdź, czy nie ma pęcherzyków i włóż roztwór do komory na kolejne 15 minut. Następnie przygotuj wafel na koderze spinowym.
Otwórz pokrętła gazu dla azotu. Połóż wafel na przędzarce i zabezpiecz go na miejscu za pomocą odkurzacza. Następnie wylej cienką warstwę PDMS na wafel.
Wiruj wafel za pomocą PDMS przez minutę z prędkością 1000 obr./min, aby uzyskać powłokę PDMS o grubości 100 mikronów na płytce. Następnie przenieś wafel na płytę grzejną w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Piecz tam przez 30 minut.
Po stwardnieniu PDMS użyj pipety, aby obrysować krawędzie szablonów większą ilością PDMS. Następnie upiecz dodany PDMS na wafli. Tak jak poprzednio, gdy obramowania PDMS stwardnieją, odetnij szablon wzdłuż granic, aby oderwać silikonowy szablon od płytki, aby rozpocząć RIN.
Szklana pokrywa o średnicy 23 milimetrów kwadratowych z wodą destylowaną, następnie 70% etanolem, następnie acetonem, następnie izopropanolem, a na końcu wodą destylowaną. Ponownie wysusz kwadraty pod strumieniem azotu. Następnie delikatnie dociśnij jeden szablon PDMS do każdego szkiełka nakrywkowego.
Umieść szkiełka nakrywkowe z szablonami w komorze próżniowej na 15 minut. Po odkurzeniu upuść mililitr PDL na szablony i włóż zespoły z powrotem do komory próżniowej na 20 minut. Powtórz 20-minutowy cykl próżniowy jeden raz, a następnego dnia pozostaw PDL do wyschnięcia na noc.
Przygotuj szalki Petriego, które będą wspierać komórki sieciowe. Pierwszy. Przykryj 3,5-centymetrowe naczynia mililitrem PDL na dwie godziny. Później w temperaturze pokojowej wyjmij PDL z naczynia przez aspirację.
Następnie umyj naczynia wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia. Po wysuszeniu naczynia dodaj do naczynia niewielką ilość smaru silikonowego zgodnie z czterema rogami szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełka nakrywkowe na naczyniu z PDMS skierowanym do góry i delikatnie dociśnij je, aby upewnić się, że są zamocowane.
Teraz delikatnie odsuń PĘSETĄ A-P-D-M-S od szkiełek okładkowych, pozostawiając wzór PDL. Na koniec wysterylizuj naczynia, wystawiając je na działanie promieniowania UV przez siedem minut. Najpierw wyczyść matrycę wieloelektrodową, myjąc ją pod bieżącą wodą, a następnie poddaj ją sonikacji w skoncentrowanym detergencie enzymatycznym.
Powtórz te kroki trzy razy. Następnie trzykrotnie poddać SONICA w czystej wodzie destylowanej, po czym pod maską. Wcześniej umyj MEA wodą destylowaną.
Sterylizacja światłem UV przez 30 minut. Następnie najpierw przygotuj sieć wspierającą. Wlej PDMS do płytki 12- lub 24-dołkowej.
Gdy PDMS stwardnieje, usuń go za pomocą igły. Teraz wytnij otwory w środku dysków, aby wykonać pierścienie, które działają jako podpora formy. Teraz umieść wspornik formy na środku MEA i przykryj zewnętrzną odsłoniętą powierzchnię MEA.
Niech to się uspokoi na dwie godziny w pokoju. Następnie zassać płuczkę PDL, zewnętrzną odsłoniętą powierzchnię MEA wodą destylowaną i usunąć podporę formy, aby MEA mogła wyschnąć. Teraz przymocuj szablon do przygotowanego mikromanipulatora pod odwróconym mikroskopem.
Sprawdź i wyrównaj wzorzystą strukturę, aby pasowała do elektrod MEA. Następnie użyj mikromanipulatora, aby opuścić szablon na powierzchnię MEA. Po zamocowaniu podnieś manipulator mikrom i, jeśli to konieczne, użyj pęsety, aby wywrzeć niewielki nacisk, aby zapobiec odłączeniu się PDMS.
Teraz przenieś MEA do komory próżniowej na 15 minut. Następnie nałóż jednomililitrową kroplę PDL na szablon i wróć do komory próżniowej na dwa cykle po 20 minut. Pozostaw PDL do wyschnięcia na noc następnego dnia.
Usuń szablony P DM S z wymiarów za pomocą pęsety. Na koniec sterylizuj pomiary promieniami UV przez siedem minut. Następnie są gotowe do przygotowania komórek hodowlanych i przygotowania zawiesin, jak w protokole tekstowym.
Po zawieszeniu przez Resus wymaganej liczby komórek, umieść je na środku wzorzystego obszaru na MEA lub szkiełku nakrywkowym. MEA powinien być załadowany objętością 100 mikrolitrów i szkiełkiem nakrywkowym. Mieści 1000 mikrolitrów.
Inkubować komórki płytki przez 40 minut, a następnie dodawać pożywkę galwaniczną, aby utrzymać komórki co cztery dni. Dodaj z powrotem świeże uzupełnione podłoże wzrostowe. Po szóstym lub siódmym dniu w tym momencie powinny zacząć tworzyć się połączenia neuronalne między modułami.
Rozcieńczyć pożywkę hodowlaną środkiem antymitotycznym, aby zapobiec przerostowi gleju. Po czterech dniach in vitro można zaobserwować, że neurony przyłączone do PD DL kodują plamki o powierzchni 600 mikronów kwadratowych po 14 dniach. W hodowli neuron spontanicznie nawiązał połączenie w obrębie modułów i między modułami, tworząc aktywne sieci funkcjonalne.
Obwody neuronalne o powierzchni 300 mikronów kwadratowych obserwowano dzięki rozmiarowi cechy PDMS przy zachowaniu tego samego stężenia posiewu. Obrazowanie wapnia przeprowadzono przy użyciu celu Forex, aby szeroko pojętą aktywność w hodowanych sieciach. Pomiędzy modułami zielonym i różowym widoczna jest większa liczba połączeń, podczas gdy moduły niebieskie i czerwone są mniej połączone z innymi modułami.
Wykres rozkładu początków zdarzeń wapniowych jest pokazany dla filmu uzyskanego z częstotliwością 30 Hz z obrazem o rozdzielczości 1 miliona pikseli. Moduły zielony i różowy były wysoce zsynchronizowane, podczas gdy moduły niebieski i czerwony były mniej. Tak więc, modułowa sieć korowa złożona z trzech odrębnych obwodów została zarejestrowana po 21 dniach in vitro.
Za pomocą MEA stwierdzono, że obwody neuronalne oddalone od siebie o około 600 mikronów są ze sobą połączone. Zrekonstruowano ich aktywność elektrofizjologiczną. Korzystając z precyzyjnego algorytmu wykrywania skoków czasowych, wykonano wykres harmonogramu pięciu minut tych danych z danymi klastrowymi oznaczonymi kolorami.
Zapewnia to porównanie aktywności całej sieci i pojedynczego klastra oraz daje wgląd w synchronizację wewnątrz klastra. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować szablony PDM i używać ich do modelowania adhezji komórek neurogleju, co prowadzi do ustanowienia funkcjonalnej sieci modalnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół hodowli in vitro sieci modułowych składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Zostaje to osiągnięte poprzez przygotowanie szablonów z PDMS do wzorowania warstwy białkowej, która wspomaga adhezję komórkową na podłożu hodowlanym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- elektrofizjologia
Wstęp
- Sieci neuronalne in vitro są niezbędne do badania łączności neuronowej.
- Ograniczenie przestrzenne obwodów neuronalnych może zwiększyć funkcjonalną interkonektywność.
- Adhezja komórkowa jest kluczowa dla prawidłowego wzrostu neuronów.
- Szablony z PDMS są powszechnie stosowane do tworzenia wzorów w hodowlach komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia modularnych sieci neuronalnych in vitro.
- Zbadanie właściwości elektrofizjologicznych tych sieci.
- Ustanowienie spontanicznych połączeń pomiędzy wysianymi neuronami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szablonów z PDMS do wzorowania białek.
- Czyszczenie podłoży hodowlanych, takich jak szalki Petriego i szkiełka nakrywkowe.
- Nakładanie szablonów z PDMS na podłoże w celu utworzenia wzorów adhezyjnych.
- Wysiewanie komórek glejowych neuronów na wzorowane podłoże.
Główne wyniki
- Skuteczne utworzenie przestrzennie ograniczonych obwodów neuronalnych.
- Wykazanie występowania spontanicznych połączeń między neuronami.
- Obserwacja aktywności elektrofizjologicznej w hodowlanych sieciach.
- Walidacja protokołu do przyszłych badań nad łącznością neuronalną.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na skuteczne tworzenie modularnych sieci neuronalnych in vitro.
- Ograniczenie przestrzenne zwiększa funkcjonalną łączność międzyneuronalną.
- Metoda ta może zostać wykorzystana do dalszych badań elektrofizjologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metodologia modularnych sieci neuronalnych in vitro umożliwia precyzyjną przestrzenną kontrolę zespołów neuronalnych, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów w procesie odkrywania leków w neuronauce. Dzięki tworzeniu funkcjonalnie połączonych obwodów z mierzalnymi odczytami elektrofizjologicznymi i obrazowaniem wapnia, podejście to zapewnia pewność predykcyjną w testach łączności neuronalnej. Rozwiązuje ono kluczowy problem etapu odkrywania: modelowanie dynamiki obwodów mózgowych w celu oceny wpływu związków na synchronizację i komunikację w sieci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez modulację odległości między przedziałami w celu regulacji synchronizacji między modułami.
- Wartość operacyjna: Zapewnia istotny w kontekście chorobowym system do oceny zaangażowania celu poprzez spontaniczne tworzenie obwodów neuronalnych i ustanawianie funkcjonalnych sieci.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych pomiarów zmiennych zależnych poprzez rejestrację z macierzy wielu elektrod oraz obrazowanie wapnia w celu oceny dynamiki aktywności sieci.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów dzięki powtarzalnemu wzorcowaniu szablonów PDMS i nanoszeniu warstw białek, co zapewnia spójną adhezję komórkową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia dopasowanie biomarkerów translacyjnych poprzez korelację gęstości połączeń z występowaniem synchronizacji, co umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość modelu przedklinicznego, umożliwiając obserwację tworzenia się połączeń neuronalnych po 6-7 dniach in vitro oraz ich stabilizację do 14. dnia.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących dynamiki komunikacji neuronalnej, a uzyskane wyniki bezpośrednio wspierają identyfikację związków wiodących poprzez profilowanie aktywności sieci.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie kontrolowanego badania tego, w jaki sposób gęstość połączeń reguluje synchronizację między modułami w sieciach modułowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki zstandaryzowanym protokołom traktowania powierzchni i wysiewania komórek, które gwarantują powtarzalne przywieranie neuronów do obszarów wzorowanych PDL.
- Analityka: Umożliwia elektrofizjologiczną detekcję impulsów (spike detection) oraz pomiary początku zdarzeń wapniowych, co pozwala na ilościowe porównanie synchronii wewnątrz- i międzyklastrowej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez wykazanie spontanicznego tworzenia funkcjonalnych sieci, które odzwierciedlają zasady komunikacji obwodów in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metod wzorowania sieci neuronowych na różnych podłożach (szkiełka nakrywkowe, MEA) w celu wsparcia powtarzalnych kampanii przesiewowych i badań walidacji celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuronalnych, zapewniając sterowalny system do badania wpływu topologii strukturalnej na łączność funkcjonalną.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność dzięki powłoce PDL wspomaganej próżniowo oraz etapom sterylizacji UV, które zapewniają spójne przygotowanie powierzchni we wszystkich eksperymentach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez umożliwienie testowania zależności dawka-odpowiedź związków w zakresie synchronii sieci, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach opracowywania leków na OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację progów synchronizacji zależnych od połączeń, co dostarcza informacji niezbędnych do ograniczania ryzyka mechanistycznego celów neuronalnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie wytwarzania szablonów mikroprzepływowych, hodowli komórek neuronalnych oraz technik rejestracji elektrofizjologicznych i optycznych.
- Zależne od dostępu do sprzętu do powlekania wirowego, komór próżniowych, sterylizatorów UV, matryc wieloelektrodowych (MEA) oraz systemów obrazowania wapniowego.
- Wymaga standaryzacji projektu szablonów, protokołów powlekania białkami oraz gęstości wysiewu między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności międzylaboratoryjnej.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów dla różnych podtypów neuronów lub proporcji kokultur glejowych w celu utrzymania stabilności sieci i zapobiegania przerostowi.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba precyzyjnego dopasowania szablonu do elektrod MEA oraz zależność wymiarów obwodów od rozmiaru struktur PDMS (np. moduły kwadratowe o boku 300 micron).
