Name: Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę hodowli modułowych sieci neuronowych in vitro przy użyciu szablonów PDMS do wzoru warstwy białkowej. Technika umożliwia badanie aktywności elektrofizjologicznej i łączności neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Europejski Projekt BRIANBOW (FP7- Młodzi Odkrywcy, Autorzy chcieliby podziękować dr Jacopo Tessadori za przydatne komentarze do manuskryptu, oraz Silvii Chiappalone za jej pomoc w tworzeniu grafik użytych w filmie.

Procedura została wykonana zgodnie ze standardami NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Tel-Awiwie (numer zezwolenia – L-14-019).
1. Przygotowanie instrumentów i PDMS
<ol>
	<li>Przygotuj wafel (Tabela materiałów lub zamów wafel z laboratorium mikrofabrykacji), skalpel i pęsetę – sterylizacja nie jest konieczna.</li>
	<li>Przygotować roztwór poli-D-lizyny (PDL) w następujących warunkach: 4 mg/ml w 0,1 M buforze boranowym o pH 8 i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj szablony PDMS zgodnie z następującą procedurą:
	<ol>
		<li>Przygotować polidimetylosiloksan (PDMS, elastomer silikonowy) mieszając ze sobą bazę i utwardzacz w stosunku 10:1, a następnie mieszać 2 substancje przez około 5 minut.</li>
		<li>Umieść w komorze próżniowej dwa razy na 15 minut za każdym razem i sprawdź, czy pęcherzyki zniknęły.</li>
		<li>Gdy PDMS jest gotowy, przygotuj powlekarkę wirową: otwórz pokrętła azotu, aby umożliwić użycie gazu, umieść płytkę krzemową (rysunek 1A) na przędzarce i użyj podciśnienia, aby zapobiec jej przesuwaniu się.</li>
		<li>Wlej PDMS na wafel i aktywuj wirówkę na 1 minutę przy 1 000 obr./min (tworzy około 100 μm wysokości).</li>
		<li>Umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C na 30 minut.</li>
		<li>Gdy PDMS stwardnieje, obrysuj krawędzie szablonu za pomocą PDMS za pomocą pipety Pasteura. Umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C na 30 minut.</li>
		<li>Gdy brzegi PDMS stwardnieją, użyj skalpela, aby przyciąć szablony zgodnie z obramowaniami i oderwij silikonowy szablon od płytki (kwadratowy PDMS zawierający pojedynczy wzór).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie szalki Petriego i szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Przygotuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 23 mm i wyczyść je zgodnie z następującą kolejnością:
	<ol>
		<li>Umyć wodą destylowaną, 70% etanolem i acetonem.</li>
		<li>Umyć izopropanolem i szybkoschnąć azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wzorzyste szablony PDMS na szkiełku nakrywkowym i delikatnie dociśnij, aby sprawdzić, czy są mocno przymocowane do szklanej powierzchni. Umieścić w komorze próżniowej na 15 minut.</li>
	<li>Upuść 1 ml PDL na szablon. Włóż szkiełko nakrywkowe do komory próżniowej dwa razy na 20 minut za każdym razem i pozostaw PDL O/N do wyschnięcia.</li>
	<li>Przygotuj szalkę Petriego, aby utworzyć wspierającą sieć komórkową:
	<ol>
		<li>Przykryj powierzchnię naczynia (3,5 cm) 1 ml PDL przez 2 godziny w suchej temperaturze regulowanej. Usuń kroplę PDL za pomocą pipety.</li>
		<li>Umyć wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia. Umieść bardzo małą kroplę smaru silikonowego w każdym rogu szkiełka nakrywkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na środku szalki Petriego (tj. PDMS powinien być skierowany do góry) i delikatnie dociśnij, aby sprawdzić mocowanie.</li>
	<li>Delikatnie usuń PDMS z szkiełka nakrywkowego za pomocą pęsety. W celu sterylizacji wystawić na działanie promieniowania UV przez 7 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie matrycy wieloelektrodowej (MEA)
<ol>
	<li>Wyczyść MEA w tej kolejności (tabela materiałów):
	<ol>
		<li>Umyć wodą pod bieżącą wodą i 3 razy poddać sonikacji w skoncentrowanym, enzymatycznym detergencie.</li>
		<li>Sonikuj w wodzie destylowanej 3 razy.</li>
		<li>Umyj wodą destylowaną (w kapturze, końcówka 1 000 μl) 3 razy i umieść w świetle UV na 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wspieranie przygotowania sieci:
	<ol>
		<li>Przygotuj zaprojektowaną formę sieci wsporczej.
		<ol>
			<li>Wlać PDMS do płytki 12-dołkowej (o średnicy 22 mm).</li>
			<li>Gdy PDMS stwardnieje, wyjmij formę i za pomocą skalpela wytnij otwór w środku, aby utworzyć kształt pierścienia.</li>
			<li>Umieść zaprojektowaną formę sieci nośnej na środku MEA (rysunek 2A) i przykryj resztę powierzchni PDL przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń PDL za pomocą pipety i przemyj wodą destylowaną.</li>
		<li>Wyjmij formę i pozostaw do wyschnięcia (Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopasuj szablon do MEA w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Umieść szablon na wyznaczonym mikromanipulatorze. Użyj odwróconego mikroskopu, aby dokładnie wyrównać wzorzystą strukturę do elektrod i opuść szablon, aż zostanie umieszczony na powierzchni MEA (Rysunek 2B). 
		Uwaga: Kontakt z dobrze oczyszczonym MEA zapewnia konkurencyjną przyczepność między PDMS a samym MEA.</li>
		<li>Podnieś mikromanipulator i, jeśli to konieczne, użyj pęsety, aby wywrzeć niewielki nacisk nad PDMS, aby zapobiec jego odłączeniu się od MEA.</li>
		<li>Delikatnie dociśnij szablon do powierzchni MEA i użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy jest mocno przymocowany i dobrze wyrównany. (Rysunek 2C-D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść MEA w komorze próżniowej na 15 minut; nałóż 1 ml kropli PDL na szablon.</li>
	<li>Włóż do komory próżniowej 2 razy po 20 minut. Pozostawić PDL do wyschnięcia O/N w inkubatorze.</li>
	<li>Przed poszyciem należy usunąć szablony PDMS z MEA i umyć sterylną wodą. Umieścić w świetle UV na 7 minut.</li>
</ol>
4. Sekcja i kultura
<ol>
	<li>Przygotuj kultury zgodnie z opisem w Herzog i in. 2011 21.</li>
</ol>
5. Poszycie
<ol>
	<li>Oblicz liczbę ogniw potrzebnych do posiewu za pomocą hemocytometru (optymalna gęstość w zależności od wielkości obwodu, jak omówiono w wyniku).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że komora licząca (hemocytometr) jest czysta i umieść na niej szkiełko nakrywkowe (do czyszczenia użyj alkoholu).</li>
		<li>Rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek w 190 μl pożywki galwacyjnej (rozcieńczenie 1:20).</li>
		<li>Załadować 10 μl rozcieńczonych komórek na krawędź komory liczenia i powoli odpipetować komórki, pozwalając komorze napełnić się sama.</li>
		<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu zwizualizuj siatkę hemocytometru. Określ liczbę komórek w komorze przez bezpośrednie liczenie (zdrowe komórki powinny być okrągłe). Policz komórki w dużym kwadracie bez tych, które przecinają krawędzie.</li>
		<li>Oblicz stężenie komórek: 
		Całkowita liczba komórek/1000 μl = Całkowita liczba komórek × współczynnik rozcieńczenia ×10 4 (powierzchnia hemocytometru). 
		Uwaga: Na przykład, jeśli współczynnik rozcieńczenia wynosił 20, a całkowita liczba zliczonych komórek wynosiła 100: 
		100 × 20 × 104 = 0,1 x 107 komórek/1 000 μl lub 1 x 106/100 μl. Aby pokryć 6 komórek 0,75 x 10, należy pobrać z komórek 75 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weź liczbę komórek potrzebnych do posiewu na pojedynczą szalkę MEA lub Petriego, ponownie zawieś komórki, aby zapobiec agregacji, i umieść je w środku, na górze obszaru wzoru (w razie potrzeby możliwe jest rozcieńczenie komórek w pożywce). W przypadku MEA umieść kroplę o pojemności 100 μl na środku. W przypadku szkiełka nakrywkowego umieść kroplę o pojemności 1 000 μl na środku.</li>
	<li>Inkubować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Dodać pożywkę galwaniczną do posianych komórek, do 1 ml na MEA i 2 ml na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 37 °C i co 4 dni rozcieńczać świeżym podłożem wzbogaconym w 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 i 0,75% glutamaxu.</li>
	<li>Od 6/7 DIV, po zaobserwowaniu połączeń między wyspami, rozcieńczyć pożywkę 10 μl/ml FUDR (25 mg deoksyurydyny + 62,5 mg urydyny w 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) lub innym środkiem antymitotycznym, aby zapobiec przerostowi gleju.</li>
</ol>

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+syntax%3A+cell+assemblies%2C+synapsembles%2C+and+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers.</a> Neuron. 68, 362-385 (2010).</li>
<li>Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+and+hierarchically+modular+organization+of+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular and hierarchically modular organization of brain networks.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, 200(2010).</li>
<li>Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+neural+representation+capacity+by+modular+architecture+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).</li>
<li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microelectrode+array+%28MEA%29+integrated+with+clustering+structures+for+investigating+in+vitro+neurodynamics+in+confined+interconnected+sub-populations+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).</li>
<li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PloS One. 9, e107400(2014).</li>
<li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+synchronous+oscillations+in+freely-organized+small+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits.</a> PloS One. 5, e14443(2010).</li>
<li>Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+neuronal+circuits%3A+a+new+platform+for+studying+the+role+of+modular+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology.</a> Frontiers in Neuroengineering. 4, 10(2011).</li>
<li>Bonifazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+large-scale+experimental+and+theoretical+studies+for+the+realization+of+bi-directional+brain-prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.</a> Front Neural Circuits. 7, 40(2013).</li>
<li>Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triangular+neuronal+networks+on+microelectrode+arrays%3A+an+approach+to+improve+the+properties+of+low-density+networks+for+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).</li>
<li>Marconi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+functional+properties+of+neuronal+networks+with+controlled+topology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology.</a> PloS One. 7, e34648(2012).</li>
<li>Taylor, A. M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+and+compartmentalized+platforms+for+neurobiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).</li>
<li>Sorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+self-wiring+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Compact self-wiring in cultured neural networks.</a> J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+properties+for+biomedical+micro%2Fnanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems.</a> Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).</li>
<li>Campo, A. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8%3A+a+photoresist+for+high-aspect-ratio+and+3D+submicron+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+MicroengineeringEmail+alert+RSS+feed%22%5BJournal%5D)">SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography.</a> Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).</li>
<li>Liu, G. T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kan+Y+Fabrication+of+high-aspect-ratio+microstructures+using+SU8+photoresist%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystem+Technologies%22%5BJournal%5D)">Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist.</a> Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).</li>
<li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).</li>
<li>Pine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+action+potentials+from+cultured+neurons+with+extracellular+microcircuit+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).</li>
<li>Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Fixed-Array+Multi-Microelectrode+System+Designed+for+Long-Term+Monitoring+of+Extracellular+Single+Unit+Neuronal-Activity+In+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro.</a> Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).</li>
<li>Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+of+spontaneous+activity+with+photoetched+microelectrode+surfaces+from+mouse+spinal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).</li>
<li>Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+microelectrode+array+to+monitor+the+bioelectric+activity+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.</a> Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).</li>
<li>Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+validation+of+in+vitro+extra-cellular+neuronal+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings.</a> J Neural Eng. 8, 056008(2011).</li>
<li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).</li>
<li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li>
<li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li>
<li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li>
<li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).</li>
<li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li>
<li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano protokół hodowli modułowych sieci neuronowych 2D in vitro składających się z funkcjonalnie połączonych ze sobą obwodów. Zabieg opiera się na modelowaniu warstwy kleju komórkowego. Tworzenie wzorów odbywa się za pomocą szablonów PDMS odtwarzających negatywną cechę pożądanej architektury sieciowej. Szablony PDMS definiują obszary, w których osadza się warstwa kleju komórkowego. Po pokryciu plateracją komórki spontanicznie łączą się z powlekanymi wyspami i samoorganizują się w aktywne, połączone ze sobą obw...

Eksperymentalne i teoretyczne dowody potwierdzają możliwość, że mózg działa poprzez skoordynowaną aktywację zespołów komórkowych1-5, które można uznać za dynamiczne jednostki funkcjonalne, które przejściowo oddziałują ze sobą, kształtując i leżąc u podstaw różnych stanów mózgu. Modularność funkcjonalna jest również zależna i związana ze strukturalną organizacją modularną obwodów mózgowych6,7. To, w jaki sposób funkcja i struktura obwodów mózgowych wzajemnie się kształtują, jest nadal jednym z głównych otwartych pytań w neurobiologii. Aby zapewnić głębsze zrozumienie tego pytania, ważne jest zidentyfikowanie optymalnych ram eksperymentalnych, w których możliwe jest rozwiązanie, przynajmniej częściowo, tych problemów. Ponieważ kontrolowana manipulacja czasoprzestrzenną dynamiką sieci neuronowych w eksperymentach in vivo jest wyzwaniem, rozwój modeli sieci neuronalnych in vitro cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na ich łatwą dostępność, monitorowanie, manipulację i modelowanie8,9. W ostatnich latach technologie in vitro wspierane zaawansowanymi metodami modelowania substratów pozwoliły na skłonienie sieci neuronalnych do opracowania szeregu predefiniowanych struktur modułowych3 oraz na zbadanie właściwości funkcjonalnych sieci o narzuconych topologiach10. W szczególności ostatnio zastosowano metody organizowania sieci poprzez nakładanie fizycznych ograniczeń4,11. Rzeczywiście, aby zbadać związek między strukturą a funkcją w sieciach neuronalnych oraz zapewnić uproszczoną, ale wiarygodną reprezentację oddziałujących na siebie zespołów neuronalnych, systemy in vitro powinny zapewnić wzajemnie połączone subpopulacje neuronów. Szeroko badane jednorodne kultury neuronalne 2D nie nakładają żadnych ograniczeń przestrzennych na samoorganizujące się emergentne okablowanie obwodów. Dlatego możliwym podejściem do kształtowania sztucznie połączonych zespołów komórkowych jest umieszczanie różnych populacji neuronów w przestrzennie odrębnych obszarach. Odległość między tymi obszarami nie przeszkadza w łączeniu między zespołami. Wykazano, że takie podejście, zapewniając znaczną kontrolę nad złożonością sieci, zapewnia bogatszy repertuar modeli synchronizacji6,7,12.
Aby ułatwić powtarzalne hodowanie modułowych zespołów neuronalnych, przedstawiono i opisano protokół składania samoorganizacji sieci w klastry neuronalne połączone aksonami i dendrytami. Struktura polimeryczna do fizycznego uwięzienia kultur neuronalnych została stworzona z polidimtheylsiloxanu (PDMS). PDMS jest elastomerem szeroko stosowanym do zastosowań biomedycznych ze względu na jego biokompatybilność, przezroczystość i przepuszczalność dla gazów13. PDMS jest przygotowywany i wyłączany z mikroobrabianych struktur SU8 207514,15 poprzez powlekanie przędzalnicze ciekłego PDMS na "masterze", jak opisano wcześniej w Jackman et al. 16 Uzyskane wzorzyste sieci neuronowe składają się z połączonych ze sobą modułów o różnej wielkości i udało się je uzyskać zarówno na szkiełkach nakrywkowych, jak i na matrycach mikroelektrod (MEA)17-20. Gęstość połączeń między modułami może zmieniać cechy synchronizacji sieci, od w pełni zsynchronizowanej sieci, typowej dla jednolitych kultur, do przejściowych stanów synchronizacji między modułami.

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Komora próżniowa Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene</td><td>Thermo</td><td>5305-0609</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna PDL</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy - SILICAID 1010</td><td>aidchim Ltd</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laurell - Technologies Corporation</td><td>WS-650-23</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Sigma</td><td>CLS3336</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2'-deoksyurydyna</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>MEA1060-Inv-BC</td> Systemy <td></td><td></td><td>wielokanałowe</td></tr><tr><td>TC02</td> Systemy <td></td><td></td><td>wielokanałowe</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Biological Industries Beit Haemek</td><td>03-033-1C</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>glutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td><td>Biological Industries Beit Haemek</td><td>01-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Mikro matryce elektrod 4Q</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>Instrukcja czyszczenia 60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td>: <td><a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">http:// www.multichannelsystems.com</a></td></tr><tr><td>Mikrochemia</td> <td>wafla krzemowa</td><td>SU8-2075</td><td>Protokół przygotowania: <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">http://www.microchem.com</a></td></tr></tbody></table>

projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Mózg działa poprzez skoordynowaną aktywację i dynamiczną komunikację zespołów neuronalnych. Głównym otwartym pytaniem jest to, w jaki sposób szeroki repertuar motywów dynamicznych, które leżą u podstaw najróżniejszych funkcji mózgu, może wyłonić się z ustalonej topologicznej i modularnej organizacji obwodów mózgowych. W porównaniu z badaniami in vivo obwodów neuronalnych, które stwarzają nieodłączne trudności eksperymentalne, preparaty in vitro oferują znacznie większe możliwości manipulowania i badania właściwości strukturalnych, dynamicznych i chemicznych eksperymentalnych układów neuronalnych. W pracy opisano metodologię eksperymentalną in vitro, która pozwala na wyhodowanie sieci modułowych złożonych z przestrzennie odrębnych, funkcjonalnie połączonych zespołów neuronalnych. Protokół pozwala na kontrolowanie dwuwymiarowej (2D) architektury sieci neuronalnej na różnych poziomach złożoności topologicznej.
Pożądane wzorcowanie sieci można osiągnąć zarówno na zwykłych szkiełkach nakrywkowych, jak i na układach mikroelektrod osadzonych w podłożu. Mikroobrabiane struktury są wytłaczane na płytce krzemowej i wykorzystywane do tworzenia biokompatybilnych szablonów polimerowych, które zawierają negatywne cechy pożądanej architektury sieci. Szablony są umieszczane na podłożach hodowlanych podczas procedury powlekania powierzchni warstwą molekularną w celu promowania adhezji komórkowej. Po usunięciu szablonów neurony są platerowane i spontanicznie przekierowywane do pokrytych obszarów. Zmniejszając odległość między przedziałami, możliwe jest uzyskanie izolowanych lub połączonych ze sobą obwodów neuronalnych. Aby zapewnić przetrwanie komórek, komórki są hodowane wspólnie ze wspierającą siecią neuronalną, która znajduje się na obrzeżach naczynia hodowlanego. Przedstawiono elektrofizjologiczne i optyczne zapisy aktywności sieci modułowych uzyskane odpowiednio przy użyciu układów mikroelektrod osadzonych w podłożu oraz obrazowania wapniowego. Podczas gdy każdy moduł wykazuje spontaniczne synchronizacje globalne, występowanie synchronizacji między modułami jest regulowane przez gęstość połączeń między obwodami.

Do kształtowania PDMS wykorzystano formę SU8-2075 na płytce krzemowej o grubości struktury około 100 µm. Wzór składał się z kwadratów o różnych wymiarach, których długość boku i odległości między nimi wahały się od 200 do 700 µm (Rysunek 1B). Rozmiar kwadratu dobrano tak, aby pasował do pola widzenia obiektywu 10X (dla wysp o długości boku &lt;800 µm) oraz obiektywu 20X (dla wysp o długości boku &lt;400 µm). Trzy parametry, mianowicie gęstość wysiewu komórek, odległość między obwodami oraz rozmiar obwodó...

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnych i wzajemnie połączonych obwodów neuronalnych. Osiąga się to poprzez przygotowanie szablonów z PDMS w celu ukształtowania warstwy białkowej wspomagającej adhezję komórkową na podłożu hodowlanym. Drugim krokiem jest oczyszczenie podłoży hodowlanych.W szczególności powierzchnie szalek Petriego, szkiełek nakrywkowych oraz macierzy wieloelektrodowych. Następnie szablony PDMS nanosi się na podłoże hodowlane i tworzy pożądane wzory warstw białek adhezyjnych. Ostatnim etapem jest wysiew komórek neuronalnych i glejowych.W końcowej fazie rejestracje z macierzy wieloelektrodowych oraz obrazowanie wapnia są wykorzystywane do wykazania dynamiki uzyskanych modularnych sieci neuronalnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe otwarte pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak badanie dynamiki komunikacji między zespołami neuronalnymi, przy zastosowaniu odpowiednich warunków eksperymentalnych. Polidimetylosiloksan (PDMS) przygotowuje się poprzez zmieszanie jednej części utwardzacza z 10 częściami bazy.Po pięciu minutach mieszania przenieś mieszaninę do ko

design-surface-treatment-cellular-plating-culturing-modular-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Projektowanie, Obróbka powierzchni, Powlekanie komórkowe oraz hodowlania modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Ten film pokazuje rozwój hodowli neuronów 3D połączonej z planarnym układem mikroelektrod z neuronami hipokampa. Izolowane neurony tworzą sieć 2D w obszarze aktywnym układu mikroelektrod i przylegają do szklanych mikrokulek w wielodołkowej płytce z wkładką membranową. Po przeniesieniu tych pokrytych neuronami mikrokulek do elektrody, organizują się one w połączoną sieć neuronową 3D.

Budowa trójwymiarowych sieci neuronowych sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten film pokazuje proces hodowli komórek neuronalnych na schemacie wieloelektrodowym (MEA) w celu stworzenia modułowych sieci neuronowych. Metoda ta pozwala na badanie transmisji sygnału neuronalnego i interakcji komórkowych.

Konstruowanie wzorzystych obwodów neuronalnych na matrycy wieloelektrodowej

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

W tej pracy nowatorski model eksperymentalny, w którym hodowle neuronów 3D są sprzężone z płaskimi matrycami mikroelektrod (MEAs), presented. 3D sieci są budowane przez umieszczanie neuronów w rusztowaniu wykonanym ze szklanych mikrokulek, na których neurony rosną i tworzą połączone ze sobą struktury 3D.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje użycie plastikowych chipów do hodowli i podziału pierwotnych neuronów mysich. Chipy te są wstępnie zmontowane, przyjazne dla użytkownika i kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, na żywo i fluorescencyjnym. Protokół ten opisuje, w jaki sposób umieścić neurony hipokampa szczura w tych chipach i przeprowadzić izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Wykorzystanie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich

Ten protokół demonstruje użycie podzielonych na przedziały mikroprzepływowych chipów, formowanych wtryskowo w cyklicznym kopolimerze olefin, do hodowanych neuronów zróżnicowanych od ludzkich komórek macierzystych. Chipy te są wstępnie zmontowane i łatwiejsze w użyciu niż tradycyjne urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) z przedziałami. Opisano tutaj wiele powszechnych paradygmatów eksperymentalnych, w tym znakowanie wirusów, izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Podział neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych na wstępnie zmontowane plastikowe chipy mikroprzepływowe

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Poznaj metodę hodowli modułowych sieci neuronowych in vitro przy użyciu szablonów PDMS do wzoru warstwy białkowej. Technika umożliwia badanie aktywności elektrofizjologicznej i łączności neuronalnej.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów (Wideo) | JoVE Journal

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Przeglądaj więcej filmów