Name: In vitro Wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę wieloparametrycznej analizy komórkowej in vitro za pomocą mikromacierzy tranzystorów OCMFET. To elastyczne, niskokosztowe urządzenie umożliwia monitorowanie aktywności elektrycznej i metabolicznej kultur komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają finansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 882897-Projekt Search&Rescue oraz projektu PON "TEX-STYLE" ARS01_00996, PNR 2015-2020.

Wszystkie obowiązujące międzynarodowe, krajowe i/lub instytucjonalne wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt były przestrzegane. Dołożono wszelkich starań, aby zmniejszyć liczbę zwierząt na potrzeby projektu i zminimalizować ich cierpienie.
1. Przygotowanie roztworu rozwijającego, roztworów trawiących, roztworu półprzewodników organicznych i masek fotolitograficznych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór rozwijający, rozcieńczając granulki NaOH w wodzie dejonizowanej o stężeniu 175 mM. 
	UWAGA: Jest to reakcja egzotermiczna. Jeśli używany jest plastikowy pojemnik, mieszaj pojemnik, aż wszystkie granulki całkowicie się rozpuszczą.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do trawienia tytanu, rozcieńczając kwas fluorowodorowy (HF) w wodzie dejonizowanej (1 część stężonej 48% HF, 49 części wody dejonizowanej). 
	UWAGA: Kwas fluorowodorowy może łatwo przenikać przez skórę, powodując poważne uszkodzenia głębokich warstw tkanek. Szybka neutralizacja HF jest konieczna, aby zapobiec niszczeniu tkanek, które może trwać przez kilka dni i skutkować poważnymi obrażeniami, a nawet śmiercią. Ryzyko związane z niewydolnością serca zależy od stężenia i czasu kontaktu z kwasem. Używać tylko pod wyciągiem za pomocą osłony twarzy. Zdecydowanie zaleca się również stosowanie podwójnych rękawic.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do wytrawiania złota, mieszając jod, jodek potasu i wodę dejonizowaną (na 250 g roztworu użyj 200 ml wody dejonizowanej, 20 g KI, 5 g I2). Mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i pozostaw na noc przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować roztwór półprzewodnikowy, rozpuszczając 6,13-bis(triizopropyloetynylo) pentacen (TIPS Pentacene) w anizolu (1% wagowo) i delikatnie mieszając przez 2 godziny na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C. 
	UWAGA: Kontynuuj mieszanie tego roztworu. Używaj fiolek ze szkła oranżowego i/lub przechowuj je w warunkach słabego oświetlenia.</li>
	<li>Przygotuj żądany zestaw masek fotolitograficznych za pomocą oprogramowania do grafiki wektorowej. Przygotuj 5 masek na cały proces: maskę do wzorowania pływających bramek (FG); maskę do otwierania przelotek i obszarów wykrywania dla zapisów elektrofizjologicznych; maska do procesu samowyrównania; maska do wzorowania górnego styku źródła, odpływu i bramki sterującej; oraz maska do aktywacji kanałów pH przez plazmę. 
	UWAGA: W zależności od wymaganej rozdzielczości i konkretnego układu fotolitograficznego można stosować różne rodzaje masek. W przypadku proponowanych urządzeń (które mają maksymalną rozdzielczość boczną 40 μm) proste plastikowe elastyczne maski zostały zakupione w lokalnym punkcie ksero.</li>
</ol>
2. Wybór i przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Wytnij kwadrat o wymiarach 6 x 6cm2 z politereftalanu etylenu (PET) o wymiarach 250 μm z nieskazitelnego arkusza PET. 
	UWAGA: Zacznij od nieco większego podłoża niż końcowe urządzenie, aby mieć wystarczająco szerokie marginesy, aby umożliwić manipulację standardową pęsetą laboratoryjną bez jej uszkodzenia.</li>
	<li>Sprawdź podłoże za pomocą mikroskopu optycznego, aby wykluczyć obecność głębokich rowków i zadrapań. Starannie dobieraj mniej porysowane podłoża, ponieważ większe niedoskonałości mogą doprowadzić do awarii końcowego urządzenia.</li>
	<li>Podłoża PET należy spłukać acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną (w tej kolejności) i wysuszyć za pomocą strumieni azotu. Przechowuj podłoża w czystych plastikowych szalkach/pojemnikach Petriego.</li>
</ol>
3. FG: osadzanie tytanu
<ol>
	<li>Wstępnie oczyść podłoża tlenem plazmowym (30 s przy 100 W) i umieść je na uchwycie substratu w komorze próżniowej parownika termicznego.</li>
	<li>Umieścić 60 mg tytanu w tyglu, zamknąć przesłonę i pompować w dół komory parowania, aż osiągnie poziom próżni niższy niż 10-6 Torr. Zwiększ moc parownika, aż tygiel zaświeci się na czerwono i odczekaj 30 sekund. Otwórz migawkę, zwiększ moc do 60% (lub do momentu, gdy tygiel zacznie świecić na jasnobiało) i poczekaj 60 sekund. Zamknij migawkę i zmniejsz zasilanie.</li>
	<li>Usunąć substraty z parownika, oczyścić je acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną, a następnie wysuszyć za pomocą strumieni azotu. Wykonaj drugą obróbkę plazmą tlenową (60 s przy 200 W), aby lekko utlenić powierzchnię tytanu.</li>
</ol>
4. Wzór FG
<ol>
	<li>Umieszczać po jednym substracie na powlekarkę wirową umieszczoną w dygestorium. Umieść 4 ml fotorezystu na podłożu za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 2 μm, należy użyć następujących parametrów powłoki wirowej: prędkość wirowania: 3000 obr./min; czas wirowania: 45 s; czas przyspieszenia: 0,5 s; Czas hamowania: 0,5 s.</li>
	<li>Fotorezystor upiecz na miękko, umieszczając podłoże na płycie grzejnej (70 °C przez 5 min). Przechowuj podłoże w owiniętej folią aluminiową szalce Petriego/plastikowym pojemniku, aby uniknąć bezpośredniego narażenia na światło. 
	UWAGA: Unikaj sugerowanej temperatury pieczenia (100 °C przez 50 s), aby zapobiec deformacji podłoża. Jednak pieczenie w niższej temperaturze przez dłuższy czas zapewnia dobre rezultaty.</li>
	<li>Umieść urządzenie w bromografie i umieść plastikową maskę fotolitograficzną z pożądanym układem FG na podłożu. Wystaw się na działanie światła ultrafioletowego (UV) od góry przez 1 minutę i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jego zarysowania.</li>
	<li>Zanurz podłoże na 5 s w szklanym pojemniku wypełnionym roztworem rozwijającym (krok 1.1). Szybko opłucz go w wodzie dejonizowanej i wysusz pod azotem. Użyj mikroskopu optycznego, aby poszukać słabo rozwiniętych/nadmiernie rozwiniętych miejsc w podłożu. Powtórzyć zanurzenie podłoża w roztworze rozwijającym w przypadku niedorozwoju.</li>
	<li>Wytrawić odsłonięty tytan, zanurzając go w roztworze do wytrawiania tytanu (krok 1.2) na 15 s, spłukać wodą dejonizowaną i wysuszyć azotem. Sprawdź optycznie podłoże i usuń fotorezystor za pomocą acetonu. Podłoże spłukać alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną, a następnie osuszyć azotem.</li>
</ol>
5. Osadzanie dielektryka bramki
<ol>
	<li>Przygotować komorę osadzania powlekarki Parylene, rozprowadzając 2 ml promotora adhezji (metakrylan silanu - 3-(trimetysylilo)propylu)) na ściankach komory osadzania za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Umieścić 300 mg dimeru Parylene C (odpowiadającego końcowej grubości 150 nm) na powlekarce Parylene. Ustaw dolną wartość ciśnienia na 7 mbar, a wyższą wartość ciśnienia na 10 mbar. Po osadzeniu podłoża należy oczyścić acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną, a następnie osuszyć azotem.</li>
</ol>
6. Otwarcie obszarów detekcyjnych OCMFET do rejestracji aktywności elektrycznej i tworzenia przelotek w celu uzyskania dostępu do tylnej części FG
<ol>
	<li>Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2.</li>
	<li>Umieść urządzenie w bromografie i umieść plastikową maskę fotolitograficzną na podłożu dla przelotek (okrągłe otwory o średnicy 50 μm nad obszarami wykrywania i 100 x 100 μm2 otwory nad FG z dala od obszarów wykrywania (określane jako kontakt wsteczny FG w <silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2)) pod mikroskopem stereoskopowym w celu poprawy precyzji wyrównania. Wystaw maskę na działanie promieniowania UV od góry przez 1 minutę i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jej zarysowania. 
	UWAGA: Przelotki po stronie FG z dala od obszaru wykrywania (pokazane jako kontakt wsteczny FG w <silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2) są niezbędne do kontaktu podczas charakteryzowania tranzystora. Co więcej, dostęp elektryczny do FG może być bardzo przydatny dla różnych rodzajów funkcjonalizacji (np. elektroosadzania).</li>
	<li>Wywołaj fotorezystor zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4.4. Wystaw podłoże za pomocą wzorzystego fotorezystu (który działa tutaj jak maska) na działanie plazmy tlenowej (180 s przy 200 W), aby usunąć Parylen C z obszarów wykrywania. 
	UWAGA: Szybkość wytrawiania parylenu C w izotropowym myjce plazmowej o mocy 200 W wynosi około 90 nm/min. Wykonuje się lekkie przetrawienie w celu dalszego oczyszczenia obszarów wykrywania. Fotorezystor jest również trawiony podczas tego procesu. Jednak jego grubość (2 μm) jest znacznie wyższa niż Parylene C.</li>
	<li>Umieść podłoża w szklanym pojemniku wypełnionym acetonem w kąpieli ultradźwiękowej na 10 s, aby całkowicie usunąć fotorezyst. Podłoża spłukać acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą i osuszyć azotem. 
	UWAGA: Stosowanie sonikacji zamiast zwykłego spłukiwania podłoży acetonem ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia niepożądanemu fałdowaniu i ponownemu osadzaniu się fragmentów parylenu C na powierzchni obszarów wykrywania.</li>
</ol>
7. Samoczynne wyrównanie źródła i odpływu za pomocą FG
<ol>
	<li>Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2. Umieść urządzenie w bromografie i umieść na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z prostymi czarnymi prostokątami, które całkowicie zakrywają obszary tranzystora. Wystaw maskę na działanie promieniowania UV przez 1 minutę zarówno od góry, jak i od dołu i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jej zarysowania. 
	UWAGA: W przypadku dwustronnej ekspozycji FG działają jak maski fotolitograficzne w odniesieniu do dolnej ekspozycji, podczas gdy obecność górnej maski zapewnia, że tylko fotorezyst obecny na kanale tranzystorów pozostaje nienaświetlony.</li>
	<li>Wywołaj fotorezystor zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4.4.</li>
</ol>
8. Osadzanie złota, tworzenie kanałów i wzorowanie źródeł, drenów i bramek kontrolnych
<ol>
	<li>Oczyść podłoża delikatną obróbką plazmową (30 s przy 30 W), aby zwiększyć przyczepność metalu do Parylenu C i umieść je na uchwycie podłoża wewnątrz komory próżniowej parownika termicznego.</li>
	<li>Umieść 30 mg złota w tyglu, zamknij żaluzję i pompuj w dół komorę parowania, aż osiągnie 10-5 Torr. Zwiększ moc parownika, aż tygiel zaświeci się na czerwono i odczekaj 30 sekund. Otwórz migawkę, zwiększ moc do 40% (lub do momentu, gdy tygiel zacznie świecić na jasnobiało), odczekaj 60 sekund, zamknij migawkę i zmniejsz zasilanie.</li>
	<li>Umieść podłoża w pojemniku z acetonem wewnątrz kąpieli ultradźwiękowej na 10 s, aby oderwać fotorezystor, usuwając w ten sposób złoto z kanału tranzystorów. Podłoża spłukać acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą i osuszyć azotem. Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2.</li>
	<li>Umieść urządzenie w bromografie i umieść na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z żądanymi źródłami, drenami i układem bramek sterujących. Wystaw na działanie światła UV przez 1 minutę od góry i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jego zarysowania.</li>
	<li>Wywołaj fotorezystor zgodnie z opisem w kroku 4.4. Wytrawić odsłonięte złoto, zanurzając je w roztworze do wytrawiania złota (krok 1.3) na 10 s, spłucz je wodą dejonizowaną i wysusz azotem. Sprawdź optycznie podłoże i usuń fotorezystor za pomocą acetonu. Spłucz alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną i osusz azotem.</li>
</ol>
9. Osadzanie i aktywacja Parylenu C do pomiaru pH
<ol>
	<li>Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2.</li>
	<li>Umieścić urządzenie w bromografie i umieścić na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z otworami odpowiadającymi obszarom wykrywania pH przez OCMFET. Wystaw na działanie światła UV przez 1 minutę od góry i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jego zarysowania.</li>
	<li>Wywołaj fotorezystor zgodnie z opisem w kroku 4.4. Całe urządzenie, z wyjątkiem obszarów wykrywających pH, należy zabezpieczyć poliimidową taśmą izolacyjną (patrz Tabela materiałów). Na podłożu nanieść warstwę 500 nm parylenu C (co odpowiada 1 g dimera parylenu C) przy użyciu tych samych parametrów, które opisano w kroku 5.1. 
	UWAGA: Całkowita grubość Parylenu C w obszarach wyczuwających pH wynosi 650 nm. Do tego osadzania nie jest wymagany silan.</li>
	<li>Ostrożnie usuń poliamidową taśmę izolacyjną. Wystaw substrat na działanie plazmy tlenowej (5 min i 30 s przy 200 W), aby aktywować Parylen C w obszarach wyczuwających pH OCMFETs. 
	UWAGA: Poliimidowa taśma izolacyjna jest tutaj niezbędna, aby ograniczyć osadzanie się Parylenu C. W rzeczywistości proste uniesienie za pomocą fotorezystu nie daje pozytywnych rezultatów ze względu na prawie bezotworowy charakter powłoki konforemnej uzyskanej za pomocą Parylenu C.</li>
	<li>Umieść podłoża w pojemniku z acetonem wewnątrz kąpieli ultradźwiękowej na 10 s, aby całkowicie usunąć fotorezyst. Podłoża spłukać acetonem i alkoholem izopropylowym (bez wody) i osuszyć azotem.</li>
</ol>
10. Osadzanie półprzewodników, umieszczanie w komorze hodowlanej i ostateczne wycinanie urządzenia z PET
<ol>
	<li>Umieścić podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C. Odleć kroplę (1 μl) roztworu półprzewodnikowego (krok 1.4) na każdy obszar kanału, przykryć całe podłoże pokrywką i pozostawić do wyschnięcia pod kapturem chemicznym na 30 minut.</li>
	<li>Przygotuj komorę hodowlaną, drukując za pomocą drukarki 3D pierścień akrylonitryl-butadien-styren o promieniu wewnętrznym 15 mm, grubości 1 mm i wysokości 7 mm. Przykleić komorę hodowlaną do środkowej części podłoża za pomocą polidimetylosiloksanu (stosunek utwardzacza: 15% wagowo). Wytnij urządzenie z PET ręcznie lub za pomocą wycinarki laserowej.</li>
</ol>
11. Charakterystyka elektryczna tranzystorów
<ol>
	<li>Scharakteryzuj każdy tranzystor za pomocą miernika źródłowego18,19,20,21 (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Zarówno charakterystyka wyjściowa, jak i wejściowa powinny być mierzone w celu ekstrapolacji parametrów tranzystorów (głównie ruchliwość nośników, napięcie progowe, stosunek ION/I OFF oraz nachylenie podprogowe).</li>
</ol>

<ol><li>Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tungsten+microelectrode+for+recording+from+single+units%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tungsten microelectrode for recording from single units.</a> Science. 125 (3247), 549-550 (1957).</li>
<li>Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+in+cortical+and+thalamic+networks.+A+study+with+multiple+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes.</a> Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).</li>
<li>Thomas, C. A. Jr, Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+microelectrode+array+to+monitor+the+bioelectric+activity+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.</a> Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).</li>
<li>Grattarola, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+neuron-microtransducer+junction%3A+from+extracellular+to+patch+recording%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).</li>
<li>Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+assay+for+determination+of+neurotoxicant+effects+on+spontaneous+network+activity+and+viability+from+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroToxicology%22%5BJournal%5D)">A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays.</a> NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).</li>
<li>Bergveld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+operation%2C+and+application+of+the+tool+for+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development, operation, and application of the tool for electrophysiology.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).</li>
<li>Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+potential+recordings+by+means+of+a+field+effect+transistor+without+gate+metal%2C+called+OSFET%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).</li>
<li>Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuron-silicon+junction%3A+a+Retzius+cell+of+the+leech+on+an+insulated-gate+field-effect+transistor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor.</a> Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).</li>
<li>Martinoia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ISFET+array-based+microsystems+for+bioelectrochemical+measurements+of+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations.</a> Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).</li>
<li>Heer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMOS+microelectrode+array+for+the+monitoring+of+electrogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).</li>
<li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+pixel+sensor+array+for+high+spatio-temporal+resolution+electrophysiological+recordings+from+single+cell+to+large+scale+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).</li>
<li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+functional+connectivity+estimation+on+low-density+neuronal+cultures+recorded+by+high-density+CMOS+micro+electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).</li>
<li>Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+aspect+ratio+microelectrode+array+for+mapping+neural+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Scientific Reports. 4, 5489(2014).</li>
<li>Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+a+three-dimensional+multi-electrode+array+for+neuron+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).</li>
<li>Spanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+micro-electrode+array+for+in-vitro+neuronal+interfacing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033(2020).</li>
<li>Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacing+cells+with+organic+transistors%3A+a+review+of+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications.</a> Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).</li>
<li>Spanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organic+transistor-based+system+for+reference-less+electrophysiological+monitoring+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells.</a> Scientific Reports. 5, 8807(2015).</li>
<li>Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin%2C+flexible+and+multimodal+tactile+sensors+based+on+organic+field-effect+transistors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors.</a> Scientific Reports. 8, 8073(2018).</li>
<li>Napoli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+detection+of+DNA+hybridization+by+coupling+organic+field-effect+transistor-based+sensors+and+hairpin-shaped+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes.</a> Sensors. 18 (4), 990(2018).</li>
<li>Spanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference-less+pH+sensor+based+on+an+organic+field+effect+transistor+with+tunable+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Electronics%22%5BJournal%5D)">A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity.</a> Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807(2015).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensor-integrated+organs-on-chips+platform+for+automated+and+continual+in+situ+monitoring+of+organoid+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+design+of+multifunctional+integrated+cell-based+biosensors+for+simultaneously+detecting+cell+acidification+and+extracellular+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).</li>
<li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).</li>
<li>Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organic+neurophysiological+tool+for+neuronal+metabolic+activity+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring.</a> APL Bioengineering. 2 (4), 046105(2018).</li>
<li>Díaz-García, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+stimulation+triggers+neuronal+glycolysis+and+not+lactate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).</li>
<li>Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+sodium+channel+blocker+tetrodotoxin+%28TTX%29+on+cellular+ion+homeostasis+in+rat+brain+subjected+to+complete+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia.</a> Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).</li>
<li>Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+organic+thin-film+transistors+for+pH+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Sensors+Journal%22%5BJournal%5D)">Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring.</a> IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).</li>
<li>Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+of+transparent%2C+flexible%2C+organic+transistors%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors.</a> Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W przeciwieństwie do poprzednich metod wytwarzania OCMFET do zastosowań komórkowych18,29, proponowana metoda jest specjalnie zaprojektowana do przygotowania MOA, które mogą jednocześnie wykrywać elektryczną i metaboliczną aktywność komórkową. Co więcej, to podejście do osiągnięcia czułości pH ma tę zaletę, że jest kompatybilne ze standardowymi protokołami produkcyjnymi i nie wiąże się z żadną chemiczną modyfikacją obszaru wykrywania (ten aspekt zapewnia biokompatybilność całego urządzenia). Czułość pH uzyskuje się przy użyciu tego samego materiału, który jest używany jako dielektryk bramki (tj. biokompatybilnego Parylenu C), dzięki czemu podejście to jest szybkie i powtarzalne.
Końcowym rezultatem tego podejścia jest elastyczne, przejrzyste, tanie i wielozmysłowe narzędzie organiczne do zastosowań komórkowych in vitro . Fakt, że można to uzyskać za pomocą pojedynczej struktury tranzystorowej i prostej fizycznej modyfikacji obszaru wykrywania, zwiększa korzyści oferowane przez zastosowanie organicznych materiałów i metod elektronicznych. Ponadto, ponieważ zasada transdukcji OCMFET nie zależy ściśle od konkretnego półprzewodnika lub materiału FG, cały proces może być modyfikowany i skalowany w zależności od konkretnego zastosowania.
Krytyczny aspekt proponowanej techniki jest związany z odtwarzalnością techniki aktywacji plazmy. Aby uzyskać spójne wyniki, należy kontrolować zarówno grubość parylenu C, jak i szybkość jego wytrawiania. Częsta kalibracja procesu osadzania Parylene C i myjki plazmowej jest absolutnie konieczna. Inne krytyczne aspekty, które również przyczyniają się do odtwarzalności procesu, to ostrożne obchodzenie się z urządzeniem i osadzanie półprzewodnika organicznego. Zastosowano tutaj prostą technikę odlewania matrycowego, która sama w sobie stwarza ograniczenia w odtwarzalności. Aby zminimalizować te problemy, zgodnie z opisem w kroku 10.1 protokołu, za każdym razem należy używać tej samej ilości roztworu półprzewodnikowego, a odparowywanie rozpuszczalnika powinno być w jak największym stopniu znormalizowane. Utrzymywanie stałej temperatury za pomocą płyty grzejnej i przykrywanie podłoża po każdym osadzaniu się kropli pomoże w spowolnieniu procesu parowania. Aby jeszcze bardziej zminimalizować ten problem, technikę osadzania (np. przy użyciu metody druku atramentowego) można zmienić30.
Ograniczenie proponowanego protokołu wynika z charakteru funkcjonalizacji OCMFET do pomiaru pH. Stabilność czujników pH jest ograniczona do kilku tygodni26. Jednak okno stabilności proponowanego podejścia jest wystarczająco duże, aby pokryć standardowe czasy inkubacji potrzebne do wzrostu hodowli neuronalnej (2-3 tygodnie). W przypadku dłuższych eksperymentów należy rozważyć inne rodzaje funkcjonalizacji obszaru detekcji. W protokole produkcyjnym zastosowano dedykowany styk tylny, umożliwiający dostęp elektryczny do FG. Styk ten, który pozostaje nieruchomy podczas normalnej pracy urządzenia, może być wykorzystany do charakterystyki elektrycznej urządzenia i funkcjonalności obszarów wykrywania przy użyciu różnych technik (np. elektroosadzania).
Ta procedura stanowi wygodny sposób przygotowania urządzenia z wieloma czujnikami do zastosowań komórkowych bez konieczności stosowania ekspansywnych materiałów lub pomieszczeń czystych. Pomimo ograniczeń w zakresie wydajności i stabilności wynikających z zastosowania półprzewodnika organicznego i fizycznej (nie chemicznej) funkcjonalizacji obszaru wykrywania, podobne podejścia można zastosować do przygotowania tanich (i potencjalnie jednorazowych), mechanicznie elastycznych i optycznie przezroczystych czujników i bioczujników, które mogą zapewnić naukowcom zajmującym się biologią komórkową, inżynierią tkankową i neuronauką nowatorskie specjalistyczne narzędzia do badania systemów komórkowych in vitro.

Monitorowanie in vivo komórek elektroaktywnych, takich jak neurony i kardiomiocyty, stanowi ważne i skuteczne podejście w podstawowych zastosowaniach badawczych dla ludzkiego mózgu, badaniach nad łącznościami funkcjonalnymi, farmakologii i toksykologii. Narzędzia zwykle stosowane do takich badań opierają się głównie na matrycach mikroelektrod (MEAs)1,2,3,4,5 oraz coraz bardziej wydajne i potężne urządzenia polowe (FED)6,7,8,9,10,11,12. Te dwie rodziny urządzeń umożliwiają monitorowanie i stymulację aktywności elektrycznej neuronów i kardiomiocytów w czasie rzeczywistym i zwykle charakteryzują się solidnością, łatwością obsługi i niezawodnością. Te cechy sprawiają, że MEA i FED są złotym standardem dla zastosowań elektrofizjologicznych, obecnie wykorzystywanym do łączenia ze standardowymi kulturami komórkowymi, organotypowymi wycinkami mózgu i trójwymiarowymi organoidami13,14,15,16. Pomimo ich powszechnego zastosowania i imponujących cech, MEA i FED mają pewne ograniczenia, takie jak wysoki koszt, sztywność materiałów i obecność zwykle nieporęcznej elektrody referencyjnej, która musi być umieszczona w środowisku cieczy pomiarowej i jest niezbędna do prawidłowego działania urządzeń.
Aby zbadać alternatywne rozwiązania dla komunikacji komórkowej, w ciągu ostatniej dekady włożono wiele wysiłku w badania nad urządzeniami elektronicznymi opartymi na materiałach organicznych i innowacyjnych technikach produkcji17. Wśród kilku urządzeń organicznych badanych w celu rozwiązania wyżej wymienionych ograniczeń, osobliwy tranzystor organiczny o nazwie OCMFET został niedawno zaproponowany jako ważna alternatywa dla MEA i FEDs18. Oprócz standardowych funkcji oferowanych przez technologię elektroniki organicznej, takich jak tanie materiały i techniki wytwarzania, optymalne właściwości mechaniczne i chemiczne, przezroczystość optyczna i biokompatybilność, OCMFET oferuje również bardzo wysoką czułość ładowania (ze względu na podwójnie bramkowaną strukturę) bez konieczności stosowania zewnętrznej elektrody referencyjnej. Co więcej, ten organiczny czujnik ma niezwykłą zdolność wykrywania różnych parametrów analitowych/fizycznych, w zależności od specyficznej funkcjonalności jego obszaru wykrywania, który jest oddzielony od obszaru tranzystora19,20. Wszystkie te cechy można wygodnie wykorzystać do pozyskiwania różnych parametrów w kulturze komórkowej. W szczególności, oprócz możliwości wykrycia aktywności elektrycznej neuronów/serca, możliwe jest również wykorzystanie ultra-wysokiej czułości pH oferowanej przez osobliwą podwójnie bramkowaną strukturę OCMFET za pomocą prostej funkcjonalnej fizycznej funkcjonalności21 w celu niezawodnego monitorowania niewielkich lokalnych zmian pH spowodowanych komórkową aktywnością metaboliczną.
W biosensoryce in vitro monitorowanie aktywności metabolicznej komórek jest potężnym wskaźnikiem stanu kultury i może być używane do oceny odpowiedzi komórkowej na różne bodźce, takie jak podawanie leków i stymulacja elektryczna22,23. Ponadto, w specyficznym przypadku zastosowań neuronowych, monitorowanie zarówno aktywności elektrycznej, jak i metabolicznej jest bardzo interesujące, szczególnie w farmakologii i toksykologii24. Z zamiarem wygodnego sprostania wymaganiom nowoczesnej elektrofizjologii in vitro, przy jednoczesnym zaoferowaniu wszystkich zalet OCMFET, niedawno wprowadzono urządzenie o nazwie Micro OCMFET Array (MOA). MOA to matryca oparta na OCMFET ze specjalistycznymi obszarami detekcji specjalnie zaprojektowanymi do łączenia komórkowego in vitro, umożliwiająca wieloparametryczną analizę elektrogenicznych kultur komórkowych. W szczególności dwa kanały MOA mają większe obszary wykrywania, aby zmaksymalizować ich czułość i mogą być selektywnie funkcjonalizowane w celu monitorowania określonych parametrów zainteresowania, takich jak zmiany pH pożywki hodowlanej. Pozostałe tranzystory OCMFET w strukturze działają jako zewnątrzkomórkowe czujniki aktywności elektrycznej. Rysunek 1 pokazuje strukturę 16-kanałowego MOA. Ta zdolność, w połączeniu z brakiem zewnętrznej elektrody referencyjnej, sprawia, że MOA jest bardzo interesującym narzędziem do zastosowań in vitro. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół wytwarzania wieloczujnikowego MOA do wykrywania in vitro aktywności elektrycznej i metabolicznej neuronów i kardiomiocytów. Rysunek 2 pokazuje główne etapy produkcji, użyte materiały i strukturę urządzenia.

<table><tbody><tr><td>Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440159 drukarka 3D</td><td></td></tr><tr><td>Makerbot Replicator 2x</td><td>Makerbot</td><td></td><td>https://www.makerbot.gr/. Szacowana cena: 2k-3k euro.</td></tr><tr><td>Filament</td><td></td><td></td><td></td>ABS</tr><tr><td>Anisole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296295</td><td></td></tr><tr><td>Bromograf model Hellas</td><td>Bungard</td><td></td><td>https://www.bungard.de/. Szacowana cena: 1k-2k euro.</td></tr><tr><td>Złoto</td><td>Lokalny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas fluorowodorowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695068</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207772</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td> kaptonowa <td>poliimidowa taśma izolacyjna</td></tr><tr><td>Wycinarka laserowa VLS2.30</td><td>Uniwersalne systemy</td><td></td> laserowe <td>https://www.ulsinc.com/it. Szacowana cena: 20 tys. euro.</td></tr><tr>Płytka <td></td><td></td><td>akwizycyjna systemów wielokanałowych</td><td>www.multichannelsystems.com</td></tr><tr><td>granulki NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Parylene C dimer</td><td>SCS specjalne systemy powłokowe powłoki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Silgard 184</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>PDS 2010 LABCOATER 2 System osadzania parylenu</td><td>SCS</td><td></td><td>https://scscoatings.com/. Szacowana cena: 50k euro Folia</td></tr><tr><td>PET zorientowana dwuosiowo (grubość 0,25 mm)</td><td>Goodfellow</td><td>ES301450</td><td></td></tr><tr><td>szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Myjka plazmowa Gambetti "Tucano"</td><td>Gambetti</td><td></td><td>https://www.gambetti.it/. Szacowana cena: 20 tys. euro.</td></tr><tr><td>Dodatni fotorezystu AZ1518</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodek potasu KI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>Miernik źródła 2636</td><td>Keithley</td><td></td><td>https://it.farnell.com/. Szacowana cena: 18k euro</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Ossila</td><td></td><td>https://www.ossila.com/. Szacowana cena: 2,5 tys. euro.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy SMZ745T</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Szacowana cena: 2k-3k euro.</td></tr><tr><td>Parownik</td><td></td><td></td><td></td>termiczny</tr><tr><td>KOŃCÓWKI pentacen (6,13-Bis(triizopropylosilylethynyl)-pentacen)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716006</td><td></td></tr><tr><td>Drut tytanowy</td><td>Goodfellow</td><td>TI005129</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Falc Instruments</td><td></td><td>https://www.falcinstruments.it/. Szacowana cena: 1k euro.</td></tr></tbody></table>

in vitro wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku

In Vitro Multiparametric Cellular Analysis by Micro Organic Charge-modulated Field-effect Transistor Arrays

Współczesna elektrofizjologia jest stale napędzana przez równoległy rozwój coraz bardziej wyrafinowanych narzędzi i materiałów. Z kolei odkrycia w tej dziedzinie napędzały postęp technologiczny w procesie tam i z powrotem, który ostatecznie zadecydował o imponujących osiągnięciach ostatnich 50 lat. Jednak najczęściej stosowane urządzenia używane do łączenia komórkowego (a mianowicie układy mikroelektrod i urządzenia mikroelektroniczne oparte na tranzystorach) nadal mają kilka ograniczeń, takich jak wysoki koszt, sztywność materiałów i obecność zewnętrznej elektrody referencyjnej. Aby częściowo przezwyciężyć te problemy, dokonano postępów w nowej dziedzinie naukowej zwanej bioelektroniką organiczną, co przyniosło korzyści, takie jak niższe koszty, wygodniejsze materiały i innowacyjne techniki wytwarzania.
W ciągu ostatniej dekady zaproponowano kilka interesujących nowych urządzeń organicznych do wygodnego łączenia się z hodowlami komórkowymi. Ten artykuł przedstawia protokół produkcji urządzeń do łączenia komórkowego opartych na organicznym tranzystorze polowym z modulacją ładunku (OCMFET). Urządzenia te, zwane mikro macierzami OCMFET (MOA), łączą zalety elektroniki organicznej i szczególne cechy OCMFET, aby przygotować przejrzyste, elastyczne i niereferencyjne narzędzia, za pomocą których możliwe jest monitorowanie zarówno aktywności elektrycznej, jak i metabolicznej kardiomiocytów i neuronów in vitro, umożliwiając w ten sposób wieloparametryczną ocenę elektrogenicznych modeli komórek.

Potencjał MOA został tutaj zweryfikowany zarówno pod kątem rejestracji aktywności elektrycznej, jak i monitorowania aktywności metabolicznej. Precyzyjna ocena zdolności urządzenia do wykrywania zewnątrzkomórkowych potencjałów czynnościowych opierała się na szczegółowej charakterystyce z wykorzystaniem kultur kardiomiocytów szczura (w szczególności pierwotnych kardiomiocytów szczura mierzonych w 8 dniu in vitro [DIV])18. Rysunek 3A przedstawia kompletny MOA z 16 OCMFET. Górny wstawka pokazuje przykład konfluentnej kultury kardiomiocytów szczura przylegającej do powierzchni MOA. Aby podkreślić ich żywotność, komórki zostały poddane immunobarwieniu na białko sarkomerowe, tropomiozynę, po zakończeniu sesji rejestracyjnej. Dolna wstawka przedstawia sygnał z pojedynczego kardiomiocytu zmierzony za pomocą OCMFET.
Co ciekawe, urządzenie było w stanie wykryć spontaniczną aktywność elektryczną oraz aktywność indukowaną po podaniu różnych substancji chemicznych, co przedstawiono na Rysunku 3B. Walidacja ta była kluczowa dla wykazania możliwości zastosowania tego podejścia do interfejsowania z komórkami elektrogennymi. Dzięki konfiguracji macierzy, MOA umożliwiło również rekonstrukcję prędkości propagacji sygnału kardiologicznego, co potwierdziło przydatność systemu do badania sieci komórkowych (Rysunek 3C). W celu dalszej walidacji i określenia rzeczywistego limitu detekcji urządzenia, MOA przetestowano również z neuronami prążkowia (21 DIV)18, uzyskując interesujące wyniki w zakresie amplitudy sygnału i niezawodności pomiarów. Jak widać na Rysunku 3D, OCMFET mógł wzmacniać potencjały polowe neuronów z niezwykłą stabilnością, wykazując stosunki sygnału do szumu (SNRS) do 3,2 (w tym samym zakresie, co SNRs uzyskane przy użyciu standardowych MEA25). Układ rejestrujący składał się z niestandardowej elektroniki wielokanałowej do polaryzacji tranzystorów oraz odczytu i kondycjonowania sygnału. Każdy kanał rejestracji elektrycznej posiada pierwszy stopień składający się z przetwornika I/V z rezystorem sprzężenia zwrotnego 1 MΩ oraz filtra pasmowo-przepustowego 150 Hz-1,3 kHz ze wzmocnieniem napięciowym 110. Dla wszystkich przedstawionych pomiarów tranzystory były polaryzowane przy VDS = VGS = -1 V. Konwersja A/D oraz wizualizacja i przechowywanie danych zostały przeprowadzone przy użyciu karty akwizycji danych (patrz Tabela Materiałów). Wszystkie sesje pomiarowe przeprowadzono w klatce Faradaya, aby zminimalizować elektryczny szum środowiskowy wpływający na system.
Jak wspomniano wcześniej, dzięki wykorzystaniu prostej funkcjonalizacji fizycznej przedstawionej w protokole, możliwe było przygotowanie wysoce czułych czujników pH o odpowiedzi supernernstowskiej. Ze względu na zaprezentowaną metodę wykonania, urządzenia te do pomiaru pH mogły zostać zintegrowane w układzie MOA i wykorzystane do monitorowania niewielkich zmian pH indukowanych aktywnością metaboliczną pierwotnych neuronów hipokampa szczura26. W szczególności, jak pokazano na Rysunku 4, w celu zademonstrowania wykonalności tej metody, selektywnie funkcjonalizowano tylko jeden z dwóch tranzystorów OCMFET przeznaczonych do detekcji niskich częstotliwości. Ta selektywna funkcjonalizacja pozwoliła na ocenę odpowiedzi obu tranzystorów OCMFET na chemicznie indukowane zmiany metaboliczne: w szczególności, wysoki stan metaboliczny można uzyskać przy użyciu bikukuliny (BIC), inhibitora receptorów GABA A27, natomiast niski stan metaboliczny można wywołać poprzez dodanie tetrodotoksyny (TTX), która ostatecznie prowadzi do śmierci komórkowej28. Układ rejestrujący składał się z tej samej specjalistycznej elektroniki wielokanałowej, która była używana do pomiarów aktywności elektrycznej.
W przeciwieństwie do poprzedniego przypadku, do rejestracji wolnych zmian indukowanych aktywnością metaboliczną komórek wykorzystano dwa dedykowane kanały. Każdy kanał składał się z prostego obwodu zbudowanego z dwóch głównych bloków: przetwornika I/V z rezystorem sprzężenia zwrotnego 1 MΩ oraz filtru dolnoprzepustowego o częstotliwości odcięcia 10 Hz. Tranzystory spolaryzowano napięciami VDS = VGS = -1 V, a wszystkie pomiary przeprowadzono wewnątrz klatki Faradaya, aby zminimalizować wpływ zewnętrznych szumów na zapisy (jest to szczególnie istotny aspekt, biorąc pod uwagę niskie fluktuacje prądu indukowane aktywnością metaboliczną komórek). Podczas eksperymentów hodowle utrzymywano w słabo buforowanym medium hodowlanym, a cały układ umieszczono w kontrolowanym środowisku (37 °C i ciągły przepływ CO2/powietrza). Zgodnie z oczekiwaniami, tylko prąd pH-czułego OCMFET mógł być modulowany poprzez dodanie 25 µM BIC. Potwierdzono to ponadto poprzez wywołanie zmiany prądu za pomocą odpowiadającej jej zmiany aktywności metabolicznej komórek.
Ten sam eksperyment powtórzono po dodaniu 10 µM TTX, co doprowadziło do stopniowego spowolnienia metabolizmu komórkowego. Po dodaniu TTX ani OCMFET wrażliwy na pH, ani ten niewrażliwy na pH nie wykazały żadnej reakcji, co potwierdziło skuteczność zastosowanego podejścia. Wyniki te demonstrują efektywność proponowanej funkcjonalizacji oraz jej względną stabilność przez okres do 2 tygodni. Istotnym wnioskiem, jaki można wyciągnąć z przeprowadzonych eksperymentów (zarówno w zakresie aktywności elektrycznej, jak i metabolicznej), jest możliwość przygotowania różnych rodzajów sensorów poprzez selektywną funkcjonalizację poszczególnych OCMFET w obrębie tego samego obszaru hodowli. Aspekt ten stanowi nieoczywiste osiągnięcie w biosensoryce dla zastosowań komórkowych, ponieważ możliwość monitorowania różnych parametrów w obrębie tej samej kultury komórkowej jest kluczowa dla lepszej charakterystyki złożoności tych systemów biologicznych.
<img alt="Schemat OCMFETs dla aktywności metabolicznej i elektrycznej; kanał tranzystora; bramka sterująca; kontakty S/D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Widok z góry 16-kanałowej matrycy MOA do monitorowania metabolicznego i elektrycznego komórek elektroaktywnych. Pasek skali = 1 cm. Skróty: OCMFETs = organiczne tranzystory polowe z modulacją ładunku; FG = bramka pływająca; S/D = źródło/dren; MOA = mikrostrukturalna matryca OCMFET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat OCMFET przedstawiający etapy wytwarzania i warstwy służące do monitorowania aktywności metabolicznej i elektrycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Główne etapy wytwarzania MOA do monitorowania metabolicznego i elektrycznego komórek elektroaktywnych. (A i B) Odparowana warstwa Ti jest wzorowana za pomocą standardowego procesu fotolitograficznego w celu przygotowania bramki pływającej tranzystorów OCMFET. (C) Osadzanie 15 nm Parylenu C. Warstwa ta, wraz z natywnym tlenkiem Ti, pełni rolę dielektryka bramki tranzystorów. (D i E) Warstwa Parylenu C jest wzorowana przy użyciu obróbki plazmą tlenową. Wzorowana warstwa fotorezystu jest wykorzystywana do selektywnego odsłonięcia obszarów czujnych dla pomiarów elektrycznych oraz tylnych kontaktów bramki pływającej. (F) Wzorowanie górnych kontaktów Au, mianowicie źródła, drenu, bramki sterującej i tylnego kontaktu bramki pływającej. W celu poprawy parametrów elektrycznych urządzenia zastosowano technikę samowyrównania. (G-I) Osadzanie drugiej warstwy Parylenu C na obszarze czujnym tranzystorów OCMFET do monitorowania aktywności metabolicznej. Po ekspozycji na plazmę tlenową warstwa ta będzie pełnić funkcję membrany wrażliwej na pH (J). (K) Przekrój poprzeczny kompletnego MOA (z materiałami) po osadzeniu organicznego półprzewodnika (TIPS Pentacene) i ustawieniu komory hodowlanej. Skróty: OCMFETs = organiczne tranzystory polowe z modulacją ładunku; FG = bramka pływająca; S/D = źródło/dren; MOA = mikrotablica OCMFET; CG = bramka sterująca; PET = politereftalan etylenu; Par C = Parylen C; TIPS = 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacene; ABS = akrylonitryllybutadienostyren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ detekcji z macierzą mikroelektrod; wykresy wpływu norepinefryny na aktywność kanałów jonowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rejestracja aktywności elektrycznej komórek za pomocą MOA. (A) Konfluentna hodowla kardiomiocytów szczura (8 DIV) przylegająca do powierzchni MOA, utrwalona po sesji pomiarowej i poddana immunobarwieniu na białko sarkomerowe, tropomiozynę (lewy górny wstawka). Dolna wstawka: przykład sygnału z pojedynczego kardiomiocytu zmierzonego za pomocą OCMFET. Pasek skali = 150 µm. (B) Chemiczna regulacja aktywności elektrycznej hodowli kardiomiocytów. Przyspieszenie aktywności było wynikiem dodania 100 mM norepinefryny, natomiast supresja wynikała z dodania 100 mM verapamilu. Po lewej: modulacja częstotliwości skurczów; po prawej: statystyki z 5 OCMFET – średnia i odchylenie standardowe: liczba impulsów w ciągu 4 min aktywności podstawowej (129 ± 4.6), indukowanej norepinefryną (280 ± 28.6) oraz indukowanej verapamilem (15 ± 1.9). (C) Rekonstrukcja propagacji sygnału kardiologicznego. Po prawej: wykres rastrowy spontanicznej aktywności hodowli wskazujący na propagację sygnału z miejsca 14 do miejsca 41 (po prawej). (D) Potencjały czynnościowe komórek prążkowiowych z zarodka szczura (21 DIV). Rysunek zmodyfikowany na podstawie 18. Skróty: OCMFET = organic charge-modulated field-effect transistor; MOA = micro OCMFET array; NE = norepinefryna; VER = verapamil; DIV = dni in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza OCMFET wrażliwego na pH; wykresy natężenia prądu w funkcji czasu, układ półprzewodnika, obraz mikroskopowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62907/62907fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Rejestracja aktywności metabolicznej za pomocą MOA. Odpowiedź kanałów (A) wrażliwych na pH i (B) niewrażliwych na pH w obrębie MOA na dodanie 25 µM BIC przed i po dodaniu 10 µM TTX. Po dodaniu TTX zachowanie kanału wrażliwego na pH staje się zbliżone do zachowania kanału niewrażliwego na pH. W szczególności nie obserwuje się zmian natężenia prądu po dodaniu BIC z powodu śmierci komórek wywołanej przez TTX. (C) MOA do rejestracji aktywności metabolicznej. OCMFET-y wrażliwe na pH i niewrażliwe na pH są obramowane odpowiednio kolorem zielonym i czerwonym. Wstawka: zdrowe neurony hipokampa hodowane na urządzeniu po 15 DIV. Pasek skali = 50 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie 26. Skróty: OCMFET = organiczny tranzystor polowego z modyfikacją ładunku; MOA = macierz mikro-OCMFET; BIC = bikukulina; TTX = tetrodotoksyna; DIV = dni in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62907/62907fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania urządzenia opartego na tranzystorze polowym z modulacją ładunku organicznego (OCMFET) do łączenia komórkowego in vitro. Urządzenie, zwane macierzą micro OCMFET, jest elastycznym, tanim i niereferencyjnym urządzeniem, które umożliwi monitorowanie aktywności elektrycznej i metabolicznej elektroaktywnych kultur komórkowych.

In vitro Wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku

Modern electrophysiology has been constantly fueled by the parallel development of increasingly sophisticated tools and materials. In turn, discoveries in ...

Metoda ta stanowi oryginalne rozwiązanie dla analizy komórkowej, dziedziny, w której obecnie brakuje odpowiednich systemów rejestracji, które są wieloparametryczne, biokompatybilne, zgodne mechanicznie i wreszcie tanie. Dzięki tej metodzie możliwe jest uzyskanie systemów detekcyjnych o różnych możliwościach wykrywania, takich jak możliwość monitorowania zarówno aktywności elektrycznej, jak i metabolicznej komórek za pomocą jednego rodzaju elektronicznego urządzenia organicznego. Systemy wieloparametryczne in vitro nie tylko przyczyniają się do ograniczenia liczby eksperymentów na zwierzętach, ale także są niezwykle obiecującym narzędziem w różnych dziedzinach biomedycyny, takich jak medycyna spersonalizowana i badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi.Wszystko to dzięki dużej wszechstronności tranzystora polowego z ładunkiem organicznym, modulatorem, możliwa jest również integracja innych czujników, takich jak na przykład czujniki do wykrywania objętości różnych biomarkerów. Wytnij kawałki o wymiarach 6 na 6 centymetrów kwadratowych z nowego arkusza PET o grubości 250 mikrometrów, a następnie spłucz podłoża PET acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną. Wysusz je za pomocą strumieni i azotu i przechowuj na czystych, plastikowych szalkach Petriego.W przypadku osadzania tytanu należy wstępnie oczyścić podłoża tlenem plazmowym i umieścić je na uchwycie podłoża w komorze zaplecza parownika termicznego. Następnie umieść 60 miligramów tytanu w tyglu, zamknij żaluzję i pompuj w dół komorę parowania, aż osiągnie 10 do 6 tury. Zwiększ moc parownika, aż tygiel zacznie świecić na czerwono i odczekaj 30 sekund.Następnie otwórz migawkę, zwiększ moc do 60% i poczekaj 60 sekund. Po 60 sekundach zamknij migawkę i zmniejsz zasilanie. W celu wykonania wzoru należy umieszczać po jednym podłożu na powlekarce Spin Coater umieszczonej wewnątrz dygestoria.Za pomocą jednorazowej plastikowej pipety nałóż cztery mililitry fotorezystu na podłoże, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości dwóch mikrometrów, używając parametrów powlekania wirowego wymienionych w manuskrypcie tekstowym. Upiecz fotorezystor na miękko, umieszczając podłoże na płycie grzejnej, a następnie przechowuj podłoże w szalce Petriego owiniętej folią aluminiową lub plastikowym pojemniku. Następnie umieść podłoże na wykresie brahmy i umieść plastikową maskę fotolitograficzną, ale pożądany układ pływających bramek na podłożu, wystaw maskę na działanie światła UV od góry przez jedną minutę.Następnie ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, zanurz podłoże na 10 sekund w szklanym pojemniku wypełnionym roztworem rozwijającym. Następnie szybko spłucz go w wodzie dejonizowanej, wytraw odsłonięty tytan, zanurzając go w roztworze do trawienia tytanu na 15 sekund, a następnie spłucz wodą dejonizowaną i wysusz azotem. Optycznie sprawdź podłoże i usuń fotorezystor za pomocą acetonu.Następnie spłucz podłoże alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną i osusz je azotem. W celu osadzania dielektryka bramki umieść 300 miligramów dimeru Parylene C na powlekarce parylenu i ustaw wartości ciśnienia. Po osadzeniu należy oczyścić podłoża acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną i wysuszyć je azotem, jak pokazano wcześniej.Po osadzeniu fotorezystu na podłożu, jak pokazano wcześniej, umieść podłoże w bromografie i umieść plastikową maskę fotolitograficzną na podłożu w celu odchylenia pod mikroskopem stereoskopowym. Po minutowej ekspozycji na promieniowanie UV od góry ostrożnie zdejmij maskę, jak pokazano wcześniej. Wywołaj fotorezyst, jak pokazano wcześniej, a następnie naświetl podłoże wzorzystym fotorezystantem plazmy tlenowej, aby usunąć Parylen C z obszarów wykrywania.Umieść podłoża w szklanym pojemniku wypełnionym acetonem w kąpieli ultradźwiękowej na 10 sekund, aby całkowicie usunąć fotorezystu, a następnie spłucz podłoża acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą i wysusz je azotem, jak pokazano wcześniej. Po osadzeniu fotorezystu na podłożu, jak pokazano wcześniej, umieść podłoże w burmografie i umieść na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z prostymi czarnymi prostokątami, które całkowicie zakrywają obszary tranzystorów. Po minutowej ekspozycji na światło UV od góry i od dołu ostrożnie zdejmij maskę i wywołaj fotorezyst, jak pokazano wcześniej.Oczyść podłoża delikatną obróbką plazmową, aby zwiększyć przyczepność metalu do Parylenu C, a następnie umieść je na uchwycie podłoża w komorze próżniowej parownika termicznego. Umieść 30 miligramów złota w tyglu, zamknij żaluzję i pompuj w dół komorę parowania, aż osiągnie 10 do minus 5 Torów. Zwiększ moc parownika, aż tygiel zacznie świecić na czerwono i odczekaj 30 sekund.Otwórz migawkę, zwiększ moc do 40% i odczekaj 60 sekund. Następnie zamknij migawkę i zmniejsz zasilanie. Umieść podłoża w pojemniku z acetonem w kąpieli ultradźwiękowej na 10 sekund, aby oderwać fotorezyst, usuwając w ten sposób złoto z kanału tranzystorów.Spłucz, wysusz i ołóż fotorezystor na podłożach, jak pokazano wcześniej. Po umieszczeniu podłoża w bromografie, umieść na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z żądanymi źródłami, drenami i układem bramek sterujących. Po jednominutowej ekspozycji na promieniowanie UV od góry, ostrożnie zdejmij maskę i wywołaj fotorezyst, jak pokazano wcześniej.Wytrawić odsłonięte złoto, zanurzając je w roztworze do wytrawiania złota na 10 sekund, a następnie spłucz wodą dejonizowaną i wysusz przy użyciu azotu, jak pokazano. Po oględzinach optycznych podłoża należy usunąć fotorezystor za pomocą acetonu, spłukać alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną i osuszyć azotem. Po umieszczeniu fotorezystu na podłożu, umieścić podłoże i bromograf w miejscu na podłożu plastikowej maski fotolitograficznej z otworami odpowiadającymi obszarom wykrywania pH OCMFET.Po minutowej ekspozycji na promieniowanie UV od góry ostrożnie zdejmij maskę, jak pokazano wcześniej. Opracuj fotorezyst, jak pokazano wcześniej, a następnie zabezpiecz całe urządzenie z wyjątkiem obszarów pomiaru pH poliimidową taśmą izolacyjną i nałóż 500-nanometrową warstwę parylenu C na podłoże przy użyciu parametrów wymienionych w manuskrypcie tekstowym. Po ostrożnym usunięciu poliamidowej taśmy izolacyjnej, wystawić podłoże na działanie plazmy tlenowej, aby aktywować parylen C w obszarach wykrywania pH OCMFET.Następnie umieść podłoża w pojemniku z acetonem w kąpieli ultradźwiękowej na 10 sekund, aby całkowicie usunąć fotorezystor. Podłoża spłukać acetonem i alkoholem izopropylowym i osuszyć azotem. Umieść podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 50 stopni Celsjusza przed wylaniem jednej mikrolitrowej kropli roztworu półprzewodnikowego na każdy obszar kanału.Przykryj całe podłoże pokrywką i wysusz pod kapturem chemicznym przez 30 minut. Wytnij urządzenie z PET, ręcznie lub za pomocą wycinarki laserowej. Zlewająca się hodowla kardiomiocytów szczurów przylegających do powierzchni MOA była immunologią dla białka sarkomerowego tropomiozyny.Przykład pojedynczego sygnału kardiomiocytów mierzonego za pomocą OCMFET pokazano tutaj. Urządzenie może wykrywać zarówno spontaniczną komórkową aktywność elektryczną, jak i aktywność wywołaną po podaniu różnych substancji chemicznych lub leków. Dzięki konfiguracji matrycowej MOA miał on oszacować prędkość propagacji sygnału sercowego w obrębie hodowli komórkowej.OCMFET był również w stanie wzmocnić potencjały pola neuronalnego z niezwykłą stabilnością i dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Różne reakcje kanału MOA wrażliwego i niewrażliwego na pH na stymulację chemiczną bikukuliną i tetrodotoksyną wykazały zdolność urządzenia do rozróżniania różnych komórkowych stanów metabolicznych. Dokładnie sprawdź podłoże przed każdym etapem protokołu produkcyjnego.To znacznie zwiększy wydajność procesu. Dzięki zastosowaniu różnych metod funkcjonalizacji możliwe jest uzyskanie czujników chemicznych i fizycznych, które mogą być wykorzystywane w aplikacjach takich jak laboratorium na chipie i zrobotyzowanej skórze.

in-vitro-multiparametric-cellular-analysis-micro-organic-charge

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Wiele urządzeń mikroprzepływowych zostało opracowanych do użytku w badaniach nad elektrotaksją. Jednak żaden z tych chipów nie pozwala na efektywne badanie jednoczesnego wpływu substancji chemicznych i pola elektrycznego (EF) na komórki. Opracowaliśmy urządzenie na bazie polimetakrylanu metylu, które zapewnia lepiej kontrolowany współistniejący ślad węglowy i stymulację chemiczną do wykorzystania w badaniach nad elektrotaksją.

Badania elektrotaktyczne komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego o podwójnym polu elektrycznym

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Ten protokół opisuje ogólną strategię regeneracji komercyjnych mikroelektrod złotych wyposażonych w bezznacznikowy analizator komórek, mający na celu zaoszczędzenie na wysokich kosztach eksploatacji testów opartych na mikroprocesorach. Proces regeneracji obejmuje trawienie trypsyną, płukanie etanolem i wodą oraz etap wirowania, który umożliwia wielokrotne użycie mikroczipów.

Regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Poznaj metodę wieloparametrycznej analizy komórkowej in vitro za pomocą mikromacierzy tranzystorów OCMFET. To elastyczne, niskokosztowe urządzenie umożliwia monitorowanie aktywności elektrycznej i metabolicznej kultur komórkowych.

In vitro Wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku

Przeglądaj więcej filmów