Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Za pomocą tej metody możemy bezpośrednio badać tworzenie się rurki serca, pętle i tworzenie się pełnej komory bez dalszych eksperymentalnych manipulacji zarodkiem myszy. Chociaż jako przykładu używamy myszy MLC-2v-tdTomato, ta prosta metoda może być szeroko stosowana z innymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest bardzo prosty i nie wymaga żadnych skomplikowanych technik ani sprzętu.

Można go wykonać w zwykłych warunkach laboratoryjnych. Po kryciu samicy z samcami myszy, zarówno MLC-2v-tdTomato w wieku od 8 do 10 tygodni, codziennie rano sprawdzaj tamy pod kątem zatyczek pochwowych. Połóż ciężarne matki, poddane eutanazji w różnych dniach po stosunku, w pozycji leżącej i spryskaj brzuch 70% etanolem.

Użyj ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby otworzyć jamę brzuszną poprzez nacięcie zarówno skóry, jak i ściany brzucha. Po zlokalizowaniu obustronnych rogów macicy w grzbietowej części jamy brzusznej, należy oddzielić całą macicę za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby ostrożnie przeciąć nad jajowodami po obu stronach. Umieść całą wypreparowaną macicę na 10-centymetrowej szalce Petriego z lodowatym PBS.

Za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy ostrożnie oddziel każdy worek owodniowy wzdłuż rogu macicy. Za pomocą pęsety przenieś każdy zarodek na 35-milimetrową płytkę hodowlaną wypełnioną lodowatym PBS. Za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy otwórz worek owodniowy i odsłoń każdy zarodek, odcinając pępowinę, a następnie wytnij jak najwięcej dodatkowych tkanek embrionalnych, nie uszkadzając zarodków.

Pod mikroskopem preparacyjnym z oświetlaczem mikroskopu światłowodowego odetnij głowę zarodka i przenieś ją do 1,5 mililitrowej probówki ze 100 mikrolitrami buforu A w celu późniejszego genotypowania w celu skorelowania z wynikami obrazowania epifluorescencyjnego. Za pomocą cienkich kleszczy otwórz klatkę piersiową zarodka. Ostrymi nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami usuń serce z płuc i naczyń krwionośnych.

Użyj pęsety, aby przenieść wypreparowane serce embrionalne na 35-milimetrową płytkę hodowlaną z PBS. Umieść płytkę z sercami embrionalnymi myszy pod epifluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Użyj cienkich kleszczy, aby ustawić embrionalne serca tak, aby rozwijające się komory były skierowane w stronę egzaminatora.

Dostosuj ostrość za pomocą obiektywu 0,63x w trybie jasnego pola. Rób ekspozycje w jasnym polu i rób wiele zdjęć. Aby zobrazować ekspresję tdTomato, wyłącz oświetlacz mikroskopu światłowodowego i ustaw filtr na czerwoną fluorescencję.

W razie potrzeby dostosuj ostrość obrazu, dostosuj jasność i kontrast, wykonaj ekspozycję z czerwonej jarzeniówki i zrób wiele zdjęć. W celu genotypowania zarodków należy gotować wcześniej wyizolowane próbki głów w buforze A w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wirować przez dwie minuty przy 11, 360 razy G. Przenieść 20 mikrolitrów supernatantu do nowej 1,5 mililitrowej probówki z 20 mikrolitrami buforu B i wymieszać.

Użyj 4,5 mikrolitra zmieszanego supernatantu jako matrycy DNA i połącz go z 0,5 mikrolitra każdego z 10 mikromolowych starterów do przodu i do tyłu, 10 mikrolitrami 2x wstępnie zmieszanej polimerazy i buforu reakcyjnego, a następnie dodaj wodę do całkowitej objętości 20 mikrolitrów. Przeprowadź PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie. Załaduj zakończoną reakcję do drabinki DNA 100 par zasad na 1% żelu agarozowym i uruchom pod napięciem 140 woltów w buforze 1x TAE przez 25 minut.

Umieść gotowy żel na transiluminatorze UV i włącz światło UV, aby zidentyfikować prążki DNA. MLC-2v jest uważany za najwcześniejszy marker specyfikacji komory komorowej podczas rozwoju serca. U myszy reporterowych MLC-2v-tdTomato stosunkowo słaba ekspresja tdTomato w liniowej rurze serca przy E8,0 staje się silniejsza przy E8,5, jak pokazano przy użyciu obrazowania epifluorescencyjnego zarodków w całości.

Korzystając z obrazowania epifluorescencyjnego całego wypreparowanego serca, można łatwo określić tworzenie się komór podczas rozwoju serca myszy. W wypreparowanym sercu z całego zarodka myszy w E10.5 ekspresję reporterową MLC-2v-tdTomato wykazano w komorowej części serca, a nie w drodze dopływu, drodze odpływu lub przyszłych przedsionkach. W E12,5 do E13,5 tdTomato reporter ulega ekspresji wyłącznie w komorach czterokomorowego serca.

Podobny specyficzny dla komór wzorzec ekspresji wykazano w wypreparowanym zarodku myszy przy E16,5. Po pełnym obrazowaniu określono genotyp zarodków za pomocą dwóch zestawów starterów do genotypowania PCR, potwierdzając homozygotyczne zarodki z allelem knock-in tdTomato, heterozygotyczne i zarodki typu dzikiego. Ta metoda jest dość prosta i prosta do wykonania.

Kluczowym krokiem jest wypreparowanie embrionalnych serc. Zrozumienie anatomii serca podczas rozwoju serca jest niezbędne do skutecznego odizolowania serca od całego zarodka.