Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry
17 kwietnia 2019
Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.
Za pomocą tej metody możemy bezpośrednio badać tworzenie się rurki serca, pętle i tworzenie się pełnej komory bez dalszych eksperymentalnych manipulacji zarodkiem myszy. Chociaż jako przykładu używamy myszy MLC-2v-tdTomato, ta prosta metoda może być szeroko stosowana z innymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest bardzo prosty i nie wymaga żadnych skomplikowanych technik ani sprzętu.
Można go wykonać w zwykłych warunkach laboratoryjnych. Po kryciu samicy z samcami myszy, zarówno MLC-2v-tdTomato w wieku od 8 do 10 tygodni, codziennie rano sprawdzaj tamy pod kątem zatyczek pochwowych. Połóż ciężarne matki, poddane eutanazji w różnych dniach po stosunku, w pozycji leżącej i spryskaj brzuch 70% etanolem.
Użyj ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby otworzyć jamę brzuszną poprzez nacięcie zarówno skóry, jak i ściany brzucha. Po zlokalizowaniu obustronnych rogów macicy w grzbietowej części jamy brzusznej, należy oddzielić całą macicę za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby ostrożnie przeciąć nad jajowodami po obu stronach. Umieść całą wypreparowaną macicę na 10-centymetrowej szalce Petriego z lodowatym PBS.
Za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy ostrożnie oddziel każdy worek owodniowy wzdłuż rogu macicy. Za pomocą pęsety przenieś każdy zarodek na 35-milimetrową płytkę hodowlaną wypełnioną lodowatym PBS. Za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy otwórz worek owodniowy i odsłoń każdy zarodek, odcinając pępowinę, a następnie wytnij jak najwięcej dodatkowych tkanek embrionalnych, nie uszkadzając zarodków.
Pod mikroskopem preparacyjnym z oświetlaczem mikroskopu światłowodowego odetnij głowę zarodka i przenieś ją do 1,5 mililitrowej probówki ze 100 mikrolitrami buforu A w celu późniejszego genotypowania w celu skorelowania z wynikami obrazowania epifluorescencyjnego. Za pomocą cienkich kleszczy otwórz klatkę piersiową zarodka. Ostrymi nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami usuń serce z płuc i naczyń krwionośnych.
Użyj pęsety, aby przenieść wypreparowane serce embrionalne na 35-milimetrową płytkę hodowlaną z PBS. Umieść płytkę z sercami embrionalnymi myszy pod epifluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Użyj cienkich kleszczy, aby ustawić embrionalne serca tak, aby rozwijające się komory były skierowane w stronę egzaminatora.
Dostosuj ostrość za pomocą obiektywu 0,63x w trybie jasnego pola. Rób ekspozycje w jasnym polu i rób wiele zdjęć. Aby zobrazować ekspresję tdTomato, wyłącz oświetlacz mikroskopu światłowodowego i ustaw filtr na czerwoną fluorescencję.
W razie potrzeby dostosuj ostrość obrazu, dostosuj jasność i kontrast, wykonaj ekspozycję z czerwonej jarzeniówki i zrób wiele zdjęć. W celu genotypowania zarodków należy gotować wcześniej wyizolowane próbki głów w buforze A w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wirować przez dwie minuty przy 11, 360 razy G. Przenieść 20 mikrolitrów supernatantu do nowej 1,5 mililitrowej probówki z 20 mikrolitrami buforu B i wymieszać.
Użyj 4,5 mikrolitra zmieszanego supernatantu jako matrycy DNA i połącz go z 0,5 mikrolitra każdego z 10 mikromolowych starterów do przodu i do tyłu, 10 mikrolitrami 2x wstępnie zmieszanej polimerazy i buforu reakcyjnego, a następnie dodaj wodę do całkowitej objętości 20 mikrolitrów. Przeprowadź PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie. Załaduj zakończoną reakcję do drabinki DNA 100 par zasad na 1% żelu agarozowym i uruchom pod napięciem 140 woltów w buforze 1x TAE przez 25 minut.
Umieść gotowy żel na transiluminatorze UV i włącz światło UV, aby zidentyfikować prążki DNA. MLC-2v jest uważany za najwcześniejszy marker specyfikacji komory komorowej podczas rozwoju serca. U myszy reporterowych MLC-2v-tdTomato stosunkowo słaba ekspresja tdTomato w liniowej rurze serca przy E8,0 staje się silniejsza przy E8,5, jak pokazano przy użyciu obrazowania epifluorescencyjnego zarodków w całości.
Korzystając z obrazowania epifluorescencyjnego całego wypreparowanego serca, można łatwo określić tworzenie się komór podczas rozwoju serca myszy. W wypreparowanym sercu z całego zarodka myszy w E10.5 ekspresję reporterową MLC-2v-tdTomato wykazano w komorowej części serca, a nie w drodze dopływu, drodze odpływu lub przyszłych przedsionkach. W E12,5 do E13,5 tdTomato reporter ulega ekspresji wyłącznie w komorach czterokomorowego serca.
Podobny specyficzny dla komór wzorzec ekspresji wykazano w wypreparowanym zarodku myszy przy E16,5. Po pełnym obrazowaniu określono genotyp zarodków za pomocą dwóch zestawów starterów do genotypowania PCR, potwierdzając homozygotyczne zarodki z allelem knock-in tdTomato, heterozygotyczne i zarodki typu dzikiego. Ta metoda jest dość prosta i prosta do wykonania.
Kluczowym krokiem jest wypreparowanie embrionalnych serc. Zrozumienie anatomii serca podczas rozwoju serca jest niezbędne do skutecznego odizolowania serca od całego zarodka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokoły dotyczące badania rozwoju serca myszy z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej całego preparatu na myszach z wbudowanym reporterem MLC-2v-tdTomato. Metoda umożliwia bezpośrednią wizualizację etapów formowania komór sercowych bez użycia skomplikowanych technik histochemicznych.
Kluczowe Elementy Badań
Dział Neurologii
- Neuroscience
- Developmental Biology
- Cardiovascular Research
Wprowadzenie
- Rozwój serca jest kluczowym obszarem badań w biologii rozwojowej.
- Tradycyjne metody badania morfologii serca mogą być pracochłonne.
- Myszy reporterowe fluorescencyjne stanowią nowe podejście do wizualizacji struktur serca.
- Myszy MLC-2v-tdTomato służą jako użyteczny model dla tych badań.
Cel Badań
- Umożliwienie prostej metody wizualizacji etapów rozwoju serca.
- Wyrażenie przydatności myszy reporterowych fluorescencyjnych w badaniach rozwojowych.
- Ułatwienie badań bez potrzeby stosowania skomplikowanych technik.
Wykorzystane Metody
- Mikroskopia epifluorescencyjna całego preparatu.
- Wykorzystanie myszy z wbudowanym reporterem MLC-2v-tdTomato.
- Dissekcja zarodków na różnych etapach rozwoju.
- Prosty zestaw eksperymentalny odpowiedni do regularnych warunków laboratoryjnych.
Główne Wyniki
- Pomyślna wizualizacja formowania rurki serca i zagięcia.
- Wyraźna obserwacja pełnego formowania komór.
- Metoda zastosowalna do innych linii myszy reporterowych fluorescencyjnych.
- Protokół zademonstrował łatwość użycia w standardowym środowisku laboratoryjnym.
Wnioski
- Przedstawiona metoda upraszcza badanie rozwoju serca.
- Umożliwia naukowcom wizualizację krytycznych etapów bez skomplikowanych procedur.
- To podejście może wzbogacić zrozumienie morfogenezy serca.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of ventricular chamber formation in mouse embryos using fluorescent reporter lines, supporting early-stage target validation in cardiovascular drug discovery. By simplifying heart morphology assessment without complex histochemistry, it enhances mechanistic de-risking of developmental pathways. The approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on cardiac morphogenesis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular specification mechanisms using MLC-2v as an early marker for chamber development.
- Operational Value: Supports functional target validation by directly linking genetic reporters to structural heart formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline ventricular morphology.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible whole-mount epifluorescent imaging across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying conserved cardiac morphogenesis pathways across vertebrates.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating tdTomato expression with ventricular chamber maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling direct assessment of cardiac structural phenotypes following genetic or pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting heart tube looping and chamber septation.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts to compare ventricular formation across experimental conditions.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based measurements of tdTomato expression to evaluate ventricular specificity.
- Translational Research: Connects early ventricular patterning to preclinical continuity through conserved developmental mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple fluorescent reporter lines beyond MLC-2v-tdTomato.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in ventricular chamber formation assessment.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized dissection and imaging protocols in regular lab settings.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cardiac structural phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying developmental liabilities in lead compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection and cardiac anatomy identification.
- Dependent on epifluorescent microscopy with appropriate filter sets for tdTomato detection.
- Necessitates standardization of embryo staging and heart isolation procedures across users.
- Involves adaptation considerations when applying to different fluorescent reporter lines with varying expression patterns.
- Limited by the need for embryonic tissue access, restricting use to ex vivo developmental studies.
