Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych
10 marca 2020
W tym protokole opisujemy procedury jakościowej i ilościowej analizy fenotypów rozwojowych u myszy związanych z wrodzonymi wadami serca.
Protokół ten standaryzuje nowe techniki analizy tkanek, dzięki czemu mogą być szerzej stosowane przez inne grupy, które również badają wrodzone wady serca. Ponieważ zarówno techniki analizy jakościowej, jak i ilościowej mają swoje wady i zalety, metodologia ta wykorzystuje obie te techniki, aby odpowiedzieć na najszerszy zakres pytań eksperymentalnych. Techniki te mogą mieć pozytywny wpływ na kardiologiczne metody diagnostyczne.
Na przykład patolodzy mogliby zastosować nasze techniki mikroskopowej analizy tkanki serca do diagnozowania chorób serca u ludzi na podstawie próbek biopsyjnych. Protokół ten może być stosowany w badaniach kardiologii rozwojowej lub kardiologii ogólnej. Jednak metody te zapewniają również różne przydatne techniki, które można zastosować do dowolnej analizy tkanek.
Aby zebrać serca embrionalne od 15 do 15,5 dnia, zabezpiecz kończyny ciężarnej matki i zaczynając od cewki moczowej aż do mostka, ostrożnie wykonaj nacięcie w kształcie litery I wzdłuż tułowia. Używając kleszczy ruchem nabierającym, delikatnie wyjmij macicę z jamy brzusznej, chwytając w razie potrzeby powierzchowne tkanki macicy za pomocą cienkich kleszczy, aby pomóc w ekstrakcji. Użyj nożyczek, aby uwolnić macicę z brzucha.
Po namoczeniu macicy w lodowatym PBS, włóż narząd do naczynia preparacyjnego. Za pomocą nożyczek pokrój macicę na poszczególne sekcje, z których każda zawiera oddzielny zarodek. Za pomocą dwóch par cienkich kleszczyków delikatnie oderwij zarodki z tkanki macicy i umieść je na nowej szalce Petriego zawierającej PBS-EDTA o temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aby zebrać serca, umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym i użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby ustawić zarodek w pozycji leżącej. Po ustabilizowaniu dostępu do klatki piersiowej użyj ostrego czubka drugiej pary cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie wzdłuż mostka zarodka rozciągającego się między obojczykami a pępkiem. Wykonując bardzo drobne i powierzchowne nacięcia, stopniowo kierując się do wnętrza jamy klatki piersiowej, otwórz brzuch zarodka.
Kiedy serce stanie się widoczne, użyj kleszczy, aby ścisnąć tułów lekko przytulony do klatki piersiowej, aby obrać żebra. Używając boków jednej pary kleszczy, delikatnie chwyć naczynia krwionośne płuc bez oddzielania tkanki i wyciągnij serce z jamy. Oczyść serce w świeżym PBS-EDTA przez jedną do dwóch minut przed utrwaleniem tkanki w 4% paraformaldehydzie przez 45 do 60 minut.
Następnie umyj serce trzy razy przez 5 do 10 minut na jedno mycie w PBS uzupełnionym glicyną. Przed przechowywaniem serc w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować serce do kriosekcji, umieść próbki w probówce z 30% sacharozą i PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 do 40 godzin.
Gdy serca opadną na dno tuby, użyj pipety Pasteura ze zmodyfikowaną końcówką, aby ostrożnie przenieść każde serce na kawałek niestrzępiącej się chusteczki. Po krótkim wysuszeniu na powietrzu umieść każdą próbkę w indywidualnych formach o optymalnej temperaturze cięcia w żądanych orientacjach do cięcia. Zanurz tkanki w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia bez pęcherzyków.
Następnie przechowuj formy w temperaturze 20 stopni Celsjusza do kilku dni przed zamrożeniem tkanek w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny przed kriosekcją. Aby uzyskać skrawki kriostatu w próbkach, należy użyć świeżego podłoża do cięcia o optymalnej temperaturze, aby przymocować interesujący blok tkanki do uchwytu kriostatu i pozostawić pożywkę do zamrożenia, aż stanie się nieprzezroczysta biała. Włóż nowe ostrze i wyreguluj odległość między blokiem tkanki a ostrzem, aby umożliwić uzyskanie skrawków.
Przytnij blok w 10 mikrometrowych plasterkach, aż do osiągnięcia interesującego Cię punktu. Gdy można zaobserwować chusteczkę, użyj małego płaskiego pędzla, aby delikatnie pociągnąć plasterek do stojaka w ciągłym ruchu tnącym. Gdy tkanka zostanie całkowicie przecięta, użyj pędzla do detali, aby wklepać plasterek płasko w stolik.
Przytrzymaj sekcję na miejscu przez około 20 do 30 sekund przed wyjęciem szczegółowego pędzla i zakończeniem plasterka. Użyj obu pędzli, aby delikatnie spłaszczyć plasterek na scenie, zapobiegając toczeniu się i przytrzymać część tkanki przy stoliku. Po 20 do 30 sekundach odwróć sekcję i ponownie spłaszcz ją na stoliku, a następnie umieść naładowany elektrostatycznie suwak wystarczająco blisko, aby plasterek został przyciągnięty i przylegał do zjeżdżalni bez konieczności dotykania szkiełka do stolika.
Aby ocenić skrawki tkanki serca pod kątem obecności typowych wad serca, za pomocą mikroskopu wyposażonego w kamerę, uzyskaj obrazy w powiększeniach od 5 do 10x i 40x. W celu analizy zagęszczenia mięśnia sercowego otwórz interesującą tkankę w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i ustaw obraz na 8-bitowy. Aby ustawić próg obrazu, kliknij pozycję Obraz, Dostosuj i Próg, a następnie przesuń górny pasek, aby dostosować próg, aż zostaną zaznaczone tylko piksele tła.
Następnie użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby narysować obszar zainteresowania wokół tkanki, a następnie kliknij Analizuj, Ustaw pomiary, Obszar i Ogranicz do progu. Kliknij przycisk Analizuj i mierz, aby zmierzyć obszar podświetlonych pikseli w celu uzyskania wartości obszaru przestrzeni ujemnej. Aby zmierzyć obszar całego obszaru zainteresowania, kliknij przycisk Analizuj, Ustaw miary i usuń zaznaczenie opcji Ogranicz do progu.
Następnie wybierz opcję Analizuj i mierz, aby zmierzyć cały obszar wybranego obszaru zainteresowania. Aby obliczyć obszar tkanki mięśniowej, odejmij obszar przestrzeni ujemnej od obszaru obszaru zainteresowania. Następnie podziel obszar tkanki mięśniowej przez obszar obszaru zainteresowania, aby obliczyć zagęszczenie mięśni i X. Barwienie wycinków tkanek z pobranych serc embrionalnych zapewnia wystarczający kontrast, aby dostrzec krawędzie tkanki, ale nie jest tak ciemne, aby cechy komórki były nie do odróżnienia.
W tej reprezentatywnej analizie zaobserwowano, że zagęszczenie mięśni jest znacznie zmniejszone w sercach doświadczalnych w porównaniu z zarodkami, które rozwinęły się w warunkach nieeksperymentalnych. Te próbki są cenne i wymagają dużo czasu na stworzenie. Podczas sekcji zwłok, a w szczególności sekcji kriostatu, upewnij się, że każda wykonywana czynność jest celowa.
Zachowanie tkanek w paraformaldehydzie utrzymuje aktywność antygenu, co pozwala na wykorzystanie próbek do testów, takich jak barwienie aminofluoresceiną, które pomagają zidentyfikować patologiczne przyczyny stwierdzone podczas oceny morfologii. W naszym laboratorium uzyskaliśmy ilościową reprezentację eksperymentalnych metod leczenia, która może pomóc nam określić stopień, w jakim różne terapie wpływają na nasze próbki. Paraformaldehyd może utrwalić każdą tkankę, której dotknie.
Należy pamiętać, aby zawsze nosić rękawice, aby zminimalizować odsłoniętą skórę i pracować w kapturze foliowym podczas pracy z tą substancją chemiczną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół standaryzuje nowe techniki analizy tkanek służące do badania wrodzonych wad serca u myszy. Łączy on metody jakościowe i ilościowe w celu odpowiedzi na szeroki zakres pytań badawczych, co może przyczynić się do usprawnienia diagnostyki kardiologicznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kardiologia
- Biologia rozwoju
- Analiza tkanek
Wstęp
- Wrodzone wady serca stanowią istotny problem zdrowotny.
- Zrozumienie fenotypów rozwojowych u myszy może dostarczyć cennych informacji na temat schorzeń u ludzi.
- Ustandaryzowane metodologie zwiększają powtarzalność badań pomiędzy grupami badawczymi.
- Połączenie analiz jakościowych i ilościowych zapewnia kompleksowe podejście.
Cel badania
- Opracowanie zestandaryzowanych technik analizy tkanek.
- Ułatwienie badań nad wrodzonymi wadami serca.
- Udoskonalenie metod diagnostycznych w kardiologii.
Zastosowane metody
- Techniki jakościowej analizy tkanek.
- Techniki ilościowej analizy tkanek.
- Badanie mikroskopowe tkanek serca.
- Zastosowanie metod w diagnostyce chorób serca u ludzi.
Główne wyniki
- Znormalizowane techniki mogą zostać szeroko przyjęte przez grupy badawcze.
- Zarówno metody jakościowe, jak i ilościowe dostarczają cennych informacji.
- Potencjalne zastosowania w diagnostyce chorób serca u ludzi na podstawie próbek biopsyjnych.
- Metody te mają zastosowanie w różnych rodzajach analizy tkanek.
Wnioski
- Protokół ten usprawnia badanie wrodzonych wad serca.
- Wspiera on rozwój ulepszonych technik diagnostycznych.
- Badania mogą odnieść korzyść z integracji różnorodnych metod analizy.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia powtarzalną analizę histologiczną wrodzonych wad serca u embrionów myszy, wspierając walidację punktów uchwytu w procesie odkrywania leków kardiośrodkowych. Poprzez połączenie metod jakościowych i ilościowych, pozwala on na mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do wczesnych hipotez terapeutycznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w przedklinicznych modelach rozwoju serca człowieka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościową histomorfometrię fenotypów zagęszczenia mięśniowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury pobierania i utrwalania tkanek w celu zapewnienia powtarzalnej oceny fenotypowej w różnych badaniach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację ubytków przegrody międzykomorowej, ubytków przegrody międzyprzedsionkowej oraz otwartego przewodu tętniczego jako biomarkerów przekładalnych klinicznie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generowanie ilościowych wskaźników zagęszczenia mięśni za pomocą oprogramowania do analizy obrazów w celu screeningu związków.
- Wartość operacyjna: Ustanowienie protokołów pomiarowych opartych na progach w celu spójnego generowania danych.
- Gotowość do analizy: Przygotowanie krioprzesieczonych tkanek serca do późniejszych zastosowań w barwieniu immunohistochemicznym lub fluorescencyjnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystuje konserwatywne programy rozwoju serca u myszy i ludzi do modelowania chorób.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Łączy fenotypy histologiczne z potencjalnymi przyczynami patologicznymi poprzez fiksację zachowującą antygeny.
- Model przedkliniczny: Dostarcza próbek serca z 15. do 15,5 dnia embrionalnego do oceny kardiotoksyczności rozwojowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesami biologii odkrywczej, umożliwiając standaryzowane fenotypowanie wad serca przed rozpoczęciem prac nad identyfikacją związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących interwencji genetycznych lub farmakologicznych w morfogenezie serca.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników (procent zagęszczenia mięśnia) do analizy wysokotreściowej bibliotek związków.
- Analityka: Generuje pomiary oparte na powierzchni, które umożliwiają porównanie statystyczne warunków eksperymentalnych i kontrolnych.
- Badania translacyjne: Łączy morfologię embrionalnego serca z mechanizmami ludzkich wrodzonych wad serca poprzez konserwatywne szlaki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę histologiczną możliwą do ponownego wykorzystania w wielu typach tkanek poza analizą kardiologiczną.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukcja niejednoznaczności mechanistycznej dzięki połączeniu jakościowej identyfikacji defektów z ilościową analizą zagęszczenia.
- Wartość operacyjna: Powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom sekcji zarodków, fiksacji, kriosekcjonowania i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację efektów terapii na rozwój mięśnia sercowego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja związków skorygowana o ryzyko, oparta na profilach kardiotoksyczności rozwojowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik sekcji embrionów oraz cięcia histologicznego.
- Zależne od dostępności kriotomu, mikroskopu z kamerą oraz infrastruktury oprogramowania do analizy obrazu.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnej orientacji tkanek i procedur barwienia.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie czasu utrwalania do różnych stadiów embrionalnych lub tła genetycznego.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość tkanek podczas cięcia oraz czasochłonność przygotowania próbek (inkubacja w sacharozie przez 24-40 godzin).
