Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych

Protokół ten standaryzuje nowe techniki analizy tkanek, dzięki czemu mogą być szerzej stosowane przez inne grupy, które również badają wrodzone wady serca. Ponieważ zarówno techniki analizy jakościowej, jak i ilościowej mają swoje wady i zalety, metodologia ta wykorzystuje obie te techniki, aby odpowiedzieć na najszerszy zakres pytań eksperymentalnych. Techniki te mogą mieć pozytywny wpływ na kardiologiczne metody diagnostyczne.

Na przykład patolodzy mogliby zastosować nasze techniki mikroskopowej analizy tkanki serca do diagnozowania chorób serca u ludzi na podstawie próbek biopsyjnych. Protokół ten może być stosowany w badaniach kardiologii rozwojowej lub kardiologii ogólnej. Jednak metody te zapewniają również różne przydatne techniki, które można zastosować do dowolnej analizy tkanek.

Aby zebrać serca embrionalne od 15 do 15,5 dnia, zabezpiecz kończyny ciężarnej matki i zaczynając od cewki moczowej aż do mostka, ostrożnie wykonaj nacięcie w kształcie litery I wzdłuż tułowia. Używając kleszczy ruchem nabierającym, delikatnie wyjmij macicę z jamy brzusznej, chwytając w razie potrzeby powierzchowne tkanki macicy za pomocą cienkich kleszczy, aby pomóc w ekstrakcji. Użyj nożyczek, aby uwolnić macicę z brzucha.

Po namoczeniu macicy w lodowatym PBS, włóż narząd do naczynia preparacyjnego. Za pomocą nożyczek pokrój macicę na poszczególne sekcje, z których każda zawiera oddzielny zarodek. Za pomocą dwóch par cienkich kleszczyków delikatnie oderwij zarodki z tkanki macicy i umieść je na nowej szalce Petriego zawierającej PBS-EDTA o temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby zebrać serca, umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym i użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby ustawić zarodek w pozycji leżącej. Po ustabilizowaniu dostępu do klatki piersiowej użyj ostrego czubka drugiej pary cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie wzdłuż mostka zarodka rozciągającego się między obojczykami a pępkiem. Wykonując bardzo drobne i powierzchowne nacięcia, stopniowo kierując się do wnętrza jamy klatki piersiowej, otwórz brzuch zarodka.

Kiedy serce stanie się widoczne, użyj kleszczy, aby ścisnąć tułów lekko przytulony do klatki piersiowej, aby obrać żebra. Używając boków jednej pary kleszczy, delikatnie chwyć naczynia krwionośne płuc bez oddzielania tkanki i wyciągnij serce z jamy. Oczyść serce w świeżym PBS-EDTA przez jedną do dwóch minut przed utrwaleniem tkanki w 4% paraformaldehydzie przez 45 do 60 minut.

Następnie umyj serce trzy razy przez 5 do 10 minut na jedno mycie w PBS uzupełnionym glicyną. Przed przechowywaniem serc w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować serce do kriosekcji, umieść próbki w probówce z 30% sacharozą i PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 do 40 godzin.

Gdy serca opadną na dno tuby, użyj pipety Pasteura ze zmodyfikowaną końcówką, aby ostrożnie przenieść każde serce na kawałek niestrzępiącej się chusteczki. Po krótkim wysuszeniu na powietrzu umieść każdą próbkę w indywidualnych formach o optymalnej temperaturze cięcia w żądanych orientacjach do cięcia. Zanurz tkanki w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia bez pęcherzyków.

Następnie przechowuj formy w temperaturze 20 stopni Celsjusza do kilku dni przed zamrożeniem tkanek w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny przed kriosekcją. Aby uzyskać skrawki kriostatu w próbkach, należy użyć świeżego podłoża do cięcia o optymalnej temperaturze, aby przymocować interesujący blok tkanki do uchwytu kriostatu i pozostawić pożywkę do zamrożenia, aż stanie się nieprzezroczysta biała. Włóż nowe ostrze i wyreguluj odległość między blokiem tkanki a ostrzem, aby umożliwić uzyskanie skrawków.

Przytnij blok w 10 mikrometrowych plasterkach, aż do osiągnięcia interesującego Cię punktu. Gdy można zaobserwować chusteczkę, użyj małego płaskiego pędzla, aby delikatnie pociągnąć plasterek do stojaka w ciągłym ruchu tnącym. Gdy tkanka zostanie całkowicie przecięta, użyj pędzla do detali, aby wklepać plasterek płasko w stolik.

Przytrzymaj sekcję na miejscu przez około 20 do 30 sekund przed wyjęciem szczegółowego pędzla i zakończeniem plasterka. Użyj obu pędzli, aby delikatnie spłaszczyć plasterek na scenie, zapobiegając toczeniu się i przytrzymać część tkanki przy stoliku. Po 20 do 30 sekundach odwróć sekcję i ponownie spłaszcz ją na stoliku, a następnie umieść naładowany elektrostatycznie suwak wystarczająco blisko, aby plasterek został przyciągnięty i przylegał do zjeżdżalni bez konieczności dotykania szkiełka do stolika.

Aby ocenić skrawki tkanki serca pod kątem obecności typowych wad serca, za pomocą mikroskopu wyposażonego w kamerę, uzyskaj obrazy w powiększeniach od 5 do 10x i 40x. W celu analizy zagęszczenia mięśnia sercowego otwórz interesującą tkankę w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i ustaw obraz na 8-bitowy. Aby ustawić próg obrazu, kliknij pozycję Obraz, Dostosuj i Próg, a następnie przesuń górny pasek, aby dostosować próg, aż zostaną zaznaczone tylko piksele tła.

Następnie użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby narysować obszar zainteresowania wokół tkanki, a następnie kliknij Analizuj, Ustaw pomiary, Obszar i Ogranicz do progu. Kliknij przycisk Analizuj i mierz, aby zmierzyć obszar podświetlonych pikseli w celu uzyskania wartości obszaru przestrzeni ujemnej. Aby zmierzyć obszar całego obszaru zainteresowania, kliknij przycisk Analizuj, Ustaw miary i usuń zaznaczenie opcji Ogranicz do progu.

Następnie wybierz opcję Analizuj i mierz, aby zmierzyć cały obszar wybranego obszaru zainteresowania. Aby obliczyć obszar tkanki mięśniowej, odejmij obszar przestrzeni ujemnej od obszaru obszaru zainteresowania. Następnie podziel obszar tkanki mięśniowej przez obszar obszaru zainteresowania, aby obliczyć zagęszczenie mięśni i X. Barwienie wycinków tkanek z pobranych serc embrionalnych zapewnia wystarczający kontrast, aby dostrzec krawędzie tkanki, ale nie jest tak ciemne, aby cechy komórki były nie do odróżnienia.

W tej reprezentatywnej analizie zaobserwowano, że zagęszczenie mięśni jest znacznie zmniejszone w sercach doświadczalnych w porównaniu z zarodkami, które rozwinęły się w warunkach nieeksperymentalnych. Te próbki są cenne i wymagają dużo czasu na stworzenie. Podczas sekcji zwłok, a w szczególności sekcji kriostatu, upewnij się, że każda wykonywana czynność jest celowa.

Zachowanie tkanek w paraformaldehydzie utrzymuje aktywność antygenu, co pozwala na wykorzystanie próbek do testów, takich jak barwienie aminofluoresceiną, które pomagają zidentyfikować patologiczne przyczyny stwierdzone podczas oceny morfologii. W naszym laboratorium uzyskaliśmy ilościową reprezentację eksperymentalnych metod leczenia, która może pomóc nam określić stopień, w jakim różne terapie wpływają na nasze próbki. Paraformaldehyd może utrwalić każdą tkankę, której dotknie.

Należy pamiętać, aby zawsze nosić rękawice, aby zminimalizować odsłoniętą skórę i pracować w kapturze foliowym podczas pracy z tą substancją chemiczną.