Name: Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj standardowe techniki analizy tkankowej w badaniu wrodzonych wad serca u myszy, łącząc metody jakościowe i ilościowe. Protokół wspiera rozwój ulepszonych metod diagnostycznych w kardiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Aguirre jest wspierane przez National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health pod numerem nagrody K01HL135464 oraz przez American Heart Association pod numerem nagrody 19IPLOI34660342.

<ol><li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li>
<li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Heart+Disease%3A+Causes%2C+Diagnosis%2C+Symptoms%2C+and+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li>
<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li>
<li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+congenital+heart+disease%3A+The+glass+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li>
<li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li>
<li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li>
<li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+in+the+single+ventricle+population%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li>
<li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li>
<li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+Fontan+palliation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li>
<li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease%3A+part+II.+Clinical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery+%3A+Official+Journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li>
<li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects%3A+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li>
<li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood+-+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li>
<li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+%3A+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506(2015).</li>
<li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signalling+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015(2016).</li>
<li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li>
<li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+toward+heart+regeneration%3A+Stem+cells+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+or+breaking+the+heart%3A+from+lineage+determination+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li>
<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).</li>
<li>Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).</li>
<li>Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).</li>
<li>Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).</li>
<li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22IJC+Heart+and+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li>
<li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+in+the+Child+and+Young+Adult%3A+From+Bench+to+Bedside%22%5BJournal%5D)">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , Elsevier. 269-290 (2018).</li>
<li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction%3A+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

W protokole tym omówiono techniki związane z analizą rozwoju serca w sercach embrionalnych. Niektóre ograniczenia tej metody to wymagana sprawność fizyczna dla technik przygotowawczych, która może wymagać praktyki, oraz umiejętności obrazowania mikroskopowego. Jeśli plastry uzyskane w kriostacie są niechlujne, barwienie hematoksyliną i eozyną nie będzie wyraźne lub jeśli obrazy wykonane pod mikroskopem mają słabe oświetlenie, wówczas metoda zastosowana w przypadku ImageJ nie zadziała. Ograniczeniem funkcji progu w oprogr...

CHD są najczęstszym typem wad wrodzonych u ludzi i są główną przyczyną zgonów związanych z wadami wrodzonymi1,2,3,4,5,6. Chociaż około 90% noworodków przeżywa chorobę niedokrwienną serca, często wiąże się ona ze znaczną zachorowalnością i interwencjami medycznymi na przestrzeni lat, stanowiąc duże obciążenie dla życia pacjentów i systemu opieki zdrowotnej7,8,9,10. Poza czynnikami czysto genetycznymi, przyczyny choroby niedokrwiennej serca są słabo poznane4. Niezidentyfikowane przyczyny stanowią ~56-66% wszystkich przypadków choroby niedokrwiennej serca według American Heart Association i innych źródeł2,3,4,11. Dobrze znane czynniki obejmują mutacje genetyczne, CNV, warianty pojedynczych nukleotydów de novo i aneuploidię. Podejrzewa się, że czynniki środowiskowe i dietetyczne są również ważnymi źródłami przyczyniającymi się do choroby niedokrwiennej serca, co sugerują badania epidemiologiczne łączące styl życia matki2,12, deprywacja ekonomiczna i rasa13, oraz badania nad czynnikami dietetycznymi, takimi jak kwas foliowy11,14 i bioaktywny lipid kwas retinowy15,16. Badanie mechanizmów i przyczyn choroby niedokrwiennej serca i innych wad sercowo-naczyniowych jest ważne dla opracowania strategii prewencyjnych i nowych opcji terapeutycznych1,4,17,18,19.
Rozwijająca się mysz jest podstawowym modelem do badania CHD u ssaków. Jednak niektóre z zastosowanych metod i analiz, takie jak sekcje z zachowaniem morfologii serca, analiza etapów rozwojowych i identyfikacja wad związanych z chorobą niedokrwienną serca, mogą być zniechęcające dla naukowców, którzy są nowicjuszami w analizie mysich serc. Celem metod opisanych w niniejszym protokole jest dostarczenie jakościowych i ilościowych wytycznych dla tych procesów. Dlatego w tym protokole wyjaśniamy, jak wykonywać krycia czasowe w celu wytworzenia zarodków w pożądanym stadium ciąży, preparować ciężarne samice w celu odzyskania nienaruszonego serca (w tym tkanek towarzyszących, takich jak droga odpływu), stabilizacji serca i przygotowania do sekcji kriostatu, podstawowe metody histologiczne, analizy ilościowe częstych wad serca oraz analiza jakościowa zagęszczenia mięśnia sercowego, powszechny fenotyp prekursorowy niektórych typów choroby niedokrwiennej serca.

<table><tbody><tr><td>Probówka stożkowa 15 mLFisher</td> <td>Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Myszy</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - stockowe</td> słoiki do barwienia 000664 <td></td></tr><tr><td>Coplin (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24X50MM #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia preparacyjne</td> <td>Fisher Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 - Drobne kleszcze (x2)</td><td>Narzędzia do nauki</td> <td>precyzyjnej# 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Y</td><td>Millipore Sigma</td> <td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy (czysty, 200 dowodów)</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td> <td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td><td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Narzędzia naukowe</td># <td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Millipore Sigma</td><td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe</td><td>Narzędzia naukowe</td># <td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Graphpad Prism 8</td><td>Oprogramowanie Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td> Roztwór hematoksyliny <td></td></tr><tr><td>Mayera</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do mikropipet - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>Microsoft ExcelZwiązek Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus CkX53</td><td>Pędzle</td> malarskie Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>(co najmniej 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601 Zrobić</td><td>na 4% roztwór (rozpuszczony w PBS)</td></tr><tr><td>Pipeta(y) PasteuraFisher</td> <td>Scientific</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>Rozcieńczyć od 10x do 1x przed użyciem</td></tr><tr><td>Waga</td><td>Mettler Toledo</td><td># Waga MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Mettler Toledo</td># Rękojeść do skalpela <td>MS105</td><td></td></tr><tr><td>#3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Forma kwadratowa</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>Do form OCT</td></tr><tr><td>Milipor sacharozy</td><td>Sigma</td> <td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Narzędzia do nauki</td> <td>precyzyjnej # 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge Jednorazowe ostrza do mikrotomów</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Waga podróżna</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Wrodzone wady serca (CHD) są najczęstszym rodzajem wad wrodzonych u ludzi, dotykając do 1% wszystkich żywych urodzeń. Jednak przyczyny leżące u podstaw choroby niedokrwiennej serca są nadal słabo poznane. Rozwijająca się mysz stanowi cenny model do badań nad chorobą niedokrwienną serca, ponieważ programy rozwojowe serca między myszami a ludźmi są wysoce konserwatywne. Protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób wytwarzać zarodki myszy w pożądanym stadium ciąży, metody izolowania i przechowywania serca do dalszego przetwarzania, metody ilościowe identyfikacji powszechnych typów choroby niedokrwiennej serca za pomocą histologii (np. Ubytki przegrody międzykomorowej, ubytki przegrody międzyprzedsionkowej, przetrwały przewód tętniczy) oraz ilościowe metody histomorfometrii do pomiaru typowych fenotypów zagęszczenia mięśni. Metody te opisują wszystkie etapy związane z przygotowaniem, pobieraniem i analizą próbek, umożliwiając naukowcom prawidłowy i powtarzalny pomiar CHD.

Wskaźnik zagęszczenia mięśni porównano pomiędzy sercami rozwijającymi się w dwóch różnych środowiskach: grupie kontrolnej i eksperymentalnej. Protokoły te wykorzystano do ilościowej analizy zagęszczenia tkanki mięśniowej, co umożliwiło przeprowadzenie analizy statystycznej. Wykazano, że zagęszczenie mięśni było znacznie mniejsze w sercach eksperymentalnych w porównaniu z embrionami rozwijającymi się w warunkach nieeksperymentalnych.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

W tym protokole opisujemy procedury jakościowej i ilościowej analizy fenotypów rozwojowych u myszy związanych z wrodzonymi wadami serca.

Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Protokół ten standaryzuje nowe techniki analizy tkanek, dzięki czemu mogą być szerzej stosowane przez inne grupy, które również badają wrodzone wady serca. Ponieważ zarówno techniki analizy jakościowej, jak i ilościowej mają swoje wady i zalety, metodologia ta wykorzystuje obie te techniki, aby odpowiedzieć na najszerszy zakres pytań eksperymentalnych. Techniki te mogą mieć pozytywny wpływ na kardiologiczne metody diagnostyczne.Na przykład patolodzy mogliby zastosować nasze techniki mikroskopowej analizy tkanki serca do diagnozowania chorób serca u ludzi na podstawie próbek biopsyjnych. Protokół ten może być stosowany w badaniach kardiologii rozwojowej lub kardiologii ogólnej. Jednak metody te zapewniają również różne przydatne techniki, które można zastosować do dowolnej analizy tkanek.Aby zebrać serca embrionalne od 15 do 15,5 dnia, zabezpiecz kończyny ciężarnej matki i zaczynając od cewki moczowej aż do mostka, ostrożnie wykonaj nacięcie w kształcie litery I wzdłuż tułowia. Używając kleszczy ruchem nabierającym, delikatnie wyjmij macicę z jamy brzusznej, chwytając w razie potrzeby powierzchowne tkanki macicy za pomocą cienkich kleszczy, aby pomóc w ekstrakcji. Użyj nożyczek, aby uwolnić macicę z brzucha.Po namoczeniu macicy w lodowatym PBS, włóż narząd do naczynia preparacyjnego. Za pomocą nożyczek pokrój macicę na poszczególne sekcje, z których każda zawiera oddzielny zarodek. Za pomocą dwóch par cienkich kleszczyków delikatnie oderwij zarodki z tkanki macicy i umieść je na nowej szalce Petriego zawierającej PBS-EDTA o temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby zebrać serca, umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym i użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby ustawić zarodek w pozycji leżącej. Po ustabilizowaniu dostępu do klatki piersiowej użyj ostrego czubka drugiej pary cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie wzdłuż mostka zarodka rozciągającego się między obojczykami a pępkiem. Wykonując bardzo drobne i powierzchowne nacięcia, stopniowo kierując się do wnętrza jamy klatki piersiowej, otwórz brzuch zarodka.Kiedy serce stanie się widoczne, użyj kleszczy, aby ścisnąć tułów lekko przytulony do klatki piersiowej, aby obrać żebra. Używając boków jednej pary kleszczy, delikatnie chwyć naczynia krwionośne płuc bez oddzielania tkanki i wyciągnij serce z jamy. Oczyść serce w świeżym PBS-EDTA przez jedną do dwóch minut przed utrwaleniem tkanki w 4% paraformaldehydzie przez 45 do 60 minut.Następnie umyj serce trzy razy przez 5 do 10 minut na jedno mycie w PBS uzupełnionym glicyną. Przed przechowywaniem serc w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować serce do kriosekcji, umieść próbki w probówce z 30% sacharozą i PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 do 40 godzin.Gdy serca opadną na dno tuby, użyj pipety Pasteura ze zmodyfikowaną końcówką, aby ostrożnie przenieść każde serce na kawałek niestrzępiącej się chusteczki. Po krótkim wysuszeniu na powietrzu umieść każdą próbkę w indywidualnych formach o optymalnej temperaturze cięcia w żądanych orientacjach do cięcia. Zanurz tkanki w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia bez pęcherzyków.Następnie przechowuj formy w temperaturze 20 stopni Celsjusza do kilku dni przed zamrożeniem tkanek w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny przed kriosekcją. Aby uzyskać skrawki kriostatu w próbkach, należy użyć świeżego podłoża do cięcia o optymalnej temperaturze, aby przymocować interesujący blok tkanki do uchwytu kriostatu i pozostawić pożywkę do zamrożenia, aż stanie się nieprzezroczysta biała. Włóż nowe ostrze i wyreguluj odległość między blokiem tkanki a ostrzem, aby umożliwić uzyskanie skrawków.Przytnij blok w 10 mikrometrowych plasterkach, aż do osiągnięcia interesującego Cię punktu. Gdy można zaobserwować chusteczkę, użyj małego płaskiego pędzla, aby delikatnie pociągnąć plasterek do stojaka w ciągłym ruchu tnącym. Gdy tkanka zostanie całkowicie przecięta, użyj pędzla do detali, aby wklepać plasterek płasko w stolik.Przytrzymaj sekcję na miejscu przez około 20 do 30 sekund przed wyjęciem szczegółowego pędzla i zakończeniem plasterka. Użyj obu pędzli, aby delikatnie spłaszczyć plasterek na scenie, zapobiegając toczeniu się i przytrzymać część tkanki przy stoliku. Po 20 do 30 sekundach odwróć sekcję i ponownie spłaszcz ją na stoliku, a następnie umieść naładowany elektrostatycznie suwak wystarczająco blisko, aby plasterek został przyciągnięty i przylegał do zjeżdżalni bez konieczności dotykania szkiełka do stolika.Aby ocenić skrawki tkanki serca pod kątem obecności typowych wad serca, za pomocą mikroskopu wyposażonego w kamerę, uzyskaj obrazy w powiększeniach od 5 do 10x i 40x. W celu analizy zagęszczenia mięśnia sercowego otwórz interesującą tkankę w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i ustaw obraz na 8-bitowy. Aby ustawić próg obrazu, kliknij pozycję Obraz, Dostosuj i Próg, a następnie przesuń górny pasek, aby dostosować próg, aż zostaną zaznaczone tylko piksele tła.Następnie użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby narysować obszar zainteresowania wokół tkanki, a następnie kliknij Analizuj, Ustaw pomiary, Obszar i Ogranicz do progu. Kliknij przycisk Analizuj i mierz, aby zmierzyć obszar podświetlonych pikseli w celu uzyskania wartości obszaru przestrzeni ujemnej. Aby zmierzyć obszar całego obszaru zainteresowania, kliknij przycisk Analizuj, Ustaw miary i usuń zaznaczenie opcji Ogranicz do progu.Następnie wybierz opcję Analizuj i mierz, aby zmierzyć cały obszar wybranego obszaru zainteresowania. Aby obliczyć obszar tkanki mięśniowej, odejmij obszar przestrzeni ujemnej od obszaru obszaru zainteresowania. Następnie podziel obszar tkanki mięśniowej przez obszar obszaru zainteresowania, aby obliczyć zagęszczenie mięśni i X. Barwienie wycinków tkanek z pobranych serc embrionalnych zapewnia wystarczający kontrast, aby dostrzec krawędzie tkanki, ale nie jest tak ciemne, aby cechy komórki były nie do odróżnienia.W tej reprezentatywnej analizie zaobserwowano, że zagęszczenie mięśni jest znacznie zmniejszone w sercach doświadczalnych w porównaniu z zarodkami, które rozwinęły się w warunkach nieeksperymentalnych. Te próbki są cenne i wymagają dużo czasu na stworzenie. Podczas sekcji zwłok, a w szczególności sekcji kriostatu, upewnij się, że każda wykonywana czynność jest celowa.Zachowanie tkanek w paraformaldehydzie utrzymuje aktywność antygenu, co pozwala na wykorzystanie próbek do testów, takich jak barwienie aminofluoresceiną, które pomagają zidentyfikować patologiczne przyczyny stwierdzone podczas oceny morfologii. W naszym laboratorium uzyskaliśmy ilościową reprezentację eksperymentalnych metod leczenia, która może pomóc nam określić stopień, w jakim różne terapie wpływają na nasze próbki. Paraformaldehyd może utrwalić każdą tkankę, której dotknie.Należy pamiętać, aby zawsze nosić rękawice, aby zminimalizować odsłoniętą skórę i pracować w kapturze foliowym podczas pracy z tą substancją chemiczną.

analysis-congenital-heart-defects-mouse-embryos-using-qualitative

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Śmierć płodowa i okołoporodowa jest częstym zjawiskiem podczas badania zmian genetycznych wpływających na rozwój serca. Obrazowanie za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości poprawiło rozdzielczość 2-D i może dostarczyć doskonałych informacji na temat wczesnego rozwoju serca, stanowiąc idealną metodę wykrywania wpływu na strukturę i funkcję serca przed śmiercią.

Echokardiografia płodowa myszy

Ultra-wysokiej częstotliwości ultrasonografia to potężne narzędzie do obrazowania na żywo do badania nieprawidłowości w pracy serca u małych zwierząt. Jego nieinwazyjność pozwala na utrzymanie stanu fizjologicznego zarodków. W tym artykule pokazujemy zastosowanie ultrasonografii w trybie M do pomiaru częstości akcji serca zarodków przy E18,5 w macicy.

W macicy Pomiar tętna u myszy za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii w trybie m

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Badanie echokardiograficzne jest często stosowane u myszy. W tym celu opracowano drogie urządzenia ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje niedrogą procedurę echokardiograficzną połączoną z histologicznymi analizami morfometrycznymi w celu określenia morfologii serca.

Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości u płodu myszy poprawiło rozdzielczość obrazowania i może zapewnić precyzyjną, nieinwazyjną charakterystykę rozwoju serca i wad strukturalnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest przeznaczony do wykonywania echokardiografii płodu u myszy w czasie rzeczywistym in vivo.

Obrazowanie układu sercowo-naczyniowego u płodu myszy za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości (30/45 MHZ)

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody diagnostyki mysiej wrodzonej wady serca (CHD) za pomocą echokardiografii płodu, sekcji zwłok i episkopowego przechwytywania obrazu fluorescencyjnego (EFIC) za pomocą episkopowej mikroskopii konfokalnej (ECM), a następnie trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji.

Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy

Tutaj informujemy o podwójnym znakowaniu komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych za pomocą wewnątrzgatunkowego szczepienia rurki nerwowejGFP w połączeniu z wewnątrznaczyniowym wstrzyknięciem DiI. Ta eksperymentalna technika pozwala nam jednocześnie wizualizować i badać rozwój układu nerwowego (jelitowego) wywodzącego się z NCC i układu naczyniowego podczas organogenezy.

Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowejpiskląt GFP i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaniny DiI

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania ultradźwiękowych mikropęcherzykowych środków kontrastowych do żywych, izolowanych mysich zarodków w późnym stadium ciąży. Metoda ta umożliwia badanie parametrów perfuzji i naczyniowych markerów molekularnych w obrębie zarodka za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości ze wzmocnieniem kontrastowym.

Obrazowanie kontrastowe w zarodkach myszy za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości

Poznaj standardowe techniki analizy tkankowej w badaniu wrodzonych wad serca u myszy, łącząc metody jakościowe i ilościowe. Protokół wspiera rozwój ulepszonych metod diagnostycznych w kardiologii.

Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych

Przeglądaj więcej filmów