Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest ocena dojrzewania mięśni i kardiomiocytów w rozwijającym się embrionalnym sercu myszy. Osiąga się to poprzez uprzednią orientację i zamrożenie serca embrionalnego w podłożu tnącym. Następnie serce jest kriogeniczne w odpowiedniej orientacji.

Następnie odcinki serca poddawane są immunofluorescencyjnemu znakowaniu interesujących ich białek. Na koniec przeprowadza się mikroskopię konfokalną wycinków serca z barwieniem immunologicznym. Ostatecznie dwuwymiarowe i trójwymiarowe analizy obrazów są wykorzystywane do pokazania rozwoju MyFi i innych struktur kardiomiocytów.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju serca, takie jak to, w jaki sposób mutacje i geny serca wpływają na składanie MyFi i pojawianie się określonych struktur, takich jak krążki międzykrążkowe i klienteli. Aby zatrzasnąć zamrożone serca embrionalne, użyj optymalnej temperatury cięcia lub pożywki OCT, aby wypełnić 3,5-centymetrową szalkę Petriego w kapturze chemicznym. Chłodny. Dwa metylobutan w ciekłym azocie.

Po wyizolowaniu embrionalnych serc myszy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść serca w OCT i pozwól im się zrównoważyć przez kilka sekund przed przeniesieniem ich do siedmiomilimetrowej formy zawierającej OCT. Zorientuj wewnętrzną ścianę serca na dnie formy. Delikatnie umieść formę w chłodzonych ciekłym azotem dwóch metylobutanach.

Uważając, aby nie dopuścić do tego, aby dwie ciecze metylobutanu dotknęły OCT lub zamarzło serce, dopóki OCT nie stanie się stałe białe. Następnie przenieś formę do wiaderka z lodem zawierającego suchy lód. Po zamrożeniu wszystkich serc zawiń formy kriogeniczne w folię i przechowuj je w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do kriosekcji.

Aby utrwalić serca embrionalne, użyj 4% PFA w PBS, aby wypełnić dołki 12 foliowych płytek hodowlanych. Po wypreparowaniu serc embrionalnych zgodnie z protokołem tekstowym, umieść każde serce w studzience PFA i utrwal w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc Aby kriogenicznie chronić serca za pomocą plastikowej pipety transferowej, przenieś każde serce do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra 15% sacharozy w PBS i delikatnie mieszaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż serce opadnie na dno probówki. Przenieś każde serce do 30% sacharozy w PBS i delikatnie mieszaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż serce opadnie na dno probówki.

Zamroź zarodki w OCT, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Po umieszczeniu form kriogenicznych w komorze kriostatu i osiągnięciu ujemnej temperatury 17 stopni Celsjusza, odwróć formę krio i delikatnie dociśnij, aby usunąć blok serca z formy. Zorientuj przednią ścianę serca na szczycie uformowanego bloku tkanki.

Umieść dużą kroplę OCT na uchwycie i zamontuj blok serca na kropli OCT. Utrzymywanie orientacji w taki sposób, aby przednia ściana serca znajdowała się najdalej od uchwytu. Pozwól, aby serce zamarzło na uchwycie.

Załaduj uchwyt i zamontowany blok serca na uchwyt kriostatu. Wyreguluj tak, aby kąt ostrza wynosił od trzech do pięciu stopni w stosunku do próbki. Zbierz 10 skrawków mikrometru na szkiełka mikroskopowe, które zostały wstępnie potraktowane dodatnio naładowaną powłoką.

Pozostawić próbki do całkowitego wyschnięcia przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przeprowadzenia immunofluorescencji. Po utrwaleniu i/lub usunięciu OCT z sekcji, użyj jednego x buforu blokującego rozcieńczonego w PBS, aby blokować przez 45 minut z delikatnym potrząsaniem. W przypadku stosowania przeciwciała pierwszorzędowego wytworzonego u myszy, dodać monowalentny fragment FAB IgG H plus L osła lub kozy rozcieńczony w proporcji 1 do 100 w PBS 0,1% tween 20 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie wstrząsając.

Dodać pierwszorzędowe przeciwciało lub przeciwciała rozcieńczone w jednym buforze blokującym x i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji użyj jednego XPBS, aby umyć sekcje trzy razy przez 10 minut. W temperaturze pokojowej sprzężone z addorem przeciwciało drugorzędowe rozcieńczono w stosunku 1 do 500 w buforze blokującym do próbek i inkubowano chronione przed światłem przez dwie godziny.

W temperaturze pokojowej użyj jednego XPBS, aby umyć sekcje w temperaturze pokojowej trzy razy przez 10 minut, chroniąc przed światłem. Zamontuj szkiełka na podłożu zapobiegającym blaknięciu, umieszczając dwie krople medium na każdym końcu szkiełka i użyj szkiełka nakrywkowego do przykrycia. Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełka nakrywkowe.

Przechowuj go w czterech stopniach Celsjusza, chroń przed światłem, aż będzie gotowy do obrazu. Używając czterokrotnego obiektywu i fluorescencji laserowej, znajdź próbkę i obszar zainteresowania. Przechwyć obraz, aby użyć go jako mapy.

Podczas obrazowania przy dużym powiększeniu. Usuń slajd, dokonując minimalnych regulacji na stoliku slajdu. Następnie zmień obiektyw na 60 x zanurzeniowy z olejkiem.

Umieść małą kroplę oleju na obiektywie i umieść suwak na stoliku ślizgowym. Następnie ponownie znajdź próbkę, ustaw czas ekspozycji na moc lasera i kategoryzację na żądane poziomy dla każdego kanału. Po ustaleniu optymalnych ustawień zgodnie z wytycznymi protokołu tekstowego, użyj ustawień próbki dla wszystkich odcinków tkanki w eksperymencie.

Użyj histogramu intensywności, aby zanotować optymalny zakres intensywności dla każdego kanału, który zostanie użyty do analizy. Wygeneruj Zacka za pomocą funkcji akwizycji, wybierając odpowiednie kanały laserowe. Następnie wybierz górny i dolny limit stosu Z.

Wybierz rozmiar kroku Zacna, który jest równy połowie wartości grubości warstwy optycznej podanej przez oprogramowanie. Kliknij przycisk Uruchom, aby zebrać obrazy za pomocą Fidżi lub porównywalnego programu do analizy obrazów. Otwórz plik Zack z opcją niestandardowego trybu kolorów, a kanały zostaną podzielone na osobne okna.

Z menu rozwijanego obrazu otwórz narzędzie Dostosuj kontrast jasności i w każdym kanale ustaw optymalny zakres intensywności histogramu. Jak wcześniej ustalono, zastosuj te zakresy kanałów do wszystkich analizowanych Zacków. Następnie z koloru obrazu, rozwiń menu, połącz poszczególne kanały w jeden obraz kompozytowy.

Korzystając z menu projektu Stosy Z, utwórz spłaszczony stos Z na podstawie obrazu kompozytowego. Ponieważ ten obraz będzie znacznie jaśniejszy niż obraz 3D, dostosuj zakres intensywności histogramu dla próbki kontrolnej, aby uniknąć przesycenia i zastosuj te same ustawienia do eksperymentalnego spłaszczonego Pocka Aby wygenerować obraz 3D, najpierw wybierz menu projektu 3D stosów obrazów. Wybierz oś obrotu x lub oś Y.

Ustaw odstępy między plasterkami na taką samą liczbę mikronów, jak rozmiar kroku stosu Z. Wybierz żądany całkowity obrót i ustaw przyrost kąta obrotu na jeden. Następnie otwórz przeglądarkę obrazu J 3D z menu rozwijanego wtyczek.

Wybierz obraz kompozytowy wygenerowany jako głośność i ustaw współczynnik ponownego próbkowania na jeden lub dwa. Liczby te pokazują typowe wyniki barwienia cos różnych białek w zatrzaskowo mrożonym, acetonowym utrwalonym sercu, przeciwciałie przeciwko S alfa aktyninie powtarzalnie znakowanym krążkom Z oraz w krążkach interowanych o wysokiej specyficzności i minimalnym tle. Przeciwciało przeciwko białku beta-kateniny łączącego adherencji wiązało błonę zarówno kardiomiocytów, jak i komórek niekardiomiocytów, a kolokalizacja z aktyniną SFA wystąpiła w przypuszczalnych krążkach interowanych w E 16,5 beta one Immunofluorescencja integryny w sercu embrionalnym jest szczególnie trudna, ale barwienie integryny beta jeden w tych badaniach wykazało sygnał o takiej samej okresowości jak krążki Z znakowane aktyniną SFA, być może odzwierciedlając rodzących się klientów formujących się na E 16.5.

W E 12,5 wzór barwienia aktyniną SFA i mycyną tropo wykazywał regularną okresowość w kardiomiocytach beleczkowych zgodnych z dojrzałymi miofibrylami w zewnętrznej strefie zwartej Aktynina SFA była bardziej punktowa niż liniowa, a sygnał miozyny tropo był raczej rozproszony niż liniowy barwienie przylegające do NCA, a kardiomiocyty beleczkowe w sercach E 12,5 współlokalizowane z obszarami intensywnego barwienia aktyniny SFA, które mogą reprezentować krążki pośrednie. Pokazane tutaj jest utrwalone serce embrionalne PFA E 12.5 oznaczone aktyniną SFA i aktonem nitkowatym z transgenicznej myszy RFP Ruby. Stosunek sygnalizowanej aktyny SFA do szumu był zmniejszony w porównaniu z zamrożonymi sekcjami serca.

Trójwymiarowa rekonstrukcja obrazu ujawniła, że MyFi w kardiomiocycie były mniej więcej równoległe do siebie, ale poszczególne kardiomiocyty były zorientowane pod różnymi kątami względem siebie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo orientować i kriowycinać serca embrionalne, a także wykonywać barwienie immunologiczne, mikroskopię konfokalną i analizę obrazu w celu oceny dojrzewania MyFi i kardiomiocytów podczas rozwoju serca myszy. Przyznać.