Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest ocena dojrzewania miofibroblastów i kardiomiocytów w rozwijającym się embrionalnym sercu myszy. Osiąga się to poprzez wstępne zorientowanie i zamrożenie embrionalnego serca w medium do cięcia. Następnie serce jest poddawane kriosekcjonowaniu w odpowiedniej orientacji.

Następnie przekroje serca poddaje się znakowaniu immunofluorescencyjnemu wybranych białek. W końcowym etapie przeprowadzana jest mikroskopia konfokalna immunobarwionych przekrojów serca. Ostatecznie wykorzystuje się dwu- i trójwymiarową analizę obrazu, aby wykazać rozwój MyFi oraz innych struktur kardiomiocytów.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny rozwoju serca, takie jak wpływ mutacji i genów sercowych na montaż MyFi oraz powstawanie specyficznych struktur, takich jak krążki międzykomorowe i kostery. Aby zamrozić embrionalne serca metodą szybkiego mrożenia, należy wypełnić 3,5 centymetrową szalkę Petriego medium OCT (optimal cutting temperature) w dygestorium. Schłodzić 2-metylobutan w ciekłym azocie.

Po wyizolowaniu embrionalnych serc myszy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść serca w OCT i odczekaj kilka sekund w celu wyrównania temperatury przed przeniesieniem ich do formy o średnicy siedmiu milimetrów zawierającej OCT. Zorientuj wewnętrzną ścianę serca w stronę dna formy. Ostrożnie umieść formę w 2-metylobutanie schłodzonym w ciekłym azocie.

Należy uważać, aby ciecz dimetylbutan nie miała kontaktu z OCT ani mrożonym sercem, dopóki OCT nie stanie się całkowicie biały. Następnie należy przenieść formę do wiaderka z lodem zawierającego suchy lód. Po zamrożeniu wszystkich serc formy do kriokonserwacji należy owinąć folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia kriosekcji.

Aby utrwalić serca embrionalne, należy wypełnić dołki 12-dołkowej płytki hodowlanej 4% PFA w PBS. Po wypreparowaniu serc embrionalnych zgodnie z protokołem tekstowym, każde serce należy umieścić w dołku z PFA i utrwalać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W celu kriotekcji serc, za pomocą plastikowej pipety transferowej, należy przenieść każde serce do 1,5 mililitrowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1,5 mililitra 15% sacharozy w PBS i delikatnie mieszać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż serce opadnie na dno probówki. Następnie każde serce należy przenieść do 30% sacharozy w PBS i delikatnie mieszać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż serce opadnie na dno probówki.

Zamroź zarodki w OCT, zgodnie z wcześniejszą demonstracją w tym filmie. Po umieszczeniu form do kriokonserwacji w komorze kriostatu i wyrównaniu temperatury do -17°C, odwróć formę i delikatnie dociśnij, aby wypchnąć blok serca z formy. Zorientuj ścianę przednią serca tak, aby znajdowała się u góry uformowanego bloku tkanki.

Nanieś dużą kroplę OCT na uchwyt i zamocuj blok serca na kropli OCT. Zachowaj taką orientację, aby ściana przednia serca była najdalej oddalona od uchwytu. Pozostaw serce do zamrożenia na uchwycie.

Umieść uchwyt i zamocowany blok serca w uchwycie obiektowym kriostatu. Dostosuj ustawienia tak, aby kąt nachylenia noża względem próbki wynosił od trzech do pięciu stopni. Pobierz przekroje o grubości 10 µm na szkiełka przedmiotowe, które zostały wstępnie przygotowane za pomocą powłoki dodatnio naładowanej.

Próbki należy całkowicie wysuszyć przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C w celu przeprowadzenia immunofluorescencji. Po utrwaleniu i/lub usunięciu OCT z przekrojów, należy zastosować 1x bufor blokujący rozcieńczony w PBS, aby blokować przez 45 minut przy delikatnym wstrząsaniu. W przypadku użycia przeciwciała pierwszorzędowego wytworzonego u myszy, należy dodać monowalenny fragment FAB przeciwciała anty-mysiego IgG H plus L pochodzenia osiołkowego lub koziego, rozcieńczony 1:100 w PBS z 0,1% tween 20, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut przy delikatnym wstrząsaniu.

Należy dodać przeciwciało pierwotne lub przeciwciała pierwotne rozcieńczone w jednokrotnym buforze blokującym i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C. Po inkubacji należy trzykrotnie przemyć skrawki 1x PBS przez 10 minut. W temperaturze pokojowej należy dodać do próbek koniugowane przeciwciało wtórne rozcieńczone 1:500 w buforze blokującym i inkubować przez dwie godziny, chroniąc przed światłem.

W temperaturze pokojowej należy trzykrotnie przemyć skrawki w roztworze XPBS przez 10 minut każdy, chroniąc je przed światłem. Preparaty należy zamontować w medium przeciwblaknięciowym, nakładając dwie krople medium na każdy koniec szkiełka, a następnie przykryć szkiełkiem nakrywkowe. Brzegi szkiełek nakrywkowych należy zabezpieczyć lakierem do paznokci.

Przechowywać w temperaturze 4 °C, w ciemności, do momentu obrazowania. Używając obiektywu 4x i fluorescencji laserowej, zlokalizować próbkę oraz obszar zainteresowania. Wykonać zdjęcie, które posłuży jako mapa.

Podczas obrazowania przy dużym powiększeniu należy wyjąć preparat, wprowadzając minimalne korekty ustawienia stolika. Następnie należy zmienić obiektyw na 60 x z imersją olejową.

Nanieś niewielką kroplę olejku na obiektyw i umieść preparat z powrotem na stoliku mikroskopu. Następnie ponownie zlokalizuj próbkę, a moc lasera, czas ekspozycji oraz binning ustaw na poziomy odpowiednie dla każdego kanału. Po ustaleniu optymalnych ustawień zgodnie z wytycznymi protokołu tekstowego, zastosuj te same parametry dla wszystkich przekrojów tkanek w ramach eksperymentu.

Użyj histogramu intensywności, aby określić optymalny zakres intensywności dla każdego kanału, który zostanie wykorzystany do analizy. Wygeneruj stos Z (Z stack), korzystając z funkcji akwizycji i wybierając odpowiednie kanały laserowe. Następnie wybierz górną i dolną granicę stosu Z.

Wybierz wielkość kroku Zack tak, aby stanowiła połowę wartości grubości warstwy optycznej podanej przez oprogramowanie. Kliknij run, aby zebrać obrazy przy użyciu programu Fiji lub porównywalnego programu do analizy obrazu. Otwórz plik Zack, korzystając z opcji niestandardowego trybu kolorów i rozdzielając kanały na osobne okna.

Z menu rozwijanego obrazu otwórz narzędzie do regulacji jasności i kontrastu, a następnie w każdym kanale ustaw optymalny zakres intensywności histogramu. Zastosuj te zakresy kanałów do wszystkich analizowanych próbek, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami. Następnie z menu rozwijanego kolorów obrazu połącz poszczególne kanały w jeden obraz kompozytowy.

Używając menu projektu Image Stacks Z, utwórz spłaszczony stos Z (flattened Z stack) z obrazu kompozytowego. Ponieważ obraz ten będzie znacznie jaśniejszy niż obraz 3D, dostosuj zakres intensywności histogramu dla próbki kontrolnej, aby uniknąć przesycenia, a następnie zastosuj te same ustawienia do eksperymentalnego spłaszczonego stosu Z. Aby wygenerować obraz 3D, wybierz najpierw menu projektu Image Stacks 3D. Wybierz oś obrotu X lub Y.

Ustaw odstęp między przekrojami (slice spacing) na taką samą wartość w mikronach, jak rozmiar kroku stosu Z. Wybierz pożądany całkowity zakres obrotu i ustaw przyrost kąta obrotu na jeden. Następnie otwórz przeglądarkę Image J 3D viewer z rozwijanego menu wtyczek (plugins).

Wybierz wyświetlanie wygenerowanego obrazu kompozytowego jako wolumen i ustaw współczynnik ponownego próbkowania na jeden lub dwa. Ryciny te przedstawiają typowe wyniki barwienia współlokalizacyjnego różnych białek w gwałtownie zamrożonym i utrwalonym acetonem sercu; przeciwciało przeciwko α-aktyninie sarkomerycznej w sposób powtarzalny i z wysoką swoistością oraz minimalnym tłem znakowało dyski Z oraz dyski międzykomórkowe. Przeciwciało przeciwko białku połączeń przylegających beta-kateninie wiązało się z błoną zarówno kardiomiocytów, jak i komórek niebędących kardiomiocytami, a współlokalizacja z α-aktyniną sarkomeryczną wystąpiła w domniemanych dyskach międzykomórkowych w stadium E 16,5. Immunofluorescencja beta-1 integryny w sercu zarodkowym jest szczególnie wymagająca, jednak barwienie beta-1 integryny w tych badaniach ujawniło sygnał o tej samej periodyczności co dyski Z znakowane α-aktyniną sarkomeryczną, co prawdopodobnie odzwierciedla formowanie się początkowych kostamerów w stadium E 16,5.

W stadium E 12,5 wzór barwienia aktyniną SFA i tropomiozyną wykazał regularną periodyczność w kardiomiocytach beleczkowych, co jest zgodne z dojrzałymi miofibrylami; w zewnętrznej strefie zwartej aktynina SFA miała charakter bardziej punktowy niż liniowy, a sygnał tropomiozyny był rozproszony, a nie liniowy. Barwienie adherentne NCA i kardiomiocyty beleczkowe w sercach w stadium E 12,5 współlokalizowały z obszarami intensywnego barwienia aktyniną SFA, co prawdopodobnie reprezentuje prążki międzykomórkowe. Przedstawione tutaj jest A utrwalone w PFA embrionalne serce w stadium E 12,5, znakowane w kierunku aktyniny SFA i aktyny filamentowej z transgenicznej myszy life act RFP Ruby. Stosunek sygnału do szumu dla aktyniny SFA był niższy w porównaniu do przekrojów serca zamrożonych metodą snap frozen.

Trójwymiarowa rekonstrukcja obrazu wykazała, że włókna MyFi w obrębie kardiomiocytu przebiegają w sposób niemal równoległy, natomiast poszczególne kardiomiocyty są zorientowane pod różnymi kątami względem siebie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat prawidłowego orientowania i kriotomii zarodkowych serc, a także przeprowadzania immunobarwienia, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazu w celu oceny dojrzewania MyFi oraz kardiomiocytów podczas rozwoju serca myszy.