Lipidomika i transkryptomika w chorobach neurologicznych

Ten artykuł przedstawia modułowy protokół dla lipidomiki tkankowej i transkryptomiki oraz lipidomiki osocza w mysich modelach chorób neurologicznych ukierunkowanych na lipidy leżące u podstaw stanu zapalnego i aktywności neuronalnej, lipidy błonowe, dalsze przekaźniki oraz enzymy/receptory kodujące mRNA leżące u podstaw funkcji lipidów. Przedstawiono procedury pobierania próbek, przetwarzania próbek, ekstrakcji i kwantyfikacji.

Ten modułowy protokół umożliwia badanie wielu zdarzeń molekularnych renderowanych przez lipidy strukturalne i sygnałowe i/lub RNA w dyskretnych regionach tkanek i we krwi z ulepszonymi danymi ilościowymi i jakościowymi wyjściowymi na próbkę próbki. Metoda ma zastosowanie do każdego modelu eksperymentalnego, a także może być stosowana do próbek tkanek ludzkich i krwi. Procedurę zademonstrują Claudia Schwitter, technik, Julia Post, doktorantka i Raissa Lerner, doktorant w mojej grupie.

Na początek weźmy wcześniej wyizolowane, całe, zamrożone mózgi myszy z ostrą i profilaktycznie leczoną padaczką wywołaną kwasem kainowym. Zamontuj mózgi na systemie mocowania kriostatu. Ustaw grubość na 50 mikrometrów i pokrój mózg w trybie przycinania blisko interesującego Cię obszaru.

Zbliżając się do obszaru zainteresowania, ustaw grubość na 18 do 20 mikrometrów. Aby zlokalizować interesujący podregion, wybarwić wycinki mózgu za pomocą błękitu toluidynowego. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić poplamione plasterki, aby zidentyfikować obszary zainteresowania, które mają zostać przedziurkowane, i użyj atlasu myszy jako odniesienia, aby znaleźć odpowiednie obszary anatomiczne mózgu.

Użyj rdzeni do próbek, aby pobrać stemple o średnicy od 0,8 do 1,0 milimetra. Przenieś stemple do koekstrakcji endokannabinoidów i eikozanoidów do wstępnie schłodzonych 2-mililitrowych bursztynowych probówek z siedmioma wstępnie schłodzonymi stalowymi kulkami na probówkę. W przypadku koekstrakcji fosfolipidów i endokannabinoidów, podwójnej koekstrakcji lipidów i RNA, przenieś stemple do 2-mililitrowych probówek ekstrakcyjnych wolnych od RNaz z kulkami ceramicznymi.

Zważyć zamrożone stemple w chłodni i natychmiast przystąpić do ekstrakcji lub zamrożenia w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić płynno-płynną koekstrakcję lipidów endokannabinoidów i eikozanoidów z kawałków mózgu, stempli lub próbek proszku tkankowego, umieść probówki ekstrakcyjne zawierające próbki tkanek i siedem stalowych kulek na lodzie. Dodać 600 mikrolitrów lodowatego MTBE i 50 mikrolitrów wody acetonitrylowej zawierającej wzorce wewnętrzne.

Po dodaniu 400 mikrolitrów 0,1-molowego kwasu mrówkowego użyj lizera tkankowego do homogenizacji przez 30 sekund do 1 minuty. Odwirować ten homogenat przez 15 minut w temperaturze 5 000 razy g w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Umieść go w zamrażarce na 10 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby zamrozić dolną fazę wodną, co ułatwi przenoszenie górnej fazy organicznej.

Przenieś górną fazę organiczną do nowych 1,5 mililitrowych bursztynowych probówek, odparuj pod delikatnym strumieniem azotu o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie rozpuść w 50 mikrolitrach wody acetonitrylowej do dalszej analizy. Przechowuj fazę wodną w temperaturze 20 lub 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy zawartości białka. Aby wyekstrahować endokannabinoidy i eikozanoidy z próbek osocza, umieść zamrożone próbki osocza na lodzie i pozwól im całkowicie się rozmrozić.

Dodać 800 mikrolitrów MTBE i 50 mikrolitrów wody acetonitrylowej zawierającej wewnętrzne wzorce zoptymalizowane pod kątem dozowania przy użyciu referencyjnych próbek osocza. Dodaj 600 mikrolitrów 0,1 molowego kwasu mrówkowego i wiruj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 2 minuty. Odwirować próbki w temperaturze 4 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Przenieś fazę organiczną do nowych probówek. Odparuj go pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie rozpuść w 50 mikrolitrach wody acetonitrylowej do analizy monitorowania wielu reakcji chromatografii cieczowej. Aby przeprowadzić koekstrakcję fosfolipidów i endokannabinoidów z obszarów mózgu, stempli lub innych próbek proszku tkankowego, umieść probówki ekstrakcyjne zawierające próbki tkanek i kulki ceramiczne na lodzie.

Dodać 800 mikrolitrów mieszaniny eteru metylowo-tert-butylowego i metanolu oraz 10 mikrolitrów metanolu zawierającego wzorce wewnętrzne. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego zawierającego 25 mikromolowych tetrahydrolipstatyny/URB597 i 50 mikrogramów na mililitr BHT. Po homogenizacji za pomocą homogenizatora tkankowego odwirować w temperaturze 5 000 g i 4 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Przenieś górną fazę organiczną do nowych probówek, odparuj pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie rozpuść ten ekstrakt lipidowy w 90 mikrolitrach metanolu. Jeśli kontynuujesz natychmiast, dodaj 10% wody do podwielokrotności ekstraktu lipidowego i wstrzyknij 10 mikrolitrów do LC/MS w celu analizy fosfolipidów. W celu dalszej analizy endokannabinoidów przejdź do następnego kroku.

Pobrać porcję ekstraktu lipidowego, odparować do sucha i rozpuścić w wodzie z acetonitrylem. Aby przeprowadzić podwójną ekstrakcję RNA i lipidów oraz koekstrakcję fosfolipidów i endokannabinoidów z próbek tkanek, należy rozmrozić podwielokrotności proszku tkankowego lub pęczki mózgu w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodaj tkankę do probówek ekstrakcyjnych z kulkami ceramicznymi.

Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu RLT razem z 200 mikrolitrami chloroformu. W przypadku koekstrakcji fosfolipidów i endokannabinoidów, należy pobrać próbki z 10 mikrolitrami mieszaniny wzorca wewnętrznego i homogenizować z dużą prędkością przez 20 sekund. Przenieś homogenizowane próbki do nowych probówek wirówkowych i wiruj przez pięć minut z pełną prędkością i w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby umożliwić separację faz.

Przenieś górną fazę do świeżej probówki w celu ekstrakcji RNA za pomocą standardowego zestawu. Elute wyekstrahował RNA w łącznej objętości 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz i przechowywał go w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Do ekstrakcji lipidów dodać 800 mikrolitrów MTBE/metanolu i 200 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego do dolnej fazy zawierającej chloroform.

Wirować przez 45 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieś górną fazę organiczną do nowej probówki. Odparuj go pod delikatnym strumieniem azotu o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W celu dalszej analizy LC/MS należy rozpuścić próbkę w 90 mikrolitrach metanolu i przechowywać ją w temperaturze 20 lub 80 stopni Celsjusza lub natychmiast przystąpić do analizy. W celu dalszej analizy endokannabinoidów przejdź do następnego kroku. Pobrać porcję ekstraktu lipidowego, odparować do sucha i rozpuścić w wodzie z acetonitrylem.

Następnie wstrzyknij 20 mikrolitrów do LC/MS w celu analizy endokannabinoidów. Indukcja kwasu kainowego w ostrych napadach padaczkowych prowadziła do maksymalnej intensywności napadu godzinę po wstrzyknięciu. Profilowanie lipidomiczne endokannabinoidów i eikozanoidów, a także fosfolipidów i endokannabinoidów, pokazuje zmiany poziomu lipidów w korze mózgowej, prążkowiu, okolicy wzgórza, hipokampie, podwzgórzu, móżdżku, a także w tkance serca i płuc u myszy padaczkowych wywołanych kwasem kainowym i w grupie kontrolnej.

Po podwójnej ekstrakcji fosfolipidów i endokannabinoidów oraz RNA w celu ilościowego profilowania ciosów mózgu myszy, przeanalizowano ilościowy rozkład lipidów w podwzgórzu, ciele migdałowatym podstawno-bocznym oraz hipokampie brzusznym i grzbietowym. Względne poziomy ekspresji endogennych enzymów i receptorów zaangażowanych w sygnalizację lipidową, a także markery aktywności mózgu badane na poziomie mRNA w różnych regionach i podregionach mózgu od myszy poddanych napadom padaczkowym wywołanym kwasem kainowym i kontrolom. Padaczka wywołana kwasem kainowym spowodowała masywną utratę sygnału NeuN, głównie w regionie CA1, CA3 i wnęki hipokampa, którym towarzyszyły zdarzenia apoptotyczne wskazane sygnałem kaspazy-3 w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną.

Po leczeniu podprzewlekłym palmitoiloetanoloamidem sygnał białkowy jąder neuronalnych był zauważalnie zachowany, a sygnał CASP3 był ledwo wykrywalny. Dziurkowanie mózgu i preparowanie dyskretnych obszarów mózgu jest dość trudne i wymaga doskonałych umiejętności, aby uzyskać spójne pobieranie próbek w wielu kohortach. Dlatego zdecydowanie zaleca się ćwiczenie na narządach testowych i dobrą znajomość morfologii mózgu.