Lipidomika i transkryptomika w chorobach neurologicznych
18 marca 2022
Ten artykuł przedstawia modułowy protokół dla lipidomiki tkankowej i transkryptomiki oraz lipidomiki osocza w mysich modelach chorób neurologicznych ukierunkowanych na lipidy leżące u podstaw stanu zapalnego i aktywności neuronalnej, lipidy błonowe, dalsze przekaźniki oraz enzymy/receptory kodujące mRNA leżące u podstaw funkcji lipidów. Przedstawiono procedury pobierania próbek, przetwarzania próbek, ekstrakcji i kwantyfikacji.
Ten modułowy protokół umożliwia badanie wielu zdarzeń molekularnych renderowanych przez lipidy strukturalne i sygnałowe i/lub RNA w dyskretnych regionach tkanek i we krwi z ulepszonymi danymi ilościowymi i jakościowymi wyjściowymi na próbkę próbki. Metoda ma zastosowanie do każdego modelu eksperymentalnego, a także może być stosowana do próbek tkanek ludzkich i krwi. Procedurę zademonstrują Claudia Schwitter, technik, Julia Post, doktorantka i Raissa Lerner, doktorant w mojej grupie.
Na początek weźmy wcześniej wyizolowane, całe, zamrożone mózgi myszy z ostrą i profilaktycznie leczoną padaczką wywołaną kwasem kainowym. Zamontuj mózgi na systemie mocowania kriostatu. Ustaw grubość na 50 mikrometrów i pokrój mózg w trybie przycinania blisko interesującego Cię obszaru.
Zbliżając się do obszaru zainteresowania, ustaw grubość na 18 do 20 mikrometrów. Aby zlokalizować interesujący podregion, wybarwić wycinki mózgu za pomocą błękitu toluidynowego. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić poplamione plasterki, aby zidentyfikować obszary zainteresowania, które mają zostać przedziurkowane, i użyj atlasu myszy jako odniesienia, aby znaleźć odpowiednie obszary anatomiczne mózgu.
Użyj rdzeni do próbek, aby pobrać stemple o średnicy od 0,8 do 1,0 milimetra. Przenieś stemple do koekstrakcji endokannabinoidów i eikozanoidów do wstępnie schłodzonych 2-mililitrowych bursztynowych probówek z siedmioma wstępnie schłodzonymi stalowymi kulkami na probówkę. W przypadku koekstrakcji fosfolipidów i endokannabinoidów, podwójnej koekstrakcji lipidów i RNA, przenieś stemple do 2-mililitrowych probówek ekstrakcyjnych wolnych od RNaz z kulkami ceramicznymi.
Zważyć zamrożone stemple w chłodni i natychmiast przystąpić do ekstrakcji lub zamrożenia w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić płynno-płynną koekstrakcję lipidów endokannabinoidów i eikozanoidów z kawałków mózgu, stempli lub próbek proszku tkankowego, umieść probówki ekstrakcyjne zawierające próbki tkanek i siedem stalowych kulek na lodzie. Dodać 600 mikrolitrów lodowatego MTBE i 50 mikrolitrów wody acetonitrylowej zawierającej wzorce wewnętrzne.
Po dodaniu 400 mikrolitrów 0,1-molowego kwasu mrówkowego użyj lizera tkankowego do homogenizacji przez 30 sekund do 1 minuty. Odwirować ten homogenat przez 15 minut w temperaturze 5 000 razy g w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Umieść go w zamrażarce na 10 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby zamrozić dolną fazę wodną, co ułatwi przenoszenie górnej fazy organicznej.
Przenieś górną fazę organiczną do nowych 1,5 mililitrowych bursztynowych probówek, odparuj pod delikatnym strumieniem azotu o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie rozpuść w 50 mikrolitrach wody acetonitrylowej do dalszej analizy. Przechowuj fazę wodną w temperaturze 20 lub 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy zawartości białka. Aby wyekstrahować endokannabinoidy i eikozanoidy z próbek osocza, umieść zamrożone próbki osocza na lodzie i pozwól im całkowicie się rozmrozić.
Dodać 800 mikrolitrów MTBE i 50 mikrolitrów wody acetonitrylowej zawierającej wewnętrzne wzorce zoptymalizowane pod kątem dozowania przy użyciu referencyjnych próbek osocza. Dodaj 600 mikrolitrów 0,1 molowego kwasu mrówkowego i wiruj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 2 minuty. Odwirować próbki w temperaturze 4 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przenieś fazę organiczną do nowych probówek. Odparuj go pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie rozpuść w 50 mikrolitrach wody acetonitrylowej do analizy monitorowania wielu reakcji chromatografii cieczowej. Aby przeprowadzić koekstrakcję fosfolipidów i endokannabinoidów z obszarów mózgu, stempli lub innych próbek proszku tkankowego, umieść probówki ekstrakcyjne zawierające próbki tkanek i kulki ceramiczne na lodzie.
Dodać 800 mikrolitrów mieszaniny eteru metylowo-tert-butylowego i metanolu oraz 10 mikrolitrów metanolu zawierającego wzorce wewnętrzne. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego zawierającego 25 mikromolowych tetrahydrolipstatyny/URB597 i 50 mikrogramów na mililitr BHT. Po homogenizacji za pomocą homogenizatora tkankowego odwirować w temperaturze 5 000 g i 4 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Przenieś górną fazę organiczną do nowych probówek, odparuj pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie rozpuść ten ekstrakt lipidowy w 90 mikrolitrach metanolu. Jeśli kontynuujesz natychmiast, dodaj 10% wody do podwielokrotności ekstraktu lipidowego i wstrzyknij 10 mikrolitrów do LC/MS w celu analizy fosfolipidów. W celu dalszej analizy endokannabinoidów przejdź do następnego kroku.
Pobrać porcję ekstraktu lipidowego, odparować do sucha i rozpuścić w wodzie z acetonitrylem. Aby przeprowadzić podwójną ekstrakcję RNA i lipidów oraz koekstrakcję fosfolipidów i endokannabinoidów z próbek tkanek, należy rozmrozić podwielokrotności proszku tkankowego lub pęczki mózgu w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodaj tkankę do probówek ekstrakcyjnych z kulkami ceramicznymi.
Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu RLT razem z 200 mikrolitrami chloroformu. W przypadku koekstrakcji fosfolipidów i endokannabinoidów, należy pobrać próbki z 10 mikrolitrami mieszaniny wzorca wewnętrznego i homogenizować z dużą prędkością przez 20 sekund. Przenieś homogenizowane próbki do nowych probówek wirówkowych i wiruj przez pięć minut z pełną prędkością i w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby umożliwić separację faz.
Przenieś górną fazę do świeżej probówki w celu ekstrakcji RNA za pomocą standardowego zestawu. Elute wyekstrahował RNA w łącznej objętości 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz i przechowywał go w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Do ekstrakcji lipidów dodać 800 mikrolitrów MTBE/metanolu i 200 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego do dolnej fazy zawierającej chloroform.
Wirować przez 45 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieś górną fazę organiczną do nowej probówki. Odparuj go pod delikatnym strumieniem azotu o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W celu dalszej analizy LC/MS należy rozpuścić próbkę w 90 mikrolitrach metanolu i przechowywać ją w temperaturze 20 lub 80 stopni Celsjusza lub natychmiast przystąpić do analizy. W celu dalszej analizy endokannabinoidów przejdź do następnego kroku. Pobrać porcję ekstraktu lipidowego, odparować do sucha i rozpuścić w wodzie z acetonitrylem.
Następnie wstrzyknij 20 mikrolitrów do LC/MS w celu analizy endokannabinoidów. Indukcja kwasu kainowego w ostrych napadach padaczkowych prowadziła do maksymalnej intensywności napadu godzinę po wstrzyknięciu. Profilowanie lipidomiczne endokannabinoidów i eikozanoidów, a także fosfolipidów i endokannabinoidów, pokazuje zmiany poziomu lipidów w korze mózgowej, prążkowiu, okolicy wzgórza, hipokampie, podwzgórzu, móżdżku, a także w tkance serca i płuc u myszy padaczkowych wywołanych kwasem kainowym i w grupie kontrolnej.
Po podwójnej ekstrakcji fosfolipidów i endokannabinoidów oraz RNA w celu ilościowego profilowania ciosów mózgu myszy, przeanalizowano ilościowy rozkład lipidów w podwzgórzu, ciele migdałowatym podstawno-bocznym oraz hipokampie brzusznym i grzbietowym. Względne poziomy ekspresji endogennych enzymów i receptorów zaangażowanych w sygnalizację lipidową, a także markery aktywności mózgu badane na poziomie mRNA w różnych regionach i podregionach mózgu od myszy poddanych napadom padaczkowym wywołanym kwasem kainowym i kontrolom. Padaczka wywołana kwasem kainowym spowodowała masywną utratę sygnału NeuN, głównie w regionie CA1, CA3 i wnęki hipokampa, którym towarzyszyły zdarzenia apoptotyczne wskazane sygnałem kaspazy-3 w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną.
Po leczeniu podprzewlekłym palmitoiloetanoloamidem sygnał białkowy jąder neuronalnych był zauważalnie zachowany, a sygnał CASP3 był ledwo wykrywalny. Dziurkowanie mózgu i preparowanie dyskretnych obszarów mózgu jest dość trudne i wymaga doskonałych umiejętności, aby uzyskać spójne pobieranie próbek w wielu kohortach. Dlatego zdecydowanie zaleca się ćwiczenie na narządach testowych i dobrą znajomość morfologii mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia modularny protokół lipidomiki i transkryptomiki tkanek, wraz z lipidomiką osocza, koncentrując się na mysich modelach chorób neurologicznych. Badanie obejmuje lipidy zaangażowane w procesy zapalne i aktywność neuronalną, szczegółowo opisując procedury pobierania próbek, ich przetwarzania, ekstrakcji oraz kwantyfikacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Lipidomika
- Transkryptomika
- Modele chorób neurologicznych
Wprowadzenie
- Bada kluczowe lipidy oraz ich role w sygnalizacji neuronalnej i stanach zapalnych.
- Może być stosowane w różnych modelach eksperymentalnych, w tym w tkankach i krwi ludzkiej.
- Dąży do uzyskania lepszej jakości wyników w analizach lipidów i RNA.
- Wykorzystuje wcześniej wyizolowane, zamrożone w całości mózgi mysie z modelu epilepsji indukowanej kwasem kainowym.
Cel badania
- Zapewnienie kompleksowej metody badania oddziaływań lipidów i RNA w schorzeniach neurologicznych.
- Poprawa jakości i ilości danych molekularnych uzyskiwanych z próbek biologicznych.
- Opracowanie technik możliwych do zastosowania zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w tkankach ludzkich.
Zastosowane metody
- Wykorzystuje skrawki mózgu myszy przygotowane za pomocą kriotomu, z zachowaniem określonej grubości dla celów ukierunkowanych badań.
- Obejmuje metody współekstrakcji lipidów i RNA, w tym ekstrakcję ciecz-ciecz oraz homogenizację próbek.
- Opisuje protokoły przetwarzania różnych typów tkanek oraz próbek osocza wraz ze szczegółowymi krokami ekstrakcji i analizy.
- Metody obejmują techniki rozdzielania faz i odparowywania w celu przygotowania próbek.
Główne wyniki
- Przedstawia systematyczne procedury umożliwiające jednoczesną analizę lipidów i RNA.
- Opisuje kluczowe klasy lipidów oraz ich rolę w stanach zapalnych i sygnalizacji neuronalnej w chorobach neurologicznych.
- Podkreśla precyzję metod ekstrakcji molekularnej w izolacji istotnych zmiennych lipidowych.
- Kładzie nacisk na zintegrowane podejście do badania lipidomiki i transkryptomiki w neuronauce.
Wnioski
- Prezentuje wszechstronne podejście do badania oddziaływań między lipidami a RNA w badaniach nad chorobami neurologicznymi.
- Wnosi wkład w zrozumienie mechanizmów lipidowych zaangażowanych w funkcje i patologię neuronów.
- Wskazuje na potencjał protokołu do szerszych zastosowań, w tym w badaniach klinicznych na tkankach ludzkich.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zintegrowaną analizę lipidów i RNA z odrębnych regionów mózgu, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów terapeutycznych w chorobach neurologicznych. Dzięki ilościowemu określeniu zmian w sygnalizacji lipidowej równolegle z ekspresją enzymów i receptorów, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków. Podejście to jest możliwe do zastosowania w modelach zwierzęcych oraz w tkankach ludzkich, co ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania do fazy przedklinicznej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza systemów sygnalizacji lipidowej i ich fenotypów molekularnych w obszarach mózgu istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwia współekstrakcję lipidów i RNA z wycinków o rozmiarze zaledwie 0,8–1,0 mm, co redukuje błąd próbkowania.
- Wartość prognostyczna: Łączy zmiany w lipidomie z mRNA enzymów i receptorów, co wspiera testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Standaryzuje oznaczanie ilościowe LC/MRM dla endokannabinoidów, eikozanoidów i fosfolipidów w różnych regionach.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardy wewnętrzne oraz zoptymalizowaną ekstrakcję w celu zapewnienia powtarzalnego profilowania lipidomicznego.
- Gotowość analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewu związków w modelach neurologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Rozszerzenie na organy obwodowe i osocze, co umożliwia odkrywanie systemowych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Wsparcie dla podłużnego śledzenia zmian w lipidach i RNA od fazy ostrego napadu do leczenia podprzewlekłego.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Korelacja zmian lipidowych z markerami neurodegeneracji (np. NeuN, kaspaza-3) w celu określenia kryteriów go/no-go.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, łącząc testowanie hipotez we wczesnej biologii z opracowywaniem testów i walidacją przedkliniczną za pomocą odczytów multiomicznych.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących sygnalizacji lipidowej w anatomicznie zdefiniowanych obszarach z wykorzystaniem pobierania próbek metodą wycinania (punch-based sampling).
- Przesiewanie: Generowanie ilościowych danych dotyczących lipidów i RNA, odpowiednich do wysokopoziomowej oceny efektów działania związków.
- Analityka: Ilościowe oznaczanie lipidów metodą LC/MRM oraz standardowe profilowanie mRNA do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Powiązanie zmian w składzie lipidowym centralnego układu nerwowego z lipidomiką narządów obwodowych i osocza w celu dopasowania biomarkerów.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Zapewnienie modularnej, adaptowalnej platformy do współanalizy lipidów i RNA w różnych modelach chorób neurologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez integrację danych lipidomicznych i transkrypcyjnych z tej samej próbki.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, reprodukowalne przepływy pracy dla tkanek o niskiej zawartości materiału pochodzących z określonych obszarów mózgu.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność walidacji celów poprzez wielopoziomowe fenotypowanie molekularne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o modulację szlaków sygnalizacji lipidowej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu lipidomiki, transkryptomiki oraz anatomii mózgu w celu precyzyjnej dyssekcji obszarów.
- Zależność od dostępności kriotomu, homogenizatora tkanek, wirówki oraz systemów LC/MS z możliwością kontroli temperatury podczas procesowania.
- Konieczność stosowania ustandaryzowanych procedur operacyjnych we wszystkich zespołach w celu zapewnienia spójności pobieranych wycinków i wierności ekstrakcji.
- Konieczność uwzględnienia specyficznych dla klas lipidów schematów postępowania (np. metoda oparta na MTBE w porównaniu z metodą chloroform/metanol) podczas adaptacji do nowych modeli.
- Ograniczenia wynikające z dostępności tkanki oraz wysokich umiejętności technicznych wymaganych do pobierania wycinków o rozmiarach submilimetrowych.
