Produkcja RNA do analizy transkryptomicznej z ciał komórek neuronów ruchowych rdzenia kręgowego myszy za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego

Wysokiej jakości całkowite RNA zostało przygotowane z ciał komórkowych mysich neuronów ruchowych rdzenia kręgowego za pomocą laserowej mikrodysekcji po zabarwieniu odcinków rdzenia kręgowego Azure B w 70% etanolu. Wystarczająca ilość RNA (~40-60 ng) jest odzyskiwana z 3 000-4 000 neuronów ruchowych, aby umożliwić dalszą analizę RNA za pomocą sekwencji RNA i qRT-PCR.

Ogólnym celem tej procedury jest odzyskanie wysokiej jakości RNA z neuronów ruchowych rdzenia kręgowego bez zanieczyszczenia RNA z sąsiednich komórek. Osiąga się to poprzez najpierw odzyskanie, podzielenie i zatopienie pępowiny w podłożu kriogenicznym i zamrożenie w temperaturze minus 160 stopni Celsjusza. Drugim krokiem jest kriogeniczne przecięcie przewodu na szkiełka membranowe pióra w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Następnie szkiełka są myte w 70% etanolu i barwione lazurem B w 70% etanolu. Ostatnim krokiem jest mikropreparacja laserowa zidentyfikowanych ciał komórkowych neuronów ruchowych do buforu lizy tiocyjanianów gwinei. Ostatecznie całkowity RNA jest przygotowywany z połączonych lizatów i testowany w celu odkrycia różnic w ogólnej lub specyficznej transkrypcji RNA w neuronach zwierząt zmutowanych i dzikich.

Mikrodysekcja laserowa umożliwia odzyskanie ciał komórek neuronów ruchowych z odcinków rdzenia kręgowego bez zanieczyszczenia przez liczniejsze Scalia i inne typy komórek. Daje to szansę na przygotowanie RNA i porównanie transkrypcji między neuronami chorego zwierzęcia i normalnego. Najtrudniejszym aspektem przy opracowywaniu tej procedury było znalezienie metody barwienia, która pozwoliłaby nam wykryć neurony ruchowe w odcinkach rdzenia kręgowego przy zachowaniu wysokiego poziomu integralności RNA i zdolności ekstrakcji, zarówno przed, jak i w trakcie wychwytywania laserowego.

Stwierdziliśmy, że skrawki barwienia w lazurze B i 70% etanolu spełniały te kryteria w połączeniu z pobieraniem wypreparowanych ciał komórkowych bezpośrednio do buforu do lizy tiocyjanianu Gwinei, co pokazuje, że procedura jest ine Van Padia, postdoc w naszym laboratorium Aby uzyskać najlepsze wyniki. Upewnij się, że cały sprzęt jest oczyszczony roztworem odkażającym RNA, a następnie 70% etanolem wolnym od RNA po eutanazji i perfuzji transsercowej Ostrożnie odizoluj rdzeń kręgowy. Płucz pępowinę przez 10 sekund w RNA.

Wolna woda, aby zmyć resztki krwi i umieścić ją na szkiełku podstawowym bez RNA bardzo delikatnie, ale szybko. Następnie podziel rdzeń kręgowy poprzecznie za pomocą czystej żyletki na dziewięć do 10 części. Umieść kawałki w formie kriogenicznej wypełnionej OCT i wyrównaj je pionowo za pomocą czystej igły.

Umieść formę w płytkiej tacy zawierającej dwa metylobutany wstępnie schłodzone ciekłym azotem. Aby uniknąć degradacji RNA, umieść tackę w kąpieli z ciekłym azotem. Aby szybko zamrozić kawałki rdzenia kręgowego.

Przechowuj osadzony blok OCT w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do sześciu miesięcy przed cięciem. Gdy jest gotowy do pozycji cięcia, OCT osadza blok w schłodzonym kriostacie. Wyprodukuj plastry o grubości 20 mikronów, z których każdy zawiera od dziewięciu do 10 przekrojów rdzenia kręgowego.

Umieść skrawki na błonie pióra wolnej od RNA. Dwie szkiełka mikronowe utrzymywane początkowo w temperaturze pokojowej, aby zapewnić przyleganie sekcji. Cóż, natychmiast ponownie zamroź sekcję na powierzchni o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza wewnątrz kriostatu.

Utrzymuj szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, dopóki nie zostaną użyte na czystym stojaku. Sześć 50-mililitrowych stożkowych probówek wypełnionych RNA bez 70% etanolu. Głębokość powinna być wystarczająca, aby pokryć wszystkie sekcje zjeżdżalni, gdy zjeżdżalnia jest zanurzona.

Następnie umieść rozwiązanie 1%Azure B na tym samym stojaku. Aby zminimalizować czas między wymianą roztworów podczas prania lub barwienia, trzymaj trzy lub cztery chusteczki laboratoryjne przed stojakiem, aby szybko spuścić dodatkowy roztwór. Gdy będą gotowe, wyjmij szkiełka z zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i umieść je na suchym lodzie, rozmrozić jedno szkiełko, umieszczając je na dłoni w rękawiczce.

Usuń większość wilgoci i kondensatu ze szkiełka, wycierając je chusteczką laboratoryjną, uważając, aby nie dotknąć sekcji. Umieść szkiełko na świeżym środku osuszającym z żelem krzemionkowym na szalce Petriego na 30 do 40 sekund do całkowitego wyschnięcia. Po wyschnięciu zanurz szkiełko w pierwszej probówce RNA, wolnej od 70% etanolu.

Namocz szkiełko przez 30 sekund, a następnie zmyj OCT, zanurzając je w górę iw dół na 45 sekund do jednej minuty. Następnie wyjmij szkiełko z roztworu i spuść nadmiar płynu na chusteczki laboratoryjne. Powtórz ten proces, zanurzając szkiełko w drugiej tubce z 70% etanolem.

Jeśli OCT pozostanie wokół odcinków rdzenia kręgowego, powtórz mycie w trzeciej rurce. Po spuszczeniu nadmiaru płynu zanurz szkiełko w 1% roztworze Azure B w 70% RNA, wolnym etanolu na 30 do 45 sekund. Odcedź nadmiar Azure B na wycieraczce laboratoryjnej.

W tym momencie cała zjeżdżalnia będzie niebieska. Zanurz szkiełko w następnej tubce z 70% etanolem i zanurz szybko w górę iw dół, trzy do czterech razy, aby usunąć nadmiar barwnika i uwidocznić specyficzne zabarwienie neuronu ruchowego. Jeśli skrawki wyglądają na bardzo ciemno poplamione, powtórz etap barwienia w świeżej tubce z 70% etanolem.

Jeśli barwienie wydaje się zbyt jasne, włóż szkiełko z powrotem do roztworu Azure B na kolejne 32 sekundy i powtórz barwienie. Jeśli zabarwienie jest zadowalające, pozostaw szkiełko do krótkiego wyschnięcia na powietrzu i przejdź do następnego kroku. Po barwieniu i wysuszeniu DES istota szara będzie jasnoniebieska, a ciemnoniebieskie zabarwione neurony ruchowe będą łatwo widoczne.

Rozpocznij sekcję natychmiast po włączeniu mikroskopu. Rozładuj uchwyt probówki, aby założyć nasadkę rurki mikro fuge o średnicy 0,6 milimetra. W celu pobrania próbki umieść 30 mikrolitrów buforu do lizy gwinei i tiocyjanianów w nasadce i przykryj powierzchnię, rozprowadzając roztwór.

Za pomocą końcówki do pipety wyrównaj nasadkę z otworem i obiektywem. W przypadku zużycia oprogramowania mikroskopu utrzymuj nasadkę w zakrytej pozycji, aż do rozpoczęcia przechwytywania laserowego. Umieść wysuszone powietrzem szkiełko do góry nogami na stoliku mikroskopu tak, aby strona z membraną była skierowana w dół, a sekcja była wyrównana z otworem.

Po założeniu szkiełka skup się na odcinku rdzenia kręgowego z obiektywem pięć x, a następnie przejdź do obiektywu 20 x w celu rozwarstwienia. Najpierw zaznacz fikcyjny obszar pisakiem świetlnym i pozwól laserowi wyciąć go bez zbierania. Rozluźnia to membranę i umożliwia kolejno zaznaczanie i wycinanie wielu obszarów.

Następnie ponownie skoncentruj się i zidentyfikuj neurony ruchowe w brzusznym obszarze rogu. Neurony te można rozpoznać po ich lokalizacji morfologii parmalnej, dużym rozmiarze i ciemnoniebieskim zabarwieniu z Azure B. Za pomocą jasnego pióra wybierz narzędzie do rysowania i zaznacz wzdłuż krawędzi neuronów ruchowych, tworząc pełny kontur. Staraj się, aby kontur znajdował się jak najbliżej neuronu ruchowego, aby uniknąć zanieczyszczenia innymi komórkami.

Wiele komórek można oznaczyć przed cięciem, ponieważ oprogramowanie zapamięta pozycje, gdy będzie gotowe do cięcia, umieść nasadkę pod pozycją cięcia i kliknij przycisk start, aby rozpocząć sekcję neuronów ruchowych za pomocą lasera. Zbierz wszystkie neurony ruchowe ze wszystkich sekcji na jednym szkiełku do nasadki jednej rurki z mikro fuge. Po zakończeniu zbierania wyjmij probówkę z mikrofuge z uchwytu, rozładowując tackę i delikatnie usuwając probówkę, całkowicie rozpuść neurony ruchowe i buforuj, pipetując roztwór w górę iw dół.

Przenieś roztwór do korpusu probówki przez odwirowanie, natychmiast zamroź próbkę w suchym lodzie i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po zabarwieniu Azure B. Neurony ruchowe wyglądają jak duże, ciemno zabarwione ciała komórkowe. Są one potwierdzone przez przeciwciała anty CHATT, barwienie i są łatwe do odróżnienia od mniejszych sąsiednich komórek. W tym przykładzie ciała komórek neuronów ruchowych zostały obrysowane piórem świetlnym i ponumerowane przez oprogramowanie.

Tutaj ciała komórek zostały wycięte laserem i wrzucone do probówki zbiorczej z wyłączonymi konturami. Zakres uszkodzeń lasera w sąsiednich regionach jest oczywisty. Przedstawiono tutaj typowe wyniki analizy elektroforetycznej integralności RNA próbki z około 4 000 ciał komórek neuronów ruchowych myszy pobranych za pomocą LMD.

Zwróć uwagę na wyraźne piki rybosomalnego RNA. Ten proces od barwienia szkiełka do rozwarstwienia neuronu ruchowego powinien zostać zakończony w ciągu 30 minut dla wszystkich sekcji na jednym szkiełku, aby zminimalizować degradację RNA. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o jak najszybszej pracy, zarówno w początkowym rozwarstwieniu i osadzeniu rdzenia, jak i w końcowych etapach barwienia i mikrodysekcji neuronów ruchowych wychwytywanych laserowo.