Produkcja RNA do analizy transkryptomicznej z ciał komórek neuronów ruchowych rdzenia kręgowego myszy za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego
13 stycznia 2014
Wysokiej jakości całkowite RNA zostało przygotowane z ciał komórkowych mysich neuronów ruchowych rdzenia kręgowego za pomocą laserowej mikrodysekcji po zabarwieniu odcinków rdzenia kręgowego Azure B w 70% etanolu. Wystarczająca ilość RNA (~40-60 ng) jest odzyskiwana z 3 000-4 000 neuronów ruchowych, aby umożliwić dalszą analizę RNA za pomocą sekwencji RNA i qRT-PCR.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości RNA z neuronów ruchowych rdzenia kręgowego bez zanieczyszczenia RNA z sąsiednich komórek. Osiąga się to poprzez wstępne odzyskanie, podzielenie i zatopienie rdzenia w medium do kriozatopienia, a następnie zamrożenie w temperaturze -160 °C. Drugim krokiem jest wykonanie kriosiekcji rdzenia na szkiełkach z membraną w temperaturze -20 °C.
Następnie preparaty na szkiełkach są przemywane 70% etanolem i barwione Azure B w 70% etanolu. Ostatnim etapem jest laserowa mikrodysekcja (LCM) zidentyfikowanych ciał komórek neuronów ruchowych do buforu lizującego z izotiocyjanianem guanidyny. Ostatecznie z połączonych lizatów izoluje się całkowite RNA, które jest następnie analizowane w celu wykrycia różnic w ogólnej lub specyficznej transkrypcji RNA w neuronach zwierząt mutantów w porównaniu do zwierząt typu dzikiego.
Mikrodyssekcja sterowana laserem umożliwia odzyskanie ciał komórek neuronów ruchowych z przekrojów rdzenia kręgowego bez zanieczyszczenia ich przez bardziej liczne glejowce oraz inne typy komórek. Daje to możliwość przygotowania RNA i porównania transkrypcji między neuronami zwierzęcia chorego a zdrowego. Najtrudniejszym aspektem opracowania tej procedury było znalezienie metody barwienia, która pozwoliłaby na wykrycie neuronów ruchowych w przekrojach rdzenia kręgowego, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiego poziomu integralności RNA i możliwości jego ekstrakcji, zarówno przed, jak i w trakcie mikrodyssekcji laserowej.
Stwierdzono, że barwienie przekrojów w Azure B i 70% etanolu spełnia te kryteria w połączeniu z bezpośrednim zbieraniem wypreparowanych ciał komórkowych do buforu lizującego z tiocyjanianem guanidyny, co dowodzi skuteczności tej procedury. Van Padia, postdoc w naszym laboratorium, sugeruje, aby dla uzyskania najlepszych wyników upewnić się, że cały sprzęt został oczyszczony roztworem do dekontaminacji RNA, a następnie 70% etanolem wolnym od RNA. Po eutanazji i perfuzji przezsercowej należy ostrożnie wyizolować rdzeń kręgowy. Przemyć rdzeń przez 10 sekund w roztworze wolnym od RNA.
Przepłucz wodą, aby usunąć resztki krwi, a następnie bardzo delikatnie, lecz szybko, połóż tkankę na szkiełku przedmiotowym wolnym od RNA. Następnie, używając czystej żyletki, podziel rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym na od 9 do 10 fragmentów. Umieść fragmenty w formie do kriotomii wypełnionej OCT i ustaw je pionowo za pomocą czystej igły.
Umieścić formę w płytkiej kuwecie zawierającej dwa methyl butane schłodzone ciekłym azotem. Aby zapobiec degradacji RNA, należy umieścić kuwetę w kąpieli z ciekłego azotu w celu szybkiego zamrożenia fragmentów rdzenia kręgowego.
Blok zatopiony w OCT przechowywać w temperaturze -80 °C do sześciu miesięcy przed skrawaniem. Po przygotowaniu do skrawania, umieścić blok zatopiony w OCT w schłodzonym kriostacie. Przygotować skrawki o grubości 20 µm, z których każdy zawiera od 9 do 10 przekrojów poprzecznych rdzenia kręgowego.
Umieść skrawki na membranie wolnej od RNA. Przez dwie minuty pozostaw preparaty w temperaturze pokojowej, aby zapewnić przyleganie skrawków. Następnie niezwłocznie zamroź ponownie skrawki na powierzchni o temperaturze -20 °C wewnątrz kriotomatu.
Przechowywać preparaty na szkiełkach w temperaturze -80 °C aż do momentu użycia, korzystając z czystego statywu. Przygotować sześć probówek stożkowych o pojemności 50 ml wypełnionych 70% etanolem wolnym od RNaz. Poziom cieczy powinien być wystarczający, aby w pełni zakryć wszystkie skrawki na szkiełku po jego zanurzeniu.
Następnie umieść roztwór Azure B 1% na tym samym statywie. Aby zminimalizować czas między zmianami roztworów podczas przemywania lub barwienia, połóż przed statywem trzy lub cztery chusteczki laboratoryjne, aby szybko odprowadzać nadmiar roztworu. Po przygotowaniu wyjmij preparaty z zamrażarki do -80 °C i umieść je na suchym lodzie; rozmroź jeden preparat, kładąc go na dłoni w rękawiczce.
Usuń większość wilgoci i kondensacji z preparasu, wycierając go chusteczką laboratoryjną, uważając, aby nie dotknąć skrawków. Umieść preparas na świeżym żelu krzemionkowym w szalce Petriego na 30 do 40 sekund w celu całkowitego osuszenia. Po wyschnięciu zanurz preparas w pierwszej probówce z 70% ethanol.
Namaczaj preparat przez 30 sekund, a następnie wypłucz OCT, zanurzając go kilkakrotnie góra-dół przez od 45 sekund do jednej minuty. Następnie wyjmij preparat z roztworu i odsącz nadmiar cieczy za pomocą ręczników laboratoryjnych. Powtórz tę procedurę, zanurzając preparat w drugiej probówce z 70% ethanol.
Jeśli OCT pozostaje wokół przekrojów rdzenia kręgowego, powtórz płukanie w trzeciej probówce. Po odlaniu nadmiaru płynu zanurz preparat w 1% roztworze Azure B w 70% etanolu wolnym od RNaz na 30 do 45 sekund. Odlej nadmiar Azure B na ręcznik laboratoryjny.
Na tym etapie cały preparat będzie miał niebieski kolor. Zanurz slajd w kolejnej probówce z 70% ethanol i szybko zanurzaj go w górę i w dół trzy lub cztery razy, aby usunąć nadmiar barwnika i uwidocznić specyficzne barwienie neuronów ruchowych. Jeśli przekroje wydają się zbyt ciemno zabarwione, powtórz etap odbarwiania w nowej probówce z 70% ethanol.
Jeśli barwienie wydaje się zbyt słabe, należy ponownie umieścić preparat w roztworze Azure B na kolejne 32 s i powtórzyć odbarwianie. Jeśli barwienie jest zadowalające, należy pozostawić preparat do krótkiego wyschnięcia na powietrzu i przejść do następnego kroku. Po barwieniu DES i wysuszeniu istota szara będzie miała jasnoniebieski kolor, a intensywnie niebieskie barwione motoneurony będą łatwo widoczne.
Rozpocznij sekcję natychmiast po włączeniu mikroskopu. Wyjmij uchwyt probówki, aby przymocować zakrętkę probówki do mikrowirówki o rozmiarze 0,6 mm. W celu pobrania próbki, wprowadź 30 µL buforu lizującego z guanidyną i tiocyjanianem do zakrętki i pokryj powierzchnię, rozprowadzając roztwór.
Za pomocą końcówki pipety wyrównaj nakrętkę z otworem i obiektywem. W oprogramowaniu mikroskopu utrzymuj nakrętkę w pozycji zamkniętej aż do rozpoczęcia laserowej mikrodysekcji. Umieść wysuszoną na powietrzu laminkę odwróconą do góry dnem na stoliku mikroskopu tak, aby strona z membraną była skierowana w dół, a przekrój znajdował się w osi otworu.
Po umieszczeniu preparatu w uchwycie, należy ustawić ostrość na przekroju rdzenia kręgowego przy użyciu obiektywu 5x, a następnie przełączyć na obiektyw 20x w celu przeprowadzenia mikrodysekcji. Najpierw należy zaznaczyć obszar testowy za pomocą pióra świetlnego i pozwolić laserowi wyciąć go bez zbierania materiału. Pozwala to na rozluźnienie błony, co umożliwia sukcesywne zaznaczanie i wycinanie wielu kolejnych obszarów.
Następnie należy ponownie ustawić ostrość i zidentyfikować motoneurony w obszarze rogu przedniego. Neurony te można rozpoznać po ich lokalizacji, morfologii, dużym rozmiarze oraz ciemnoniebieskim barwieniu Azure B. Używając pióra świetlnego, należy wybrać narzędzie do rysowania i obrysować krawędź motoneuronów, tworząc pełny kontur. Należy starać się, aby obrys był jak najbliższy motoneuronu, aby uniknąć zanieczyszczenia sygnału innymi komórkami.
Przed rozpoczęciem cięcia można zaznaczyć wiele komórek, ponieważ oprogramowanie zapamięta ich pozycje; gdy system będzie gotowy do cięcia, należy umieścić kapturek pod pozycją cięcia i kliknąć przycisk start, aby rozpocząć wycinanie neuronów ruchowych za pomocą lasera. Wszystkie neurony ruchowe ze wszystkich przekrojów na jednym szkiełku należy zebrać do kapturka jednej probówki typu microfuge. Po zakończeniu zbierania należy wyjąć probówkę microfuge z uchwytu poprzez wysunięcie tacy i delikatne wysunięcie probówki, a następnie całkowicie rozpuścić neurony ruchowe w buforze, pipetując roztwór w górę i w dół.
Przenieś roztwór na dno probówki poprzez wirowanie, natychmiast zamroź próbkę w suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C po barwieniu błękitem Azure B. Neurony ruchowe widoczne są jako duże, ciemno zabarwione ciała komórek. Ich obecność potwierdzono barwieniem przeciwciałami anty-CHATT, a same są łatwo odróżnialne od mniejszych komórek sąsiednich. W tym przykładzie ciała komórek neuronów ruchowych zostały obrysowane za pomocą pióra świetlnego i ponumerowane przez oprogramowanie.
W tym przypadku ciała komórek zostały wycięte laserem i przeniesione do probówki zbierającej przy wyłączonych konturach. Widoczny jest zakres uszkodzeń laserowych w obszarach sąsiednich. Przedstawiono tutaj typowe wyniki analizy elektroforetycznej integralności RNA próbki pochodzącej z około 4 000 ciał komórek neuronów ruchowych myszy, zebranych metodą LMD.
Zwróć uwagę na wyraźne piki rRNA. Ten proces, od barwienia preparatu po mikrodysekcję neuronów ruchowych, powinien zostać ukończony w ciągu 30 minut dla wszystkich sekcji na jednym szkiełku, aby zminimalizować degradację RNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować tak szybko, jak to możliwe, zarówno podczas wstępnej dysekcji i zatapiania rdzenia, jak i w końcowych etapach barwienia oraz laserowej mikrodysekcji neuronów ruchowych.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metodę izolacji wysokiej jakości RNA z neuronów ruchowych rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem laserowej mikrodysekcji przechwytującej. Proces ten zapewnia minimalne zanieczyszczenie komórkami sąsiednimi, co umożliwia dokładną analizę RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia molekularna
- Analiza ekspresji genów
Wstęp
- Neurony ruchowe mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia chorób neurodegeneracyjnych.
- Ekstrakcja wysokiej jakości RNA jest niezbędna do dokładnych badań ekspresji genów.
- Zanieczyszczenia z otaczających komórek mogą zniekształcać wyniki.
- Mikrosekcja laserowa (LCM) stanowi rozwiązanie pozwalające na izolację konkretnych typów komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji RNA z neuronów ruchowych.
- Porównanie transkrypcji RNA u zwierząt mutantów i typu dzikiego.
- Zachowanie integralności RNA podczas ekstrakcji i analizy.
Zastosowane metody
- Przekroje rdzenia kręgowego osadzono w medium do mrożenia i zamrożono.
- Przekroje zabarwiono błękitem Azure B i przemyto etanolem.
- Wykonano mikrodysekcję laserową w celu wyizolowania motoneuronów.
- Z lizatów przygotowano całkowite RNA do dalszych analiz.
Główne wyniki
- Z 3 000–4 000 neuronów ruchowych pomyślnie wyekstrahowano wysokiej jakości RNA (~40-60 ng).
- Zastosowana metoda zminimalizowała zanieczyszczenie innymi typami komórek.
- Integralność RNA została zachowana przez cały czas trwania procedury.
- Można przeprowadzić dalsze analizy, takie jak RNA-seq i qRT-PCR.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w izolowaniu RNA z konkretnych populacji neuronów.
- Umożliwia ona prowadzenie badań porównawczych między neuronami chorobowymi a prawidłowymi.
- Technika ta może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy na temat biologii neuronów ruchowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Izolacja wysokiej jakości RNA z rzadkich populacji komórek, takich jak neurony ruchowe, umożliwia precyzyjną walidację celów w modelach chorób neurodegeneracyjnych. Podejście to redukuje szum biologiczny i zwiększa wiarygodność prognostyczną podczas porównywania profilów transkrypcyjnych mutantów z typem dzikim. Wspiera ono wczesną weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie genotypu ze zmianami ekspresji genów specyficznymi dla danego typu komórek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w neuronach ruchowych istotnych dla danej jednostki chorobowej, bez zakłócających sygnałów z komórek glejowych lub sąsiednich.
- Wartość operacyjna: Dostarcza odtwarzalnej metody izolacji <10% populacji komórek rdzenia kręgowego do badań nad oddziaływaniem na cel terapeutyczny.
- Wartość prognostyczna: Wspiera odkrywanie biomarkerów i redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z ekspresją RNA specyficzną dla danego typu komórek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie wysokiej jakości RNA do dalszych analiz, takich jak qRT-PCR i RNA-seq, przy minimalnym zanieczyszczeniu międzykomórkowym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek poprzez barwienie Azure B w 70% etanolu oraz bezpośrednią lizę w buforze z tiocyjanianem guanydyny.
- Gotowość do analizy: Umożliwia skalowalne profilowanie transkryptomów neuronów ruchowych w różnych modelach genetycznych lub warunkach terapeutycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia ciągłość translacyjną, umożliwiając bezpośrednie porównanie profili RNA między chorymi a zdrowymi neuronami ruchowymi.
- Wartość operacyjna: Zachowuje integralność RNA od momentu cięcia sekcji po lizę, co pozwala na wiarygodne wykrycie różnic transkrypcyjnych.
- Minimalizacja ryzyka: Redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas walidacji celu poprzez izolację komórkowego źródła sygnału.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywisk – od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu po identyfikację związków wiodących – poprzez dostarczanie oczyszczonych odczytów molekularnych z neuronów istotnych dla przebiegu choroby.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację punktów uchwytu poprzez izolowanie specyficznych dla neuronów ruchowych odpowiedzi transkrypcyjnych.
- Przesiewanie: Pozwala na otrzymanie RNA gotowego do analizy z ilościowo określoną integralnością, co zapewnia spójność przesiewania związków w modelach neuronalnych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary zmiennych zależnych (np. wydajność RNA, wartości RIN), które umożliwiają porównanie statystyczne między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez bezpośrednie porównanie transkryptomów neuronów mutantowych i typu dzikiego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowany, powtarzalny schemat postępowania w celu izolacji rzadkich populacji neuronów dla wielu celów w obrębie OUN.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej wynikającej z heterogeniczności komórkowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji parametrów barwienia, mikrodysekcji laserowej i lizy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie czystszych i łatwiejszych do interpretacji danych transkrypcyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zmiany ekspresji specyficzne dla danego typu komórek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu histologii, laserowej mikrodysekcji oraz postępowania z RNA w celu zapobiegania jego degradacji.
- Wynik zależy od zastosowania kriosztatu, systemu laserowej mikrodysekcji UV oraz odczynników wolnych od RNaz dla zapewnienia powtarzalności wyników.
- Konieczna jest standaryzacja czasu barwienia i etapów płukania etanolem pomiędzy zespołami w celu zapewnienia widoczności neuronów ruchowych.
- Należy uwzględnić adaptację specyficzną dla tkanki przy zastosowaniu metody w innych podtypach neuronów lub modelach chorobowych.
- Metoda jest ograniczona skalowalnością wydajności RNA; najlepiej nadaje się do prób łączonych z wielu skrawków lub od wielu zwierząt.
