Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej
16 sierpnia 2019
Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.
Ten mysi model zawału mięśnia sercowego umożliwia monitorowanie procesów patologicznych zachodzących od niedrożności naczyń wieńcowych do późnego stadium niewydolności serca na poziomie lokalnej tkanki serca i ogólnoustrojowym. Metoda ta jest kompatybilna z każdym odczytem stosowanym obecnie w biologii i fizjologii serca. Ponadto korzysta z ogromnej różnorodności mysich modeli genetycznych.
Opanowanie odpowiednich umiejętności chirurgicznych może zająć trochę czasu. Tej procedury najlepiej nauczyć się krok po kroku z doświadczonym badaczem. Wizualna demonstracja tego mysiego modelu pozwala na dzielenie się wskazówkami, które mogą pomóc w zabiegu chirurgicznym i przyspieszyć proces uczenia się.
Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby szybko ogolić znieczuloną, ważącą od 25 do 30 gramów, męską mysz C57-Black/6 na gardle i lewej stronie klatki piersiowej. Potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u stóp. Nałóż maść na oczy zwierzęcia.
Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej i umieść mały kompres z gazy pod głową, aby uniknąć przegrzania oczu. Zabezpiecz kończyny taśmą klejącą. Przełóż pętlę jedwabnego szwu 5-0 pod górnymi siekaczami i przymocuj koniec pętli do poduszki grzewczej, aby usta były otwarte podczas kaniulacji.
Nałóż krem do depilacji na ogolone miejsca i delikatnie masuj bawełnianym wacikiem przez minutę. Usuń nadmiar sierści i kremu gazą, a odsłoniętą skórę oczyść kroplami 0,9% roztworu soli fizjologicznej i gazy. Nałóż kawałki sterylnej gazy na ogolone gardło i klatkę piersiową, a następnie namocz gazę jodopowidonem.
Ustaw wentylator na objętość oddechową siedmiu mililitrów na kilogram i szybkość wentylacji 140 uderzeń na minutę. Przesuń mysz pod mikroskop stereoskopowy do mikrochirurgii. Trzymając skórę na środku gardła, wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie wzdłuż linii ogonowej/głowowej i oddziel płaty gruczołu ślinowego.
Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oddzielić powięź mięśnia mostkowo-gnykowego, aż krtań i tchawica będą widoczne. Następnie zabezpiecz krawędzie otworu za pomocą zwijaczy przymocowanych do elastycznych taśm. Następnie delikatnie pociągnij język na boki i za pomocą kleszczy włóż wewnętrzną igłę kaniuli o rozmiarze 16 do tchawicy.
Wyobraź sobie prawidłowe wprowadzenie do tchawicy przez nacięcie gardła i podłącz kaniulę do respiratora. Umieść sterylną 0,9% sól fizjologiczną uzupełnioną gazą nasączoną jodopowidonem na nacięciu, aby utrzymać mokre tkanki podczas operacji. Następnie umieść rurkę wydechową w wodzie.
Obecność pęcherzyków wskazuje na udaną intubację. W celu podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej lub LAD, ostrożnie przesuń mysz do pozycji odleżynowej po prawej stronie i ponownie zabezpiecz lewą kończynę przednią w nowej pozycji. Zidentyfikuj linię między lewym mięśniem piersiowym mniejszym a większym i wykonaj ukośne jednocentymetrowe nacięcie skóry wzdłuż linii.
Za pomocą mikronożyczek preparacyjnych oddziel powięź mięśni piersiowych bez nacinania tkanek i użyj retraktorów przymocowanych do elastycznych taśm, aby utrzymać separację. Ustaw wentylator na dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe wynoszące trzy centymetry wody. Użyj kleszczy, aby otworzyć jamę klatki piersiowej w trzeciej przestrzeni międzyżebrowej między trzecim a czwartym żebrem.
Umieść dwa zwijacze w klatce piersiowej, po jednym na każdym żebrze i użyj zakrzywionych cienkich kleszczy, aby ostrożnie usunąć osierdzie, nie uszkadzając serca i płuc. Zlokalizuj LAD jako powierzchowną, jaskrawoczerwoną linię biegnącą od krawędzi lewej małżowiny usznej w kierunku wierzchołka. Użyj uchwytu na igłę, aby wprowadzić jedwabny szew 7-0 pod LAD dwa do trzech milimetrów poniżej lewego przedsionka.
Ciągnąc jedwab powoli, aby uniknąć rozdarcia tkanki serca, zawiąż ligaturę trzema węzłami. Dolna lewa część lewej komory natychmiast zblednie po podwiązaniu. Teraz zwolnij zwijacze żeber i trzymając trzecie żebro kleszczami, wykonaj dwa przejścia z jedwabnym szwem 6-0 pod trzecim i czwartym żebrem.
Umieść trzy krople 0,9% roztworu soli fizjologicznej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na otworze i zamknij rurkę wydechową na dwa lub trzy cykle oddechowe, aby prawidłowo napompować płuca. Zaciśnij i zabezpiecz szew dwoma rzutami i zwolnij zwijacze przytrzymujące mięśnie, pomagając mięśniom powrócić do prawidłowego położenia anatomicznego. Następnie zamknij skórę klatki piersiowej dwoma szwami i dwoma rzutami jedwabiu do szwów 5-0.
Zamknij skórę gardła jednym szwem jedwabiu do szwów 5-0 i dwoma rzutami. Pod koniec zabiegu usuń taśmy z kończyn, ostrożnie obróć zwierzę do brzusznego odleżyny na podkładkę kompresową i umieść kompres na poduszce grzewczej po prawej stronie zwierzęcia. Dootrzewnowo wstrzyknąć 0,3 mililitra 5% roztworu glukozy o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Zatrzymać wentylator. Jeśli mysz spontanicznie oddycha, ostrożnie wyjmij kaniulę. Wstrzyknąć podskórnie 0,1 miligrama na kilogram buprenorfiny.
Umieść mysz w klatce o temperaturze 30 stopni Celsjusza wentylowanej 100% tlenem na co najmniej godzinę z monitorowaniem. Przez pierwsze dwa dni po zabiegu należy podawać myszy miękką dietę i wodę ad libitum, ogrzewając zwierzę w razie potrzeby. Siedem dni po zabiegu obszary niedokrwienne pozostają niezabarwione chlorkiem trifenylotetrazolu, podczas gdy żywa tkanka barwi się na czerwono z powodu obecności dehydrogenaz.
Obszary niedokrwienne można następnie obliczyć jako procent białego obszaru lewej komory w oprogramowaniu do obrazowania. Analiza Western blot dla aktyny alfa-mięśni gładkich i fosforylacji SMAD2, które są odpowiednio głównymi odczytami miofibroblastów i aktywacji sygnalizacji transformującego czynnika wzrostu beta, może być wykorzystana do określenia zakresu zwłóknienia w tkance mięśnia sercowego serca po zawale serca. W celu oceny obecności zwłóknienia mięśnia sercowego można również przeprowadzić analizę reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym transformującego czynnika wzrostu beta i jego dalszej docelowej ekspresji mRNA.
Zazwyczaj stwierdza się, że prozapalne szlaki sygnałowe i ekspresja genów prozapalnych są aktywowane w ciągu pierwszego tygodnia po zawale mięśnia sercowego. Obserwuje się również ekspresję mRNA genów prozapalnych i markerów monocytów/makrofagów. Wysokość podwiązania będzie miała decydujący wpływ na przeżywalność i powinna być dostosowana do każdego szczepu lub genotypu, ponieważ rozgałęzienia LAD mogą się różnić.
Stałe w ligacji są kluczem do uzyskania powtarzalnych wyników. Procedura ta może być połączona z dowolną metodą analityczną i może być poprzedzona analizą funkcjonalną, utrwalaniem tkanek, hodowlą komórkową lub dowolną techniką będącą przedmiotem zainteresowania.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę chirurgicznego, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy, co stanowi model istotny dla badania zawału mięśnia sercowego oraz towarzyszących mu procesów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia serca
- Zawał mięśnia sercowego
- Techniki chirurgiczne w modelach zwierzęcych
Wstęp
- Ten model mysi umożliwia monitorowanie procesów patologicznych od zamknięcia tętnicy wieńcowej po niewydolność serca.
- Metoda ta jest kompatybilna z różnymi parametrami pomiarowymi w fizjologii serca.
- Wykorzystuje ona różnorodność mysich modeli genetycznych.
- Opanowanie umiejętności chirurgicznych wymaga wsparcia doświadczonych badaczy.
Cel badania
- W celu przedstawienia szczegółowego protokołu chirurgicznego wiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej.
- W celu ułatwienia badania zawału mięśnia sercowego oraz związanych z nim procesów biologicznych.
- W celu usprawnienia procesu nauki badaczy poprzez demonstracje wizualne.
Zastosowane metody
- Przygotowanie myszy, w tym znieczulenie i pozycjonowanie.
- Wykonanie nacięć w celu uzyskania dostępu do jamy klatki piersiowej i tętnicy wieńcowej.
- Podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej za pomocą jedwabnych szwów.
- Opieka pooperacyjna i monitorowanie myszy.
Główne wyniki
- Pomyślna ligacja prowadzi do obserwowalnych zmian w tkance serca.
- Obszary niedokrwienne można skwantyfikować za pomocą oprogramowania do obrazowania.
- Analiza Western blot oraz PCR pozwalają ocenić włóknienie i szlaki sygnalizacyjne.
- Wykazuje wykonalność zastosowania tego modelu w badaniach kardiologicznych.
Wnioski
- Opisana procedura jest skuteczna w badaniu zawału mięśnia sercowego.
- Pozwala ona na uzyskanie wglądu w patofizjologię chorób serca.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do eksploracji interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem permanentnego podwiązania LAD stanowi solidną, powtarzalną platformę do badania mechanizmów uszkodzenia serca oraz remodelingu pozawałowego. Model ten umożliwia wysoką pewność walidacji celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków sercowo-naczyniowych, wykorzystując różnorodność genetyczną i ilościowe odczyty. Jego znaczenie translacyjne wspiera podejmowanie decyzji dotyczących portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka na etapie przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w obrębie szlaków uszkadzania i naprawy mięśnia sercowego.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie patologii serca istotnych dla człowieka.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki integracji modeli genetycznych i analizie szlaków sygnałowych.
- Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie rozwoju celów terapeutycznych w kardiologii.
Przesiew i rozwój testu
- Ustanawia zwalidowany system in vivo do dalszych analiz skuteczności i oznaczeń biomarkerów.
- Zapewnia powtarzalną kwantyfikację wielkości zawału oraz odczyty molekularne niezbędne do standaryzacji testu.
- Umożliwia skalowalny przesiew interwencji kandydackich w kontekście istotnym dla danej choroby.
- Pozwala na wiarygodną ocenę wpływu związków na przebudowę i włóknienie mięśnia sercowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z istotnymi dla przebiegu choroby punktami końcowymi, takimi jak wielkość obszaru zawału, włóknienie i sygnalizacja zapalna.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem ilościowego obrazowania i analiz molekularnych.
- Wspiera dostosowane do ryzyka postępy badań poprzez modelowanie progresji niewydolności serca w stadium zaawansowanym.
- Stanowi platformę do odkrywania i walidacji translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację związków wiodących oraz badania translacyjne w obszarze badań i rozwoju układu sercowo-naczyniowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych w zakresie mechanizmów uszkodzeń serca i zaangażowania szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalną kwantyfikację obszaru zawału oraz wyniki molekularne niezbędne do opracowywania testów.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar powierzchni zawału, markerów włóknienia i ekspresji genów do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez wykorzystanie fenotypów i biomarkerów istotnych dla przebiegu choroby.
- Wykorzystanie przedsiębiorcze: Oferuje zestandaryzowaną, adaptowalną platformę dla różnorodnych programów badawczych nad układem sercowo-naczyniowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne modelowanie in vivo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej oceny przedklinicznej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w obszarze układu sercowo-naczyniowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga specjalistycznej wiedzy chirurgicznej i przeszkolenia w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowej, molekularnej i analitycznej w celu uzyskania wyników ilościowych.
- Konieczna jest standaryzacja techniki ligacji i protokołów odczytu pomiędzy zespołami.
- Parametry ligacji muszą być dostosowane do tła genetycznego i anatomii specyficznej dla danej szczepu.
- Stała wysokość i technika ligacji są krytyczne dla uzyskania powtarzalnych wyników.
