Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

W tym filmie opisujemy zestaw procedur zaprojektowanych w celu zbadania wpływu infekcji wirusowej i wynikającej z niej odpowiedzi immunologicznej przy użyciu mysiego modelu zakażenia wirusem Zika. Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala nam rozwinąć mechanistyczne zrozumienie infekcji i odporności poprzez określenie zakresu, w jakim wirus rozprzestrzenił się w całym ciele, przekraczając bariery fizyczne i uzyskując dostęp do tkanek. Techniki te pozwalają na szczegółowe zrozumienie patogenezy wirusa i dają możliwość przeanalizowania mechanizmu ochrony zapewnianej przez szczepionki lub środki terapeutyczne.

Tutaj demonstrujemy tę metodę przy użyciu infekcji myszy wirusem Zika, ale metoda ta może być stosowana do szeregu infekcji wirusowych, w tym innych flawiwirusów, takich jak wirus dengi i alfawirusów, takich jak wirus Chikungunya. Pobieranie narządów ośrodkowego układu nerwowego może być trudne, dlatego ważne jest, aby dana osoba zaplanowała mały eksperyment i była przygotowana do wcześniejszego przećwiczenia technik. Protokół ten pozwala na szybką analizę rozprzestrzeniania się wirusa w małych modelach zwierzęcych z możliwością wizualizacji, przechwytywania i przechowywania danych eksperymentalnych.

Ważne jest, aby wizualnie zademonstrować tę metodę, aby umożliwić eksperymentatorowi zrozumienie, jak pobrać narządy ośrodkowego układu nerwowego. Ważne jest również, aby zobaczyć poziom zbiegu komórek i intensywność ognisk wirusowych. Na początek użyj kleszczy, aby usunąć sierść zainfekowanej myszy.

Odetnij głowę myszy nożyczkami, a następnie usuń ręce i nogi. Aby pobrać mózg, użyj ząbkowanych nożyczek La Grange, aby przeciąć czaszkę przez otwór wielki. Oderwij czaszkę kleszczami i zgarnij mózg szpatułką.

Za pomocą mocnych, nożyczek usuń kość otaczającą kręgosłup, a następnie przetnij kość miednicy, aby odsłonić otwór kręgowy na poziomie lędźwiowym. Następnie usuń jak najwięcej mięśni otaczających kręgosłup. Ostrożnie umieść ściętą końcówkę igły wewnątrz otworu kręgowego, unikając nadmiernego nacisku, aby zapobiec wtargnięciu igły w trzon kręgu.

Przytrzymać mocno, aby wywrzeć nacisk na trzon kręgu i igłę, a następnie nacisnąć tłok strzykawki, aby wypchnąć pępowinę na szalkę Petriego. Natychmiast przenieś rdzeń kręgowy do oznakowanej rurki i umieść w kąpieli suchego lodu w celu dalszej homogenizacji. Do homogenizacji dodaj jeden mililitr DMEM i homogenizuj próbkę w ubijaku BeadBeater.

Po upewnieniu się, że narządy są homogenizowane, odwirować i podwielokrotne próbki na lodzie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne. W dniu testu wyjmij homogenizowane próbki z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozwól im się rozmrozić. Gdy próbki znajdują się na lodzie, rozcieńczyć wirusa Zika dziesięciokrotnie do pierwszego dołka płytki rozcieńczającej i za pomocą pipety wielokanałowej wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia w dół płytki, za każdym razem zmieniając końcówki.

Dodając 20 mikrolitrów próbki do 180 mikrolitrów pożywki wzrostowej, zmieniaj końcówki pipet między każdym rozcieńczeniem. Przygotować płytkę tworzącą ognisko, usuwając pożywkę z przygotowanej płaskiej 96-dołkowej płytki pokrywającej virokomórki. Aby zapobiec wysychaniu monowarstwy, należy natychmiast dodać 100 mikrolitrów rozcieńczenia wirusa do każdej studzienki w wiropłytce.

Użyj tego samego zestawu wskazówek, aby dodać od najniższego do najwyższego stężenia. Kołysz płytę z boku na bok dwa do czterech razy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jedną do dwóch godzin. Rozgrzej 2% metylocelulozę do temperatury pokojowej.

Następnie rozcieńczyć 2% roztwór metylocelulozy w pożywce wzrostowej w stosunku około dwa do jednego. Po inkubacji dodać 125 mikrolitrów pożywki wzrostowej metylocelulozy do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek. Ponownie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 32 do 40 godzin.

Aby utrwalić wirusokomórki, w komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 50 mikrolitrów 5% paraformaldehydu na wierzch warstwy metylocelulozy w każdym dołku z 96-dołkowych płytek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie przykryj płytki Parafilmem i umieść je na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą pipety usuń nakładkę i media z komórek do jednorazowego pojemnika wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umyć delikatnie 150 mikrolitrami PBS na studzienkę. Usuń PBS z płytek i wyjmij płytkę z szafy bezpieczeństwa biologicznego.

Powtórz płukanie PBS dwukrotnie, a następnie dodaj 150 mikrolitrów na studzienkę jeden razy bufor do płukania FFA i pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć do 10 minut, aby przepuszczalność utrwalonych komórek. Następnie użyj pierwotnego przeciwciała Zika do wykrycia infekcji. Przygotować pierwszorzędowe przeciwciało 4G2 w stężeniu jednego mikrograma na mililitr w buforze barwiącym FFA.

Zetrzyj bufor płuczący FFA z płytek i dodaj 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze barwiącym FFA do każdej studzienki. Następnie uszczelnij płytki Parafilmem lub folią z tworzywa sztucznego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować wtórne przeciwciało znakowane anty-mysim HRP w stężeniu od jednego do 5 000 w buforze barwiącym FFA.

Po usunięciu roztworu przeciwciała przemyj komórki trzykrotnie 150 mikrolitrami buforu płuczącego FFA na studzienkę. Wyjmij bufor do mycia, za każdym razem wsuwając go do zlewu. Wybarwić komórki przeciwciałem wtórnym w buforze barwiącym FFA w ilości 50 mikrolitrów na studzienkę i inkubować od jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj komórki trzykrotnie buforem do płukania FFA, ponownie usuwając bufor do mycia, za każdym razem wsuwając go do zlewu. Dodaj 50 mikrolitrów substratu TrueBlue do każdej studzienki. Odczekaj od dwóch do 15 minut, aż plamy zostaną w pełni zdefiniowane z minimalnym tłem.

Po wyświetleniu plam delikatnie umyj je wodą, używając dłoni, aby osłonić monowarstwę przed siłą płynącej wody. Osusz ręczniki papierowe. Wkrótce potem użyj lunety sekcyjnej, aby ręcznie policzyć plamy w każdym dołku lub użyj automatycznego licznika punktów.

W oprogramowaniu ImmunoCapture wybierz rozcieńczenie z łatwo rozróżniającymi ogniskami w zakresie od 20 do 200 na studzienkę dla każdej próbki i oblicz miano w jednostkach tworzących ognisko na milimetr, korzystając ze średniej z duplikatów studzienek. W tym eksperymencie wykazano obciążenie wirusem w tkankach obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego po podaniu podskórnie myszom Ifnar wirusa Zika. Granica wykrywalności wynosiła od 100 do 500 FFU na gram, w zależności od narządu.

Podczas wykonywania testu ogniskowania błędy techniczne mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami. Toksyczność narządowa, spowodowana wysokim stężeniem wątroby, zmieniła czułość testu. Gdy miano wirusa w narządzie było niższe niż toksyczne, FFA nie mógł dokładnie zarejestrować miana wirusa.

Komórki nerkowe wykazywały toksyczność przy wysokim stężeniu narządów, ale zostały pokonane przez miano wirusa przy niskich stężeniach narządów. Energiczne pipetowanie lub mycie może usunąć monowarstwę, co prowadzi do utraty danych, niedokładnego raportowania wyników miana. Włókna lub włosy, które są obecne w papierze chłonnym na stole laboratoryjnym, mogą zanieczyszczać poszczególne studzienki i powodować znaczne błędy w przypadku korzystania z automatycznego programu liczenia.

Kolejną kwestią jest gęstość komórek, która może dramatycznie wpłynąć na powodzenie testu skupiającego. Komórki o około 60% konfluencji na początku testu, w porównaniu z komórkami posianymi przy 90% konfluencji, wykazały dramatyczną różnicę wpływającą na test tworzący ognisko. Najważniejszą częścią procedury jest zaplanowanie wielkości i zakresu eksperymentu w taki sposób, aby pobranie narządów przebiegało sprawnie, a następnie rozpoczęcie testu skupiającego się na komórkach wysokiej jakości.

Procedura ta została wykorzystana do ilościowego określenia wirusa dla wielu rodzin wirusów. Protokół ten można również dostosować do badań przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych i ilościowego określania mian przeciwciał neutralizujących. Techniki te są stosowane do ilościowego oznaczania żywego wirusa i należy podjąć odpowiednie kroki bezpieczeństwa zgodnie z wytycznymi określonymi w BMBL.