Name: Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji wirusa Zika z narządów myszy. Technika ta pozwala zrozumieć patogenezę wirusową i odpowiedź immunologiczną w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Pinto jest finansowany z grantu zalążkowego z Saint Louis University School of Medicine i funduszy startowych z Saint Louis University School of Medicine. Dr Brien jest finansowany przez K22AI104794 wczesnego badacza z NIH NIAID, a także grant zalążkowy ze Szkoły Uniwersytetu Saint Louis. W przypadku wszystkich finansowanych osób grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%3A+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li>
<li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li>
<li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li>
<li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li>
<li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda%3A+a+serological+survey+in+Karamoja+district%2C+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li>
<li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+history+of+a+newly+emerging+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Weekly+Epidemiological+Record%22%5BJournal%5D)">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li>
<li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Immunological+basis+of+age-related+vulnerability+to+viral+infection%22">Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection</a>. , Oregon Health & Science University. (2007).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-1+%28IRF-1%29+shapes+both+innate+and+CD8%28%2B%29+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8%2B+T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li>
<li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li>
<li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae%2C+Bunyaviridae%2C+and+Filoviridae+Families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li>
<li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Zakażenie wirusem ZIKV może powodować chorobę neurologiczną, dlatego obecne modele zwierzęce do badania patogenezy, odpowiedzi immunologicznych i skuteczności ochronnej szczepionek i leków przeciwwirusowych muszą koncentrować się na kontroli wirusa w obrębie OUN. Jednym z wyzwań związanych ze skupieniem się na chorobach ośrodkowego układu nerwowego jest to, że często odbywa się to kosztem badania infekcji obwodowych. Zaproponowane tutaj metody izolacji narządów koncentrują się na potrzebie szybkiej oceny zakażenia ZIKV z...

Wirus Zika (ZIKV) to arbowirus należący do rodziny flaviviridae, która obejmuje ważne neuroinwazyjne ludzkie patogeny, takie jak wirus Powassan (POWV), wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV) i wirus Zachodniego Nilu (WNV)1. Po jego izolacji i zidentyfikowaniu pojawiały się okresowe doniesienia o zakażeniach ZIKV u ludzi w Afryce i Azji2,3,4,5 oraz epidemie w Ameryce Środkowej i Południowej (przejrzane w reference6). Jednak dopiero niedawno uznano, że ZIKV powoduje ciężką chorobę7. Obecnie istnieją tysiące przypadków chorób neurologicznych i wad wrodzonych związanych z infekcjami ZIKV. Szybkie pojawienie się ZIKV wywołało wiele pytań dotyczących: dlaczego następuje wzrost nasilenia choroby, jaka jest odpowiedź immunologiczna na zakażenie ZIKV oraz czy istnieją patologie o podłożu wirusowym i/lub immunologicznym związane ze wzrostem objawów neurologicznych i wad wrodzonych. Obecnie obserwuje się pośpiech w zrozumieniu choroby związanej z ośrodkowym układem nerwowym (OUN) związanej z ZIKV, a także potrzeba szybkiego przetestowania skuteczności leków przeciwwirusowych i szczepionek przeciwko ZIKV. W tym kontekście opracowaliśmy metody szybkiej analizy miana ZIKV zarówno na obrzeżach, jak i w OUN przy użyciu testów formowania ogniskowego specyficznych dla ZIKV (FFA).
Małe modele zwierzęce są ważne dla zrozumienia postępu choroby i wczesnej oceny szczepionek, terapii i leków przeciwwirusowych. Stworzyliśmy małe modele zwierzęce do badania choroby arbowirusowej, używając różnych szczepów myszy do modelowania infekcji u ludzi i ochrony przed patogenami wirusowymi8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Korzystając z tego wcześniejszego doświadczenia, zaczęliśmy modyfikować techniki stosowane do oceny wirusa WNV i dengi, pokrewnego flawiwirusa do oceny miana ZIKV w obu narządach obwodowych, a także w klasie CNS<sup="xref">21,23,24. Zalety tych metod w porównaniu z innymi testami to: 1) to, że łączą one w sobie zdolność do pobierania do analizy zarówno narządów obwodowych, jak i OUN; 2) metody można dostosować do cytometrii przepływowej, do pomiarów wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych, wraz z mianami wirusów na tym samym zwierzęciu w tym samym narządzie; 3) technika zbioru jest przystosowana do analizy histologicznej; 4) ZIKV FFA jest szybką, wysokoprzepustową metodą analizy miana wirusa; oraz 5) Metody te mogą być stosowane do oceny mian wirusów w narządach zwierząt zakażonych większością patogenów25.

<table><tbody>Strzykawka <tr><td>1-bromo-3-chloropropan (BCP)</td><td>MRC</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BD 309642</td><td></td></tr><tr><td>18 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-557-145</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 cc TB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td></td></tr><tr><td>20 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-561-66</td><td></td></tr><tr><td>24-rurkowy młynek do koralików</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15 340 163</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej 3,2 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9084634</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Inkubator kultur tkankowych</td><td>Przeciwciało Nuair</td><td>5800</td><td></td></tr><tr><td>4G2</td><td>w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki z płaskim dnem</td><td>Midsci</td><td>TP92696</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe okrągłe płytki denne</td><td>Midsci</td><td>TP92697</td><td></td></tr><tr><td>Basix 1,5 ml Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Skoncentrowane bakteriobójcze</td><td>zszywki wybielające</td><td>30966CT</td><td></td></tr><tr><td>Analizator CTL S6</td><td>Uniwersalny analizator</td><td></td><td>CTL</td> S6</tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki do cięcia</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średnia - wysoka glukoza Z 4,500 mg / L glukozy</td><td>MiliporeSigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (klasa biologii molekularnej)</td><td>MilliporeSigma</td><td>e7023</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11036-20</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>MilliporeSigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Koza przeciwciało anty-mysie znakowane HRP</td><td>MilliporeSigma</td><td>8924</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (klasa biologii molekularnej)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl ketamina/ksylazyna</td><td>Medycyna</td><td></td><td></td>porównawcza</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>MilliporeSigma</td><td>g7513</td><td></td></tr><tr><td>Magmax RNA zestaw do oczyszczania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1830</td><td></td></tr><tr><td>Milipore,</td><td>metylocelulozaSigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Ependorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MiniCollect 0,5 ml probówki EDTA</td><td>Bio-one</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Rurki O-ring</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-403-195</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowa mieszanka q RT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4392938</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EMS-15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>MilliporeSigma</td><td>d8537-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe Proline</td><td>Sartorius</td><td>72230/72240</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe Proline</td><td>Sartorius</td><td>728230</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNAzywa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol BD</td><td>MRC gen</td><td>RB192</td><td></td></tr><tr><td>Platforma bujana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-676-333</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MilliporeSigma</td><td>s7900</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka/szpatułka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>Prosty nożyczki do cięcia</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MilliporeSigma</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Prawdziwe niebieskie podłoże</td><td>VWR</td><td>95059-168</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>MilliporeSigma</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i kwantyfikacja wirusa zika z wielu narządów myszy

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Prezentowane metody demonstrują laboratoryjne procedury izolacji organów od zwierząt zakażonych wirusem Zika i ilościowego oznaczania wiremii. Celem procedury jest ilościowe określenie miana wirusa w obszarach obwodowych i OUN myszy w różnych punktach czasowych po zakażeniu lub w różnych warunkach eksperymentalnych w celu zidentyfikowania czynników wirusologicznych i immunologicznych regulujących zakażenie wirusem Zika. Zademonstrowane procedury izolacji narządów pozwalają zarówno na ilościowe oznaczanie mian wirusa metodą formowania ostrości, jak i ilościową ocenę mian wirusa metodą PCR. Techniki szybkiej izolacji narządów mają na celu zachowanie miana wirusa. Kwantyfikacja miana wirusa za pomocą testu zogniskowania pozwala na szybką ocenę przepustowości wirusa Zika. Zaletą testu skupiającego jest ocena zakaźnego wirusa, ograniczeniem tego testu jest możliwość toksyczności narządowej zmniejszającej granicę wykrywalności. Ocenę miana wirusa łączy się z ilościową PCR, a przy użyciu kontroli kopii rekombinowanej RNA ocenia się liczbę kopii genomu wirusa w narządzie z dolną granicą wykrywalności. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te zapewniają dokładną, szybką, wysokoprzepustową metodę analizy mian wirusa Zika na obrzeżach i w OUN zwierząt zakażonych wirusem Zika i mogą być stosowane do oceny miana wirusa w narządach zwierząt zakażonych większością patogenów, w tym wirusem dengi.

W celu oceny miana ZIKV zgodnie z opisanym powyżej protokołem myszy Ifnar1-/- zostały zainfekowane ZIKV (PRVABC59) poprzez wstrzyknięcie podskórne (SC) do poduszki stopy. W tym przypadku podanie 1 x 105 FFU ZIKV podskórnie myszom Ifnar1-/- w wieku 8–12 tygodni nie jest śmiertelne, jednak wirus może replikować się zarówno w obwodowych tkankach, jak i w OUN. Taką dawkę i drogę podania stosuje się do badania odpowiedzi immunologicznej gospod...

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

W tym filmie opisujemy zestaw procedur zaprojektowanych w celu zbadania wpływu infekcji wirusowej i wynikającej z niej odpowiedzi immunologicznej przy użyciu mysiego modelu zakażenia wirusem Zika. Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala nam rozwinąć mechanistyczne zrozumienie infekcji i odporności poprzez określenie zakresu, w jakim wirus rozprzestrzenił się w całym ciele, przekraczając bariery fizyczne i uzyskując dostęp do tkanek. Techniki te pozwalają na szczegółowe zrozumienie patogenezy wirusa i dają możliwość przeanalizowania mechanizmu ochrony zapewnianej przez szczepionki lub środki terapeutyczne.Tutaj demonstrujemy tę metodę przy użyciu infekcji myszy wirusem Zika, ale metoda ta może być stosowana do szeregu infekcji wirusowych, w tym innych flawiwirusów, takich jak wirus dengi i alfawirusów, takich jak wirus Chikungunya. Pobieranie narządów ośrodkowego układu nerwowego może być trudne, dlatego ważne jest, aby dana osoba zaplanowała mały eksperyment i była przygotowana do wcześniejszego przećwiczenia technik. Protokół ten pozwala na szybką analizę rozprzestrzeniania się wirusa w małych modelach zwierzęcych z możliwością wizualizacji, przechwytywania i przechowywania danych eksperymentalnych.Ważne jest, aby wizualnie zademonstrować tę metodę, aby umożliwić eksperymentatorowi zrozumienie, jak pobrać narządy ośrodkowego układu nerwowego. Ważne jest również, aby zobaczyć poziom zbiegu komórek i intensywność ognisk wirusowych. Na początek użyj kleszczy, aby usunąć sierść zainfekowanej myszy.Odetnij głowę myszy nożyczkami, a następnie usuń ręce i nogi. Aby pobrać mózg, użyj ząbkowanych nożyczek La Grange, aby przeciąć czaszkę przez otwór wielki. Oderwij czaszkę kleszczami i zgarnij mózg szpatułką.Za pomocą mocnych, nożyczek usuń kość otaczającą kręgosłup, a następnie przetnij kość miednicy, aby odsłonić otwór kręgowy na poziomie lędźwiowym. Następnie usuń jak najwięcej mięśni otaczających kręgosłup. Ostrożnie umieść ściętą końcówkę igły wewnątrz otworu kręgowego, unikając nadmiernego nacisku, aby zapobiec wtargnięciu igły w trzon kręgu.Przytrzymać mocno, aby wywrzeć nacisk na trzon kręgu i igłę, a następnie nacisnąć tłok strzykawki, aby wypchnąć pępowinę na szalkę Petriego. Natychmiast przenieś rdzeń kręgowy do oznakowanej rurki i umieść w kąpieli suchego lodu w celu dalszej homogenizacji. Do homogenizacji dodaj jeden mililitr DMEM i homogenizuj próbkę w ubijaku BeadBeater.Po upewnieniu się, że narządy są homogenizowane, odwirować i podwielokrotne próbki na lodzie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne. W dniu testu wyjmij homogenizowane próbki z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozwól im się rozmrozić. Gdy próbki znajdują się na lodzie, rozcieńczyć wirusa Zika dziesięciokrotnie do pierwszego dołka płytki rozcieńczającej i za pomocą pipety wielokanałowej wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia w dół płytki, za każdym razem zmieniając końcówki.Dodając 20 mikrolitrów próbki do 180 mikrolitrów pożywki wzrostowej, zmieniaj końcówki pipet między każdym rozcieńczeniem. Przygotować płytkę tworzącą ognisko, usuwając pożywkę z przygotowanej płaskiej 96-dołkowej płytki pokrywającej virokomórki. Aby zapobiec wysychaniu monowarstwy, należy natychmiast dodać 100 mikrolitrów rozcieńczenia wirusa do każdej studzienki w wiropłytce.Użyj tego samego zestawu wskazówek, aby dodać od najniższego do najwyższego stężenia. Kołysz płytę z boku na bok dwa do czterech razy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jedną do dwóch godzin. Rozgrzej 2% metylocelulozę do temperatury pokojowej.Następnie rozcieńczyć 2% roztwór metylocelulozy w pożywce wzrostowej w stosunku około dwa do jednego. Po inkubacji dodać 125 mikrolitrów pożywki wzrostowej metylocelulozy do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek. Ponownie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 32 do 40 godzin.Aby utrwalić wirusokomórki, w komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 50 mikrolitrów 5% paraformaldehydu na wierzch warstwy metylocelulozy w każdym dołku z 96-dołkowych płytek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie przykryj płytki Parafilmem i umieść je na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie za pomocą pipety usuń nakładkę i media z komórek do jednorazowego pojemnika wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umyć delikatnie 150 mikrolitrami PBS na studzienkę. Usuń PBS z płytek i wyjmij płytkę z szafy bezpieczeństwa biologicznego.Powtórz płukanie PBS dwukrotnie, a następnie dodaj 150 mikrolitrów na studzienkę jeden razy bufor do płukania FFA i pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć do 10 minut, aby przepuszczalność utrwalonych komórek. Następnie użyj pierwotnego przeciwciała Zika do wykrycia infekcji. Przygotować pierwszorzędowe przeciwciało 4G2 w stężeniu jednego mikrograma na mililitr w buforze barwiącym FFA.Zetrzyj bufor płuczący FFA z płytek i dodaj 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze barwiącym FFA do każdej studzienki. Następnie uszczelnij płytki Parafilmem lub folią z tworzywa sztucznego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować wtórne przeciwciało znakowane anty-mysim HRP w stężeniu od jednego do 5 000 w buforze barwiącym FFA.Po usunięciu roztworu przeciwciała przemyj komórki trzykrotnie 150 mikrolitrami buforu płuczącego FFA na studzienkę. Wyjmij bufor do mycia, za każdym razem wsuwając go do zlewu. Wybarwić komórki przeciwciałem wtórnym w buforze barwiącym FFA w ilości 50 mikrolitrów na studzienkę i inkubować od jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.Następnie umyj komórki trzykrotnie buforem do płukania FFA, ponownie usuwając bufor do mycia, za każdym razem wsuwając go do zlewu. Dodaj 50 mikrolitrów substratu TrueBlue do każdej studzienki. Odczekaj od dwóch do 15 minut, aż plamy zostaną w pełni zdefiniowane z minimalnym tłem.Po wyświetleniu plam delikatnie umyj je wodą, używając dłoni, aby osłonić monowarstwę przed siłą płynącej wody. Osusz ręczniki papierowe. Wkrótce potem użyj lunety sekcyjnej, aby ręcznie policzyć plamy w każdym dołku lub użyj automatycznego licznika punktów.W oprogramowaniu ImmunoCapture wybierz rozcieńczenie z łatwo rozróżniającymi ogniskami w zakresie od 20 do 200 na studzienkę dla każdej próbki i oblicz miano w jednostkach tworzących ognisko na milimetr, korzystając ze średniej z duplikatów studzienek. W tym eksperymencie wykazano obciążenie wirusem w tkankach obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego po podaniu podskórnie myszom Ifnar wirusa Zika. Granica wykrywalności wynosiła od 100 do 500 FFU na gram, w zależności od narządu.Podczas wykonywania testu ogniskowania błędy techniczne mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami. Toksyczność narządowa, spowodowana wysokim stężeniem wątroby, zmieniła czułość testu. Gdy miano wirusa w narządzie było niższe niż toksyczne, FFA nie mógł dokładnie zarejestrować miana wirusa.Komórki nerkowe wykazywały toksyczność przy wysokim stężeniu narządów, ale zostały pokonane przez miano wirusa przy niskich stężeniach narządów. Energiczne pipetowanie lub mycie może usunąć monowarstwę, co prowadzi do utraty danych, niedokładnego raportowania wyników miana. Włókna lub włosy, które są obecne w papierze chłonnym na stole laboratoryjnym, mogą zanieczyszczać poszczególne studzienki i powodować znaczne błędy w przypadku korzystania z automatycznego programu liczenia.Kolejną kwestią jest gęstość komórek, która może dramatycznie wpłynąć na powodzenie testu skupiającego. Komórki o około 60% konfluencji na początku testu, w porównaniu z komórkami posianymi przy 90% konfluencji, wykazały dramatyczną różnicę wpływającą na test tworzący ognisko. Najważniejszą częścią procedury jest zaplanowanie wielkości i zakresu eksperymentu w taki sposób, aby pobranie narządów przebiegało sprawnie, a następnie rozpoczęcie testu skupiającego się na komórkach wysokiej jakości.Procedura ta została wykorzystana do ilościowego określenia wirusa dla wielu rodzin wirusów. Protokół ten można również dostosować do badań przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych i ilościowego określania mian przeciwciał neutralizujących. Techniki te są stosowane do ilościowego oznaczania żywego wirusa i należy podjąć odpowiednie kroki bezpieczeństwa zgodnie z wytycznymi określonymi w BMBL.

isolation-quantification-zika-virus-from-multiple-organs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wideo demonstruje procedurę ilościowego oznaczania wirusa Zika w wielu narządach myszy za pomocą testu tworzącego ognisko. Proces ten polega na zakażeniu monowarstw komórek ssaków homogenatami tkanek zakażonych wirusem, a następnie zastosowaniu metylocelulozy w celu zapobieżenia rozprzestrzenianiu się wirusa. Następnie stosuje się barwienie immunologiczne, aby umożliwić precyzyjną kwantyfikację i pomiar zakaźności specyficznej dla narządów.

Test skupiający się do ilościowego określania mian wirusa w narządach zakażonej myszy

Film demonstruje domózgowe wstrzyknięcie zawiesiny wirusa Zika dorosłej myszy w celu wywołania neurodegeneracji. Znieczuloną mysz umieszcza się w stereotaktycznej ramie, a w odsłoniętej czaszce wierci się otwór do wstrzyknięcia. Zawiesina wirusa Zika jest wstrzykiwana do tkanki mózgowej. Infekcja wirusowa powoduje stan zapalny, prowadzący do neurodegeneracji.

Opracowanie modelu neurodegeneracji wywołanej wirusem Zika u dorosłej myszy

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Ten protokół opisuje odzyskiwanie zakaźnego wirusa Zika z dwuplazmidowego zakaźnego klonu cDNA.

Ratowanie i charakterystyka rekombinowanego wirusa z zakaźnego klonu wirusa Zika z Nowego Świata

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu mikrocefalii wywołanej wirusem Zika u myszy. Protokół ten obejmuje metody inokulacji śródmózgowej wirusa Zika w stadium embrionalnym, noworodkowym i dorosłym.

Tworzenie mysich modeli zaburzeń neurologicznych wywołanych wirusem Zika przy użyciu strategii iniekcji domózgowych: embrionalnej, noworodkowej i dorosłej

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Opisujemy metodę oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności na wirusa dengi na infekcję wirusem Zika za pomocą ludzkiej surowicy, pierwotnych komórek ludzkich i kwantyfikacji infekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji wirusa Zika z narządów myszy. Technika ta pozwala zrozumieć patogenezę wirusową i odpowiedź immunologiczną w modelu zwierzęcym.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

Przeglądaj więcej filmów