Name: Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj zautomatyzowane eksperymenty ciągłego wzrostu mikroorganizmów przy użyciu platformy eVOLVER. Ta metoda umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i kontrolę parametrów kultur bakterii oraz drożdży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy B. Staffordowi za pomoc w projektowaniu systemu, oraz H. Khalilowi, A. Soltanianzadehowi, A. Sunowi, S. Pipe'owi i A. Cavale'owi za pomoc przy budowie systemu. Dziękujemy za ich usługi Electronics Design Facility (EDF), Engineering Product Innovation Center (EPIC) oraz Software & Application Innovation Lab (SAIL) w Hariri Institute for Computing na Uniwersytecie Bostońskim. Praca ta została wsparta nagrodą NSF CAREER Award (MCB-1350949 dla A.S.K.) oraz grantami DARPA HR0011-15-C-0091 i HR0011-18-2-0014 (dla ASK). A.S.K. potwierdza również finansowanie z nagrody NIH Director's New Innovator Award (1DP2AI131083-01), DARPA Young Faculty Award (D16AP00142) oraz NSF Expeditions in Computing (CCF-1522074).

1. Przygotowanie pożywek, fiolek i inokulum
UWAGA: Niniejszy protokół zakłada, że użytkownicy skalibrowali już system eVOLVER i korzystają z konfiguracji Smart Sleeve opisanej w poprzednich pracach16. Smart Sleeves można łatwo przeprojektować lub zmodyfikować, jednak szczegóły konfiguracji dotyczące objętości i parametrów sterowania mogą się różnić w przypadku alternatywnych konfiguracji.
<ol>
	<li>Dzień przed eksperymentem przygotować 2 mL nocnych kultur ciekłych szczepu referencyjnego S. cerevisiae BY4741 oraz szczepów wariantowych w podłożu YPD (Yeast Peptone Dextrose) w temperaturze 30 °C w inkubatorze wytrząsowym ustawionym na co najmniej 300 r.p.m.</li>
	<li>Przenieść sterylne podłoże YPD do czystych, autoklawowanych butelek wyposażonych w rurki. Alternatywnie podłoże można autoklawować bezpośrednio w butelkach uprzednio wyposażonych w rurki. 
	UWAGA: Butelki wyposaża się w rurki poprzez wywiercenie otworu w nakrętce i przeprowadzenie przez niego rurki z konektorami, które stabilizują ją w miejscu. Patrz Tabela materiałów.</li>
	<li>Do każdej fiolki dodać mieszadło magnetyczne i zakręcić zakrętką wyposażoną w słomki dopływowe i odpływowe. Poprzez inspekcję wizualną upewnić się, że wszystkie komponenty są czyste.</li>
	<li>Umieścić fiolki w statywie do autoklawowania, przykryć folią i autoklawować w cyklu grawitacyjnym lub próżniowym z 20-minutowym etapem sterylizacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentu
<ol>
	<li>W trzech dużych zlewkach przygotować 500 mL 10% wybielacza, 200 mL 10% wybielacza oraz 300 mL 70% etanolu.</li>
	<li>Za pomocą przełączników w urządzeniu eVOLVER włączyć zasilacz 5 V, odczekać 5 s, a następnie włączyć zasilacz 12 V.</li>
	<li>W przypadku obsługi kilku fiolek z jednej butelki z pożywką, połączyć wiele linii doprowadzających pożywkę za pomocą rozdzielaczy rurek. Własne rozdzielacze rurek można zbudować z komponentów Luer.</li>
	<li>Zanurzyć linie doprowadzające pożywkę w pierwszej zlewce z wybielaczem, a linie odpływowe pożywki w drugiej zlewce z wybielaczem. Umieścić końcowy odcinek linii doprowadzających pożywkę w drugiej zlewce, razem z liniami odpływowymi. Linie odpływowe poprowadzić do baniaka na odpady.</li>
	<li>Do dużego, pustego baniaka na odpady wlać 1-2 L wybielacza, który zsterylizuje odpady powstałe podczas eksperymentu. Skonsultować się z koordynatorem ds. bezpieczeństwa w celu zapewnienia prawidłowej utylizacji odpadów.</li>
	<li>Za pomocą ekranu dotykowego eVOLVER przejść do sekcji konfiguracji i uruchomić wszystkie pompy na 20 s, aby wypełnić linie płynów 10% wybielaczem. Podczas pracy upewnić się poprzez kontrolę wizualną, że wszystkie linie zostały wypełnione, a pompy pracują prawidłowo. Pozostawić wybielacz w liniach na co najmniej 30 min w celu sterylizacji.</li>
	<li>Ponownie uruchomić pompy za pomocą aplikacji na ekranie dotykowym, aż linie przestaną być zanurzone, przepychając powietrze przez linie, aby usunąć jak najwięcej wybielacza.</li>
	<li>Umieścić linie doprowadzające pożywkę w zlewce z etanolem i powtórzyć czynności opisane powyżej, wypełniając linie etanolem, a następnie przepłukując je powietrzem. 
	UWAGA: Ponieważ etanol działa szybko, nie ma potrzeby oczekiwania 30 min na sterylizację.</li>
	<li>Podłączyć linie doprowadzające pożywkę do butelek z pożywką za pomocą złączy Luer i uruchomić pompy, aż pożywka całkowicie przepłynie przez linie, wypłukując pozostałości etanolu.</li>
	<li>Wsunąć częściowo wysterylizowane fiolki do Smart Sleeves urządzenia eVOLVER i podłączyć linie w odpowiednich pozycjach, zgodnie z kodowaniem kolorystycznym linii. Zacząć od podłączenia linii doprowadzających do krótkiej rurki dopływowej, a następnie linii odpływowych do długiej rurki odpływowej. 
	OSTRZEŻENIE: Kluczowe jest sprawdzenie, czy nie ma luźnych połączeń lub nieprawidłowo poprowadzonych linii. Zaniechanie tego kroku spowoduje przelewanie się cieczy i może uszkodzić Smart Sleeve.</li>
	<li>Uruchamiać wszystkie pompy w 10 s odstępach, aby napełnić fiolki pożywką. Przez kontrolę wizualną upewnić się, że pompy odpływowe skutecznie usuwają pożywkę przez rurki odpływowe, aby zapobiec przelewaniu. Jeśli rurki odpływowe nie wydają się działać sprawnie, sprawdzić połączenia linii płynowych i pompę perystaltyczną. Poprawić lub wymienić części w razie potrzeby.</li>
	<li>Docisnąć fiolki, aż zostaną całkowicie zamknięte przez Smart Sleeve.</li>
	<li>Ustawić warunki początkowe parametrów eksperymentalnych za pomocą ekranu dotykowego eVOLVER na interaktywnej stronie konfiguracji. Dla wszystkich fiolek ustawić temperaturę na 30 °C i mieszanie na 10. Można to zrobić dla wszystkich fiolek jednocześnie, przesuwając palcem po ekranie dotykowym, aby zaznaczyć wszystkie fiolki.</li>
</ol>
3. Konfigurowanie oprogramowania eVOLVER i programowanie algorytmicznych rutyn hodowli
<ol>
	<li>W panelu sterowania eVOLVER na komputerze przejdź do strony menedżera eksperymentów. W panelu nawigacji eksperymentów wybierz eksperyment bazowy lub istniejący eksperyment jako punkt wyjścia, a następnie kliknij clone new. 
	UWAGA: Można korzystać z eksperymentów innych grup, wklejając do menedżera eksperymentów link z GitHub do repozytorium, w którym zapisana jest definicja eksperymentu.</li>
	<li>Określ nazwę eksperymentu oraz urządzenie eVOLVER, na którym zostanie on przeprowadzony. Upewnij się, że wybrano pożądane ustawienia kalibracji, modyfikując odpowiednie pola na stronie.</li>
	<li>Użyj okien wyboru fiolek i definiowania parametrów, aby ustawić warunki eksperymentalne. Na przykład, aby ustawić temperaturę 30 °C dla fiolek 0-4, zaznacz fiolki w selektorze fiolek, ustaw wartość parametru na 30 i kliknij Set. Powtórz tę czynność dla OD, aby ustawić górny i dolny próg dla każdej fiolki.</li>
	<li>Po zakończeniu definiowania parametrów eksperymentalnych zapisz eksperyment, klikając Save, a następnie kliknij Start, aby go uruchomić.</li>
</ol>
4. Rozpoczęcie eksperymentu i monitorowanie w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Po rozpoczęciu eksperymentu przejdź do panelu danych w czasie rzeczywistym w interaktywnym pulpicie nawigacyjnym. Przeglądając wykresy, upewnij się dla każdej fiolki, że wartości OD utrzymują się na poziomie zero, a temperatury osiągnęły lub zmierzają do zaprogramowanych poziomów.</li>
	<li>Aby przygotować inokulum, zmierz OD kultur nocnych, oblicz wymagany stopień rozcieńczenia przy założeniu objętości fiolki 25 mL, a następnie pipetuj obliczoną objętość inokulum do fiolek przez port pobierania próbek. Na przykład, aby uzyskać pożądaną początkową wartość OD około 0,05 w fiolce z kulturą z kultur nocnych o OD 2,0, do każdej fiolki należy dodać 625 μL komórek.</li>
	<li>Sprawdź wykresy na pulpicie nawigacyjnym, aby upewnić się, że wykresy OD zostały odpowiednio zaktualizowane. Na wykresach powinien być widoczny wzrost do wartości zbliżonej do pożądanej początkowej OD.</li>
	<li>Monitoruj różne typy danych (takie jak OD, temperatura, szybkość wzrostu, generacje i zużycie pożywki) w trakcie trwania eksperymentu, przeglądając odpowiednie wykresy w pulpicie nawigacyjnym. Wartości te mogą pomóc użytkownikowi w podejmowaniu decyzji eksperymentalnych (np. harmonogram punktów czasowych) lub być wykorzystywane w funkcjach do automatycznego sprzężenia zwrotnego.</li>
	<li>Aby wymienić butelki z pożywką w trakcie eksperymentu, wstrzymaj eksperyment w panelu zarządzania eksperymentem, aby zapobiec uruchomieniu pomp. Szybko odkręć linię doprowadzającą pożywkę od pustej butelki i podłącz ją do nowej butelki. Unikaj dotykania końcówek rurek, aby zapobiec kontaminacji. Wznów eksperyment w panelu zarządzania eksperymentem.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek komórek drożdżowych z fiolek eVOLVER
<ol>
	<li>Przygotować roztwór cykloheksymidu w celu zahamowania syntezy białek i utrwalenia komórek drożdży do analizy w cytometrii przepływowej. Do probówki stożkowej o pojemności 15 mL dodać 12 mL PBS oraz 12 μL cykloheksymidu w stężeniu 20 mg/mL i mieszać na wirówce (vortex) przez 5 s.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść po 100 μL do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem.</li>
	<li>Zawiń płytkę w folię aluminiową, aby zapobiec dostępowi światła, i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Aby pobrać próbkę, pipetować przez otwór pobierający w zakrętce fiolki, używając wydłużonych końcówek o pojemności 200 μL.</li>
	<li>Przenieść 100 μL z fiolki do studzienki w płytce do utrwalania, mieszając 2-3 razy poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie ponownie owinąć folią i przenieść płytkę do temperatury 4 °C.</li>
</ol>
6. Zakończenie eksperymentu i sprzątanie
<ol>
	<li>Przygotować 1 L 10% wybielacza oraz dwa roztwory wody DI o objętości 500 mL w dużych zlewkach.</li>
	<li>Zatrzymać eksperyment, wysyłając polecenie stop w panelu zarządzania eksperymentem. Dane są nadal przechowywane w bazie danych w chmurze i mogą być później przeglądane w panelu danych czasu rzeczywistego w kokpicie nawigacyjnym lub pobrane do analizy offline.</li>
	<li>Wyjąć fiolki z inteligentnych rękawów (Smart Sleeves) i umieścić je w statywie autoklawizacyjnym, aby uniknąć przepełnienia w kolejnych krokach.</li>
	<li>Odkręcić linie doprowadzające pożywkę od butelek z pożywką i umieścić je w zlewce z 10% wybielaczem. Uruchomić pompy z interfejsu użytkownika eVOLVER w sposób analogiczny do konfiguracji, aby wysterylizować linie i fiolki.</li>
	<li>Odłączyć linie od fiolek i zanurzyć je w wodzie DI. Uruchomić pompy, aby wypłukać cały wybielacz z systemu – najpierw wodą DI, a następnie powietrzem.</li>
	<li>Wyłączyć urządzenie eVOLVER, najpierw wyłączając zasilacz 12 V, odczekując 5 s, a następnie wyłączając zasilacz 5 V.</li>
	<li>Namoczyć mieszadełka magnetyczne i nakrętki w 10% wybielaczu, a następnie opłukać wodą DI. Należy pamiętać o opłukaniu słomek dopływowych i odpływowych każdej nakrętki poprzez przepuszczenie przez nie wody DI. Jeśli na ściankach utworzył się osad, wyszorować fiolki szczoteczką do probówek.</li>
	<li>Utylizować odpady w odpowiedni sposób i dokładnie opłukać pojemniki na odpady. 
	UWAGA: Pojemniki na odpady będą zawierać mieszaninę 10% wybielacza, wysterylizowanych odpadów z hodowli komórkowych oraz śladowe ilości etanolu. W celu właściwego obchodzenia się z nimi i ich utylizacji należy skonsultować się z koordynatorem ds. bezpieczeństwa.</li>
</ol>
7. Ilościowe określanie kondycji organizmów za pomocą analizy cytometrii przepływowej frakcyjnych populacji
<ol>
	<li>Przeanalizuj próbki zebrane w sekcji 5 za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w odpowiednie kanały fluorescencyjne i detektory16.</li>
	<li>Zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę, a następnie wyznacz bramkę dla całych komórek, korzystając z danych rozproszenia przedniego i bocznego.</li>
	<li>Wyznacz bramkę na podstawie odpowiedniego kanału fluorescencyjnego (np. GFP), aby określić rozkład frakcyjny każdej populacji.</li>
	<li>Zapisz dane w wybranym folderze na komputerze z poziomu strony Experiment Manager, klikając przycisk „Export”.</li>
	<li>Na podstawie plików danych eVOLVER określ liczbę pokoleń ukończonych w każdym punkcie czasowym dla każdej fiolki. W kodzie eVOLVER pokolenia są obliczane poprzez segmentację danych OD pomiędzy poszczególnymi zdarzeniami rozcieńczania, a następnie każdy segment jest dopasowywany do podstawowej funkcji wykładniczej postaci <img alt="Wzór na wzrost wykładniczy, ae^(rt), równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> dla każdego segmentu, co pozwala wyznaczyć r, czyli tempo wzrostu16. Liczbę pokoleń w danym okresie czasu oblicza się następnie za pomocą następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór na obliczanie wzrostu populacji; równania; do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2"></li>
	<li>Na podstawie danych z cytometrii przepływowej nanieś na wykres logarytm stosunku populacji znakowanej do nieznakowanej względem numeru pokolenia obliczonego powyżej w momencie pobrania próbek. Zidentyfikuj obszar liniowy i wyznacz nachylenie zgodnie z poniższym równaniem. Nachylenie to jest powszechnie definiowane jako przystosowanie konkurencyjne (competitive fitness)18,19. 
	<img alt="Równanie porównania wzrostu drobnoustrojów; wzór: ln(variant strain%/reference strain%)=slope*generations+intercept" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3"></li>
</ol>

<ol><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+Bacterial+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Growth of Bacterial Cultures.</a> Annual Review of Microbiology. , (1949).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).</li>
<li>Bull, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renaissance+of+continuous+culture+in+the+post-genomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The renaissance of continuous culture in the post-genomics age.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Lang, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+genetic+hitchhiking+and+clonal+interference+in+forty+evolving+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations.</a> Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).</li>
<li>Maddamsetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation%2C+Clonal+Interference%2C+and+Frequency-Dependent+Interactions+in+a+Long-Term+Evolution+Experiment+with+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli.</a> Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).</li>
<li>Ishii, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+High-Throughput+Analyses+Monitor+the+Response+of+E.+coli+to+Perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations.</a> Science. 316 (5824), 593-597 (2007).</li>
<li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+Growth+Rate%2C+Cell+Cycle%2C+Stress+Response%2C+and+Metabolic+Activity+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Moser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+circuit+performance+under+conditions+relevant+for+industrial+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).</li>
<li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).</li>
<li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).</li>
<li>Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Evolution+Reveals+Favored+Adaptive+Routes+to+Cell+Aggregation+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast.</a> Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).</li>
<li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).</li>
<li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost%2C+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).</li>
<li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+morbidostat%3A+an+automated+continuous-culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).</li>
<li>Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise%2C+automated+control+of+conditions+for+high-throughput+growth+of+yeast+and+bacteria+with+eVOLVER%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).</li>
<li>Bondi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+scalability+and+their+impact+on+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Second+International+Workshop+on+Software+and+Performance+-+WOSP+%E2%80%9900%22%5BJournal%5D)">Characteristics of scalability and their impact on performance.</a> Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP ’00. , 195-203 (2000).</li>
<li>Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Chemostats+in+Microbial+Systems+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50168(2013).</li>
<li>Sanchez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+paralog+divergence+modulates+genome+evolution+across+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species.</a> PLOS Genetics. 13 (2), e1006585(2017).</li>
<li>Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+metabolic+and+signaling+genes+are+required+for+heat-shock+survival+and+have+little+overlap+with+the+heat-induced+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).</li>
<li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).</li>
<li>Piper, M. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+oligonucleotide+microarray+transcriptome+analyses.+An+interlaboratory+comparison+using+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).</li>
<li>Badarinarayana, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li>
<li>Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Nucleosome+Function%3A+A+Highly+Versatile%5BTitle%5D)+AND+%22Library+of+Synthetic+Histone+H3+and+H4%22%5BJournal%5D)">Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile.</a> Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).</li>
<li>McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Accessible+Continuous-Culture+Turbidostat+for+Pooled+Analysis+of+Complex+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries.</a> bioRxiv. , 450536(2018).</li>
<li>Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+the+continuous+directed+evolution+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A system for the continuous directed evolution of biomolecules.</a> Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).</li>
<li>Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+and+stringency+modulation+in+phage-assisted+continuous+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (May), 12546(2016).</li>
<li>Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+Artists%3A+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genetics. 7 (8), e1002202(2011).</li>
<li>Yona, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+duplication+is+a+transient+evolutionary+solution+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).</li>
<li>Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+stable%2C+reproducible+microbial+communities+from+different+fecal+donors+using+minibioreactor+arrays+%28MBRAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs).</a> Microbiome. 3, 42(2015).</li>
<li>Goldford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+simplicity+in+microbial+community+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emergent simplicity in microbial community assembly.</a> Science. 361 (6401), 469-474 (2018).</li>
<li>Lagier, J. -C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+the+human+microbiota+and+culturomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Culturing the human microbiota and culturomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).</li>
<li>Fukami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Contingency+in+Community+Assembly%3A+Integrating+Niches%2C+Species+Pools%2C+and+Priority+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology%2C+Evolution%2C+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).</li>
<li>Friedman, J., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+systems+biology%3A+The+dynamics+of+interacting+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations.</a> Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).</li>
<li>Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+continuous+evolution+of+genes+and+pathways+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast.</a> Nature Communications. 7, 13051(2016).</li>
<li>Ravikumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+Continuous+Evolution+of+Genes+at+Mutation+Rates+above+Genomic+Error+Thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds.</a> Cell. 175, (2018).</li>
</ol>

Autorzy, Brandon G. Wong i Ahmad S. Khalil, są współzałożycielami firmy Fynch Bioscience Inc., która rozwija platformę eVOLVER używaną w tym artykule.

Selekcja wzrostu jest niezbędnym narzędziem w biologii, szeroko stosowanym do generowania i charakteryzowania różnic fenotypowych między populacjami komórkowymi. Podczas gdy hodowle okresowe pozwalają na selekcję wzrostu w ograniczony sposób, techniki hodowli ciągłej radykalnie zwiększają stopień kontroli i przewidywalności tych eksperymentów, wywierając precyzyjną regulację nad formą i dynamiką selekcji w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników22. Kultura ciągła została wykorzystana do rygorystycznej kontroli selekcji bibliotek o wysokiej różnorodności 20,23,24,25 oraz do wdrożenia wyrafinowanych reżimów adaptacyjnych w ewolucji eksperymentalnej i kierowanej 11,12,26,27. Hodowla ciągła umożliwia również precyzyjną charakterystykę komórek w szeregu ilościowo kontrolowanych warunków, aby lepiej zrozumieć złożone systemy genetyczne i zoptymalizować zmodyfikowane szczepy bioprodukcyjne 9,14,28.
Nie ma jednak uniwersalnego protokołu dla hodowli ciągłej, ponieważ subtelne zmiany w warunkach selekcji mogą prowadzić do dramatycznych zmian w wynikach biologicznych 4,29,30. Eksperymentatorzy muszą mieć możliwość wyboru między systemami selekcji i odpowiednio dostosować protokoły i sprzęt eksperymentalny. Oprócz oferowania wyboru między parametrami kontrolnymi, takie systemy powinny być wystarczająco zaawansowane, aby niezależnie zarządzać kilkoma parametrami jednocześnie w wysoce równoległych eksperymentach, które są potrzebne do rozszyfrowania oddziałujących danych wejściowych w złożonych systemach biologicznych (np. epistaza). eVOLVER rozwiązuje to wyzwanie, umożliwiając użytkownikom arbitralne programowanie sterowania sprzężeniem zwrotnym między warunkami hodowli a funkcjami płynów w celu określenia wysoce wyspecjalizowanych nisz środowiskowych.
Aby przezwyciężyć ograniczenia w obecnej konfiguracji i rozszerzyć lub zmienić parametry sterowania, Smart Sleeve można łatwo przeprojektować w celu dodania nowych czujników lub siłowników. Ponadto zmniejszenie objętości fiolki zmniejszyłoby wydatki na pożywkę, co może być znaczące w przypadku hodowli ciągłej. Podczas gdy obecna konstrukcja pozwala na pomiar i kontrolę temperatury, mieszania kultur, indukcji światła, zmętnienia i płynów, inne parametry muszą być mierzone zewnętrznie poprzez pobieranie próbek z fiolek. Obecne prace obejmują wykorzystanie możliwości monitorowania aktywności enzymatycznej za pomocą lucyferazy oraz regulacji rozpuszczonego tlenu i pH bezpośrednio w kulturach eVOLVER. Ponadto, choć nie wykazano tego w niniejszej pracy, eVOLVER może współpracować z nowatorskimi milifluidycznymi urządzeniami multipleksującymi16 , które opierają się na zasadach integracji na dużą skalę (wywodzących się z elektroniki i przyjętych przez mikrofluidykę) w celu niedrogiego umożliwienia bardziej złożonej obsługi płynów (np. multipleksowane wejścia płynów, transfery między fiolkami). Te moduły mokrego oprogramowania mogą być projektowane i produkowane w całości w laboratorium, umożliwiając użytkownikom kierowanie płynów poprzez programowe uruchamianie różnych kombinacji zaworów w zautomatyzowanych procedurach hydraulicznych. Pozwala to użytkownikom przezwyciężyć sztywne konstrukcje płynów tradycyjnie stosowane w hodowli ciągłej, ale także skalować możliwości płynów do wysokiej przepustowości przy mniejszej liczbie kosztownych elementów sterujących (np. pomp perystaltycznych). Wreszcie, mamy nadzieję na włączenie platformy automatycznego próbkowania, która będzie wykorzystywać te millifluidyki i komponenty DIY, pokonując ograniczenia ręcznej interakcji podczas dłuższych i większych eksperymentów, w których pobieranie próbek kultur byłoby kłopotliwe.
Oprócz fizycznych modyfikacji platformy, oprogramowanie internetowe otwiera nowe stopnie swobody, umożliwiając użytkownikom pisanie, edytowanie i udostępnianie niestandardowych skryptów eVOLVER, generując w pełni zautomatyzowane programy do hodowli oparte na informacjach zwrotnych (np. turbidostat). Użytkownicy mogą programowo przechodzić przez zakresy parametrów w subtelnych wariacjach na temat tego samego schematu wyboru lub łączyć algorytmy sterujące w nowatorskie kombinacje, aby określić dowolną liczbę wyrafinowanych schematów wyboru. Co więcej, możliwość łatwego monitorowania kultur w czasie rzeczywistym zmienia sposób, w jaki przeprowadzane są eksperymenty. Dzięki monitorowaniu w czasie rzeczywistym użytkownicy mogą 1) sprawdzać spójność między cyklami, co jest krytyczną funkcją dla zastosowań bioprodukcyjnych i eksperymentów o wysokiej przepustowości, oraz 2) interweniować podczas eksperymentów, jeśli to konieczne, w celu rozwiązania problemów z trudnymi szczepami, które wykazują słaby wzrost lub tworzenie biofilmu, lub zdiagnozować błędy użytkownika (np. zanieczyszczenie). Wreszcie, dzięki gromadzeniu i interpretowaniu wielu strumieni danych w czasie rzeczywistym dla każdej kultury, eVOLVER generuje dużą gęstość danych, co może ułatwić podejście uczenia maszynowego do nowatorskiej analizy końcowej.
Poza zademonstrowanymi zastosowaniami w charakterystyce sprawności, wyborze bibliotek i ewolucji laboratoriów, uważamy, że wiele powiązanych dziedzin jest gotowych do wdrożenia w eVOLVER ze zintegrowaną fluidyką. Eksperymenty prowadzone w ramach projektu eVOLVER na próbkach mikrobiomu mogą badać stabilność zbiorowisk w kontrolowanych środowiskach31,32, badać skład mikrobioty przy użyciu technik kultururomicznych33 lub dynamicznie mieszać gatunki w celu zbadania ekologicznej dynamiki kolonizacji lub inwazji34,35. W urządzeniu można również łatwo zaimplementować liczne metody ciągłej, ukierunkowanej ewolucji biomolekuł 26,36,37, co znacznie zwiększa dostępność i przepustowość tych systemów. Możliwość optymalizacji warunków uprawy, takich jak skład podłoża, temperatura i szczepy, w dynamicznym, wysokowydajnym charakterze, może pomóc w optymalizacji zastosowań w bioprodukcji przemysłowej9. Przewidujemy również pionową integrację eVOLVER z innymi technikami analizy, takimi jak mikroskopia i cytometria przepływowa, w sposób zamknięty, zapewniając w pełni zautomatyzowany system do wzrostu i analizy kultur komórkowych zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji. Co więcej, dzięki pewnym modyfikacjom sprzętowym inteligentnego rękawa, takim jak uszczelnienie naczynia i kontrola zawartości gazu, eVOLVER może potencjalnie zostać przystosowany do wspierania wzrostu szerszego zakresu typów komórek, takich jak zawieszone komórki ssaków. Możliwe jest również umieszczenie całego szkieletu w komorze beztlenowej do beztlenowej hodowli komórek. Patrząc w przyszłość, dążymy do zbudowania naszej struktury oprogramowania w scentralizowanej infrastrukturze chmurowej i wierzymy, że umożliwi to użytkownikom łatwe zdalne konfigurowanie, analizowanie i udostępnianie danych bez konieczności fizycznej obecności w laboratorium. Funkcjonując jako kurator danych, infrastruktura chmurowa nadawałaby się również do metaanaliz na dużą skalę w ramach eksperymentów. Przewidujemy, że eVOLVER i te przyszłe postępy znacznie rozszerzą zakres możliwych eksperymentów selekcji wzrostu, ułatwiając automatyzację i innowacje w kulturze ciągłej.

Techniki ciągłej hodowli komórkowej, opracowane po raz pierwszy prawie 70 lat temu1,2, cieszą się niedawnym odrodzeniem3,4. Wynika to ze zbiegu czynników. Po pierwsze, rozwój wysokoprzepustowych technik -omicznych, które umożliwiły odczytywanie i generowanie dużej liczby genotypów5,6, stworzył jednoczesny popyt na techniki eksperymentalne, które ułatwiają dobrze kontrolowany wzrost komórek i fenotypowanie. W tym celu hodowla ciągła stanowi potężne podejście eksperymentalne mające na celu wykorzystanie pojawiających się postępów w genomice. Ułatwiając selekcję/eksperymenty wzrostu na populacjach komórkowych w precyzyjnie kontrolowanych (i dynamicznych) warunkach środowiskowych, ciągła hodowla zapewnia środki do rygorystycznego mapowania genotypów do fenotypów7,8, ilościowo charakteryzować zmodyfikowane szczepy i organizmy9, oraz śledzić adaptacyjne zmiany genetyczne w laboratoryjnych badaniach ewolucji10,11,12.
Po drugie, niedawne pojawienie się dostępnych technik prototypowania, takich jak produkcja addytywna oraz elementy sprzętowe i programowe open-source, umożliwiło szerszemu gronu użytkowników projektowanie i budowanie własnych, opłacalnych form systemów ciągłej hodowli bezpośrednio w laboratorium. Wszystko to doprowadziło do powstania ekscytującej gamy urządzeń typu "zrób to sam" (DIY), które wykonują funkcje ciągłej hodowli, takich jak chemostat13, turbidostat14 lub morbidostat15. Niestety, mimo że te doraźne rozwiązania są skuteczne w rozwiązywaniu konkretnych (niszowych) problemów, dla których zostały zaprojektowane, na ogół nie mają możliwości skalowania pod względem przepustowości i/lub złożoności eksperymentalnego projektu.
System eVOLVER został zaprojektowany z myślą o stworzeniu pojedynczej platformy, która może sprostać rosnącym potrzebom eksperymentalnym ciągłej hodowli oraz dorównać szybkością i skalą powstających technik genomicznych16 (Rysunek 1A). Projekt eVOLVER implementuje wspólne założenia leżące u podstaw wysoce skalowalnych technologii z innych dyscyplin17, w tym ustandaryzowane rozmiary, komponenty modułowe i zasady projektowania typu open source. Dzięki temu rozwiązania dla nowych niszowych aplikacji mogą być projektowane bez większych modyfikacji systemu. Składający się z wysoce modułowego oprogramowania wetware, sprzętu, elektroniki i oprogramowania internetowego o otwartym kodzie źródłowym, eVOLVER jest pierwszym zautomatyzowanym systemem hodowli ciągłej, który można ekonomicznie i łatwo ponownie skonfigurować w celu przeprowadzenia praktycznie każdego rodzaju eksperymentu wzrostu o wysokiej przepustowości. Dzięki modułowym i programowalnym tulejom Smart Sleeves, w których znajdują się wszystkie czujniki i siłowniki potrzebne do sterowania poszczególnymi kulturami, eVOLVER w unikalny sposób umożliwia skalowanie zarówno przepustowości, jak i indywidualnej kontroli warunków hodowli. Ponadto, jako platforma internetowa, eVOLVER wymienia dane i informacje ze zdalnymi komputerami w czasie rzeczywistym, umożliwiając jednoczesne monitorowanie setek indywidualnych kultur i zautomatyzowane perturbacje kulturowe za pomocą dowolnie zdefiniowanych algorytmów sterowania.
W poprzednim worku16, solidna wydajność eVOLVER została zademonstrowana w długotrwałych eksperymentach przez setki godzin pracy, a także jego zdolność do hodowli różnych organizmów, od E. coli i S. cerevisiae po nieudomowione mikroby. Przeprowadzono serię odrębnych eksperymentów selekcji wzrostu, w których programowo zdefiniowane wielowymiarowe gradienty selekcyjne zastosowano w szeregu indywidualnych warunków hodowli, a uzyskane krajobrazy sprawności komórkowej określono ilościowo. W tym przypadku celem jest dostarczenie użytkownikom eVOLVER opisu, w jaki sposób można wykorzystać system do projektowania i tego typu eksperymentów. Jako ilustracyjny przykład przedstawiono metody ilościowego określania krajobrazu przystosowania mutantów S. cerevisiae w dwuwymiarowym gradieniu środowiskowym złożonym z temperatury i stresu osmotycznego. Protokół prowadzi użytkowników przez konfigurację ramy eVOLVER dla tego eksperymentu, zarówno programowo, wykorzystując oprogramowanie do ustawiania niestandardowych procedur kontroli zmętnienia i temperatury dla każdej z 16 równoległych ciągłych hodowli, jak i fizycznie, poprzez układ fluidyki w celu odpowiedniego kierowania pożywek o różnych stężeniach soli. Protokół ten powinien służyć jako ogólna rubryka do konfiguracji eVOLVER do wykonywania szerokiej gamy zautomatyzowanych eksperymentów z hodowlami ciągłymi dla różnych badań i dyscyplin.

<table><tbody><tr><td>5-galonowy plastikowy Hedpack z nasadką</td><td>Midwest Browarnictwo i materiały do produkcji wina</td><td>45-56Y8-E2FR</td><td>Do zbiórki odpadów</td></tr><tr><td>a-D(+)-Glukoza</td><td>Chem-Impex</td><td>00805</td><td>Dla YPD Medium</td></tr><tr><td>Attune NxT Autosampler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>umożliwia cytometrowi przepływowemu pobieranie próbek z 96-dołkowej płytki</td></tr><tr><td>Attune NxT Cytometr przepływowy</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Służy do określania frakcji populacji za pomocą fluorescencji pojedynczej komórki</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-0</td><td>Dla YPD Średnia</td></tr><tr><td>karbenicylina</td><td>Fisher Scientific BP2648250 Dla</td><td></td><td>YPD Średnio</td></tr><tr><td>odporny chemicznie łącznik trójnikowy z rurką kolczastą, do 1/8" ID rury, 250&deg; F Maksymalna temperatura</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K731</td><td>Do rozgałęziania wejścia mediów</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>Do podłoża YPD</td></tr><tr><td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td>Do sterylizacji linii fluidycznych</td></tr><tr><td>Niestandardowa pokrywka fiolki eVOLVER</td><td>Pokrywka FynchBio</td><td></td><td>posiada porty do pobierania próbek i wejścia/wyjścia</td></tr> <tr><td>płynuCykloheksymid</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10018301</td><td>Do płytek do pobierania próbek cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Etanol, Bezwodny (histologiczny)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td><td>Do sterylizacji przewodów płynnych</td></tr><tr><td>eVOLVER Unit</td><td>FynchBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Końcówki o przedłużonej długości (stojak do podnoszenia; 1 do 200 ul)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-420</td><td>Do pobierania próbek</td></tr> <tr><td>z fiolkiFisherbrand Octagon Spinbar Mieszadła magnetyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57</td><td>Średnica: 4,5 mm, Długość, 12 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Szklane butelki wielokrotnego użytku z nakrętką</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB8002000</td><td>Musi być wyposażony w rurkę</td></tr><tr><td>Wysokotemperaturowa rurka z gumy silikonowej Półprzezroczysta biała, twardość 70A, 1/8" ID, 1/4" OD</td><td>McMaster- Carr</td><td>51135K73</td><td>Do butelek na media</td></tr><tr><td>Mac Mini</td><td>Apple</td><td></td><td>Do przeprowadzenia eksperymentu/zbierania danych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP243820</td><td>Do płytek do pobierania próbek cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa złączka do probówek, zatyczki, do 1/16" Rurka kolczasta ID, polipropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K141</td><td>Do butelek z mediami</td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa złączka rurowa z tworzywa sztucznego, zaślepki, do 5/32" Rura kolczasta ID, polipropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K144</td><td>Do butelek z mediami</td></tr><tr><td>Szybkoobrotowa złączka rurowa z tworzywa sztucznego, gniazda, do 1/16" Rura kolczasta ID, polipropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K291</td><td>Do butelek z mediami</td></tr><tr><td>Szybkozłączka rurowa z tworzywa sztucznego, gniazda, do 5/32" rura kolczasta ID, polipropylen</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K294</td><td>Do mediów butelki</td></tr><tr><td>NAKRĘTKI, OTWARTE, Z SILIKONOWĄ PRZEGRODĄ Z PTFE, LAB-PAC, PRZEGRODĄ. Rozmiar gwintu: 24-400, ZIELONY</td><td>Chemglass</td><td>CG-4910-04</td><td>Fiolki do hodowli</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td> <td>Fsher Scientific</td><td>S271-3</td><td>do YPD Medium</td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Wielomodowy czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>do pomiaru OD600 w nocnych hodowlach komórkowych</td>Tylko fiolka, próbka, 40 mL, przezroczysta, 28 mm x95 mm, GPI 24-400 Chemglass CG-4902-08 Fiolki do hodowli <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>do podłoża YPD</td></tr></tbody></table>

projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu evolver

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Metody hodowli ciągłej umożliwiają hodowlę komórek w ilościowo kontrolowanych warunkach środowiskowych, a zatem są szeroko przydatne do pomiaru fenotypów dopasowania i poprawy naszego zrozumienia, jak genotypy są kształtowane przez selekcję. Niedawne szeroko zakrojone wysiłki mające na celu opracowanie i zastosowanie niszowych urządzeń do ciągłej hodowli ujawniły korzyści płynące z prowadzenia nowych form kontroli hodowli komórkowych. Obejmuje to definiowanie niestandardowych nacisków selekcyjnych i zwiększanie przepustowości dla badań, począwszy od długoterminowej ewolucji eksperymentalnej, a skończywszy na selekcji bibliotek obejmujących cały genom i charakterystyce obwodów syntetycznych genów. Aby sprostać temu rosnącemu zapotrzebowaniu, platforma eVOLVER została niedawno opracowana: platforma o ciągłym poziomie skalowalności, elastyczności i automatyzacji. eVOLVER zapewnia pojedynczą platformę standaryzacyjną, którą można (ponownie) konfigurować i skalować przy minimalnym wysiłku w celu wykonywania wielu różnych typów wysokowydajnych lub wielowymiarowych eksperymentów selekcji wzrostu. W tym miejscu przedstawiono protokół, który ma zapewnić użytkownikom frameworka eVOLVER opis konfiguracji systemu do przeprowadzenia niestandardowego, zakrojonego na szeroką skalę eksperymentu ciągłego wzrostu. W szczególności protokół prowadzi użytkowników, jak zaprogramować system tak, aby zwielokrotniał dwa ciśnienia selekcyjne - temperaturę i osmolarność - w wielu fiolkach eVOLVER w celu ilościowego określenia krajobrazów sprawności mutantów Saccharomyces cerevisiae w dokładnej rozdzielczości. Pokazujemy, w jaki sposób urządzenie można skonfigurować zarówno programowo, za pomocą oprogramowania internetowego typu open source, jak i fizycznie, poprzez rozmieszczenie układów płynów i sprzętu. Szczegółowo opisano proces fizycznej konfiguracji urządzenia, programowania rutyny hodowli, monitorowania i interakcji z eksperymentem w czasie rzeczywistym przez Internet, pobierania próbek fiolek do późniejszej analizy offline oraz analizy danych po eksperymencie. Powinno to posłużyć jako punkt wyjścia dla naukowców z różnych dyscyplin do zastosowania eVOLVER w projektowaniu własnych, złożonych i wysokoprzepustowych eksperymentów wzrostu komórek w celu badania i manipulowania systemami biologicznymi.

Opisany tutaj protokół został wykorzystany do stworzenia map przystosowania dla wariantów genetycznych S. cerevisiae w dwuwymiarowym gradiencie stresu obejmującym temperaturę i zasolenie. W szczególności dla każdego szczepu wariantowego wykorzystano system eVOLVER do przeprowadzenia eksperymentów z konkurencją parzystą przeciwko fluorescencyjnie znakowanemu szczepowi referencyjnemu (szczep S. cerevisiae BY4741 z zintegrowanym konstytutywnym reporterem mNeonGreen) w 16 różnych kombinacjach tych stresów (Rysunek 1). Jako warianty wybrano dwa szczepy z nokautem, z których każdy był przewidywany jako wrażliwy na jedną z osi warunków stresowych: ΔPRX1, o którym zgłaszano defekty przystosowania w wysokich temperaturach20, oraz ΔPBS2 z defektami przystosowania przy wysokich stężeniach soli21. Jako wariant kontrolny wykorzystano nieznakowany szczep dziki BY4741, od którego oczekiwano wyników podobnych do szczepu referencyjnego. Łącznie te trzy 72-godzinne eksperymenty konkurencji przeprowadzono jednocześnie w 48 fiolkach w trzech urządzeniach eVOLVER (po 16 fiolek w każdym), sterowanych z jednego komputera.
Interaktywny panel sterowania eVOLVER służy do nawigacji po dużej ilości danych generowanych podczas każdego eksperymentu (Rysunek 2A). Reprezentatywne krzywe OD dla wszystkich 16 fiolek w jednym urządzeniu eVOLVER przedstawiono na Rysunku 2B. Każda krzywa wykazuje charakterystyczny wzór ząbkowania wynikający z algorytmu sterowania turbidostatem, który wykorzystuje sprzężenie zwrotne OD do inicjowania rozcieńczeń i utrzymywania kultur w wąskim zakresie gęstości (w tym przypadku 0,2-0,3). Dane OD i temperatury są mierzone w sposób ciągły, przesyłane do bazy danych w chmurze i aktualizowane w czasie rzeczywistym w interaktywnym panelu sterowania eVOLVER. Z danych przesyłanych w sposób ciągły można obliczyć wskaźniki wyższego rzędu (np. tempo wzrostu, skumulowaną liczbę pokoleń) i wykreślić je w panelu sterowania (Rysunek 2C), a nawet wykorzystać je jako parametry sprzężenia zwrotnego w różnych schematach selekcji (np. morbidostat).
Aby wygenerować mapy sprawności (fitness maps), mierzymy tempo, w jakim szczep referencyjny wypiera szczep wariantowy, łącząc pomiary cytometrii przepływowej z danymi o wzroście z systemu eVOLVER. W szczególności frakcje populacyjne oblicza się jako logarytm stosunku szczepu wariantowego do szczepu referencyjnego, wykorzystując dane z cytometrii przepływowej dla próbek z każdego punktu czasowego. Dla każdej hodowli i punktu czasowego liczba pokoleń jest interpolowana na podstawie danych o tempie wzrostu z eVOLVER w każdym okresie rozcieńczenia. Po naniesieniu logarytmów stosunków na liczbę pokoleń zaczynają pojawiać się jakościowe różnice między warunkami (Rysunek 3A). Aby obliczyć sprawność, przez liniową część każdego wykresu dopasowuje się linię prostą18,19, co pozwala uzyskać ilościową wartość sprawności (zarówno znak, jak i tempo), opisującą sposób konkurowania szczepu wariantowego ze szczepem referencyjnym (Rysunek 3B). W tym eksperymencie ujemne wartości sprawności wskazują, że szczep wariantowy jest wypierany przez szczep referencyjny. Konstrukcja map ciepła na podstawie wszystkich obliczeń sprawności umożliwia wizualizację dwuwymiarowego krajobrazu sprawności, ujawniając subtelne ilościowe różnice w wydajności między szczepami a warunkami (Rysunek 3C).
Z map ciepła dostosowania wynika, że każdy szczep wariantu wykazuje deficyty dostosowania, które manifestują się w różny sposób. ΔPRX1 jest przede wszystkim wrażliwy na wysokie temperatury, jednak stres solny wydaje się mieć efekt addytywny, zwiększając deficyt dostosowania. Z kolei ΔPBS2 wykazuje deficyty dostosowania głównie w odpowiedzi na wysokie stężenia soli, przy minimalnych różnicach wzdłuż osi temperatury. Wyniki te podkreślają użyteczność eksperymentów selekcyjnych o wysokiej rozdzielczości, szczególnie w celu rozszyfrowania interakcji wielu stresorów środowiskowych, które mogą mieć efekty addytywne, synergistyczne lub epistatyczne.
Wreszcie należy zauważyć, że w niektórych przypadkach, szczególnie w warunkach silnego stresu, obliczenia przystosowania mogą prowadzić do przesadzonych lub zniekształconych wyników. Na przykład ΔPBS2 wydaje się wykazywać stromy dodatni nachylenie w warunkach 39 °C/1 M NaCl w stosunku do szczepu referencyjnego (Rycina 3A). Przypisuje się to słabemu wzrostowi obu szczepów, co odzwierciedlają dane dla typu dzikiego i ogranicza użyteczność tego konkretnego parametru w tych warunkach. Niedostateczna liczba generacji skutkuje 1) słabym rozdzieleniem punktów czasowych, co zakłóca dopasowanie nachylenia, oraz 2) wrażliwością na efekty stochastyczne wynikające z fazy adaptacyjnej. Chociaż nie zdecydowaliśmy się na to w niniejszym badaniu, dane o wzroście w czasie rzeczywistym gromadzone przez eVOLVER podczas eksperymentu mogłyby zostać wykorzystane do podjęcia decyzji o przedłużeniu badania i zebraniu dodatkowych punktów czasowych dla tych warunków przy niewielkim nakładzie pracy. W kolejnych eksperymentach można by również zmodyfikować stosunki początkowe, aby wydłużyć obszar liniowy przed wystąpieniem nasycenia.
 
<img alt="Układ bioreaktora eVOLVER; schemat analizujący parametry eksperymentalne; wykres stresu gęstości optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd platformy eVOLVER i projektu eksperymentalnego. (A) eVOLVER to zautomatyzowana platforma do ciągłych kultur, umożliwiająca wieloparametrową kontrolę warunków hodowli. Platforma składa się z tzw. Smart Sleeves, w których znajdują się czujniki i elementy wykonawcze do kontroli warunków hodowli, zestawu pomp perystaltycznych do doprowadzania pożywki i odprowadzania odpadów z kultur, ekranu dotykowego do ręcznej interakcji z urządzeniem oraz komputera służącego do komunikacji z infrastrukturą chmurową, do której strumieniowane są dane z platformy. (B) eVOLVER można konfigurować na wiele sposobów: fizycznie, poprzez dopływ komórek i pożywek, oraz programowo, poprzez dostosowanie algorytmów sterujących modułami fiolek hodowlanych Smart Sleeve. Można to wykorzystać do programowania wielowymiarowych gradientów selekcyjnych/środowiskowych o wysokiej rozdzielczości, przy czym wynikami są fizycznie pobrane komórki w określonych punktach czasowych oraz strumieniowanie danych o hodowli w czasie rzeczywistym. (C) Konfiguracja eVOLVER w celu przeprowadzenia eksperymentu dopasowania wzrostu (growth fitness) w dwuwymiarowym gradiencie selekcyjnym, składającym się z temperatury i stresu osmotycznego. Fiolki hodowlane eVOLVER zostały zaszczepione równymi proporcjami szczepu drożdży referencyjnego i wariantowego. Zaprogramowano rutynę turbidostatu, aby utrzymać wszystkie kultury w fazie wykładniczej w określonym oknie OD (OD 0.2-0.3). Warunki temperatury i pożywek były zróżnicowane w obrębie zestawu Smart Sleeve, aby utworzyć dwa niezależne gradienty stresu. Pożywka podstawowa składała się z YPD (2% glukozy) + 100 µg/mL karbenicyliny + 25 µg/mL chloramfenikolu jako środka zapobiegającego kontaminacji bakteryjnej. Skład pożywek zmieniano poprzez dodanie suplementacyjnego NaCl do stężeń 0 M, 0.6 M, 0.8 M lub 1.0 M. Temperatury fiolek zaprogramowano na jedną z czterech wartości: 30 °C, 35 °C, 37 °C lub 39 °C. (D) Przykłady surowych wyników dla OD kultury i frakcji populacji z trzech testowanych warunków. Eksperyment konkurencji był prowadzony przez 72 h, z pobieraniem próbek w 24 h, a następnie co 12 h aż do zakończenia eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="System przetwarzania danych w chmurze; wizualizacja w czasie rzeczywistym; analiza tempa wzrostu; wpływ temperatury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Panel analizy danych w czasie rzeczywistym eVOLVER. (A) Dane z eVOLVER są przetwarzane i przesyłane w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania w chmurze do interaktywnego panelu sterowania. Za pomocą panelu użytkownicy mogą definiować i uruchamiać własne rutyny hodowli na podłączonym urządzeniu eVOLVER, monitorować aktualnie prowadzone eksperymenty we wszystkich jednostkach eVOLVER oraz ręcznie zmieniać warunki eksperymentalne w pojedynczej fiolce lub zestawie fiolek, jeśli jest to konieczne. (B) Krzywe OD dla każdej fiolki w macierzy badanych warunków przez cały czas trwania eksperymentu. Krzywe można obserwować w czasie rzeczywistym, aby upewnić się, że eksperyment przebiega zgodnie z planem, oraz wykorzystać je po zakończeniu eksperymentu do dalszej analizy. (C) Tempa wzrostu i liczba generacji komórek mogą być obliczane na bieżąco z krzywych OD w celu śledzenia postępu eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dynamika wzrostu komórek; logarytm naturalny frakcji względem generacji; obliczanie wskaźnika dostosowania; wykres powierzchni dostosowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Konstrukcja powierzchni dostosowania. (A) Logarytm naturalny frakcji populacji komórkowej (szczep wariantowy/szczep referencyjny) wykreślony w funkcji generacji komórkowych. Kolor wskazuje temperaturę selekcji, a kreski rozróżniają stężenia soli. (B) Aby ilościowo określić względne dostosowanie wariantu do szczepu referencyjnego, wskaźnik dostosowania jest wyprowadzany z szybkości, z jaką frakcja populacji komórkowej zmienia się w kolejnych generacjach. Wskaźnik ten jest obliczany z liniowego obszaru wykresów frakcji komórkowych przy użyciu minimum trzech punktów. (C) Względne wskaźniki dostosowania są przedstawione na mapie ciepła w celu skonstruowania powierzchni dostosowania w gradientach stresu środowiskowego. Warunek w prawym górnym rogu (39 °C/1,0 M NaCl) dla typu dzikiego i ΔPBS2 nie został uwzględniony w tej analizie, ponieważ kultury przeszły przez niewystarczającą liczbę generacji (patrz Reprezentatywne wyniki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER daje naukowcom swobodę eksperymentowania, możliwość definiowania własnych eksperymentów wzrostu kultury z automatycznymi informacjami zwrotnymi na temat wielu parametrów i skalowania ich do dowolnego rozmiaru. eVOLVER jest bardziej elastyczny niż inne urządzenia. Użytkownicy mogą łatwo dostosować oprogramowanie w Pythonie, a także sprzęt, modyfikując inteligentne tuleje, które trzymają czujniki dla każdej kultury.Na pierwszy rzut oka system może wydawać się skomplikowany z wieloma komponentami i połączeniami. Wizualny przewodnik daje użytkownikom po raz pierwszy większą pewność siebie podczas samodzielnego przeprowadzania eksperymentów. Właściwa konfiguracja ma kluczowe znaczenie.Upewnij się, że rozumiesz, do czego służy każdy komponent. Możesz więc potwierdzić, że działają. Upewnij się, że wszystko jest prawidłowo poprowadzone i szczelnie połączone.Chociaż eVOLVER został zaprojektowany do hodowli tlenowej bakterii i drożdży w różnych warunkach, może być również modyfikowany pod kątem fermentacji beztlenowej lub utrzymywania komórek ssaków w zawiesinie. W tym filmie pokazano, jak skonfigurować, zainicjować i przeprowadzić eksperyment z ciągłą kulturą o wysokiej przepustowości przy użyciu platformy eVOLVER. Dzień przed eksperymentem przygotuj pożywkę, fiolki i inokulum zgodnie z rękopisem.W trzech dużych zlewkach przygotuj dwie zlewki z 10% wybielaczem i jedną zlewkę z 70% etanolem. Za pomocą przełączników na urządzeniu eVOLVER włącz zasilanie pięciowoltowe w eVOLVER, odczekaj pięć sekund, a następnie włącz zasilanie 12 V. W przypadku uruchamiania kilku fiolek z tej samej butelki z pożywką, należy podłączyć wiele linii wejściowych pożywki za pomocą rozdzielaczy przewodów.Niestandardowe rozdzielacze rur mogą być zbudowane z niższych elementów. Zanurz przewody doprowadzające pożywkę w pierwszej zlewce do wybielacza, a przewody odpływu pożywki w drugiej zlewce do wybielacza. Podłącz dolny koniec przewodów wejściowych mediów do drugiej zlewki z przewodami eflux.Umieść linie odpływowe w pojemniku na odpady. Dodaj jeden do dwóch litrów wybielacza do pojemnika na odpady, aby wysterylizować odpady powstałe podczas eksperymentu. Korzystając z ekranu dotykowego na eVOLVER, przejdź do sekcji konfiguracji i uruchom wszystkie pompy na 20 sekund, aby napełnić przewody płynu 10% wybielaczem.Pozostaw wybielacz w liniach na co najmniej 30 minut w celu sterylizacji. Uruchom pompy ponownie za pomocą ekranu dotykowego, aż przewody przestaną być zanurzone, przepychając powietrze przez przewody, aby usunąć jak najwięcej wybielacza. Umieść przewody doprowadzające media w zlewce etanolu, napełnij przewody etanolem, przepłucz je powietrzem.Następnie podłącz przewody wejściowe mediów do butelek z mediami za pomocą dolnych złączy i uruchom pompy, aż media całkowicie przejdą przez przewody, wypłukując resztki etanolu. Częściowo włóż wysterylizowane fiolki do inteligentnych rękawów eVOLVER i podłącz przewody wejściowe do krótkiej słomki napływowej, a przewody odpływowe do długiej słomki eflux zgodnie z kodowaniem kolorystycznym. Dostosuj na ekranie dotykowym eVOLVER, aby uruchomić wszystkie pompy w 10-sekundowych odstępach, aby napełnić fiolki mediami.Kontrola wzrokowa zapewnia, że pompy eflux skutecznie usuwają media przez słomki eflux, aby zapobiec przepełnieniu. Następnie wepchnij fiolki w dół, aż zostaną całkowicie zamknięte w inteligentnym rękawie. Na stronie konfiguracji interaktywnej ekranu dotykowego eVOLVER przeciągnij palcem po ekranie dotykowym lub naciśnij przycisk Zaznacz wszystko, aby wybrać wszystkie fiolki i ustawić początkowe warunki temperatury na 30 stopni Celsjusza i mieszać na 10.Na komputerze określ urządzenie eVOLVER, na którym zostanie uruchomiony eksperyment. Upewnij się, że żądane ustawienia kalibracji zostały wybrane. Otwórz pulpit nawigacyjny eVOLVER i przejdź do strony Menedżer eksperymentów.Jako punkt wyjścia wybierz eksperyment podstawowy w panelu Nawigator eksperymentów lub istniejący eksperyment i kliknij przycisk Klonuj. Przejdź do strony Edytor eksperymentów. Użyj paneli Selektor fiolki i Definicja parametrów, aby dostosować temperaturę do 30 stopni Celsjusza i ustawić górny i dolny próg OD dla każdej fiolki zgodnie z projektem eksperymentalnym.Zapisz eksperyment, klikając przycisk Zapisz. Następnie kliknij strzałkę, aby wrócić do strony Menedżer eksperymentów i kliknij przycisk Odtwórz, aby uruchomić. Po zakończeniu eksperymentu przejdź do panelu Dane w czasie rzeczywistym na interaktywnym pulpicie nawigacyjnym.Dla każdej fiolki sprawdzić, czy wartości OD utrzymują się na poziomie zerowym. Przejrzyj wykresy temperatury, aby sprawdzić, czy temperatury są na poziomie 30 stopni Celsjusza lub zbliżają się do nich. Aby przygotować inokulum, najpierw zmierz OD kultur nocnych i oblicz pożądane pełne rozcieńczenie dla kultur nocnych, zakładając objętość fiolki 25 mililitrów i pożądany początkowy OD około 0,05.Przez otwór do pobierania próbek odpipetować obliczoną objętość inokulum lub mieszaniny inokulu. Sprawdź wykresy na desce rozdzielczej, aby zobaczyć, że OD wzrasta do 0,05. Wzrost komórek i warunki w fiolkach mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym w trakcie trwania eksperymentu, co pozwala badaczowi interweniować w przypadku wystąpienia jakichkolwiek problemów.eVOLVER to zautomatyzowana platforma do hodowli ciągłej, umożliwiająca wieloparametrową kontrolę warunków hodowli. Wykazano różnice jakościowe między grupami typu dzikiego, wrażliwymi na temperaturę i wrażliwymi na sól, gdy współczynniki logarytmiczne zostały wykreślone w stosunku do pokoleń interpolowanych z danych o tempie wzrostu eVOLVER. Kolor wskazuje temperaturę selekcji, a kreski rozróżniają stężenia soli.Dopasowanie nachylenia przez liniową część każdej działki przy użyciu co najmniej trzech punktów daje ilościową wartość dopasowania, która opisuje, w jaki sposób szczep wariantowy konkuruje ze szczepem referencyjnym. Ujemne wartości dopasowania wskazują, że szczep wariantowy jest konkurencyjny przez szczep referencyjny. Zawsze sprawdzaj, czy wszystkie pompy pracują wydajnie i czy przewody płynów są wolne od zatorów.Przepełnienie może zrujnować eksperyment i potencjalnie uszkodzić inteligentne rękawy. Próbki pobrane z eVOLVER mogą być następnie sekwencjonowane w celu sprawdzenia zmian genomowych w wyniku eksperymentu. Informacje te mogą być wykorzystane do inżynierii nowych szczepów lub systemów.Badacze korzystający z ewolucji laboratorium lub selekcji bibliotecznej mogą łatwo zastosować unikalne naciski selekcyjne w każdym eksperymencie eVOLVER. Sterowanie sprzężeniem zwrotnym i dynamiczne środowiska są teraz również bardzo dostępne. Po eksperymencie balon na odpady będzie zawierał niewielkie ilości wybielacza i etanolu.Skonsultuj się z koordynatorem ds. bezpieczeństwa w laboratorium, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej utylizacji odpadów.

designing-automated-high-throughput-continuous-cell-growth

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opracowaliśmy i sprawdziliśmy zestaw miniaturowych chemostatów o niewielkich rozmiarach, zbudowanych z łatwo dostępnych części za niskie koszty. Wyniki ewolucji fizjologicznej i eksperymentalnej były podobne do chemostatów o większej objętości. Macierz ministat zapewnia kompaktową, niedrogą i dostępną platformę do tradycyjnych eksperymentów z chemostatem, genomiki funkcjonalnej i badań przesiewowych substancji chemicznych.

Projektowanie i wykorzystanie multipleksowanych macierzy chemostatów

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Ten protokół opisuje, jak używać systemu mikrobiologicznej hodowli mikrokropel (MMC) do prowadzenia zautomatyzowanej hodowli mikrobiologicznej i adaptacyjnej ewolucji. MMC może hodować i podkulminować mikroorganizmy automatycznie i w sposób ciągły oraz monitorować online ich wzrost ze stosunkowo wysoką przepustowością i dobrą równoległością, zmniejszając zużycie pracy i odczynników.

Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)

Ten protokół opisuje, jak utrzymać Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) poprzez wykonywanie codziennych transferów i okresowych zamrażania oraz jak przeprowadzać testy konkurencji w celu zmierzenia poprawy kondycji u wyewoluowanych bakterii. Procedury te mogą służyć jako szablon dla naukowców rozpoczynających własne eksperymenty z ewolucją drobnoustrojów.

Codzienne transfery, archiwizacja populacji i pomiar sprawności w długoterminowym eksperymencie ewolucji z Escherichia coli

Niemal ciągła ewolucja wspomagana fagami i robotyką (PRANCE) to technika szybkiej i solidnej ewolucji białek. Robotyka umożliwia równoległość eksperymentów, monitorowanie w czasie rzeczywistym i kontrolę sprzężenia zwrotnego.

Praktyczny przewodnik po niemal ciągłej ewolucji wspomaganej przez fagi i robotykę

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.

Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Poznaj zautomatyzowane eksperymenty ciągłego wzrostu mikroorganizmów przy użyciu platformy eVOLVER. Ta metoda umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i kontrolę parametrów kultur bakterii oraz drożdży.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Przeglądaj więcej filmów