Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

eVOLVER daje naukowcom swobodę eksperymentowania, możliwość definiowania własnych eksperymentów wzrostu kultury z automatycznymi informacjami zwrotnymi na temat wielu parametrów i skalowania ich do dowolnego rozmiaru. eVOLVER jest bardziej elastyczny niż inne urządzenia. Użytkownicy mogą łatwo dostosować oprogramowanie w Pythonie, a także sprzęt, modyfikując inteligentne tuleje, które trzymają czujniki dla każdej kultury.

Na pierwszy rzut oka system może wydawać się skomplikowany z wieloma komponentami i połączeniami. Wizualny przewodnik daje użytkownikom po raz pierwszy większą pewność siebie podczas samodzielnego przeprowadzania eksperymentów. Właściwa konfiguracja ma kluczowe znaczenie.

Upewnij się, że rozumiesz, do czego służy każdy komponent. Możesz więc potwierdzić, że działają. Upewnij się, że wszystko jest prawidłowo poprowadzone i szczelnie połączone.

Chociaż eVOLVER został zaprojektowany do hodowli tlenowej bakterii i drożdży w różnych warunkach, może być również modyfikowany pod kątem fermentacji beztlenowej lub utrzymywania komórek ssaków w zawiesinie. W tym filmie pokazano, jak skonfigurować, zainicjować i przeprowadzić eksperyment z ciągłą kulturą o wysokiej przepustowości przy użyciu platformy eVOLVER. Dzień przed eksperymentem przygotuj pożywkę, fiolki i inokulum zgodnie z rękopisem.

W trzech dużych zlewkach przygotuj dwie zlewki z 10% wybielaczem i jedną zlewkę z 70% etanolem. Za pomocą przełączników na urządzeniu eVOLVER włącz zasilanie pięciowoltowe w eVOLVER, odczekaj pięć sekund, a następnie włącz zasilanie 12 V. W przypadku uruchamiania kilku fiolek z tej samej butelki z pożywką, należy podłączyć wiele linii wejściowych pożywki za pomocą rozdzielaczy przewodów.

Niestandardowe rozdzielacze rur mogą być zbudowane z niższych elementów. Zanurz przewody doprowadzające pożywkę w pierwszej zlewce do wybielacza, a przewody odpływu pożywki w drugiej zlewce do wybielacza. Podłącz dolny koniec przewodów wejściowych mediów do drugiej zlewki z przewodami eflux.

Umieść linie odpływowe w pojemniku na odpady. Dodaj jeden do dwóch litrów wybielacza do pojemnika na odpady, aby wysterylizować odpady powstałe podczas eksperymentu. Korzystając z ekranu dotykowego na eVOLVER, przejdź do sekcji konfiguracji i uruchom wszystkie pompy na 20 sekund, aby napełnić przewody płynu 10% wybielaczem.

Pozostaw wybielacz w liniach na co najmniej 30 minut w celu sterylizacji. Uruchom pompy ponownie za pomocą ekranu dotykowego, aż przewody przestaną być zanurzone, przepychając powietrze przez przewody, aby usunąć jak najwięcej wybielacza. Umieść przewody doprowadzające media w zlewce etanolu, napełnij przewody etanolem, przepłucz je powietrzem.

Następnie podłącz przewody wejściowe mediów do butelek z mediami za pomocą dolnych złączy i uruchom pompy, aż media całkowicie przejdą przez przewody, wypłukując resztki etanolu. Częściowo włóż wysterylizowane fiolki do inteligentnych rękawów eVOLVER i podłącz przewody wejściowe do krótkiej słomki napływowej, a przewody odpływowe do długiej słomki eflux zgodnie z kodowaniem kolorystycznym. Dostosuj na ekranie dotykowym eVOLVER, aby uruchomić wszystkie pompy w 10-sekundowych odstępach, aby napełnić fiolki mediami.

Kontrola wzrokowa zapewnia, że pompy eflux skutecznie usuwają media przez słomki eflux, aby zapobiec przepełnieniu. Następnie wepchnij fiolki w dół, aż zostaną całkowicie zamknięte w inteligentnym rękawie. Na stronie konfiguracji interaktywnej ekranu dotykowego eVOLVER przeciągnij palcem po ekranie dotykowym lub naciśnij przycisk Zaznacz wszystko, aby wybrać wszystkie fiolki i ustawić początkowe warunki temperatury na 30 stopni Celsjusza i mieszać na 10.

Na komputerze określ urządzenie eVOLVER, na którym zostanie uruchomiony eksperyment. Upewnij się, że żądane ustawienia kalibracji zostały wybrane. Otwórz pulpit nawigacyjny eVOLVER i przejdź do strony Menedżer eksperymentów.

Jako punkt wyjścia wybierz eksperyment podstawowy w panelu Nawigator eksperymentów lub istniejący eksperyment i kliknij przycisk Klonuj. Przejdź do strony Edytor eksperymentów. Użyj paneli Selektor fiolki i Definicja parametrów, aby dostosować temperaturę do 30 stopni Celsjusza i ustawić górny i dolny próg OD dla każdej fiolki zgodnie z projektem eksperymentalnym.

Zapisz eksperyment, klikając przycisk Zapisz. Następnie kliknij strzałkę, aby wrócić do strony Menedżer eksperymentów i kliknij przycisk Odtwórz, aby uruchomić. Po zakończeniu eksperymentu przejdź do panelu Dane w czasie rzeczywistym na interaktywnym pulpicie nawigacyjnym.

Dla każdej fiolki sprawdzić, czy wartości OD utrzymują się na poziomie zerowym. Przejrzyj wykresy temperatury, aby sprawdzić, czy temperatury są na poziomie 30 stopni Celsjusza lub zbliżają się do nich. Aby przygotować inokulum, najpierw zmierz OD kultur nocnych i oblicz pożądane pełne rozcieńczenie dla kultur nocnych, zakładając objętość fiolki 25 mililitrów i pożądany początkowy OD około 0,05.

Przez otwór do pobierania próbek odpipetować obliczoną objętość inokulum lub mieszaniny inokulu. Sprawdź wykresy na desce rozdzielczej, aby zobaczyć, że OD wzrasta do 0,05. Wzrost komórek i warunki w fiolkach mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym w trakcie trwania eksperymentu, co pozwala badaczowi interweniować w przypadku wystąpienia jakichkolwiek problemów.

eVOLVER to zautomatyzowana platforma do hodowli ciągłej, umożliwiająca wieloparametrową kontrolę warunków hodowli. Wykazano różnice jakościowe między grupami typu dzikiego, wrażliwymi na temperaturę i wrażliwymi na sól, gdy współczynniki logarytmiczne zostały wykreślone w stosunku do pokoleń interpolowanych z danych o tempie wzrostu eVOLVER. Kolor wskazuje temperaturę selekcji, a kreski rozróżniają stężenia soli.

Dopasowanie nachylenia przez liniową część każdej działki przy użyciu co najmniej trzech punktów daje ilościową wartość dopasowania, która opisuje, w jaki sposób szczep wariantowy konkuruje ze szczepem referencyjnym. Ujemne wartości dopasowania wskazują, że szczep wariantowy jest konkurencyjny przez szczep referencyjny. Zawsze sprawdzaj, czy wszystkie pompy pracują wydajnie i czy przewody płynów są wolne od zatorów.

Przepełnienie może zrujnować eksperyment i potencjalnie uszkodzić inteligentne rękawy. Próbki pobrane z eVOLVER mogą być następnie sekwencjonowane w celu sprawdzenia zmian genomowych w wyniku eksperymentu. Informacje te mogą być wykorzystane do inżynierii nowych szczepów lub systemów.

Badacze korzystający z ewolucji laboratorium lub selekcji bibliotecznej mogą łatwo zastosować unikalne naciski selekcyjne w każdym eksperymencie eVOLVER. Sterowanie sprzężeniem zwrotnym i dynamiczne środowiska są teraz również bardzo dostępne. Po eksperymencie balon na odpady będzie zawierał niewielkie ilości wybielacza i etanolu.

Skonsultuj się z koordynatorem ds. bezpieczeństwa w laboratorium, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej utylizacji odpadów.