Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER
19 maja 2019
Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.
eVOLVER daje naukowcom swobodę eksperymentowania, możliwość definiowania własnych eksperymentów wzrostu kultury z automatycznymi informacjami zwrotnymi na temat wielu parametrów i skalowania ich do dowolnego rozmiaru. eVOLVER jest bardziej elastyczny niż inne urządzenia. Użytkownicy mogą łatwo dostosować oprogramowanie w Pythonie, a także sprzęt, modyfikując inteligentne tuleje, które trzymają czujniki dla każdej kultury.
Na pierwszy rzut oka system może wydawać się skomplikowany z wieloma komponentami i połączeniami. Wizualny przewodnik daje użytkownikom po raz pierwszy większą pewność siebie podczas samodzielnego przeprowadzania eksperymentów. Właściwa konfiguracja ma kluczowe znaczenie.
Upewnij się, że rozumiesz, do czego służy każdy komponent. Możesz więc potwierdzić, że działają. Upewnij się, że wszystko jest prawidłowo poprowadzone i szczelnie połączone.
Chociaż eVOLVER został zaprojektowany do hodowli tlenowej bakterii i drożdży w różnych warunkach, może być również modyfikowany pod kątem fermentacji beztlenowej lub utrzymywania komórek ssaków w zawiesinie. W tym filmie pokazano, jak skonfigurować, zainicjować i przeprowadzić eksperyment z ciągłą kulturą o wysokiej przepustowości przy użyciu platformy eVOLVER. Dzień przed eksperymentem przygotuj pożywkę, fiolki i inokulum zgodnie z rękopisem.
W trzech dużych zlewkach przygotuj dwie zlewki z 10% wybielaczem i jedną zlewkę z 70% etanolem. Za pomocą przełączników na urządzeniu eVOLVER włącz zasilanie pięciowoltowe w eVOLVER, odczekaj pięć sekund, a następnie włącz zasilanie 12 V. W przypadku uruchamiania kilku fiolek z tej samej butelki z pożywką, należy podłączyć wiele linii wejściowych pożywki za pomocą rozdzielaczy przewodów.
Niestandardowe rozdzielacze rur mogą być zbudowane z niższych elementów. Zanurz przewody doprowadzające pożywkę w pierwszej zlewce do wybielacza, a przewody odpływu pożywki w drugiej zlewce do wybielacza. Podłącz dolny koniec przewodów wejściowych mediów do drugiej zlewki z przewodami eflux.
Umieść linie odpływowe w pojemniku na odpady. Dodaj jeden do dwóch litrów wybielacza do pojemnika na odpady, aby wysterylizować odpady powstałe podczas eksperymentu. Korzystając z ekranu dotykowego na eVOLVER, przejdź do sekcji konfiguracji i uruchom wszystkie pompy na 20 sekund, aby napełnić przewody płynu 10% wybielaczem.
Pozostaw wybielacz w liniach na co najmniej 30 minut w celu sterylizacji. Uruchom pompy ponownie za pomocą ekranu dotykowego, aż przewody przestaną być zanurzone, przepychając powietrze przez przewody, aby usunąć jak najwięcej wybielacza. Umieść przewody doprowadzające media w zlewce etanolu, napełnij przewody etanolem, przepłucz je powietrzem.
Następnie podłącz przewody wejściowe mediów do butelek z mediami za pomocą dolnych złączy i uruchom pompy, aż media całkowicie przejdą przez przewody, wypłukując resztki etanolu. Częściowo włóż wysterylizowane fiolki do inteligentnych rękawów eVOLVER i podłącz przewody wejściowe do krótkiej słomki napływowej, a przewody odpływowe do długiej słomki eflux zgodnie z kodowaniem kolorystycznym. Dostosuj na ekranie dotykowym eVOLVER, aby uruchomić wszystkie pompy w 10-sekundowych odstępach, aby napełnić fiolki mediami.
Kontrola wzrokowa zapewnia, że pompy eflux skutecznie usuwają media przez słomki eflux, aby zapobiec przepełnieniu. Następnie wepchnij fiolki w dół, aż zostaną całkowicie zamknięte w inteligentnym rękawie. Na stronie konfiguracji interaktywnej ekranu dotykowego eVOLVER przeciągnij palcem po ekranie dotykowym lub naciśnij przycisk Zaznacz wszystko, aby wybrać wszystkie fiolki i ustawić początkowe warunki temperatury na 30 stopni Celsjusza i mieszać na 10.
Na komputerze określ urządzenie eVOLVER, na którym zostanie uruchomiony eksperyment. Upewnij się, że żądane ustawienia kalibracji zostały wybrane. Otwórz pulpit nawigacyjny eVOLVER i przejdź do strony Menedżer eksperymentów.
Jako punkt wyjścia wybierz eksperyment podstawowy w panelu Nawigator eksperymentów lub istniejący eksperyment i kliknij przycisk Klonuj. Przejdź do strony Edytor eksperymentów. Użyj paneli Selektor fiolki i Definicja parametrów, aby dostosować temperaturę do 30 stopni Celsjusza i ustawić górny i dolny próg OD dla każdej fiolki zgodnie z projektem eksperymentalnym.
Zapisz eksperyment, klikając przycisk Zapisz. Następnie kliknij strzałkę, aby wrócić do strony Menedżer eksperymentów i kliknij przycisk Odtwórz, aby uruchomić. Po zakończeniu eksperymentu przejdź do panelu Dane w czasie rzeczywistym na interaktywnym pulpicie nawigacyjnym.
Dla każdej fiolki sprawdzić, czy wartości OD utrzymują się na poziomie zerowym. Przejrzyj wykresy temperatury, aby sprawdzić, czy temperatury są na poziomie 30 stopni Celsjusza lub zbliżają się do nich. Aby przygotować inokulum, najpierw zmierz OD kultur nocnych i oblicz pożądane pełne rozcieńczenie dla kultur nocnych, zakładając objętość fiolki 25 mililitrów i pożądany początkowy OD około 0,05.
Przez otwór do pobierania próbek odpipetować obliczoną objętość inokulum lub mieszaniny inokulu. Sprawdź wykresy na desce rozdzielczej, aby zobaczyć, że OD wzrasta do 0,05. Wzrost komórek i warunki w fiolkach mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym w trakcie trwania eksperymentu, co pozwala badaczowi interweniować w przypadku wystąpienia jakichkolwiek problemów.
eVOLVER to zautomatyzowana platforma do hodowli ciągłej, umożliwiająca wieloparametrową kontrolę warunków hodowli. Wykazano różnice jakościowe między grupami typu dzikiego, wrażliwymi na temperaturę i wrażliwymi na sól, gdy współczynniki logarytmiczne zostały wykreślone w stosunku do pokoleń interpolowanych z danych o tempie wzrostu eVOLVER. Kolor wskazuje temperaturę selekcji, a kreski rozróżniają stężenia soli.
Dopasowanie nachylenia przez liniową część każdej działki przy użyciu co najmniej trzech punktów daje ilościową wartość dopasowania, która opisuje, w jaki sposób szczep wariantowy konkuruje ze szczepem referencyjnym. Ujemne wartości dopasowania wskazują, że szczep wariantowy jest konkurencyjny przez szczep referencyjny. Zawsze sprawdzaj, czy wszystkie pompy pracują wydajnie i czy przewody płynów są wolne od zatorów.
Przepełnienie może zrujnować eksperyment i potencjalnie uszkodzić inteligentne rękawy. Próbki pobrane z eVOLVER mogą być następnie sekwencjonowane w celu sprawdzenia zmian genomowych w wyniku eksperymentu. Informacje te mogą być wykorzystane do inżynierii nowych szczepów lub systemów.
Badacze korzystający z ewolucji laboratorium lub selekcji bibliotecznej mogą łatwo zastosować unikalne naciski selekcyjne w każdym eksperymencie eVOLVER. Sterowanie sprzężeniem zwrotnym i dynamiczne środowiska są teraz również bardzo dostępne. Po eksperymencie balon na odpady będzie zawierał niewielkie ilości wybielacza i etanolu.
Skonsultuj się z koordynatorem ds. bezpieczeństwa w laboratorium, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej utylizacji odpadów.
Przegląd
Platforma eVOLVER umożliwia przeprowadzanie wysokoprzepustowych, ciągłych hodowli mikrobiologicznych z dynamiczną kontrolą nad parametrami eksperymentalnymi. Ten protokół prowadzi użytkowników w procesie programowania automatycznej kontroli nad wieloma hodowlami, jednocześnie mierząc i wchodząc w interakcję z danymi w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hodowla mikrobiologiczna
- Automatyczne systemy sprzężeń zwrotnych
- Projektowanie eksperymentów
Wprowadzenie
- System eVOLVER zapewnia elastyczność w projektowaniu eksperymentów związanych z wzrostem hodowli.
- Umożliwia dostosowanie zarówno komponentów oprogramowania, jak i sprzętowych.
- Prawidłowy montaż i zrozumienie komponentów są kluczowe dla udanych eksperymentów.
- Można go dostosować do różnych warunków hodowli, w tym fermentacji beztlenowej.
Cel badania
- Demonstracja konfiguracji i działania platformy eVOLVER do eksperymentów z ciągłą hodowlą.
- Umożliwienie monitorowania i kontrolowania hodowli mikrobiologicznych w czasie rzeczywistym.
- Umożliwienie badania wariacji kondycji wśród różnych szczepów mikrobiologicznych.
Wykorzystane metody
- Przygotowanie pożywki i sterylizacja sprzętu.
- Konfiguracja systemu eVOLVER i inicjalizacja eksperymentów.
- Monitorowanie danych w czasie rzeczywistym za pomocą interaktywnego pulpitu.
- Analiza wskaźników wzrostu i wartości kondycji szczepów mikrobiologicznych.
Główne wyniki
- Pomyślna automatyzacja eksperymentów z ciągłą hodowlą.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym gęstości optycznej (OD) i temperatury.
- Otrzymanie ilościowych wartości kondycji na podstawie danych dotyczących wskaźników wzrostu.
- Identyfikacja różnic w wydajności wśród wariantów mikrobiologicznych.
Wnioski
- System eVOLVER zwiększa kontrolę i elastyczność eksperymentów.
- Dane w czasie rzeczywistym umożliwiają natychmiastową interwencję w eksperymentach.
- Umożliwia inżynierię nowych szczepów w oparciu o wyniki eksperymentów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The eVOLVER platform enables high-throughput, automated continuous culture with real-time monitoring of optical density and temperature, supporting scalable fitness landscape mapping for strain engineering and selection studies. Its open-source software and modular hardware allow rapid reconfiguration for multiparameter experimental designs, reducing manual intervention and increasing reproducibility in microbial strain characterization. This positions eVOLVER as a reusable discovery tool for de-risking target validation and lead identification in antimicrobial, metabolic, and synthetic biology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables quantitative fitness profiling of mutant libraries under defined selection pressures to interrogate gene function and pathway essentiality.
- Operational Value: Automates continuous culture with feedback control, reducing manual sampling and enabling long-term, unattended experiments.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking genotype to fitness under controlled environmental conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative growth rate and fitness metrics from real-time OD and temperature data for comparative strain analysis.
- Operational Value: Standardizes culture conditions across hundreds of parallel vessels via programmable fluidic and sensor arrays.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness by providing reproducible, dynamically controlled environments for library selection and evolution experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal tracking of genomic adaptations in evolving populations, informing strain engineering for therapeutic production.
- Operational Value: Supports scalable preparation of evolved strains for downstream phenotypic validation in disease-relevant models.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in strain performance by measuring competitive fitness across environmental gradients.
Pipeline & Workflow Integration
eVOLVER integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven fitness screening, assay development for evolution-based selection, and translational strain optimization prior to preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through precise environmental control and quantitative fitness readouts across genetic variants.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible growth selection assays with real-time monitoring and automated feedback.
- Analytics: Provides real-time OD, temperature, and derived fitness metrics for longitudinal comparison of culture conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase evolution to preclinical strain engineering by identifying adaptive mutations under selection.
- Enterprise Reuse: Functions as a reconfigurable platform for multiple campaigns, reducing need for bespoke culture systems per project.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive fitness modeling, target validation via competitive growth, reduction of phenotypic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, automation, and scalability of continuous culture across environmental gradients.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in strain selection, reduced biological risk in development candidates.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of engineered strains based on quantitative fitness landscapes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture, microfluidics, and Python-based software customization.
- Needs perfusion pumps, temperature control units, smart sleeves, and real-time data monitoring infrastructure.
- Demands cross-team standardization of protocols for media preparation, sterilization, and sampling.
- Requires adaptation of fluidic layouts and sensor configurations for different organism types and selection pressures.
- Limited by clogging risks in fluid lines and the need for regular maintenance to prevent experimental failure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Sterilizing the System
2:56
Loading the Culture Vials
3:51
Configuring eVOLVER Software and Programming Algorithmic Culture Routines
4:48
Inoculating and Monitoring Experiment in Real-time
5:47
Results: Fitness Surface Construction
6:35
Conclusion
