Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius
June 14th, 2024
Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.
Badania w naszej grupie skupiają się na zrozumieniu reguł ewolucji. W ramach tego projektu opracowaliśmy nowy protokół do badania, w jaki sposób ewoluują drobnoustroje ciepłolubne za pomocą kontrolowanych eksperymentów laboratoryjnych. Pozwoli nam to odpowiedzieć na pytania, w jaki sposób reagują na zmiany środowiskowe poprzez ewolucję adaptacyjną.
Dużym wyzwaniem jest kontrola warunków uprawy. Termofile wymagają do wzrostu środowiska o wysokiej temperaturze, co prowadzi do wysokich szybkości parowania i ryzyka wysuszenia kultur i płytek wzrostowych w okresie inkubacji. Innym wyzwaniem jest powolne tempo wzrostu niektórych termofilów, co może utrudniać szybkie testowanie iteracji.
Nasz protokół odpowiada na główne wyzwania związane z hodowlą drobnoustrojów ciepłolubnych w różnych temperaturach. Mamy teraz lepszą zdolność do kontrolowania warunków środowiskowych, zapewniając, że obserwowane przez nas wyniki są spójne i odzwierciedlają warunki eksperymentalne, które narzucamy. Umożliwi nam to badanie adaptacji termofilów w czasie rzeczywistym.
Nasz protokół oferuje metodę o wysokiej przepustowości, nie tylko do badań nad sulfolobusem, ale można ją dostosować do różnych mikroorganizmów. Za pomocą termomieszalników możemy prowadzić symultaniczne badania w różnych temperaturach bez konieczności stosowania wielu dużych inkubatorów z wytrząsaniem. Obniża również koszty energii, oferując bardziej ekologiczną ścieżkę dla tego typu badań.
Nasze odkrycia torują drogę do eksperymentów ewolucyjnych na Sulfolobusie i innych termofilach. Wiele z tego, co myślimy, że wiemy o ewolucji, pochodzi z badania organizmów mezofilnych i istnieje ryzyko, że przegapimy kluczowe zasady ciepłolubów, które pomogą nam wyjaśnić, jak ewoluowała różnorodność życia na Ziemi. Na początek użyj palnika Bunsena, aby ostrożnie podgrzać stalowy drut.
Wbij go w pokrywkę probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, aby utworzyć otwór o szerokości 1 mm. Umieść przekłute probówki w naczyniu nadającym się do sterylizacji w autoklawie. Po autoklawie i schłodzeniu probówek napełnij je 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM+Teraz użyj końcówki pipety, aby zeskrobać około 50 do 60 mg kultury Sulfolobus acidocaldarius z zapasu glicerolu.
Przenieść inokulum do probówek wypełnionych BBM+. Trzymaj niezaszczepioną probówkę z BBM+ jako kontrolą negatywną. Aby zapobiec wydostawaniu się aerozoli z przebitej pokrywy tuby, umieść odporną na ciepło membranę przepuszczającą gaz na górze pokrywy.
Umieść zaszczepione probówki w termomikserze w celu zaszczepienia. Gdy kultury osiągną wymaganą gęstość optyczną, odwirować probówki o stężeniu 5 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odpipetować supernatant w celu jego wyrzucenia. Dodać 1,5 ml ciepłego BBM+ do osadu i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce.
Stwierdzono, że wzrost jest podobny, porównując inkubację przy użyciu termomikserów z inkubatorami konwencjonalnymi. Na początek użyj spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną początkowej kultury Sulfolobus acidocaldarius. Następnie utwórz seryjne rozcieńczenia kultury wyjściowej od 10 do 1 do 10 do 6.
Odpipetować po 100 mikrolitrów z 10 do 5 i 10 do 6 rozcieńczeń, a następnie przenieść je do studzienek sześciodołkowej płytki zawierającej stały BBM+ Umieścić płytkę w pudełku z wilgotną szmatką do inkubatora statycznego w temperaturze 75 stopni Celsjusza na pięć do siedmiu dni, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Aby ustalić pożądaną liczbę ewoluujących linii z pojedynczych kolonii, za pomocą pętli inokulacyjnej wybierz losowo kolonię. Zawiesić kolonię w 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM+ zawartego w przebitej probówce o pojemności 2 ml.
Odpowiednio oznacz tubę. Po powtórzeniu ponownego zaparcia dla kilku kolonii, napełnić probówkę 1,5 ml pożywki jako kontroli ujemnej. Uszczelnij wierzchołki probówek oddychającą membraną, a następnie inkubuj je w termomikserze, aż kultury staną się mętne.
Odwirować kultury klonalne przy 5 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu odpipetować 200 mikrolitrów BBM+ do probówki i ponownie zawiesić osad. Dodaj 200 mikrolitrów 50% glicerolu do każdej tubki, aby utworzyć zapasy glicerolu.
Następnie przechowuj buliony w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszych eksperymentów. Na początek użyj ożywionych populacji przodków Sulfolobus acidocaldarius. Dodaj BBM+, aby rozcieńczyć kultury do OD600 0,01.
Pobrać pipetę o odpowiedniej objętości z każdej z siedmiu kultur do trzech oddzielnych przekłutych probówek o pojemności 2 ml. Uszczelnij rurki oddychającą membraną. Następnie umieść każdy zestaw siedmiu populacji przodków w oddzielnych termomikserach.
Ustaw każdy termomikser na wymaganą temperaturę i 400 obr./min, aby rozpocząć eksperyment ewolucji. Po 48 godzinach przenieść 15 mikrolitrów każdej z kultur transferu-zero do 1,5 ml podgrzanego BBM+pożywki zawartej w przebitej probówce o pojemności 2 ml oznaczonej Transfer 1. Uszczelnij rurki przepuszczalną membraną przed umieszczeniem ich z powrotem w losowych pozycjach w odpowiednich termomikserach.
Zmierz OD600 transferu zerowego w spektrofotometrze płytkowym, aby zakończyć pierwsze przenoszenie. Powtarzaj transfer kultury i pomiar gęstości optycznej co dwa dni, aby wykonywać transfery, aż do osiągnięcia żądanej liczby transferów. Przygotować zapasy glicerolu w populacjach po co dziesiątym transferze i przy ostatnim transferze, a następnie oznaczyć probówkę identyfikatorem populacji przodków i numerem transferu.
Termomiksery powinny być ustawione na stałą temperaturę 75 stopni Celsjusza i 65 stopni Celsjusza. Trzeci termomikser będzie stopniowo zmniejszany, aby obserwować reakcję na stopniowe zmiany. Na początek wysiaduj ożywione kultury przodków i ewoluujące w temperaturze kultury Sulfolobus acidocaldarius w temperaturach końcowych.
Po zakończeniu inkubacji zmierz ich gęstość optyczną na 600 nanometrach. Następnie dodaj 1,5 ml BBM+ do sześciu zestawów po siedem probówek dla każdej kultury. Następnie dodaj 15 mikrolitrów każdej kultury do sześciu zestawów probówek.
Ustaw trzy termomiksery na 75 stopni Celsjusza i trzy termomiksery na 65 stopni Celsjusza. Umieść probówki w termomikserze odpowiadającym temperaturze i powtórz ID. Po 48-godzinnej inkubacji przenieś 200 mikrolitrów z każdej kultury na 96-dołkową płytkę. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.
Na koniec wykreśl i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego. Linie ze stałego warunku 75 stopni Celsjusza wzrosły w OD600 z początkowego zakresu pod koniec eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, linie z leczenia w stałej temperaturze 65 stopni Celsjusza wykazywały spadek.
Populacje poddawane zabiegowi spadku temperatury wzrosły od początkowej gęstości optycznej do transferu 6, a następnie wykazywały stały spadek.
Przegląd
To badanie koncentruje się na ewolucji termofilnych drobnoustrojów, szczególnie archeonu Sulfolobus acidocaldarius, poprzez kontrolowane eksperymenty laboratoryjne. Przedstawiono nowy protokół wysokiej wydajności z wykorzystaniem niedrogich termomikserów do adaptacji temperaturowej, podkreślając zdolność do badania ewolucyjnych reakcji w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ewolucja mikroorganizmów
- Adaptacja termofilna
- Wysokowydajne protokoły eksperymentalne
Tło
- Wyzwania w badaniu termofili obejmują wysokie tempo parowania i powolny wzrost.
- Poprzednie badania ewolucji koncentrowały się głównie na organizmach mezofilnych.
- Zrozumienie ewolucji termofili może ujawniać wgląd w szersze zasady ewolucji.
Stosowane metody
- Wysokowydajne inkubacje z wykorzystaniem termomikserów
- Sulfolobus acidocaldarius jako organizm modelowy
- Przeprowadzanie jednocześnie badań temperaturowych z energooszczędnymi metodami
Główne wyniki
- Protokół umożliwia spójną kontrolę warunków środowiskowych.
- Obserwowano pomyślną adaptację Sulfolobus acidocaldarius w różnych ustawieniach temperaturowych.
- Wyniki potwierdzają skuteczność termomikserów w badaniu ewolucji mikroorganizmów.
Wnioski
- To badanie zwiększa nasze zrozumienie dynamiki ewolucyjnej u termofili.
- Rozwijana metoda może być zastosowana do innych mikroorganizmów, promując bardziej ekologiczne praktyki badawcze.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Experimental evolution with Sulfolobus acidocaldarius enables systematic interrogation of adaptation mechanisms in extreme environments, providing a robust platform for target validation and mechanistic de-risking in microbial chassis development. The protocol's scalability and cost-efficiency facilitate high-throughput studies, supporting predictive confidence in early-stage bioengineering and synthetic biology pipelines. This approach broadens access to thermophilic model systems, enhancing portfolio diversity and translational continuity for industrial biotechnology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables controlled hypothesis testing of adaptive responses in thermophilic archaea.
- Supports functional validation of genetic and metabolic targets under defined environmental stressors.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating lineage-specific adaptation trajectories.
- Improves predictive confidence for selecting robust microbial chassis for industrial applications.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible batch culture conditions for quantitative phenotype assessment.
- Enables parallel evaluation of multiple independent lineages, supporting scalable screening workflows.
- Delivers consistent optical density measurements for comparative analysis across experimental arms.
- Reduces operational barriers for assay development in thermophilic systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns laboratory adaptation studies with industrial process conditions for chassis optimization.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of engineered strains.
- Enables risk-adjusted advancement of microbial platforms for bioprocessing and synthetic biology.
- Provides a foundation for translational biomarker identification in extremophile systems.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling iterative adaptation studies, quantitative phenotype tracking, and lineage archiving for downstream analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of environmental adaptation and evolutionary dynamics.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cross-condition comparison and lineage selection.
- Analytics: Provides optical density and statistical data for robust evaluation of adaptive outcomes.
- Translational Research: Bridges laboratory evolution with industrial process requirements for chassis development.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, transferable workflow adaptable to diverse microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in extremophile adaptation studies.
- Operational Value: Standardizes high-throughput evolution experiments with reduced energy and equipment costs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for microbial chassis selection and process optimization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of novel extremophile platforms for industrial biotechnology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial cultivation and evolutionary biology.
- Needs access to thermomixers, spectrophotometers, and basic molecular biology infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of culture handling and measurement protocols.
- Adaptable to other microbial systems with consideration for organism-specific growth requirements.
- Evaporation control and slow growth rates may limit throughput for certain extremophiles.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:43
Reviving Sulfolobus acidocaldarius Cultures for Temperature Evolution Experimentation
3:14
Initiation of Independent Lineages of Sulfolobus acidocaldarius Cultures for Temperature Evolution Experimentation
4:56
Temperature Evolution Experimentation Using Sulfolobus acidocaldarius
6:42
Post‐Evolution Growth Assays of Sulfolobus acidocaldarius Ancestral and Evolved Lineages
