Name: Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj eksperymentalną ewolucję termofilnych mikroorganizmów z archeonem Sulfolobus acidocaldarius przy użyciu termomikserów. Ta metoda umożliwia badanie adaptacji w ekstremalnych warunkach temperatury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. SV Albers (Uniwersytet we Freiburgu), prof. Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) i dr Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) za rady i szczep S. acidocaldarius DSM639. Praca ta została sfinansowana z Royal Society Research Grant (przyznanego DRG: RGS\R1\231308), grantu badawczego UKRI-NERC "Exploring the Frontiers" (przyznanego DRG i CGK: NE/X012662/1) oraz stypendium doktoranckiego Uniwersytetu Kuwejckiego (przyznanego ZA).

Experimental Evolution Protocol for Thermophile Adaptation Using Low-Cost Thermomixers

<ol><li>Nisbet, E. G., Sleep, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+habitat+and+nature+of+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The habitat and nature of early life.</a> Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).</li>
<li>Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Beagle+in+a+bottle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Beagle in a bottle.</a> Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).</li>
<li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li>
<li>McDonald, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+experimental+evolution+-+a+proving+ground+for+evolutionary+theory+and+a+tool+for+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial experimental evolution - a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery.</a> EMBO Rep. 20 (8), e46992(2019).</li>
<li>Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+design%2C+population+dynamics%2C+and+diversity+in+microbial+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).</li>
<li>McCarthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+limits+of+thermoacidophily+in+the+archaeon+Sulfolobus+solfataricus+by+adaptive+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution.</a> Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+question+of+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea.</a> Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).</li>
<li>Whitaker, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+through+the+lens+of+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Mineral+Geochem%22%5BJournal%5D)">Population dynamics through the lens of extreme environments.</a> Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Thia-Toong, T. -L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ss-LrpB%2C+a+novel+Lrp-like+regulator+of+Sulfolobus+solfataricus+P2%2C+binds+cooperatively+to+three+conserved+targets+in+its+own+control+region%3A+Ss-LrpB-operator+interactions+for+autoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation.</a> Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).</li>
<li>Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -V., Siebers, B., Spadiut, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus+-+A+potential+key+organism+in+future+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus - A potential key organism in future biotechnology.</a> Front Microbiol. 8, 2474(2017).</li>
<li>Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+Bioprospecting+extremophiles+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Indian+Inst+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology.</a> J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Sulfolobus+acidocaldarius%2C+a+model+organism+of+the+Crenarchaeota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota.</a> J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).</li>
<li>Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+Sulfolobus+acidocaldarius+in+a+controlled+bioreactor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment.</a> Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532(2021).</li>
<li>Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heat+shock+response+for+the+thermoacidophilic+model+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophiles+and+the+problem+of+DNA+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophiles and the problem of DNA instability.</a> Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%3A+Persistent+gaps+and+other+reasons+to+focus+on+the+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork.</a> Archaea. 2015, 942605(2015).</li>
<li>Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+dangerous+missense%3A+Thermophiles+display+especially+low+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates.</a> PLoS Genet. 5 (6), e1000520(2009).</li>
<li>Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fidelity+under+harsh+conditions%3A+Analysis+of+spontaneous+mutation+in+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+genetic+tool+box+for+the+Crenarchaeote+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius.</a> Front Microbiol. 3, 214(2012).</li>
<li>Suzuki, S., Kurosawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+gene+encoding+restriction+endonuclease+SuaI+and+development+of+a+host-vector+system+for+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).</li>
<li>Baes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+translational+dynamics+underlying+heat+shock+response+in+the+thermophilic+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> mBio. 14 (5), e0359322(2023).</li>
<li>González, A. G., Pérez Y Terrón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+extremophilic+microorganisms+in+biogeochemical+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22GSC+Adv+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles.</a> GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).</li>
<li>Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus%3A+A+new+genus+of+sulfur-oxidizing+bacteria+living+at+low+pH+and+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Mikrobiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature.</a> Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).</li>
<li>Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+experimental+evolution+in+Escherichia+coli.+I.+Adaptation+and+divergence+during+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Nat%22%5BJournal%5D)">Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations.</a> Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).</li>
<li>Baes, R. Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master's Thesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms">https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms</a> (2018).</li>
<li>Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+population+bottlenecks+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution.</a> Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).</li>
<li>Bernander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+Sulfolobus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of Sulfolobus.</a> Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+and+the+fate+of+beneficial+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations.</a> Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).</li>
<li>Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+sfGFP+variants+with+improved+and+reliable+functionality+in+industrially+important+thermophilic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria.</a> Biotechnol Biofuels. 11, 8(2018).</li>
<li>Visone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+protein+imaging+in+thermophilic+archaea+by+exploiting+a+novel+protein+tag%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag.</a> PLoS One. 12 (10), e0185791(2017).</li>
<li>Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+stable+fluorescent+proteins+for+advanced+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy.</a> Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują konfliktu interesów.

W ramach tych prac opracowano eksperymentalny protokół ewolucji termofilów, tutaj dostosowany do archeonów S. acidocaldarius, ale zdolny do adaptacji do innych mikroorganizmów o wysokich wymaganiach dotyczących wzrostu. Protokół ten opiera się na technikach pierwotnie zaprojektowanych dla bakterii mezofilnych, ale jest specjalnie zmodyfikowany w celu przezwyciężenia wyzwań technicznych związanych z wysokotemperaturowym wzrostem tlenowym 2,4,5,24. Stworzenie tej metody umożliwi zbadanie wcześniej niescharakteryzowanej dynamiki ewolucyjnej, która zachodzi w ekstremalnych warunkach temperaturowych, przypominających warunki, które potencjalnie istniały na najwcześniejszych etapach ewolucji życia1.
Istnieje kilka krytycznych aspektów protokołu, których należy przestrzegać, aby uzyskać wiarygodne wyniki eksperymentów ewolucyjnych. Pierwszą z nich jest niezależność między liniami, którą osiąga się poprzez rozpędzanie się do pojedynczych kolonii przed rozpoczęciem eksperymentu. Jest to konieczne, aby zapewnić, że wszelkie powszechne mutacje znalezione w oddzielnych liniach mają niezależne pochodzenie. Jeśli zamiast tego w celu zainicjowania linii zostanie poddanych masowej hodowli płynnej, wspólne warianty genetyczne mogą zostać rozdystrybuowane do każdej populacji. Drugą kluczową kwestią jest kontrola zanieczyszczenia, którą osiąga się poprzez utrzymanie kontroli ujemnej wolnej od hodowli i monitorowanie wzrostu. W przeciwieństwie do eksperymentów z mezofilami, jest mało prawdopodobne, aby eksperymenty ewolucji ekstremofilów zostały skażone źródłami zewnętrznymi, ale zanieczyszczenie krzyżowe między liniami może nadal wystąpić. Utrzymanie równowagi między napowietrzaniem a parowaniem jest kolejną kluczową kwestią. S.acidocaldarius jest obowiązkowym tlenowcem i dlatego potrzebuje tlenu do wzrostu10,23. Ręczne przebijanie polipropylenowych probówek do mikrowirówek i uszczelnianie ich membraną przepuszczającą gaz21,25 było kluczem do utrzymania napowietrzania bez nadmiernego parowania. Zmniejszenie to można prawdopodobnie przypisać zachowaniu jednolitego środowiska w zamkniętych probówkach (dane nie pokazane).
Dwa aspekty metody mogą wymagać dostosowania lub rozwiązywania problemów w zależności od szczególnych warunków środowiskowych wykorzystanych w doświadczeniu ewolucyjnym: współczynnik rozcieńczenia i czas między transferami. W tej metodzie rozcieńczanie 1:100 wykonywano przy każdym transferze, co wymagało średniej logarytmu2 (100) = 6,64 podwojenia, aby powrócić do tej samej wielkości populacji. Zapewnia to dobrą równowagę między potencjałem adaptacji (optymalny współczynnik rozcieńczenia jest obliczany przez Wahla i Gerrisha26) a wykonalnością eksperymentalną. Zasadniczo silny współczynnik rozcieńczenia umożliwiłby pojawienie się większej liczby pokoleń dziennie, ponieważ wymaga większej liczby podwojeń, aby powrócić do tej samej gęstości zaludnienia (np. 1:1000 wymaga logarytmu2(1000) = średnio 9,97 podwojeń). Jeśli jednak zostanie osiągnięta mniejsza liczba podwojeń niż jest to wymagane między transferami, populacje będą stopniowo wypłukiwane przez rozcieńczenie, chyba że wystąpi korzystna mutacja, która skraca czas podwojenia. w przypadku populacji przenoszonych co 48 godzin, wymagane jest, aby czasy podwojenia były krótsze niż 8 godzin, co jest zgodne z szacowanym czasem podwojenia i poprzednio opublikowanymi wartościami wzrostu heterotroficznego S. acidocaldarius w temperaturze 75 °C (4–6 godzin)23,27. Jednak stopniowy spadek OD600 nm w czasie dla stałych zabiegów w temperaturze 65 °C i spadku temperatury sugeruje, że może to nie być wystarczająco długi czas, aby osiągnąć wymaganą liczbę podwojeń i że korzystny byłby dłuższy okres transferu.
Zwrócono uwagę na kilka ważnych zalet stosowania termomikserów w porównaniu z tradycyjnymi inkubatorami z wytrząsaniem do ewolucji eksperymentalnej, szczególnie podczas badań nad adaptacją do temperatury. Termomiksery stanowią ekonomiczną alternatywę dla inkubatorów z wytrząsaniem, a dodatkową zaletą jest zmniejszona powierzchnia zajmowana przez hakerów. Cechy te umożliwiają efektywną ocenę wielu równoległych zabiegów termicznych. Termomiksery wykazują również niższe zużycie energii niż inkubatory z wytrząsaniem, więc ich zastosowanie może potencjalnie zmniejszyć wpływ na środowisko, gdy inkubowana jest niewielka liczba probówek (np. mniej niż 100). Ta rozbieżność w zużyciu energii jest szczególnie widoczna w temperaturach istotnych dla termofilów, ale ma również zastosowanie w spektrum bardziej umiarkowanych zakresów temperatur (ryc. 6), co oznacza, że termomiksery mogą być również stosowane w celu zmniejszenia wpływu eksperymentalnej ewolucji mezofilów na środowisko. Łącznie cechy te sugerują, że zastosowanie termomikserów w ewolucji eksperymentalnej może potencjalnie poprawić dostępność tej metodologii badawczej, szczególnie w środowiskach o ograniczonych zasobach, takich jak laboratoria w krajach rozwijających się oraz w szkolnictwie podstawowym i średnim.
Pomimo zapewnienia drogi naprzód dla eksperymentalnej ewolucji termofilnej, obecna metoda ma pewne ograniczenia w stosunku do eksperymentalnej ewolucji mezofilnej. Po pierwsze, liczba replikowanych niezależnych linii, które można ustalić za pomocą termomieszalników, jest niewielka w porównaniu z metodami wysokoprzepustowymi obejmującymi płytki mikromiareczkowe, które są szeroko stosowane w przypadku mezofilów4. Parowanie w wysokich temperaturach wyklucza obecnie stosowanie płytek mikromiareczkowych w oknie czasowym wymaganym do osiągnięcia wykładniczego wzrostu. Po drugie, oszacowanie kluczowych parametrów krzywej wzrostu, takich jak tempo wzrostu, czas podwojenia i czas opóźnienia, jest trudne, ponieważ spektrofotometry płytkowe, które mogą pracować w wysokich temperaturach (>45 °C), nie są obecnie dostępne w sprzedaży. Dzięki opisanej tutaj metodzie charakterystyka krzywej wzrostu wymaga obecnie pracochłonnego pobierania próbek niszczących, a tym samym ogranicza przepustowość. Wreszcie, wysokoprzepustowe techniki oceny konkurencyjności adaptowanych izolatów nie są jeszcze w pełni opracowane dla termofilów. W szczególności opracowanie termostabilnego białka fluorescencyjnego, które można wykorzystać do różnicowania szczepów, umożliwiłoby wysokoprzepustowe testy dopasowania oparte na cytometrii przepływowej28,29; Ostatnie odkrycia termostabilnych białek fluorescencyjnych o różnych widmach wskazują na potencjalny przyszły rozwój 30,31,32. Zwiększenie przepustowości jest logicznym kolejnym krokiem w kierunku dalszego rozwoju eksperymentalnych technik ewolucji termofilów, ponieważ umożliwi pełniejsze opisanie procesów ewolucyjnych.

Wczesne życie na Ziemi mogło powstać w ekstremalnych środowiskach, takich jak kominy hydrotermalne, które charakteryzują się ekstremalnie wysokimi temperaturami i kwasowością1. Mikroorganizmy nadal zamieszkują ekstremalne środowiska, w tym gorące źródła i wulkaniczne solfatara. Scharakteryzowanie dynamiki ewolucyjnej, która zachodzi w tych ekstremalnych warunkach, może rzucić światło na wyspecjalizowane procesy fizjologiczne, które umożliwiają przetrwanie w tych warunkach. Może to mieć daleko idące implikacje, począwszy od zrozumienia początków różnorodności biologicznej, a skończywszy na opracowaniu nowych enzymów wysokotemperaturowych o zastosowaniach biotechnologicznych.
Zrozumienie dynamiki ewolucji mikroorganizmów w ekstremalnych środowiskach pozostaje ograniczone, pomimo jej krytycznego znaczenia. W przeciwieństwie do tego, znaczna część wiedzy na temat ewolucji w środowiskach mezofilnych została zdobyta dzięki zastosowaniu techniki znanej jako ewolucja eksperymentalna. Ewolucja eksperymentalna polega na obserwacji zmian ewolucyjnych w warunkach laboratoryjnych2,3,4,5. Często wiąże się to ze zdefiniowanym środowiskiem zmiany (np. temperatura, zasolenie, wprowadzenie toksyny lub organizmu konkurencyjnego)7,8,9. W połączeniu z sekwencjonowaniem całego genomu, ewolucja eksperymentalna umożliwiła nam przetestowanie kluczowych aspektów procesów ewolucyjnych, w tym równoległości, powtarzalności i genomicznych podstaw adaptacji. Jednak do tej pory większość eksperymentalnych ewolucji przeprowadzono na mikroorganizmach mezofilnych (w tym bakteriach, grzybach i wirusach2,3,4,5, ale w dużej mierze z wyłączeniem archeonów). Metoda ewolucji eksperymentalnej zastosowana do mikroorganizmów ciepłolubnych pozwoliłaby nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób ewoluują i przyczyniłaby się do pełniejszego zrozumienia ewolucji. Ma to potencjalnie daleko idące implikacje, od rozszyfrowania początków życia ciepłolubnego na Ziemi po zastosowania biotechnologiczne obejmujące 'ekstremozymy' używane w bioprocesach wysokotemperaturowych10 i badania astrobiologiczne11.
Archeon Sulfolobus acidocaldarius jest idealnym kandydatem na organizm modelowy do rozwoju eksperymentalnych technik ewolucji dla termofilów. S. acidocaldarius rozmnaża się tlenowo, z optymalną temperaturą wzrostu na poziomie 75 °C (zakres od 55 °C do 85 °C) i wysoką kwasowością (pH 2-3)4,6,12,13,14. Co ciekawe, pomimo ekstremalnych warunków wzrostu, S. acidocaldarius utrzymuje gęstość populacji i tempo mutacji porównywalne z mezophiles7,15,16,17,18. Ponadto posiada stosunkowo mały, dobrze opisany genom (szczep DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2,347 genów)12; S. acidocaldarius korzysta również z solidnych narzędzi inżynierii genomu, które pozwalają na bezpośrednią ocenę procesu ewolucyjnego za pomocą ukierunkowanych nokautów genów19. Godnym uwagi przykładem tego jest dostępność genetycznie zmodyfikowanych szczepów S. acidocaldarius, takich jak auksotroficzne szczepy uracylu MW00119 i SK-120, które mogą służyć jako markery do wyboru.
Istnieją poważne wyzwania związane z przeprowadzaniem eksperymentalnej ewolucji z termofilami, takimi jak S. acidocaldarius. Przedłużona inkubacja w wysokich temperaturach wymagana do tych badań wymusza znaczne parowanie zarówno w przypadku technik hodowli płynnej, jak i stałej. Przedłużona praca w wysokich temperaturach może również uszkodzić tradycyjne inkubatory z wytrząsaniem, które są powszechnie stosowane w ewolucji eksperymentalnej w płynnych mediach. Badanie wielu temperatur wymaga znacznych inwestycji finansowych w zakup i utrzymanie kilku inkubatorów. Ponadto wysokie zużycie energii budzi poważne obawy dotyczące środowiska i finansów.
Ta praca wprowadza metodę rozwiązywania problemów napotkanych podczas przeprowadzania eksperymentalnej ewolucji z termofilami, takimi jak S. acidocaldarius. Opierając się na technice opracowanej przez Baesa i in. do badania reakcji na szok cieplny14,21, opracowana tutaj metoda wykorzystuje termomiksery laboratoryjne do spójnej i niezawodnej inkubacji w wysokiej temperaturze. Jego skalowalność pozwala na jednoczesną ocenę wielu zabiegów termicznych, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów zakupu dodatkowego sprzętu do inkubacji. Zwiększa to wydajność eksperymentów, umożliwiając solidną analizę statystyczną i szeroko zakrojone badanie czynników wpływających na dynamikę ewolucji u termofilów22. Co więcej, takie podejście znacznie zmniejsza początkową inwestycję finansową i zużycie energii w porównaniu z tradycyjnymi inkubatorami, oferując bardziej zrównoważoną i przyjazną dla środowiska alternatywę.
Nasza metoda stanowi podstawę do eksperymentalnego badania dynamiki ewolucyjnej w środowiskach charakteryzujących się ekstremalnymi temperaturami, które mogły odegrać kluczową rolę we wczesnych etapach różnicowania się życia na Ziemi. Organizmy ciepłolubne mają unikalne właściwości, ale ich ekstremalne warunki wzrostu i specjalistyczne wymagania często ograniczały ich dostępność jako systemu modelowego. Pokonanie tych barier nie tylko rozszerza możliwości badawcze w zakresie badania dynamiki ewolucyjnej, ale także zwiększa szerszą użyteczność termofilów jako systemów modelowych w badaniach naukowych.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m Filtry membranowe napędzane strzykawką</td><td>StarLab</td><td>E4780-1226</td><td>Do filtrowania elementów mediów sterylizujących, które nie mogą być sterylizowane w autoklawie.</td></tr><tr><td>1 &mu; Pętle inokulacyjne L</td><td>Greiner</td><td>731161, 731165 lub 731101</td><td>Do zaszczepiania kultur. Można użyć innych pętli.</td></tr><tr><td>1000 &mu; L końcówki do pipet</td><td>StarLab</td><td>S1111-6811</td><td>Można używać innych końcówek do pipet.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 2 ml</td><td>StarLab</td><td>S1620-2700</td><td>Do hodowli S. acidocaldarius w termomikserach.</td></tr><tr><td>200 &mu; L końcówki do pipet</td><td>StarLab</td><td>S1111-0816</td><td>Można używać innych końcówek do pipet.</td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem</td><td>Corning</td><td>430828 lub 430829</td><td>Można stosować inne probówki. Sprawdź wydajność w temperaturze 75 stopni C. Rurki z zaślepkami uszczelniającymi mogą nie pozwalać na wystarczające napowietrzenie; Sprawdź przed użyciem.&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>BD plastipak</td><td>300865</td><td>Do stosowania z filtrami napędzanymi strzykawką.</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania (niepoddane obróbce, z płaskim dnem)</td><td>NUNC</td><td>260860</td><td>Do pomiaru średnicy zewnętrznej przy 600 nm w spektrofotometrze.</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa o regulowanej szerokości</td><td>Pipet-Lite</td><td>LA8-300XLS</td><td>Opcjonalnie, ale oszczędza czas podczas przenoszenia między mikrowirówką a płytkami 96-dołkowymi.</td></tr><tr><td>Siarczan amonu ((NH4)2SO4)</td><td>Milipore</td><td>168355</td><td>Dla podstawowego roztworu Brocka I.</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Priorclave</td><td>B60-SMART lub SV100-BASE</td><td>Można również stosować inne autoklawy.</td></tr><tr><td>Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz Breathe-EASY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763624-100EA</td><td>Przycięta na wymiar do stosowania na przebitych probówkach do mikrowirówek. W przypadku zastępowania innych przepuszczalnych dla gazów memrbanów, upewnij się, że wydajność jest odpowiednia przy 75 & deg; C</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Dla podstawowego roztworu Brocka I.</td></tr><tr><td>CELLSTAR Płytki sześciodołkowe (zawiesinowe/niepoddane obróbce)</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>Prawdopodobnie można zastąpić płytki sześciodołkowe innych producentów. Sprawdź wydajność w wysokich temperaturach.</td></tr><tr><td>Siarczan kobaltu(II) siedmiowodny (CoSO4&middot; 7H2O)</td><td>Supelco</td><td>1025560100</td><td>Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.</td></tr><tr><td>Chlorek miedzi(II) dwuwodny (CuCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td>Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza bezwodna (C6H12O6)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11462858</td><td>Można również stosować inne cukry pentozowe i heksozowe (np. D-ksyloza, D-arabinoza). Glukoza nie jest preferowanym źródłem węgla dla S. acidocaldarius (SV Albers, komunikacja osobista)</td></tr><tr><td>Woda podwójnie destylowana (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1101.1000</td><td>Gelrite (guma gellan) jest stosowany zamiast agaru do wytwarzania pożywek stałych ze względu na wyższą temperaturę topnienia.</td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego 100 mm</td><td>Marka</td><td>BR455742</td><td>Szklane szalki Petriego są używane, ponieważ większość standardowych polistyrenowych szalek Petriego 90 mm odkształca się przy 75 & stopni; C (zależne od marki). Alternatywnie można użyć płytek sześciodołkowych, ponieważ nie odkształcają się one w wysokich temperaturach.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>Innnova 42R</td><td>Można również korzystać z innych inkubatorów. Sprawdź temperaturę roboczą sprzętu przed zakupem/użyciem, ponieważ wiele inkubatorów nie jest w stanie pracować w temperaturach wyższych niż 65 stopni C.</td></tr><tr><td>Chlorek żelaza(III) sześciowodny (FeCl3&middot; 6H2O)</td><td>Supelco</td><td>103943</td><td>Do roztworu podstawowego Fe</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (sól Epsom) (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Dla podstawowego roztworu Brocka I.</td></tr><tr><td>Tetrahydrat chlorku manganu(II) (MnCl2&middot; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIALM5005-100G</td><td>Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.</td></tr><tr><td>Mini inteligentne gniazdo Wi-Fi, monitorowanie energii</td><td>Tapo</td><td>Tapo P110</td><td>Do monitorowania zużycia energii&nbsp;</td></tr><tr><td>N-Z-Amine A - Hydrolizat enzymatyczny kazeiny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0626-500G</td><td>N-Z-Amine-A jest stosowany jako źródło aminokwasów.</td></tr><tr><td>Spinacz do papieru (lub inny wytrzymały drut)</td><td>brak</td><td></td><td>Do przekłuwania probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (fosforan monopotasowy) (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Dla podstawowego roztworu Brocka I.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Promega Wizard</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Opcjonalnie, do ekstrakcji genomowego DNA w laboratorium</td></tr><tr><td>Dwuwodny dihydrat molibdenianu sodu (Na2MoO4&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651-100G</td><td>Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.</td></tr><tr><td>Dekahydrat tetraboranu sodu (boraks) (Na2B4O7&middot; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>BMG</td><td>SPECTROstar OMEGA</td><td>Do pomiaru średnicy zewnętrznej przy 600 nm. Można stosować inne spektrofotometry, które mogą odczytywać OD przy 600 nm.</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (rozcieńczony wodą w stosunku 1:1) (H2SO4)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11337588</td><td>Służy do dostosowania pH roztworu podstawowego Brock II/III do końcowego pH 2&ndash;3.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>DLab</td><td>HM100-Pro</td><td>Można również stosować inne termomiksery; kluczową kwestią jest zdolność do utrzymania 65&ndash; 75 stopni Celsjusza; Temperatury C i 400 RPM</td></tr><tr><td>Uracyl (C4H4N2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>Delecja pyrE jest powszechnym markerem genetycznym stosowanym w S. acidocaldarius. Szczepy deleczujące muszą być uzupełnione uracylem dla wzrostu. Suplementacja nie jest ściśle wymagana dla szczepu typu dzikiego DSM639, ale jest tutaj uwzględniona, ponieważ przyszłe eksperymenty mogą obejmować szczepy delecji.</td></tr><tr><td>Dwuwodny siarczan wanadylu (VOSO4&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204862</td><td>Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.</td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny (ZnSO4&middot; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td>Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.</td></tr></tbody></table>

adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem sulfolobus acidocaldarius

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Archeon Sulfolobus acidocaldarius okazał się obiecującym modelowym systemem ciepłolubnym. Zbadanie, w jaki sposób termofile przystosowują się do zmieniających się temperatur, jest kluczowym wymogiem, nie tylko dla zrozumienia podstawowych procesów ewolucyjnych, ale także dla opracowania S. acidocaldarius jako podstawy dla bioinżynierii. Jedną z głównych przeszkód w przeprowadzaniu eksperymentalnej ewolucji z udziałem termofilów są koszty konserwacji sprzętu i zużycia energii przez tradycyjne inkubatory do wzrostu w wysokich temperaturach. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono kompleksowy protokół eksperymentalny do przeprowadzenia eksperymentalnej ewolucji u S. acidocaldarius, wykorzystujący tanie i energooszczędne termomiksery laboratoryjne. Protokół obejmuje technikę hodowli okresowej o stosunkowo małych objętościach (1,5 ml), co umożliwia śledzenie adaptacji w wielu niezależnych liniach. Metoda ta jest łatwo skalowalna dzięki zastosowaniu dodatkowych termomikserów. Takie podejście zwiększa dostępność S. acidocaldarius jako systemu modelowego, zmniejszając zarówno początkowe inwestycje, jak i bieżące koszty związane z badaniami eksperymentalnymi. Co więcej, technikę tę można przenieść do innych systemów mikrobiologicznych w celu zbadania adaptacji do różnych warunków środowiskowych.

Pomiary krzywej wzrostu 
Krzywe wzrostu dla S. acidocaldarius DSM639 przedstawiono na Rysunku 3A. Stwierdzono, że wzrost był podobny przy porównaniu inkubacji z użyciem termomikserów do inkubacji w konwencjonalnych inkubatorach. Średnie parametry szybkości wzrostu oszacowano poprzez dopasowanie krzywej logistycznej do każdej powtórzonej krzywej wzrostu i obliczenie średniej oraz błędu standardowego. Czas do osiągnięcia środkowej fazy wykładniczej w termomikserze i inkubatorze wynosił odpowiednio 27,2 h ± 1,1 h oraz 31,1 h ± 1,9 h. Szacowany początkowy czas podwojenia dla termomiksera i inkubatora w temperaturze 75 °C wynosił odpowiednio 4,29 h ± 0,28 h i 4,19 h ± 0,44 h, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi wartościami24. Zależność między log10(OD600nm) a log10(CFU) została dobrze opisana modelem liniowym (skorygowane R2 = 0,82, F(1,22) = 104, p &lt; 0,00001, nachylenie = 1,73 ± 0,17, punkt przecięcia = 9,73 ± 0,14). Zależność między OD600nm a CFU jest zatem określona wzorem CFU = 10(1,73 × log10(OD600nm) + 9,73). Wartość OD600nm równa 0,3 odpowiada zatem około 6,7 × 108 CFU/mL (Rysunek 3B).
Eksperyment ewolucji temperaturowej 
Trzy warunki temperaturowe: stałe 75 °C, stałe 65 °C oraz spadek temperatury (75-65 °C, obniżanie o 1 °C co dwa transfery) zostały zainicjowane z wykorzystaniem siedmiu niezależnych linii pochodzących od S. acidocaldarius DSM639. Pomiary OD600nm były wykonywane po każdym transferze w ciągu 45 dni eksperymentu (około 150 generacji przy 75 °C) i są przedstawione na Rysunku 4. Pomiary OD600nm wykonywane w odstępach dobowych są z natury szumne, ponieważ mogą podlegać subtelnym różnicom np. w okresie wzrostu, temperaturze itp. Niemniej jednak pomiary dobowe mogą być nadal przydatne do oceny żywotności populacji, a także dawać wskazówkę, czy przystosowanie (fitness) poprawia się w czasie. Linie z warunku stałego 75 °C wykazały wzrost OD600nm z początkowego zakresu 0,125-0,3 do zakresu 0,248-0,471 pod koniec eksperymentu. Sugeruje to, że w tym wariancie nastąpiła poprawa przystosowania. W przeciwieństwie do tego, linie z warunku stałego 65 °C wykazały spadek OD600nm z początkowego zakresu 0,018-0,087 do 0,008-0,04 w końcowym punkcie czasowym. Sugeruje to, że populacje nie były w stanie zaadaptować się do stałej temperatury 65 °C, choć fakt, że udało się odzyskać żywe organizmy, wskazuje, że populacje nie zostały całkowicie usunięte w wyniku sukcesywnych rozcieńczeń, co sugeruje pewien stopień adaptacji. Wreszcie, populacje w wariancie spadku temperatury wzrosły z początkowego zakresu OD600nm 0,099-0,279 do 0,3-0,39 w Tx6 (odpowiadającym 288 h i 73 °C w tym wariancie), po czym nastąpił stały spadek do zakresu 0,003-0,024 w końcowym punkcie czasowym.
Analizy wzrostu/przystosowania 
Analizy przystosowania przeprowadzono dla każdej populacji potomnej po zakończeniu eksperymentów ewolucyjnych. OD600nm zmierzono po 48 h wzrostu dla wszystkich siedmiu niezależnych linii, a następnie dopasowano modele liniowe w programie R dla każdej temperatury analizy, przyjmując „środowisko selekcyjne” jako efekt główny oraz „powtórzenie/termomikser” jako efekt blokowy. Wzrost szczepu przodka posłużył jako poziom referencyjny dla kontrastów traktowań. Dane przedstawiono na Rysunku 5.
Podczas analizy w 75 °C odnotowano średnio istotne wzrosty przystosowania w stosunku do szczepu przodka dla linii z grup poddanych stałej temperaturze 75 °C (t-test: t210=3.64, p=0.0003) oraz stałej temperaturze 65 °C (t-test: t210=2.8, p=0.005), natomiast nie zaobserwowano ich dla linii z grupy poddanej obniżeniu temperatury (t-test: t210=−0.87, p=0.38). Podczas analizy w 65 °C średnio wszystkie linie z każdej z grup wykazały wzrost przystosowania (linie ze stałej temperatury 75 °C; t-test: t210=4.68, p&lt;0.0001, linie ze stałej temperatury 65 °C; t-test: t210,=4.24, p&lt;0.0001, linie z obniżenia temperatury; t-test: t210=3.15, p=0.002). Jednakże dla obu temperatur analizy wystąpiły znaczne różnice w przystosowaniu poszczególnych linii (Rycina 5). Niektóre linie nie różniły się znacząco od szczepu przodka lub wykazały spadek przystosowania; było to szczególnie widoczne w przypadku linii z grupy poddanej obniżeniu temperatury.
Warto zauważyć, że zależność między OD600nm a CFU/mL mogła ulec zmianie w trakcie eksperymentu ewolucyjnego. Można to ocenić poprzez wyznaczenie parametrów wzrostu dla linii ewoluujących (zgodnie z krokami 3.1-3.10).
Wyniki sekwencjonowania całego genomu 
Analizę całego genomu przeprowadzono przy użyciu programu breseq (wersja 0.38.1)25 dla siedmiu linii pochodzących z warunków stałej temperatury 75 °C, wykorzystując genom referencyjny S. acidocaldarius DSM639 (numer dostępu RefSeq NC_007181.1). W genomach wszystkich linii potomnych ujawniono różnorodne mutacje, w tym insercje, delecje oraz polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) (Tabela 2). Liczne insercje i mutacje niesynonimiczne wystąpiły w genach kodujących białka, a także w regionach międzygenowych, co może wpływać na ekspresję genów ze względu na przesunięcia ramki odczytu w regionach promotorowych genów. Niektóre mutacje były spójne w wielu liniach potomnych w genach zaangażowanych w różne funkcje, takie jak biosynteza ściany komórkowej, transkrypcja, metabolizm, transport komórkowy oraz aktywność katalityczna (Tabela 2). Wśród tych mutacji znajdowała się duża delecja o długości 54 667 par zasad w pięciu z siedmiu linii; potwierdzono to za pomocą wykresu brakującego pokrycia (coverage evidence plot) dla każdej populacji (częstość od 93,2% do 100%). Usunięty region odpowiada utracie 53 genów; rola tych genów w adaptacji zostanie zbadana w przyszłych studiach. Zauważono pewne różnice między użytym izolatem DSM639 a opublikowaną sekwencją referencyjną (przedstawione w Tabeli uzupełniającej 1).
Zużycie energii w inkubatorze wytrząsowym w porównaniu z termomikserem 
Zużycie energii przez inkubator z wytrząsaniem porównano z zużyciem energii przez termomikser, wykorzystując dostępną w handlu inteligentną wtyczkę do monitorowania energii w zakresie powszechnie stosowanych temperatur inkubacji oraz 75 °C temperatura zastosowana w tym przypadku. W 75 °Ctermomikser zużył około 1/40th energia tradycyjnego inkubatora z wytrząsarką (Rycina 6), co sugeruje, że termomiksery mogą stanowić potencjalny sposób na zmniejszenie śladu węglowego związanego z ewolucją eksperymentalną.
<img alt="Schemat eksperymentu ewolucyjnego Sulfolobus acidocaldarius; etapy inkubacji, zmiany temperatury, zapasy glicerynowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat blokowy ilustrujący protokół eksperymentu ewolucyjnego w trzech wariantach temperatury. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu adaptacji temperaturowej; pomiar OD600, konfiguracja termomiksera, wzrost mikroorganizmów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat blokowy ilustrujący kolejne etapy protokołu badania wzrostu/sprawności (fitness assay). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres wzrostu bakterii, OD(600 nm) w funkcji czasu oraz CFU, porównujący metody z użyciem inkubatora i termomiksera." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyznaczenie kluczowych parametrów wzrostu i porównanie urządzeń inkubacyjnych dla S. acidocaldarius DSM639. Trzy powtórne kultury hodowano w temperaturze 75 °C w 7 oddzielnych probówkach. Do pomiarów zastosowano pobieranie próbek niszczących w celu oznaczenia (A) OD600nm (średnie ± błąd standardowy dla n=3 powtórzeń technicznych; niektóre słupki błędów są mniejsze niż symbole punktów; krzywe reprezentują dopasowane logistyczne modele wzrostu) oraz (B) jednostek tworzących kolonie (CFUs; linie reprezentują dopasowane log-log liniowe modele regresji). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres analizy wzrostu kultur bakteryjnych; gęstość optyczna w funkcji czasu w różnych temperaturach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki gęstości optycznych (OD600nm) uzyskane podczas eksperymentów ewolucyjnych. Gęstości optyczne niezależnych linii mierzone podczas eksperymentów ewolucyjnych w trzech wariantach temperatury (stałe 65 °C, stałe 75 °C, spadek 75 °C-65 °C) przeprowadzonych przez około 150 pokoleń. Krzywe przedstawiają wygładzanie Loessa w czasie dla każdej niezależnej linii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wyników testów wzrostu przedstawiający OD przy 600 nm dla różnych linii i temperatur." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki testów wzrostu.Testy wzrostu dla niezależnych linii wywodzących się z S. acidocaldarius DSM639 po eksperymentach z ewolucją temperaturową (stałe 65 °C, stałe 75 °C, spadek 75 °C-65 °C) w porównaniu ze szczepem przodkiem. Dla wszystkich linii wzrost badano w 65 °C i 75 °C. Kolorowe punkty przedstawiają średnią ± błąd standardowy powtórzeń technicznych (zaznaczonych na szaro, n = 12 dla przodka i n = 3 dla każdej wyewoluowanej linii). Szary pasek oznacza średnią ± błąd standardowy przystosowania przodka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zużycia energii porównujący inkubator i thermomixer w zakresie temperatur, wynik eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Zużycie energii w tradycyjnym inkubatorze w porównaniu do urządzeń typu thermomixer. Zużycie energii rejestrowano przez 2 h przy użyciu dostępnej w handlu inteligentnej wtyczki do monitorowania energii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Składy pożywek i roztwory zapasowe wymagane do hodowli *S. acidocaldarius*. Wszystkie pożywki i roztwory zapasowe powinny być przygotowane w wodzie dwukrotnie destylowanej H2O (ddH2O)2O) a następnie sterylizowano w autoklawie lub poprzez filtrację przez 0.22 µm przefiltrować zgodnie z instrukcją. Szczegółowy opis przygotowania wszystkich pożywek i roztworów stokowych znajduje się w sekcji 1 protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Reprezentatywne wyniki sekwencjonowania całego genomu linii potomnych. Mutacje znalezione w liniach potomnych wywodzących się z S. acidocaldarius DSM639 poddanych stałej temperaturze 75 °C. Mutacje wskazują zmiany w stosunku do bezpośredniego przodka linii, który posiada kilka zmian względem sekwencji referencyjnej dla S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; mutacje u przodka przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 1). n oznacza liczbę linii, w których znaleziono daną mutację. → gen w „ramce odczytu bezpośredniego”; ← gen w „ramce odczytu odwrotnej”. †Zmiany te są określone względem przesunięcia ramki odczytu (A)10→11 występującego w izolacie S. acidocaldarius DSM639 (Tabela uzupełniająca 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%202.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Mutacje obecne w izolacie S. acidocaldarius DSM639 w stosunku do sekwencji referencyjnej (numer dostępu RefSeq NC_007181.1). → gen w „ramce odczytu bezpośredniego”; ← gen w „ramce odczytu odwrotnego”. ‡SACI_RS04020 jest adnotowany jako pseudogen w NC_007181.1, lecz zaobserwowana tutaj mutacja przesunięcia ramki odczytu Δ1 bp prawdopodobnie przywraca jego funkcję, ponieważ wraz z mutacją koduje on białko o 100% identyczności z genem odwrotnej gyrazy rgy (numer dostępu RefSeq WP_176586667.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Supplementary%20Table-1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.

Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...

Badania w naszej grupie skupiają się na zrozumieniu reguł ewolucji. W ramach tego projektu opracowaliśmy nowy protokół do badania, w jaki sposób ewoluują drobnoustroje ciepłolubne za pomocą kontrolowanych eksperymentów laboratoryjnych. Pozwoli nam to odpowiedzieć na pytania, w jaki sposób reagują na zmiany środowiskowe poprzez ewolucję adaptacyjną.Dużym wyzwaniem jest kontrola warunków uprawy. Termofile wymagają do wzrostu środowiska o wysokiej temperaturze, co prowadzi do wysokich szybkości parowania i ryzyka wysuszenia kultur i płytek wzrostowych w okresie inkubacji. Innym wyzwaniem jest powolne tempo wzrostu niektórych termofilów, co może utrudniać szybkie testowanie iteracji.Nasz protokół odpowiada na główne wyzwania związane z hodowlą drobnoustrojów ciepłolubnych w różnych temperaturach. Mamy teraz lepszą zdolność do kontrolowania warunków środowiskowych, zapewniając, że obserwowane przez nas wyniki są spójne i odzwierciedlają warunki eksperymentalne, które narzucamy. Umożliwi nam to badanie adaptacji termofilów w czasie rzeczywistym.Nasz protokół oferuje metodę o wysokiej przepustowości, nie tylko do badań nad sulfolobusem, ale można ją dostosować do różnych mikroorganizmów. Za pomocą termomieszalników możemy prowadzić symultaniczne badania w różnych temperaturach bez konieczności stosowania wielu dużych inkubatorów z wytrząsaniem. Obniża również koszty energii, oferując bardziej ekologiczną ścieżkę dla tego typu badań.Nasze odkrycia torują drogę do eksperymentów ewolucyjnych na Sulfolobusie i innych termofilach. Wiele z tego, co myślimy, że wiemy o ewolucji, pochodzi z badania organizmów mezofilnych i istnieje ryzyko, że przegapimy kluczowe zasady ciepłolubów, które pomogą nam wyjaśnić, jak ewoluowała różnorodność życia na Ziemi. Na początek użyj palnika Bunsena, aby ostrożnie podgrzać stalowy drut.Wbij go w pokrywkę probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, aby utworzyć otwór o szerokości 1 mm. Umieść przekłute probówki w naczyniu nadającym się do sterylizacji w autoklawie. Po autoklawie i schłodzeniu probówek napełnij je 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM+Teraz użyj końcówki pipety, aby zeskrobać około 50 do 60 mg kultury Sulfolobus acidocaldarius z zapasu glicerolu.Przenieść inokulum do probówek wypełnionych BBM+. Trzymaj niezaszczepioną probówkę z BBM+ jako kontrolą negatywną. Aby zapobiec wydostawaniu się aerozoli z przebitej pokrywy tuby, umieść odporną na ciepło membranę przepuszczającą gaz na górze pokrywy.Umieść zaszczepione probówki w termomikserze w celu zaszczepienia. Gdy kultury osiągną wymaganą gęstość optyczną, odwirować probówki o stężeniu 5 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odpipetować supernatant w celu jego wyrzucenia. Dodać 1,5 ml ciepłego BBM+ do osadu i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce.Stwierdzono, że wzrost jest podobny, porównując inkubację przy użyciu termomikserów z inkubatorami konwencjonalnymi. Na początek użyj spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną początkowej kultury Sulfolobus acidocaldarius. Następnie utwórz seryjne rozcieńczenia kultury wyjściowej od 10 do 1 do 10 do 6.Odpipetować po 100 mikrolitrów z 10 do 5 i 10 do 6 rozcieńczeń, a następnie przenieść je do studzienek sześciodołkowej płytki zawierającej stały BBM+ Umieścić płytkę w pudełku z wilgotną szmatką do inkubatora statycznego w temperaturze 75 stopni Celsjusza na pięć do siedmiu dni, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Aby ustalić pożądaną liczbę ewoluujących linii z pojedynczych kolonii, za pomocą pętli inokulacyjnej wybierz losowo kolonię. Zawiesić kolonię w 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM+ zawartego w przebitej probówce o pojemności 2 ml.Odpowiednio oznacz tubę. Po powtórzeniu ponownego zaparcia dla kilku kolonii, napełnić probówkę 1,5 ml pożywki jako kontroli ujemnej. Uszczelnij wierzchołki probówek oddychającą membraną, a następnie inkubuj je w termomikserze, aż kultury staną się mętne.Odwirować kultury klonalne przy 5 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu odpipetować 200 mikrolitrów BBM+ do probówki i ponownie zawiesić osad. Dodaj 200 mikrolitrów 50% glicerolu do każdej tubki, aby utworzyć zapasy glicerolu.Następnie przechowuj buliony w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszych eksperymentów. Na początek użyj ożywionych populacji przodków Sulfolobus acidocaldarius. Dodaj BBM+, aby rozcieńczyć kultury do OD600 0,01.Pobrać pipetę o odpowiedniej objętości z każdej z siedmiu kultur do trzech oddzielnych przekłutych probówek o pojemności 2 ml. Uszczelnij rurki oddychającą membraną. Następnie umieść każdy zestaw siedmiu populacji przodków w oddzielnych termomikserach.Ustaw każdy termomikser na wymaganą temperaturę i 400 obr./min, aby rozpocząć eksperyment ewolucji. Po 48 godzinach przenieść 15 mikrolitrów każdej z kultur transferu-zero do 1,5 ml podgrzanego BBM+pożywki zawartej w przebitej probówce o pojemności 2 ml oznaczonej Transfer 1. Uszczelnij rurki przepuszczalną membraną przed umieszczeniem ich z powrotem w losowych pozycjach w odpowiednich termomikserach.Zmierz OD600 transferu zerowego w spektrofotometrze płytkowym, aby zakończyć pierwsze przenoszenie. Powtarzaj transfer kultury i pomiar gęstości optycznej co dwa dni, aby wykonywać transfery, aż do osiągnięcia żądanej liczby transferów. Przygotować zapasy glicerolu w populacjach po co dziesiątym transferze i przy ostatnim transferze, a następnie oznaczyć probówkę identyfikatorem populacji przodków i numerem transferu.Termomiksery powinny być ustawione na stałą temperaturę 75 stopni Celsjusza i 65 stopni Celsjusza. Trzeci termomikser będzie stopniowo zmniejszany, aby obserwować reakcję na stopniowe zmiany. Na początek wysiaduj ożywione kultury przodków i ewoluujące w temperaturze kultury Sulfolobus acidocaldarius w temperaturach końcowych.Po zakończeniu inkubacji zmierz ich gęstość optyczną na 600 nanometrach. Następnie dodaj 1,5 ml BBM+ do sześciu zestawów po siedem probówek dla każdej kultury. Następnie dodaj 15 mikrolitrów każdej kultury do sześciu zestawów probówek.Ustaw trzy termomiksery na 75 stopni Celsjusza i trzy termomiksery na 65 stopni Celsjusza. Umieść probówki w termomikserze odpowiadającym temperaturze i powtórz ID. Po 48-godzinnej inkubacji przenieś 200 mikrolitrów z każdej kultury na 96-dołkową płytkę. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.Na koniec wykreśl i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego. Linie ze stałego warunku 75 stopni Celsjusza wzrosły w OD600 z początkowego zakresu pod koniec eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, linie z leczenia w stałej temperaturze 65 stopni Celsjusza wykazywały spadek.Populacje poddawane zabiegowi spadku temperatury wzrosły od początkowej gęstości optycznej do transferu 6, a następnie wykazywały stały spadek.

adaptation-at-extremes-life-experimental-evolution-with-extremophile

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i...

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Opisujemy technikę analizy globalnej syntezy RNA w hipoksji za pomocą obrazowania. Znakowanie chemiczne RNA metodą kliknięcia nie było wcześniej wykonywane w warunkach hipoksji i umożliwia wizualizację globalnych zmian RNA na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to uzupełnia istniejące techniki uśredniania RNA, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zmian między komórkami w globalnej syntezie RNA.

Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Niekoherentne światło ksenonowe było przepuszczane przez wąskopasmowe filtry interferencyjne i neutralne gęstości, aby dostarczyć światło o różnej długości fali i intensywności do hodowanych komórek. Protokół ten został wykorzystany do oceny wpływu terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na produkcję form reaktywnych in vitro: nie zaobserwowano żadnych efektów przy użyciu badanych parametrów.

Metoda oceny wpływu zakresu długości fal i natężeń terapii światłem czerwonym/bliskiej podczerwieni na stres oksydacyjny in vitro

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Poznaj eksperymentalną ewolucję termofilnych mikroorganizmów z archeonem Sulfolobus acidocaldarius przy użyciu termomikserów. Ta metoda umożliwia badanie adaptacji w ekstremalnych warunkach temperatury.

Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

Przeglądaj więcej filmów