Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

Badania w naszej grupie skupiają się na zrozumieniu reguł ewolucji. W ramach tego projektu opracowaliśmy nowy protokół do badania, w jaki sposób ewoluują drobnoustroje ciepłolubne za pomocą kontrolowanych eksperymentów laboratoryjnych. Pozwoli nam to odpowiedzieć na pytania, w jaki sposób reagują na zmiany środowiskowe poprzez ewolucję adaptacyjną.

Dużym wyzwaniem jest kontrola warunków uprawy. Termofile wymagają do wzrostu środowiska o wysokiej temperaturze, co prowadzi do wysokich szybkości parowania i ryzyka wysuszenia kultur i płytek wzrostowych w okresie inkubacji. Innym wyzwaniem jest powolne tempo wzrostu niektórych termofilów, co może utrudniać szybkie testowanie iteracji.

Nasz protokół odpowiada na główne wyzwania związane z hodowlą drobnoustrojów ciepłolubnych w różnych temperaturach. Mamy teraz lepszą zdolność do kontrolowania warunków środowiskowych, zapewniając, że obserwowane przez nas wyniki są spójne i odzwierciedlają warunki eksperymentalne, które narzucamy. Umożliwi nam to badanie adaptacji termofilów w czasie rzeczywistym.

Nasz protokół oferuje metodę o wysokiej przepustowości, nie tylko do badań nad sulfolobusem, ale można ją dostosować do różnych mikroorganizmów. Za pomocą termomieszalników możemy prowadzić symultaniczne badania w różnych temperaturach bez konieczności stosowania wielu dużych inkubatorów z wytrząsaniem. Obniża również koszty energii, oferując bardziej ekologiczną ścieżkę dla tego typu badań.

Nasze odkrycia torują drogę do eksperymentów ewolucyjnych na Sulfolobusie i innych termofilach. Wiele z tego, co myślimy, że wiemy o ewolucji, pochodzi z badania organizmów mezofilnych i istnieje ryzyko, że przegapimy kluczowe zasady ciepłolubów, które pomogą nam wyjaśnić, jak ewoluowała różnorodność życia na Ziemi. Na początek użyj palnika Bunsena, aby ostrożnie podgrzać stalowy drut.

Wbij go w pokrywkę probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, aby utworzyć otwór o szerokości 1 mm. Umieść przekłute probówki w naczyniu nadającym się do sterylizacji w autoklawie. Po autoklawie i schłodzeniu probówek napełnij je 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM+Teraz użyj końcówki pipety, aby zeskrobać około 50 do 60 mg kultury Sulfolobus acidocaldarius z zapasu glicerolu.

Przenieść inokulum do probówek wypełnionych BBM+. Trzymaj niezaszczepioną probówkę z BBM+ jako kontrolą negatywną. Aby zapobiec wydostawaniu się aerozoli z przebitej pokrywy tuby, umieść odporną na ciepło membranę przepuszczającą gaz na górze pokrywy.

Umieść zaszczepione probówki w termomikserze w celu zaszczepienia. Gdy kultury osiągną wymaganą gęstość optyczną, odwirować probówki o stężeniu 5 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odpipetować supernatant w celu jego wyrzucenia. Dodać 1,5 ml ciepłego BBM+ do osadu i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce.

Stwierdzono, że wzrost jest podobny, porównując inkubację przy użyciu termomikserów z inkubatorami konwencjonalnymi. Na początek użyj spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną początkowej kultury Sulfolobus acidocaldarius. Następnie utwórz seryjne rozcieńczenia kultury wyjściowej od 10 do 1 do 10 do 6.

Odpipetować po 100 mikrolitrów z 10 do 5 i 10 do 6 rozcieńczeń, a następnie przenieść je do studzienek sześciodołkowej płytki zawierającej stały BBM+ Umieścić płytkę w pudełku z wilgotną szmatką do inkubatora statycznego w temperaturze 75 stopni Celsjusza na pięć do siedmiu dni, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Aby ustalić pożądaną liczbę ewoluujących linii z pojedynczych kolonii, za pomocą pętli inokulacyjnej wybierz losowo kolonię. Zawiesić kolonię w 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM+ zawartego w przebitej probówce o pojemności 2 ml.

Odpowiednio oznacz tubę. Po powtórzeniu ponownego zaparcia dla kilku kolonii, napełnić probówkę 1,5 ml pożywki jako kontroli ujemnej. Uszczelnij wierzchołki probówek oddychającą membraną, a następnie inkubuj je w termomikserze, aż kultury staną się mętne.

Odwirować kultury klonalne przy 5 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu odpipetować 200 mikrolitrów BBM+ do probówki i ponownie zawiesić osad. Dodaj 200 mikrolitrów 50% glicerolu do każdej tubki, aby utworzyć zapasy glicerolu.

Następnie przechowuj buliony w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszych eksperymentów. Na początek użyj ożywionych populacji przodków Sulfolobus acidocaldarius. Dodaj BBM+, aby rozcieńczyć kultury do OD600 0,01.

Pobrać pipetę o odpowiedniej objętości z każdej z siedmiu kultur do trzech oddzielnych przekłutych probówek o pojemności 2 ml. Uszczelnij rurki oddychającą membraną. Następnie umieść każdy zestaw siedmiu populacji przodków w oddzielnych termomikserach.

Ustaw każdy termomikser na wymaganą temperaturę i 400 obr./min, aby rozpocząć eksperyment ewolucji. Po 48 godzinach przenieść 15 mikrolitrów każdej z kultur transferu-zero do 1,5 ml podgrzanego BBM+pożywki zawartej w przebitej probówce o pojemności 2 ml oznaczonej Transfer 1. Uszczelnij rurki przepuszczalną membraną przed umieszczeniem ich z powrotem w losowych pozycjach w odpowiednich termomikserach.

Zmierz OD600 transferu zerowego w spektrofotometrze płytkowym, aby zakończyć pierwsze przenoszenie. Powtarzaj transfer kultury i pomiar gęstości optycznej co dwa dni, aby wykonywać transfery, aż do osiągnięcia żądanej liczby transferów. Przygotować zapasy glicerolu w populacjach po co dziesiątym transferze i przy ostatnim transferze, a następnie oznaczyć probówkę identyfikatorem populacji przodków i numerem transferu.

Termomiksery powinny być ustawione na stałą temperaturę 75 stopni Celsjusza i 65 stopni Celsjusza. Trzeci termomikser będzie stopniowo zmniejszany, aby obserwować reakcję na stopniowe zmiany. Na początek wysiaduj ożywione kultury przodków i ewoluujące w temperaturze kultury Sulfolobus acidocaldarius w temperaturach końcowych.

Po zakończeniu inkubacji zmierz ich gęstość optyczną na 600 nanometrach. Następnie dodaj 1,5 ml BBM+ do sześciu zestawów po siedem probówek dla każdej kultury. Następnie dodaj 15 mikrolitrów każdej kultury do sześciu zestawów probówek.

Ustaw trzy termomiksery na 75 stopni Celsjusza i trzy termomiksery na 65 stopni Celsjusza. Umieść probówki w termomikserze odpowiadającym temperaturze i powtórz ID. Po 48-godzinnej inkubacji przenieś 200 mikrolitrów z każdej kultury na 96-dołkową płytkę. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.

Na koniec wykreśl i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego. Linie ze stałego warunku 75 stopni Celsjusza wzrosły w OD600 z początkowego zakresu pod koniec eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, linie z leczenia w stałej temperaturze 65 stopni Celsjusza wykazywały spadek.

Populacje poddawane zabiegowi spadku temperatury wzrosły od początkowej gęstości optycznej do transferu 6, a następnie wykazywały stały spadek.