Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie i wykorzystanie półautomatycznej platformy mikrofluidycznej do hodowli i stymulacji niewielkich populacji komórek oraz odzyskiwania lizatów komórkowych do analiz molekularnych. Jest to realizowane poprzez wstępne ustanowienie mikroskalowych kultur komórkowych w mikrokapilarach pokrytych fibronektyną, nazywanych komorami perfuzyjnymi komórek. Drugim krokiem jest połączenie komór perfuzyjnych z modułem cyfrowej mikrofluidyki (DMF), który zapewnia elastyczny sposób transportu odczynników do mikroskalowych kultur komórkowych i z powrotem.

Następnie moduł DMF dostarcza wybrany bodziec do komór perfuzyjnych, a komórki są inkubowane z bodźcem przez określony czas ekspozycji. Na koniec komórki są lizowane chemicznie, a lizaty są odzyskiwane do modułu DMF w celu analizy molekularnej. Odzyskane lizaty są następnie analizowane za pomocą ilościowego R-T-P-C-R, aby scharakteryzować odpowiedź transkrypcyjną populacji komórek na podany bodziec.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi metodami hodowli komórkowych jest możliwość przeprowadzania badań nad stymulacją komórek przy użyciu niewielkich ilości komórek oraz niewielkich ilości odczynników. Nasze badania wykazały, że precyzyjne operowanie komórkami i odczynnikami w skali mikro na tej platformie minimalizuje zmienność między poszczególnymi doświadczeniami. Platforma ta jest również bardzo wszechstronna.

Cyfrowy moduł mikroprzepływowy umożliwia kierowanie komórek i odczynników do komór perfuzyjnych i z nich z dużą elastycznością, dzięki czemu eksperymenty można szybko i łatwo dostosować oraz rekonfigurować. Na początek należy przygotować sterylną roztwór 50 µg/mL fibronektyny i użyć wieloportowej pompy strzykawkowej, aby pobrać 30 µL roztworu do każdej mikrokapilary w celu przyspieszenia powlekania wewnętrznych powierzchni mikrokapilar. Inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny, następnie odessać i usunąć roztwór fibronektyny i pozostawić mikrokapilary do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez sześć godzin.

Następnie należy połączyć mikrokapilary powlekane włóknem nylonowym lub komory perfuzyjne z rurkami z poliwęglanu, a rurki z pompą strzykawkową za pomocą odpowiednich złączek. Przedstawiony tutaj układ wykorzystuje pompę strzykawkową z wieloma portami, obsługującą sześć komór perfuzyjnych. Za pomocą taśmy należy przymocować korpus każdej komory perfuzyjnej do bloku grzewczego i ustawić temperaturę bloków grzewczych na 37 °C.

Następnie zanurz otwarte końce komór perfuzyjnych w zbiorniku zawierającym komórki zawieszone w świeżej pożywce wzrostowej, równomiernie zdyspergowane w stężeniu 1 milion komórek na mililitr. Zaprogramuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła 10 µL zawiesiny komórkowej do każdej komory perfuzyjnej. Następnie wyjmij otwarte końce komór perfuzyjnych z zawiesiny komórkowej i zaprogramuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła odpowiednią ilość powietrza, by przesunąć korki cieczy do sekcji zamocowanych do bloku grzewczego.

Pozwól komórkom przywrzeć do wewnętrznych powierzchni komór perfuzyjnych pokrytych fibronektyną, inkubując je w temperaturze 37 °C przez jedną do dwóch godzin. W międzyczasie przenieś otwarte końce komór perfuzyjnych do nowego zbiornika zawierającego świeżą pożywkę wzrostową. Po okresie adhezji zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby odprowadziła korki cieczowe do odpadów, a następnie zassała 10 µL świeżej pożywki do każdej komory perfuzyjnej, a następnie taką ilość powietrza, aby umieścić świeżą pożywkę nad przywrzonymi komórkami.

Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37°C, wymieniając medium co dwie godziny, aż do momentu, gdy kultury zostaną odpowiednio zrównoważone i namnożone.Wzór. Płyta dolna modułu DMF z 46 elektrodami z tlenku indu i cyny. Korzystając ze standardowych technik fotolitograficznych, pokryj płytę dolną modułu DMF warstwą 5 µm Lene C metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej, a następnie nałóż metodą spin-coatingu warstwę 50 nm Teflon af.

Następnie pokryj metodą spin-coatingu nieuśmieciowaną podstawkę szklaną z tlenkiem indu i cyny warstwą Teflonu AF o grubości 50 nanometrów, która będzie służyć jako płyta górna. Użyj metalowych ramek kompresyjnych, aby zamocować płyty w polimerowej odlewce z wgłębieniami utrzymującymi odstęp 400 mikronów między płytami. Odstęp ten, w połączeniu z rozmiarem elektrody aktywującej wynoszącym 2,5 milimetrów kwadratowych, definiuje objętość kropli jako 2,5 mikrolitrów na elektrodę.

Następnie należy wprowadzić teflonowe mikrokapilary transferowe w przestrzeń między płytkami DMF. Każdą z nich należy ustawić tak, aby sięgała od krawędzi odpowiadającej jej elektrody sterującej do przeciwległego końca każdego transferu. Do mikrokapilary należy przymocować złączkę typu capite.

Następnie podłącz złącza elektryczne, aby dostarczyć napięcie do elektrod z tlenku indu 10. Sekwencje aktywacji elektrod są zautomatyzowane dzięki zastosowaniu sterowanego komputerowo interfejsu elektronicznego, który uruchamia określone skrypty. Następnie napełnij wbudowane zbiorniki modułów DMF odpowiednimi odczynnikami do stymulacji komórek, przemywania i lizy.

W niektórych przypadkach najlepiej jest załadować sam bodziec na późniejszym etapie, tuż przed jego użyciem, pobierając go z załadowanych rezerwuarów pokładowych, a następnie dozować mikrokrople na moduł DMF. Następnie należy przetestować aktywację mikrokropli, w tym ich transport pomiędzy modułem DMF a mikrokapilarami transferowymi Blais. W pierwszej kolejności przygotować bodziec w świeżym medium z 0,1% onic F1 27 przy końcowym stężeniu 100 µg/mL.

Następnie wprowadź od 80 do 100 µL bodźca do wyznaczonego wbudowanego zbiornika. Następnie wyjmij otwarte końce komór perfuzyjnych ze zbiornika z medium i włóż je do złączy kapite znajdujących się na końcach mikrokapilar transferowych, a następnie zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby przesunęła korki cieczy wewnątrz komór perfuzyjnych do pojemnika na odpady. Następnie zaprogramuj moduł DMF tak, aby generował 10 µL kropli bodźca i dostarczał je do komór perfuzyjnych za pomocą mikrokapilar transferowych.

W razie potrzeby inkubować komórki ze stymulantem w temperaturze 37 °C przez jedną do czterech godzin. Po okresie stymulacji wymieniać stymulant na świeży w regularnych odstępach czasu. Zaprogramować pompę strzykawkową tak, aby skierowała stymulant do pojemnika na odpady, a moduł DMF tak, aby dostarczył 10 µL kropli buforu płuczącego do każdej komory perfuzyjnej.

Inkubuj komórki w buforze płuczącym przez pięć minut. Następnie wymień bufor płuczący na 10 µL roztworu lizującego i inkubuj przez kolejne pięć minut. Następnie zaprogramuj pompę strzykawkową, aby przesłać każdy lizat komórkowy do modułu DMF.

Zdejmij górną płytkę modułu DMF, uważając, aby nie przechylić jej na bok, ponieważ może to doprowadzić do kontaminacji krzyżowej między kropelkami. Następnie, za pomocą pipety, pobierz lizaty z otwartego modułu DMF do analiz poza platformą, takich jak analiza ekspresji genów za pomocą ilościowej R-T-P-C-R, aby przygotować platformę do kolejnego eksperymentu. Najpierw zanurz mikrokapilary transferowe, złączki CAPITE oraz płytki modułu DMF w 10% roztworze wybielacza na 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie płytki modułu DMF przepłucz izopropanolem, a potem wodą dejonizowaną i wysusz za pomocą azotu, po czym wypal w temperaturze 160 °C przez 10 minut.

Metody wysiewania opisane w niniejszym protokole pozwoliły na adhezję około 500 makrofagów miren na komorę perfuzyjną. Po inkubacji komórek w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, wielkość populacji wzrosła dwukrotnie do około 1000 komórek na komorę perfuzyjną. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z ilościowej analizy R-T-P-C-R czterech genów, o których wiadomo, że odgrywają one istotną rolę w wrodzonych odpowiedziach immunologicznych na bakterie.

Makrofagi hodowano w kulturach konwencjonalnych lub mikroskalowych, a następnie stymulowano biocząsteczkami e coli przez jedną lub cztery godziny. Niebieskie słupki wskazują średni wzrost ekspresji genów po stymulacji komórek hodowanych konwencjonalnie, natomiast czerwone słupki wskazują indukowaną ekspresję w komórkach hodowanych i stymulowanych. W przypadku kultur mikroskalowych słupki błędów oznaczają odchylenia standardowe pomiędzy powtórzeniami biologicznymi z trzech niezależnych eksperymentów.

Wyniki profilowania ekspresji genów były bardzo podobne, mimo że w hodowlach konwencjonalnych zastosowano płytki 96-dołkowe z około 50 000 komórek na dołek, podczas gdy w hodowlach w mikroskali zastosowano mikrokapilary z około 1000 komórek na komorę perfuzyjną. Zmienność między eksperymentami była co najmniej porównywalna, a często mniejsza w hodowlach w mikroskali, co wskazują krótsze słupki błędów. Praca w mikroskali pozwoliła na pięciokrotne zmniejszenie zużycia komórek oraz od trzech do pięćdziesięciokrotne zmniejszenie zużycia odczynników w stosunku do eksperymentów konwencjonalnych.

Metodę tę można wykorzystać do hodowli praktycznie każdego rodzaju komórek adherentnych, w niektórych przypadkach stosując inny komponent macierzy zewnątrzkomórkowej lub pożywkę wzrostową. Hodowla komórek nieadherentnych może być trudna, jednak strategie kotwiczenia komórek okazały się skuteczne w podobnych kontekstach. Opisane tutaj podejście umożliwia hodowlę w skali mikro przez okres do 24 godzin.

Platforma obejmuje również wszystkie funkcje niezbędne do prowadzenia hodowli długoterminowych, jednak wymagany jest opracowanie protokołu pasażowania komórek. Dodatkowe moduły mogą zostać zintegrowane z cyfrową kostką mikrofluidyczną poprzez mikrokapilarne połączenia. W ten sposób DMF służy jako centralny węzeł łączący moduły peryferyjne w celu realizacji złożonych schematów operacyjnych.

Skupiliśmy się przede wszystkim na charakterystyce transkrypcyjnych odpowiedzi gospodarza na czynniki zakaźne, jednak platforma ta została zaprojektowana w sposób niezwykle wszechstronny, dzięki czemu powinna ona wspierać szeroką gamę zastosowań badawczych.