Name: Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną platformę mikrofluidyczną do hodowli i stymulacji małych populacji komórek z odzyskiwaniem lizatów do analiz molekularnych. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę warunków kultury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ronaldowi F. Renzi i Michaelowi S. Bartschowi za ich wkład w projektowanie i rozwój urządzeń DMF oraz koncentratora DMF. Badania te były w pełni wspierane przez program badawczo-rozwojowy kierowany przez laboratorium w Sandia National Laboratories. Sandia to wieloprogramowe laboratorium zarządzane i obsługiwane przez Sandia Corporation, spółkę zależną należącą w całości do Lockheed Martin Corporation, dla Narodowej Administracji Bezpieczeństwa Jądrowego Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych w ramach kontraktu DE-AC04-94AL85000.

Ten ogólny protokół ma na celu wspieranie zastosowania platformy do szerokiej gamy badań; aspekty specyficzne dla reprezentatywnego badania opisanego w tym raporcie są oddzielone w nawiasach. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne badanie przeprowadzone przy użyciu protokołu. Zauważ, że w protokole wszystkie polecenia "instruct" są zautomatyzowane za pomocą wcześniej określonych skryptów. Należy również zauważyć, że Krok 2 może być wykonywany równolegle z Krokiem 1 (np. podczas Kroków 1.7 i 1.8) oraz że Krok 2.1 jest często pomijany (ponieważ wzorzyste/powlekane płyty urządzeń DMF mogą być myte i ponownie używane; patrz Krok 5.2).
1. Złóż i wypełnij komory perfuzyjne komórek
<ol>
	<li>Pokryć wewnętrzne powierzchnie wysterylizowanych (autoklawowanych) mikrokapilar (stopiona krzemionka; 679 μm üm üd, 534 μm üm id; 15 cm długości) fibronektyną, nakazując pompie strzykawkowej pobranie sterylnego roztworu fibronektyny (30 μl z 50 μg/ml) do każdej mikrokapilarnej, inkubacji (37 °C przez 2 godziny), nakazując pompie strzykawkowej pobranie roztworu, i pozostawienie mikronaczyń włosowatych do wyschnięcia (temperatura pokojowa (RT) przez 6 godzin).</li>
	<li>Podłącz każdą mikrokapilarnę (komorę perfuzyjną) pokrytą fibronektyną do rurki poliwęglanowej (średnica zewnętrzna 500 μm, średnica wewnętrzna 100 μm), a rurkę do wieloportowej pompy strzykawkowej za pomocą złączek CapTite (6 komór perfuzyjnych, 8-portowa pompa strzykawkowa).</li>
	<li>Za pomocą taśmy przymocuj korpus każdej komory perfuzyjnej do bloku grzewczego ustawionego na żądaną temperaturę (37 °C).</li>
	<li>Zanurzyć otwarte końce komór perfuzyjnych w zbiorniku (probówka mikrocentyfugowa lub studzienka płytki mikromiareczkowej) zawierającym komórki (mysie makrofagi P388D.1) zawieszone w świeżej pożywce wzrostowej (RPMI-1640, 10% FBS, 500 jednostek/ml penicyliny, 500 μg/ml streptomycyny) w pożądanym stężeniu (10-6 komórek/ml).</li>
	<li>Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła komórki (10 μl, 104 komórki) do każdej komory perfuzyjnej, a następnie doprowadzono tyle powietrza, aby przesunąć korek cieczy (~ 4.5 cm) do sekcji przymocowanej do bloku grzewczego.</li>
	<li>Pozostawić komórki do przylegania do pokrytych fibronektyną wewnętrznych powierzchni komór perfuzyjnych (37 °C przez 1-2 godziny). W międzyczasie przenieś otwarte końce komór perfuzyjnych ze zbiornika komórek do nowego zbiornika zawierającego świeżą pożywkę wzrostową.</li>
	<li>Po upływie okresu przylegania poinstruować pompę strzykawkową, aby wysłała korki cieczy (kondycjonowane media i nieprzyłączone ogniwa) do odpadów, pobrała świeżą pożywkę (10 μl), a następnie dodała wystarczającą ilość powietrza, aby umieścić nowe korki cieczy (świeże podłoże) nad przylegającymi komórkami.</li>
	<li>Kontynuuj wymianę pożywki (tj. powtarzaj krok 1.7) w regularnych odstępach czasu (co 2 godziny), aż populacje komórek zostaną wystarczająco zrównoważone i rozszerzone (16 - 24 godziny hodowli w mikroskali wygenerowanych populacji ~ 1,000 komórek / komorę).</li>
</ol>
2. Wyprodukuj urządzenie DMF i zmontuj architekturę huba
<ol>
	<li>Jak opisano poprzednio14,29, uformować dolną płytkę urządzenia DMF za pomocą czterdziestu sześciu elektrod z tlenku indu i cyny (ITO) (sterowników uruchamiania kropel) za pomocą fotolitografii i trawienia, a następnie pokryć 5 μm parylenu-C i 50 nm teflonu-AF. Uformuj górną płytę urządzenia DMF, pokrywając niewzorzyste podłoże szklane ITO Teflonem-AF, jak powyżej.</li>
	<li>Za pomocą metalowych ram zaciskowych zamocuj płyty DMF w odlewie polimerowym14,30 z wgłębieniami, które utrzymują odstęp 400 μm między płytami; odstęp ten, w połączeniu z rozmiarem elektrody uruchamiającej (2,5 mm2), określa objętość kropli (2,5 μl na elektrodę). Należy pamiętać, że montaż DKZ można wykonać w prostszy sposób24.</li>
	<li>Włożyć pokryte teflonem mikrokapilary transferowe (średnica zewnętrzna 360 μm, średnica wewnętrzna 100 μm; długość 3,5 - 4,0 cm) w przestrzeń między płytami DMF, ustawiając każdą z nich tak, aby sięgała do krawędzi pokrewnej elektrody uruchamiającej.</li>
	<li>Na przeciwległym końcu każdej mikrokapilary transferowej przymocuj złączkę CapTite.</li>
	<li>Podłącz złącza elektryczne, aby dostarczyć napięcie do elektrod ITO. Sekwencje aktywacji elektrod są zautomatyzowane za pomocą sterowanego komputerowo interfejsu elektronicznego, na którym działają wcześniej określone skrypty.</li>
	<li>Opcjonalnie: Przenieś zmontowaną piastę DMF na stolik translacyjny mikroskopu (SZ-6145TR (Olympus, Japonia)) wyposażonego w kamerę z urządzeniem ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) (DCR-HC96 (Sony, Japonia)) w celu ułatwienia śledzenia kropel. Rozdział 31</li>
</ol>
3. Podłącz komory perfuzyjne do koncentratora DMF i stymuluj populacje komórek
<ol>
	<li>Wyjmij otwarte końce komór perfuzyjnych ze zbiornika pożywki (patrz krok 1.6) i włóż je do złączek CapTite przymocowanych do końców mikrokapilar transferowych piasty DKZ (patrz krok 2.4).</li>
	<li>Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała korki cieczy (kondycjonowane media) w komorach perfuzyjnych do odpadów.</li>
	<li>Poinstruuj koncentrator DMF, aby pobierał bodziec (Biocząstki E. coli w stężeniu 100 μg/ml w świeżej pożywce z 0,1% Pluronic F127 w/v) z pokładowego zbiornika i dostarczał kroplę o odpowiedniej wielkości (10 μl) do każdej mikrokapilary transferowej. Zbiorniki pokładowe składają się z cylindrycznych komór (1,5 x 1,5 cm każdy) i są połączone z piastą DMF za pomocą przewodów.</li>
	<li>Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła czopki bodźcowe do mikrokapilar transferowych, a następnie doprowadź tyle powietrza, aby umieścić czopki nad populacjami komórek w komorach perfuzyjnych.</li>
	<li>Inkubować komórki z bodźcem (37 °C przez 1 - 4 godziny). Opcjonalnie: Wymieniaj na nowy bodziec (tj. powtarzaj kroki 3.2-3.4) w regularnych odstępach czasu.</li>
</ol>
4. Zakończ stymulację i odzyskaj lizaty komórkowe do analizy
<ol>
	<li>Opcjonalnie: Jeśli wymagany jest okres po stymulacji, należy wymienić korki płynne zawierające bodziec na świeże podłoże (tj. powtórzyć kroki 3.2 - 3.4, zastępując bodziec świeżym podłożem) i kontynuować inkubację i wymianę w razie potrzeby.</li>
	<li>Wymień korki z cieczą w komorach perfuzyjnych na bufor do przemywania (Prelude Direct Lysis Module Buffer B) (tj. powtórz kroki 3.2 - 3.4, zastępując bodziec buforem do płukania) i inkubuj w razie potrzeby (5 min).</li>
	<li>Wymień korki z cieczą (bufor do płukania) na roztwór do lizy (Prelude Direct Lysis Module Buffer A z 0,1% Pluronic F127 w/v) (tj. powtórz kroki 3.2 - 3.4, zastępując roztwór do lizy jako bodziec) i inkubuj w razie potrzeby (5 min).</li>
	<li>Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała korki cieczy (lizaty komórkowe) do piasty DMF.</li>
	<li>Zdemontuj piastę DMF, zdejmij górną płytkę urządzenia DMF (uważając, aby nie przechylić płytki na boki, ponieważ może to spowodować wymieszanie się kropel) i zbierz lizaty za pomocą Pipetmana lub strzykawki do analizy poza platformą (profilowanie ekspresji genów za pomocą qPCR).</li>
</ol>
5. Czysty sprzęt platformy do ponownego wykorzystania
<ol>
	<li>Zanurz mikrokapilary transferowe i złączki CapTite w 10% wybielaczu (v/v w wodzie) na 10 minut w temperaturze pokojowej, dobrze spłucz wodą dejonizowaną i wysusz przy użyciu gazowego azotu.</li>
	<li>Zanurz płytki urządzenia DMF w 10% wybielaczu na 10 minut w temperaturze pokojowej, dobrze spłucz izopropanolem, a następnie wodą dejonizowaną i wysusz przy użyciu azotu, a następnie piecz w temperaturze 160 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Rurka z poliwęglanu pompy strzykawkowej oraz odlewana z polimeru i rama kompresyjna urządzenia DMF mogą być ponownie użyte bez czyszczenia. Mikrokapilary komory perfuzyjnej są odrzucane po każdym eksperymencie.</li>
</ol>

<ol><li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+bioapplications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for bioapplications.</a> Small. 7, 12-48 (2011).</li>
<li>Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-contained+microfluidic+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A self-contained microfluidic cell culture system.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).</li>
<li>Skafte-Pedersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-contained%2C+programmable+microfluidic+cell+culture+system+with+real-time+microscopy+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access.</a> Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).</li>
<li>Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+complete+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for complete mammalian cell culture.</a> Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).</li>
<li>Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Openly+Accessible+Microfluidic+Liquid+Handlers+for+Automated+High-Throughput+Nanoliter+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture.</a> Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).</li>
<li>Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+cell+array+with+individually+addressable+culture+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).</li>
<li>Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+culture+of+droplet-confined+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Dynamic culture of droplet-confined cell arrays.</a> Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).</li>
<li>Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+perfusion+microfluidic+cell+culture+array+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).</li>
<li>King, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microfluidic+real-time+gene+expression+living+cell+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array.</a> Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).</li>
<li>Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile%2C+fully+automated%2C+microfluidic+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system.</a> Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).</li>
<li>Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+-+Putting+electrowetting+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemistry - Putting electrowetting to work.</a> Science. 322, 539-540 (2008).</li>
<li>Gong, J., Kim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-electronic+droplet+generation+on-chip+with+real-time+feedback+control+for+EWOD+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 898-906 (2008).</li>
<li>Choi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+field+effect+transistor-based+biosensors+with+a+digital+microfluidic+device+for+a+lab-on-a-chip+application%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application.</a> Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).</li>
<li>Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for cell-based assays.</a> Lab Chip. 8, 519-526 (2008).</li>
<li>Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modifications+designed+to+improve+peptide+stability%3A+incorporation+of+non-natural+amino+acids%2C+pseudo-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide.</a> 16, 3185-3203 (2010).</li>
<li>Miller, E. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+microfluidic+approach+to+homogeneous+enzyme+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays.</a> Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).</li>
<li>Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics%3A+a+versatile+tool+for+applications+in+chemistry%2C+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology.</a> 12, 2452-2463 (2012).</li>
<li>Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microfluidic+Magnetic+Separation+for+Particle-Based+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays.</a> Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).</li>
<li>Sista, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+immunoassays+using+magnetic+beads+on+a+digital+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform.</a> Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).</li>
<li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochip+functionalization+using+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidics+for+surface+plasmon+resonance+imaging+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).</li>
<li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+digital+microfluidics+for+enhanced+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).</li>
<li>Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidic+method+for+protein+extraction+by+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li>
<li>Nelson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubated+protein+reduction+and+digestion+on+an+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidic+chip+for+MALDI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS.</a> Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).</li>
<li>Mousa, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-scale+estrogen+assays+in+breast+tissue%2C+blood%2C+and+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum.</a> Sci. Transl. Med. 1, 1ra2(2009).</li>
<li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+microfluidic+method+for+dried+blood+spot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A digital microfluidic method for dried blood spot analysis.</a> Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).</li>
<li>Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).</li>
<li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microfluidics+for+Automated+Proteomic+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing.</a> J. Vis. Exp. (33), e1603(2009).</li>
<li>Thaitrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+of+Next+Generation+Sequencing+Library+through+an+Integrative+Digital+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Shin, Y. J., Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+vision+for+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Machine vision for digital microfluidics.</a> Review of Scientific Instruments. 81, (2010).</li>
<li>Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+minimally+disturbed+synchronous+cultures+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells.</a> BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).</li>
<li>Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+adhesion+of+hematopoietic+cells+to+culture+dish+induces+endomitosis+and+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy.</a> Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).</li>
<li>Raje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+nylon+membrane+substrate+for+convenient+and+versatile+high+resolution+microscopic+analysis+of+Escherichia+coli+%26+mammalian+cells+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture.</a> Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).</li>
<li>Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics+with+nonaqueous+solvents+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions.</a> Lab Chip. 6, 199-206 (2006).</li>
<li>Perroud, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-based+cell+sorting+of+Francisella+tularensis+infected+macrophages+using+optical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces.</a> Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Malone, J. H., Oliver, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays%2C+deep+sequencing+and+the+true+measure+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidically-unified+cell+culture%2C+sample+preparation%2C+imaging+and+flow+cytometry+for+measurement+of+cell+signaling+pathways+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution.</a> Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).</li>
<li>Srivastava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+platform+enabling+automated+phosphoprofiling+of+macrophage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response.</a> Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opracowaliśmy prostą i wszechstronną zautomatyzowaną platformę do eksperymentów z hodowlą i stymulacją komórek w mikroskali. Platforma umożliwia nam pracę z małymi objętościami kultur i populacjami komórek (1 - 20 μl i 100 - 2 000 komórek na komorę); Rozmiary kultur można jeszcze bardziej zmniejszyć poprzez zastosowanie mikronaczyń włosowatych o mniejszej średnicy. Praca w tych skalach zmniejsza koszty rutynowych badań i umożliwia badania, które wymagają użycia cennych odczynników i/lub komórek. Eksperymenty prz...

Badanie komórek utrzymywanych w hodowli (analiza in vitro) dostarczyło bezcennych informacji na temat podstawowych zasad i mechanizmów molekularnych rządzących złożonymi systemami biologicznymi i ludzkim zdrowiem. Konwencjonalne metody hodowli, stymulacji i pobierania komórek do analizy, które wykorzystują szalki Petriego i płytki do mikromiareczkowania, zostały zaprojektowane do badania dużych populacji komórek (≥105) w objętościach kultur w skali mililitrów (≥0,1 ml). Istnieje jednak wiele przypadków, w których dostępne są tylko ograniczone ilości komórek (np. komórki pierwotne) lub pożądane są małe populacje komórek (np. w celu zmniejszenia zmienności między komórkami w całej populacji) lub wymagane odczynniki są trudne do uzyskania lub zbyt drogie (np. oczyszczone czynniki wydzielane przez komórki). Problemy te można z powodzeniem rozwiązać, zmniejszając wielkość hodowli, co ma dodatkową zaletę w postaci zmniejszenia zużycia wszystkich odczynników wymaganych do analizy in vitro 1,2. Niestety, konwencjonalny sprzęt i metody nie wspierają precyzyjnej i powtarzalnej manipulacji kulturami w mikroskali, a dostępne obecnie zautomatyzowane systemy oparte na mikrofluidycesą zbyt złożone i wyspecjalizowane, aby można je było rutynowo stosować w większości laboratoriów.
W tym raporcie opisujemy montaż i wykorzystanie prostej i wszechstronnej platformy technologicznej do zautomatyzowanej hodowli, stymulacji i odzyskiwania małych populacji komórek (100 - 2 000 komórek) w mikroskalowych objętościach (1 - 20 μl). Architektura platformy (rysunek 1) ma konstrukcję modułową: zestaw mikrokapilar pokrytych fibronektyną (moduł "komory perfuzyjne komórek") służy jako miejsce zakładania, utrzymywania i stymulacji kultur w mikroskali; oraz cyfrowe urządzenie mikroprzepływowe (DMF)12,13 wyposażone w mikrokapilary "transferowe" (moduł "koncentratora centralnego")14,15 kieruje komórki i odczynniki do i z komór perfuzyjnych. DMF umożliwia użytkownikowi indywidualne adresowanie wielu kropel jednocześnie oraz zmianę lub zmianę kolejności manipulacji (tj. rekonfigurację ciągów przetwarzania próbek) bez zmiany sprzętu urządzenia. Jej ogromna elastyczność jest widoczna w niedawnym pojawieniu się jako kluczowej technologii w szerokim zakresie zastosowań, w tym w hodowlach komórkowych16,17, testach enzymatycznych18,19, testach immunologicznych20,21, analizie DNA22,23, przetwarzaniu białek,24,25 i przetwarzaniu próbek klinicznych. 26,27 Nasz centralny hub wykorzystuje elastyczność właściwą urządzeniom DMF i dodatkowo ją zwiększa poprzez dodanie interfejsów mikrokapilarnych, co daje możliwość przeprowadzenia podzbioru manipulacji (np. hodowli komórek) w wyspecjalizowanych modułach peryferyjnych, a nie na samym urządzeniu DMF. Podział na przedziały ciągów procesowych w ten sposób upraszcza również projektowanie architektury platformy (nie ma potrzeby budowania urządzenia DMF, które może przeprowadzić wszystkie etapy przetwarzania) i ułatwia jej ewolucję w miarę zapotrzebowania na nowe funkcje (w razie potrzeby wystarczy zintegrować nowe moduły peryferyjne). Transport ogniw i odczynników w obrębie węzła centralnego jest napędzany siłami elektrozwilżania generowanymi przez sekwencyjną aktywację elektrod w urządzeniu DMF13,28; Transport do, z i w obrębie komór perfuzyjnych jest napędzany zmianami ciśnienia generowanymi przez precyzyjną pompę strzykawkową. Wszystkie te płynne ruchy są kontrolowane za pomocą prostego interfejsu elektronicznego i zautomatyzowane za pomocą wcześniej określonych skryptów.
Jako reprezentatywny przykład, demonstrujemy użycie platformy do badania odpowiedzi transkrypcyjnych wywoływanych w komórkach odpornościowych po prowokacji z bakteriami (Rysunek 2). Przeprowadzenie tych eksperymentów na platformie umożliwiło nam pracę z niewielką liczbą komórek (~1000 na warunki eksperymentalne), zminimalizowanie zmienności między eksperymentami, oszczędzanie odczynników i przekierowanie pracy ręcznej. Biorąc pod uwagę korzyści, jakie daje, a także jej dostępność i wszechstronność, platforma ta powinna znaleźć zastosowanie w wielu różnych laboratoriach i aplikacjach oraz okazać się szczególnie przydatna w ułatwianiu analizy komórek i bodźców, które są dostępne tylko w ograniczonych ilościach.

<table><tbody><tr><td>Moduł Prelude Direct Lysis NuGEN</td><td></td><td>1400-24</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4% w/v)</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Stripper</td> komórkowy <td>Cellgro</td><td>25-056-C1</td><td></td></tr><tr><td>Ovation PicoSL WTA</td><td>NuGEN</td><td>3310-048</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo BioParticles</td><td>Test qRT-PCR Invitrogen</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>CCL4 TaqMan qRT-PCR</td><td>Test Applied Biosystems</td><td>Mm00443111_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCL5 Test qRT-PCR TaqMan</td><td></td><td>Mm01302428_m1</td><td></td></tr><tr><td>Test QRT-PCR PTGS2 TaqMan Test qRT-PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00478374_m1</td><td></td></tr><tr><td>TNF Test qRT-PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00443258_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Test TaqMan qRT-PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm99999915_g1</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Sigma Chemical</td><td>2594628</td><td></td></tr><tr><td>Fluorinert FC-40</td><td>Sigma Chemical</td><td>51142-49-5</td><td></td></tr><tr><td>Dimer Parylenu C</td><td>Specjalistyczne systemy powlekania</td><td>28804-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-AF</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td></td></tr><tr><td>Taśma poliamidowa</td><td>ULINE</td><td>S-11928</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża szklane powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO) Delta </td><td>Technologies</td><td>CB-40IN-1107</td><td></td></tr><tr><td>Piasta DMF Mikrokapilary z topionej krzemionki pokryte teflonem</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSU100375</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapilary komory perfuzyjnej</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP530700</td><td></td></tr><tr><td>Rurki i złączki mikrokapilarne</td><td>Sandia National Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka poliwęglanowa</td><td>Paradigm Optics</td><td>CTPC100-500-5</td><td></td></tr><tr><td>8-portowa precyzyjna pompa strzykawkowa wyposażona w 30 mm (500 &#956; l pojemność) strzykawki</td><td>Hamilton Company</td><td>54848-01</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do osadzania z fazy gazowej Parylene-C</td><td>Specjalistyczne systemy powlekania</td><td>PDS 2010 Labcoter 2</td><td></td></tr><tr><td>Wysokonapięciowy generator funkcyjny</td><td>Trek</td><td>615A-1 615-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop MVX10</td><td>Olympus</td><td></td><td>Opcjonalnie (ułatwia śledzenie kropel na piaście DMF)</td></tr> <tr><td>Cyfrowa kamera CCD QIClick</td><td>QImaging</td><td>QIClick-F-CLR-12</td><td>Opcjonalnie (ułatwia śledzenie kropel na piaście DMF)</td></tr></tbody></table>

wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Badanie komórek w hodowli (analiza in vitro) dostarczyło ważnych informacji na temat złożonych systemów biologicznych. Konwencjonalne metody i sprzęt do analizy in vitro doskonale nadają się do badania dużej liczby komórek (≥105) w objętościach w skali mililitrów (≥0,1 ml). Istnieje jednak wiele przypadków, w których konieczne lub pożądane jest zmniejszenie wielkości hodowli w celu zmniejszenia zużycia komórek będących przedmiotem zainteresowania i/lub odczynników wymaganych do ich hodowli, stymulacji lub przetwarzania. Niestety, konwencjonalne podejścia nie wspierają precyzyjnej i powtarzalnej manipulacji kulturami w mikroskali, a obecnie dostępne zautomatyzowane systemy oparte na mikroprzepływach są zbyt złożone i wyspecjalizowane, aby mogły być rutynowo stosowane przez większość laboratoriów. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy prostą i wszechstronną platformę technologiczną do zautomatyzowanej hodowli, stymulacji i odzyskiwania małych populacji komórek (100 - 2 000 komórek) w mikroskalowych objętościach (1 - 20 μl). Platforma składa się z zestawu mikronaczyń włosowatych pokrytych fibronektyną ("komór perfuzyjnych komórek"), w których zakłada się, utrzymuje i stymuluje hodowle w mikroskali; cyfrowe urządzenie mikroprzepływowe (DMF) wyposażone w mikrokapilary "transferowe" ("koncentrator centralny"), które kierują komórki i odczynniki do i z komór perfuzyjnych; precyzyjną pompę strzykawkową, która napędza transport materiałów między komorami perfuzyjnymi a piastą centralną; oraz interfejs elektroniczny, który zapewnia kontrolę nad transportem materiałów, który jest koordynowany i zautomatyzowany za pomocą wcześniej określonych skryptów. Na przykład wykorzystaliśmy platformę, aby ułatwić badanie odpowiedzi transkrypcyjnych wywoływanych w komórkach odpornościowych po prowokacji z bakteriami. Korzystanie z platformy umożliwiło nam zmniejszenie zużycia komórek i odczynników, zminimalizowanie zmienności między eksperymentami i przekierowanie pracy ręcznej. Biorąc pod uwagę korzyści, jakie daje, a także jej dostępność i wszechstronność, nasza platforma powinna znaleźć zastosowanie w wielu różnych laboratoriach i aplikacjach, a także okazać się szczególnie przydatna w ułatwianiu analizy komórek i bodźców, które są dostępne tylko w ograniczonych ilościach.

W ramach demonstracji zautomatyzowanej platformy wykorzystaliśmy ją do przeprowadzenia badania, w którym małe populacje komórek odpornościowych hodowano w kulturach w mikroskali, poddawano działaniu bakterii, a następnie lizowano w celu analizy odpowiedzi prozapalnych poza platformą (Rysunek 2).
Do każdej z sześciu komór perfuzyjnych do hodowli komórek zasiano 104 komórki odpornościowe (mysie makrofagi P388D.1) resuspendowane w 10 μl pożywki wzrostowej. Po okresie a...

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę. Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych. Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie i wykorzystanie półautomatycznej platformy mikrofluidycznej do hodowli i stymulacji niewielkich populacji komórek oraz odzyskiwania lizatów komórkowych do analiz molekularnych. Jest to realizowane poprzez wstępne ustanowienie mikroskalowych kultur komórkowych w mikrokapilarach pokrytych fibronektyną, nazywanych komorami perfuzyjnymi komórek. Drugim krokiem jest połączenie komór perfuzyjnych z modułem cyfrowej mikrofluidyki (DMF), który zapewnia elastyczny sposób transportu odczynników do mikroskalowych kultur komórkowych i z powrotem.Następnie moduł DMF dostarcza wybrany bodziec do komór perfuzyjnych, a komórki są inkubowane z bodźcem przez określony czas ekspozycji. Na koniec komórki są lizowane chemicznie, a lizaty są odzyskiwane do modułu DMF w celu analizy molekularnej. Odzyskane lizaty są następnie analizowane za pomocą ilościowego R-T-P-C-R, aby scharakteryzować odpowiedź transkrypcyjną populacji komórek na podany bodziec.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi metodami hodowli komórkowych jest możliwość przeprowadzania badań nad stymulacją komórek przy użyciu niewielkich ilości komórek oraz niewielkich ilości odczynników. Nasze badania wykazały, że precyzyjne operowanie komórkami i odczynnikami w skali mikro na tej platformie minimalizuje zmienność między poszczególnymi doświadczeniami. Platforma ta jest również bardzo wszechstronna.Cyfrowy moduł mikroprzepływowy umożliwia kierowanie komórek i odczynników do komór perfuzyjnych i z nich z dużą elastycznością, dzięki czemu eksperymenty można szybko i łatwo dostosować oraz rekonfigurować. Na początek należy przygotować sterylną roztwór 50 µg/mL fibronektyny i użyć wieloportowej pompy strzykawkowej, aby pobrać 30 µL roztworu do każdej mikrokapilary w celu przyspieszenia powlekania wewnętrznych powierzchni mikrokapilar. Inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny, następnie odessać i usunąć roztwór fibronektyny i pozostawić mikrokapilary do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez sześć godzin.Następnie należy połączyć mikrokapilary powlekane włóknem nylonowym lub komory perfuzyjne z rurkami z poliwęglanu, a rurki z pompą strzykawkową za pomocą odpowiednich złączek. Przedstawiony tutaj układ wykorzystuje pompę strzykawkową z wieloma portami, obsługującą sześć komór perfuzyjnych. Za pomocą taśmy należy przymocować korpus każdej komory perfuzyjnej do bloku grzewczego i ustawić temperaturę bloków grzewczych na 37 °C.Następnie zanurz otwarte końce komór perfuzyjnych w zbiorniku zawierającym komórki zawieszone w świeżej pożywce wzrostowej, równomiernie zdyspergowane w stężeniu 1 milion komórek na mililitr. Zaprogramuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła 10 µL zawiesiny komórkowej do każdej komory perfuzyjnej. Następnie wyjmij otwarte końce komór perfuzyjnych z zawiesiny komórkowej i zaprogramuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła odpowiednią ilość powietrza, by przesunąć korki cieczy do sekcji zamocowanych do bloku grzewczego.Pozwól komórkom przywrzeć do wewnętrznych powierzchni komór perfuzyjnych pokrytych fibronektyną, inkubując je w temperaturze 37 °C przez jedną do dwóch godzin. W międzyczasie przenieś otwarte końce komór perfuzyjnych do nowego zbiornika zawierającego świeżą pożywkę wzrostową. Po okresie adhezji zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby odprowadziła korki cieczowe do odpadów, a następnie zassała 10 µL świeżej pożywki do każdej komory perfuzyjnej, a następnie taką ilość powietrza, aby umieścić świeżą pożywkę nad przywrzonymi komórkami.Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37°C, wymieniając medium co dwie godziny, aż do momentu, gdy kultury zostaną odpowiednio zrównoważone i namnożone.Wzór. Płyta dolna modułu DMF z 46 elektrodami z tlenku indu i cyny. Korzystając ze standardowych technik fotolitograficznych, pokryj płytę dolną modułu DMF warstwą 5 µm Lene C metodą chemicznego osadzania z fazy gazowej, a następnie nałóż metodą spin-coatingu warstwę 50 nm Teflon af.Następnie pokryj metodą spin-coatingu nieuśmieciowaną podstawkę szklaną z tlenkiem indu i cyny warstwą Teflonu AF o grubości 50 nanometrów, która będzie służyć jako płyta górna. Użyj metalowych ramek kompresyjnych, aby zamocować płyty w polimerowej odlewce z wgłębieniami utrzymującymi odstęp 400 mikronów między płytami. Odstęp ten, w połączeniu z rozmiarem elektrody aktywującej wynoszącym 2,5 milimetrów kwadratowych, definiuje objętość kropli jako 2,5 mikrolitrów na elektrodę.Następnie należy wprowadzić teflonowe mikrokapilary transferowe w przestrzeń między płytkami DMF. Każdą z nich należy ustawić tak, aby sięgała od krawędzi odpowiadającej jej elektrody sterującej do przeciwległego końca każdego transferu. Do mikrokapilary należy przymocować złączkę typu capite.Następnie podłącz złącza elektryczne, aby dostarczyć napięcie do elektrod z tlenku indu 10. Sekwencje aktywacji elektrod są zautomatyzowane dzięki zastosowaniu sterowanego komputerowo interfejsu elektronicznego, który uruchamia określone skrypty. Następnie napełnij wbudowane zbiorniki modułów DMF odpowiednimi odczynnikami do stymulacji komórek, przemywania i lizy.W niektórych przypadkach najlepiej jest załadować sam bodziec na późniejszym etapie, tuż przed jego użyciem, pobierając go z załadowanych rezerwuarów pokładowych, a następnie dozować mikrokrople na moduł DMF. Następnie należy przetestować aktywację mikrokropli, w tym ich transport pomiędzy modułem DMF a mikrokapilarami transferowymi Blais. W pierwszej kolejności przygotować bodziec w świeżym medium z 0,1% onic F1 27 przy końcowym stężeniu 100 µg/mL.Następnie wprowadź od 80 do 100 µL bodźca do wyznaczonego wbudowanego zbiornika. Następnie wyjmij otwarte końce komór perfuzyjnych ze zbiornika z medium i włóż je do złączy kapite znajdujących się na końcach mikrokapilar transferowych, a następnie zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby przesunęła korki cieczy wewnątrz komór perfuzyjnych do pojemnika na odpady. Następnie zaprogramuj moduł DMF tak, aby generował 10 µL kropli bodźca i dostarczał je do komór perfuzyjnych za pomocą mikrokapilar transferowych.W razie potrzeby inkubować komórki ze stymulantem w temperaturze 37 °C przez jedną do czterech godzin. Po okresie stymulacji wymieniać stymulant na świeży w regularnych odstępach czasu. Zaprogramować pompę strzykawkową tak, aby skierowała stymulant do pojemnika na odpady, a moduł DMF tak, aby dostarczył 10 µL kropli buforu płuczącego do każdej komory perfuzyjnej.Inkubuj komórki w buforze płuczącym przez pięć minut. Następnie wymień bufor płuczący na 10 µL roztworu lizującego i inkubuj przez kolejne pięć minut. Następnie zaprogramuj pompę strzykawkową, aby przesłać każdy lizat komórkowy do modułu DMF.Zdejmij górną płytkę modułu DMF, uważając, aby nie przechylić jej na bok, ponieważ może to doprowadzić do kontaminacji krzyżowej między kropelkami. Następnie, za pomocą pipety, pobierz lizaty z otwartego modułu DMF do analiz poza platformą, takich jak analiza ekspresji genów za pomocą ilościowej R-T-P-C-R, aby przygotować platformę do kolejnego eksperymentu. Najpierw zanurz mikrokapilary transferowe, złączki CAPITE oraz płytki modułu DMF w 10% roztworze wybielacza na 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie płytki modułu DMF przepłucz izopropanolem, a potem wodą dejonizowaną i wysusz za pomocą azotu, po czym wypal w temperaturze 160 °C przez 10 minut.Metody wysiewania opisane w niniejszym protokole pozwoliły na adhezję około 500 makrofagów miren na komorę perfuzyjną. Po inkubacji komórek w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, wielkość populacji wzrosła dwukrotnie do około 1000 komórek na komorę perfuzyjną. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z ilościowej analizy R-T-P-C-R czterech genów, o których wiadomo, że odgrywają one istotną rolę w wrodzonych odpowiedziach immunologicznych na bakterie.Makrofagi hodowano w kulturach konwencjonalnych lub mikroskalowych, a następnie stymulowano biocząsteczkami e coli przez jedną lub cztery godziny. Niebieskie słupki wskazują średni wzrost ekspresji genów po stymulacji komórek hodowanych konwencjonalnie, natomiast czerwone słupki wskazują indukowaną ekspresję w komórkach hodowanych i stymulowanych. W przypadku kultur mikroskalowych słupki błędów oznaczają odchylenia standardowe pomiędzy powtórzeniami biologicznymi z trzech niezależnych eksperymentów.Wyniki profilowania ekspresji genów były bardzo podobne, mimo że w hodowlach konwencjonalnych zastosowano płytki 96-dołkowe z około 50 000 komórek na dołek, podczas gdy w hodowlach w mikroskali zastosowano mikrokapilary z około 1000 komórek na komorę perfuzyjną. Zmienność między eksperymentami była co najmniej porównywalna, a często mniejsza w hodowlach w mikroskali, co wskazują krótsze słupki błędów. Praca w mikroskali pozwoliła na pięciokrotne zmniejszenie zużycia komórek oraz od trzech do pięćdziesięciokrotne zmniejszenie zużycia odczynników w stosunku do eksperymentów konwencjonalnych.Metodę tę można wykorzystać do hodowli praktycznie każdego rodzaju komórek adherentnych, w niektórych przypadkach stosując inny komponent macierzy zewnątrzkomórkowej lub pożywkę wzrostową. Hodowla komórek nieadherentnych może być trudna, jednak strategie kotwiczenia komórek okazały się skuteczne w podobnych kontekstach. Opisane tutaj podejście umożliwia hodowlę w skali mikro przez okres do 24 godzin.Platforma obejmuje również wszystkie funkcje niezbędne do prowadzenia hodowli długoterminowych, jednak wymagany jest opracowanie protokołu pasażowania komórek. Dodatkowe moduły mogą zostać zintegrowane z cyfrową kostką mikrofluidyczną poprzez mikrokapilarne połączenia. W ten sposób DMF służy jako centralny węzeł łączący moduły peryferyjne w celu realizacji złożonych schematów operacyjnych.Skupiliśmy się przede wszystkim na charakterystyce transkrypcyjnych odpowiedzi gospodarza na czynniki zakaźne, jednak platforma ta została zaprojektowana w sposób niezwykle wszechstronny, dzięki czemu powinna ona wspierać szeroką gamę zastosowań badawczych.

a-versatile-automated-platform-for-micro-scale-cell-stimulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wszechstronna zautomatyzowana platforma do eksperymentów stymulacji komórkowej w skali mikro

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Ten film demonstruje użycie mikroprzepływowego chipa pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową do różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych lub NPC za pomocą stymulacji elektrycznej. Po wysianiu i przyleganiu do pokrytego obszaru NPC rosną, a zastosowanie prądu stałego wyzwala ich różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych wywołane stymulacją elektryczną

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Nowa platforma statyczna służy do charakteryzowania struktury białek i miejsc interakcji w natywnym środowisku komórkowym, wykorzystując technikę śladu białkowego zwaną szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

Poznaj zautomatyzowaną platformę mikrofluidyczną do hodowli i stymulacji małych populacji komórek z odzyskiwaniem lizatów do analiz molekularnych. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę warunków kultury.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Przeglądaj więcej filmów