Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie i wykorzystanie półautomatycznej platformy opartej na mikroprzepływach do hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwania lizatów komórkowych do analiz molekularnych. Osiąga się to poprzez pierwsze ustanowienie hodowli komórkowych w mikrokapilarach pokrytych fibronektyną, zwanych komorami perfuzyjnymi komórek. Drugim krokiem jest podłączenie komór perfuzyjnych do cyfrowego modułu mikrofluidycznego lub DMF, który zapewnia elastyczny sposób kierowania odczynników do i z hodowli komórkowych w mikroskali.

Następnie moduł DMF dostarcza interesujący go bodziec do komór perfuzyjnych, a komórki są inkubowane z bodźcem przez określony czas ekspozycji. Na koniec komórki są poddawane lizie za pomocą środków chemicznych, a lizaty są odzyskiwane do modułu DMF w celu analizy molekularnej. Odzyskane lizaty są następnie analizowane przy użyciu ilościowego R-T-P-C-R w celu scharakteryzowania odpowiedzi transkrypcyjnej populacji komórek na bodziec.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi metodami hodowli komórek jest to, że dzięki tej technice można przeprowadzać badania stymulacji komórek przy użyciu niewielkich ilości komórek, a także używać niewielkich ilości odczynników. Nasze badania wykazały, że precyzyjne obchodzenie się z komórkami i odczynnikiem w mikroskali minimalizuje zmienność między eksperymentami. Platforma jest również bardzo wszechstronna.

Cyfrowy moduł mikroprzepływu może kierować komórki i odczynniki do i z komór perfuzyjnych z dużą elastycznością, dzięki czemu eksperymenty można szybko i łatwo dostosować i ponownie konfigurować. Na początek przygotuj sterylny roztwór 50 mikrogramów na mililitr fibronektyny i użyj wieloportowej pompy strzykawkowej, aby pobrać 30 mikrolitrów roztworu do każdej mikrokapilary, aby przyspieszyć powlekanie wewnętrznych powierzchni mikrokapilary. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, następnie pobrać i wyrzucić roztwór fibronektyny i pozostawić mikronaczynia włosowate do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez sześć godzin.

Następnie podłącz mikrokapilary lub komory perfuzyjne pokryte włóknem nin do rurki poliwęglanowej i rurkę do pompy strzykawkowej za pomocą złączek kapitowych. Pokazana tutaj konfiguracja wykorzystuje pompę strzykawkową z portem pomocniczym obsługującą sześć komór perfuzyjnych. Za pomocą taśmy przymocuj korpus każdej komory perfuzyjnej do bloku grzewczego i ustaw temperaturę bloków grzewczych na 37 stopni Celsjusza.

Następnie zanurz otwarte końce komór perfuzyjnych w zbiorniku zawierającym komórki, zawieszone w świeżym wzroście, pożywce równomiernie rozproszonej w stężeniu 1 miliona komórek na mililitr. Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej komory perfuzyjnej. Następnie usuń otwarte końce komór perfuzyjnych z zawiesiny ogniw i poinstruuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła wystarczającą ilość powietrza, aby przesunąć korki cieczy do sekcji przymocowanych do bloku grzewczego.

Pozwól komórkom przylegać do pokrytych fibronektyną wewnętrznych powierzchni komór perfuzyjnych, inkubując je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. W międzyczasie przenieś otwarte końce komór perfuzyjnych do nowego zbiornika zawierającego świeżą pożywkę wzrostową. Po okresie adhezji poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała korki do płynu do odpadów, a następnie wciągnij 10 mikrolitrów świeżej pożywki do każdej komory obfitości, a następnie dodaj tyle powietrza, aby umieścić świeżą pożywkę nad przylegającymi komórkami.

Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wymieniając pożywkę co dwie godziny, aż kultury zostaną wystarczająco zrównoważone i rozszerzone. Deseń. Dolna płyta modułu DKZ z 46 elektrodami z tlenku indu i cyny. Korzystając ze standardowych technik fotolitograficznych, pokryj dolną płytę modułu DMF pięcioma mikronami Lene C poprzez chemiczne osadzanie z fazy gazowej, a następnie pokryj przędzą 50 nanometrów teflonu af.

Następnie należy wykonać warstwę wirową i niewzorzyste podłoże ze szkła indowo-cynowego z 50 nanometrami teflonu AF, które ma być użyte jako górna płyta. Użyj metalowych ram zaciskowych, aby zamocować płytki w odlewie polimerowym z wgłębieniami, które utrzymują odstęp 400 mikronów między płytami. Ten odstęp w połączeniu z rozmiarem elektrody uruchamiającej wynoszącym 2,5 milimetra kwadratowego określa objętość kropli jako 2,5 mikrolitra na elektrodę.

Następnie włóż pokryte teflonem mikrokapilary transferowe w przestrzeń między płytami DKZ. Ustawienie każdego z nich w taki sposób, aby rozciągał się do krawędzi pokrewnej elektrody uruchamiającej do przeciwległego końca każdego transferu. Mikrokapila mocuje złączkę capite.

Następnie podłącz złącza elektryczne, aby dostarczyć napięcie do elektrod tlenku indu 10. Sekwencje aktywacji elektrod są zautomatyzowane za pomocą sterowanego komputerowo interfejsu elektronicznego, na którym działają wcześniej określone skrypty. Następnie napełnij moduły DMF w zbiornikach pokładowych odpowiednimi odczynnikami do stymulacji komórek, płukania i lizy.

W niektórych przypadkach najlepiej jest załadować sam bodziec w późniejszym kroku tuż przed jego użyciem, czerpiąc z załadowanych zbiorników pokładowych, dozować mikrokropelki na moduł DKZ. Test, uruchamianie mikrokropel, w tym ich transport między modułem DMF a mikrokapilarnami transferowymi. Błażej. Najpierw przygotuj bodziec w świeżej pożywce z 0,1% onowym F1 27 w końcowym stężeniu 100 mikrogramów na mililitr.

Następnie załaduj od 80 do 100 mikrolitrów bodźca do wyznaczonego zbiornika pokładowego. Następnie wyjmij otwarte końce komór perfuzyjnych ze zbiornika pożywki i włóż je do złączek capite przymocowanych do końców mikrokapilar transferowych, a następnie poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała korki cieczy z komór perfuzyjnych do pojemnika na odpady. Następnie poinstruuj moduł DMF, aby wygenerował 10 mikrolitrowych kropelek bodźca i dostarczył je do komór perfuzyjnych przez mikrokapilary transferowe.

W razie potrzeby inkubować komórki z bodźcem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do czterech godzin. Wymieniaj na świeży bodziec w regularnych odstępach czasu po okresie stymulacji. Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała bodziec do pojemnika na odpady i poinstruuj moduł DMF, aby dostarczył 10 mikrolitrów kropli buforu płuczącego do każdej komory perfuzyjnej.

Inkubować komórki z buforem do przemywania przez pięć minut. Następnie wymień bufor do płukania na 10 mikrolitrów roztworu do lizy i inkubuj przez dodatkowe pięć minut. Następnie poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała każdy lizat komórkowy do modułu DMF.

Zdejmij górną płytę modułu DKZ, uważając, aby nie przechylić płyty na boki, ponieważ może to spowodować zanieczyszczenie krzyżowe między kropelkami. Na koniec należy pobrać lizaty z otwartego modułu DMF za pomocą pipety do analizy poza platformą, takiej jak ekspresja genów, profilowanie za pomocą ilościowego R-T-P-C-R, aby przygotować platformę do następnego eksperymentu. Najpierw zanurz mikrokapilary transferowe, złączki CAPITE i płytki modułów DMF w 10% wybielaczu na 10% w temperaturze pokojowej, płyty modułu DMF przepłukuje się izopropanolem, a następnie wodą dejonizowaną i suszy przy użyciu gazowego azotu, a następnie piecze w temperaturze 160 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Metody wysiewu opisane w tym protokole skutkowały przyleganiem około 500 makrofagów mirenów na komorę perfuzyjną. Po inkubacji komórek z pożywką wzrostową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin, wielkość populacji podwoiła się do około 1000 komórek na komorę perfuzyjną. Poniżej przedstawiono wyniki ilościowej analizy R-T-P-C-R czterech genów, o których wiadomo, że odgrywają ważną rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na bakterie.

Makrofagi hodowano w kulturach konwencjonalnych lub w mikroskali i stymulowano cząstkami bio E. coli przez jedną lub cztery godziny. Niebieskie słupki wskazują średni wzrost ekspresji genów po stymulacji komórek hodowanych konwencjonalnie, podczas gdy czerwone słupki wskazują ekspresję indukowaną w komórkach hodowanych i stymulowanych. W hodowlach w mikroskali słupki błędów wskazują odchylenia standardowe między kontrpróbami biologicznymi z trzech niezależnych eksperymentów.

Wyniki profilowania ekspresji genów były bardzo podobne, mimo że konwencjonalne hodowle wykorzystywały 96-dołkowe płytki z około 50 000 komórek na dołek, podczas gdy hodowle mikroskalowe wykorzystywały mikrokapilary z około 1000 komórek na komorę perfuzyjną w eksperymencie, aby eksperymentować zmienność była co najmniej porównywalna i często zmniejszana w kulturach mikroskalowych, na co wskazują krótsze słupki błędów działające w mikroskali. Pięciokrotne zmniejszenie zużycia ogniw i zmniejszenie zużycia odczynników od trzech do 50 razy. W stosunku do konwencjonalnych eksperymentów.

Metoda ta może być stosowana do hodowli praktycznie każdego typu komórek przylegających, w niektórych przypadkach przy użyciu innego składnika lub wzrostu macierzy zewnątrzkomórkowej. Średnie typy komórek, które nie przylegają do zaleceń lekarskich, mogą być trudne, ale strategie wiązania komórek okazały się skuteczne w podobnych kontekstach. Opisane tutaj podejście obsługuje hodowlę w mikroskali przez okres do 24 godzin.

Platforma zawiera wszystkie funkcje umożliwiające przeprowadzenie długoterminowej hodowli, ale konieczne jest opracowanie protokołu przekazywania komórek. Dodatkowe moduły mogą być zintegrowane z cyfrowym modułem mikroprzepływowym za pomocą mikrokonektorów kapilarnych. W ten sposób DKZ służy jako centralny węzeł do łączenia modułów peryferyjnych w celu realizacji złożonych przepływów pracy.

Skupiliśmy się przede wszystkim na scharakteryzowaniu odpowiedzi transkrypcyjnych gospodarza na czynniki zakaźne, ale platforma została zaprojektowana tak, aby była niezwykle wszechstronna, a więc powinna obsługiwać szeroką gamę zastosowań badawczych.