Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej
24 października 2019
Przedstawiono protokół do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkanek za pomocą metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego, przeznaczonej do rentgenowskiej tomografii komputerowej.
Nasz nowy protokół pozwala nam na wizualizację struktur komórkowych w 3D za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej. Robimy to poprzez barwienie tkanek eozyną i w ten sposób uwidacznia się cytoplazma. Oprócz zastosowań i badań medycznych, uważamy również, że nasza metoda może być stosowana w biologii, takiej jak na przykład badania zoologiczne lub biologia rozwojowa.
Technika jest stosunkowo prosta, bardzo szybka i nadaje się również do większych próbek tkanek. Uważamy, że nasze podejście w połączeniu z rentgenowską mikrotomografią komputerową można zintegrować z przepływem pracy klinicznej, a następnie faktycznie pomóc patologom w podejmowaniu lepszych decyzji. Zacznij od utrwalenia próbek tkanek miękkich.
Napełnij 50-mililitrową probówkę wirówkową roztworem utrwalającym zawierającym 9,5 mililitra 4% formaldehydu i 0,5 mililitra lodowatego kwasu octowego. Dodaj próbkę tkanek miękkich do probówki wirówkowej i wstaw do lodówki na 24 do 72 godzin. Po schłodzeniu przemyć próbkę tkanek miękkich roztworem DPBS przez jedną godzinę.
Następnie wybarwić próbkę, umieszczając ją w dwóch mililitrach roztworu barwiącego Eozyna Y i inkubować na poziomej płytce wstrząsającej przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie wyjmij próbkę tkanek miękkich z pojemnika na próbkę i usuń nadmiar środka barwiącego bibułą celulozową. Umieść go w stożkowym pojemniku nad fazą parową etanolu do przechowywania i dalszego wykorzystania.
Przygotuj odpowiedni uchwyt na próbkę do zamontowania próbki tkanek miękkich zgodnie ze wskazówkami rękopisu i upewnij się, że jest ściśle dopasowany, aby zapobiec przesuwaniu się próbki podczas pomiarów rentgenowskich TK. Gdy klej stwardnieje, a uchwyt na próbkę będzie gotowy do użycia, przenieś nerkę myszy do nienaruszonej probówki wirówkowej, która zawiera kilka kropli 70% etanolu na dnie. Umieść zamontowaną próbkę w tomografie rentgenowskim.
Po dokładnym wyrównaniu próbki wybierz parametry akwizycji, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. W przypadku prezentowanych danych z mikrotomografii komputerowej należy wykonać skan przy napięciu szczytowym 50 kilowoltów i prądzie o mocy 3,5 wata, korzystając z 1601 projekcji równomiernie rozłożonych w zakresie 360 stopni. Następnie użyj danych mikro CT ze skanu przeglądowego, aby wybrać obszar zainteresowania dla skanu CT o wysokiej rozdzielczości.
Przygotuj interesujące objętości próbki tkanek miękkich, tnąc ją na bardzo małe kawałki o długości krawędzi około 0,5 milimetra za pomocą skalpela i mikroskopu stereoskopowego. Jeśli używasz nerki myszy, pokrój ją na dwie połówki wzdłuż najdłuższej osi. Weź połowę i przygotuj różne obszary anatomiczne, takie jak kora nerkowa i rdzeń nerki.
Przenieś małe kawałki na nową szalkę Petriego w celu odwodnienia. Odwodnić próbki za pomocą szeregu roztworów etanolu zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie, wykonując każdy etap odwadniania przez jedną godzinę. Przenieś odwodnione próbki do mikroporowatej kapsułki i zamknij ją.
Próbki należy zawsze utrzymywać w kontakcie ze 100% etanolem. Następnie w krytycznym punkcie wysuszyć małe kawałki tkanki. Po przygotowaniu próbek tkanek należy je przechowywać na nowej szalce Petriego przechowywanej w eksykatorze przed dalszym użyciem.
Zamontuj kawałki tkanki w odpowiednim uchwycie na próbkę, zapewniając ścisłe dopasowanie. W przypadku nerki myszy przyklej kawałki do uchwytu na próbkę za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Po dokładnym wyrównaniu próbki należy wybrać parametry akwizycji, aby uzyskać najlepszą jakość obrazowania.
Dla prezentowanych danych nano-CT uzyskaj projekcje przy szczytowym napięciu 60 kilowoltów z 1599 projekcjami równomiernie rozłożonymi w 360 stopniach i rozmiarem woksela około 400 nanometrów. Protokół ten został wykorzystany do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkankowych nerki myszy. Pomiary mikrotomografii komputerowej o niskiej rozdzielczości pozwoliły na przegląd całego narządu i pomogły zidentyfikować objętości zainteresowania dla pomiarów o wysokiej rozdzielczości.
Ta sama nerka myszy została wykorzystana do uzyskania danych z mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości. Uzyskuje się bardziej szczegółowy widok struktur anatomicznych, takich jak między innymi kora, rdzeń zewnętrzny i rdzeń wewnętrzny. Interesujący obraz przedstawia obszar rdzenia i wirtualny przekrój przez naczynie.
Nano-CT wykorzystano do uzyskania szczegółowego obrazu próbki nerki na poziomie komórkowym. Mały fragment tkanki uzyskany z całej nerki myszy został wykorzystany do zobrazowania grubych wznoszących się kończyn pętli Henlego o rozmiarze woksela około 400 nanometrów. Przeprowadzono badanie porównawcze, aby upewnić się, że nano-CT jest w pełni kompatybilny z histopatologią.
Podejście oparte na obrazowaniu multimodalnym potwierdziło wyniki uzyskane obiema metodami. Na etapie inkubacji ważne jest, aby próbka była całkowicie otoczona roztworem barwiącym. Również podczas wykonywania obrazowania rentgenowskiego TK najważniejszym faktem jest zapewnienie stabilności próbki podczas pozyskiwania danych.
Próbki tkanek miękkich, które zostały przeanalizowane za pomocą naszego protokołu, mogą być dalej analizowane przy użyciu standardowych technik histologicznych, takich jak barwienie przeciwstawne hematoksyliny. Nasz protokół barwienia znacząco przyczyni się do postępu w histologii rentgenowskiej 3D. Badania medyczne szczególnie skorzystają z tej nieniszczącej techniki obrazowania 3D.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do 3D wizualizacji struktur komórkowych za pomocą tomografii komputerowej z wykorzystaniem techniki barwienia eosynem. Metoda ta może być stosowana w różnych dziedzinach biologii i ma na celu poprawę przepływu pracy klinicznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Wizualizacja medyczna
Tło
- Tomografia komputerowa z wykorzystaniem promieni X umożliwia szczegółowe obrazowanie struktur tkankowych.
- Barwienie eosynem poprawia widoczność składników komórkowych.
- Technika ta jest odpowiednia dla większych próbek tkankowych.
- Potencjalne zastosowania obejmują zoologię i biologię rozwojową.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do 3D wizualizacji struktur tkankowych.
- Integracja tej metody z procesami klinicznymi dla lepszej patologii.
- Wykazanie zgodności obrazowania rentgenowskiego z histopatologią.
Stosowane metody
- Fiksacja próbek tkanek miękkich w formaldehidzie i kwasie octowym.
- Barwienie roztworem eosyn Y dla widoczności komórkowej.
- Skanowanie mikro CT dla obrazowania o niskiej i wysokiej rozdzielczości.
- Przygotowanie próbek tkankowych do szczegółowego obrazowania na poziomie komórkowym.
Główne wyniki
- Udane wizualizacje struktur nerki myszy w 3D.
- Identyfikacja obszarów o szczególnym zainteresowaniu dla skanów o wysokiej rozdzielczości.
- Zgodność nano-CT z technikami histopatologicznymi potwierdzona.
- Metoda poprawia zrozumienie architektury tkanki i patologii.
Wnioski
- Protokół znacząco rozwija 3D histologię rentgenowską.
- Oferuje nietrwałną technikę obrazowania przydatną w badaniach medycznych.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić dokładność diagnostyczną w patologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution 3D imaging of soft-tissue samples using X-ray-specific staining and nanoscopic computed tomography enables detailed morphological characterization critical for early discovery and translational research. This approach bridges the gap between traditional histology and advanced imaging, supporting more predictive and risk-adjusted decisions in biopharma R&D. The method's compatibility with standard histopathology ensures continuity across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables 3D visualization of cellular and subcellular structures for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by revealing tissue architecture in situ.
- Facilitates hypothesis testing through direct morphological assessment.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream quantitative imaging workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing sample preparation and imaging conditions.
- Enables identification and selection of regions of interest for high-resolution analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns 3D imaging outputs with histopathological standards for translational continuity.
- Provides nondestructive assessment of tissue morphology, supporting biomarker discovery.
- Facilitates risk-adjusted advancement by confirming structural endpoints in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through preclinical validation, enabling seamless transition between morphological assessment and functional studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven exploration of tissue structure and cellular organization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D data for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides high-resolution volumetric datasets for statistical and morphological evaluation.
- Translational Research: Ensures compatibility with standard histology for biomarker and endpoint alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable imaging capability for diverse tissue types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in tissue-based target validation.
- Operational Value: Streamlines sample preparation and imaging for high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust morphological evidence.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, staining, and advanced imaging instrumentation.
- Demands access to microCT and nanoCT platforms with precise sample alignment capabilities.
- Necessitates standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various soft-tissue types with protocol optimization as needed.
- Sample stability and complete staining coverage are critical for data quality.
