Wykorzystanie tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji trójwymiarowej struktury i funkcji naczyń krwionośnych roślin

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie technologii mikrotomografii rentgenowskiej opartej na synchrotronie do zbadania struktury i funkcji transportu naczyniowego w roślinach. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie próbek do instalacji w uchwycie na uchwyt lub uchwyt na żywe rośliny, upewnienie się, że skanowana część jest jak najbardziej pionowa i wykonanie niezbędnych wstępnych pomiarów fizjologicznych. Drugim krokiem jest umieszczenie przygotowanych próbek lub żywych roślin w klatce A LS Beamline 8.3 0,2 i zabezpieczenie klatki na czas skanowania. Następny.

Po odpowiednim ustawieniu próbki rozpoczyna się skanowanie. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie komputerów stacji roboczych do normalizacji, rekonstrukcji i oceny jakości skanowania przed przekazaniem danych do VISO w celu przeprowadzenia procesu wizualizacji 3D. Ostatecznie mikrotomografia rentgenowska jest wykorzystywana do ujawniania drobnych szczegółów wzajemnych połączeń i stanu funkcjonalnego naczyń krwionośnych przewodzących wodę w roślinach.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak cięcie seryjne i mikroskopia świetlna, jest to, że tkanka roślinna może być badana w dowolnej orientacji z niespotykaną dotąd rozdzielczością. Metoda ta może pomóc nam zrozumieć kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, od fundamentalnych aspektów transportu wody w roślinach, przez suszę i tolerancję na zamarzanie, po to, jak patogeny przemieszczają się systemowo w roślinach żywicielskich. Ten protokół, zgodnie z opisem, jest przeznaczony do pracy przy zaawansowanym źródle światła.

8,3 0,2. Adaptacje linii badawczych mogą być wymagane do pracy w innych obiektach synchrotronowych. Należy postępować zgodnie ze szkoleniem w zakresie bezpieczeństwa i promieniowania wymaganym do korzystania z tych obiektów, aby rozpocząć przygotowywanie próbek dla żywych roślin.

Najpierw hoduj rośliny w doniczkach o średnicy około 10 centymetrów, upewniając się, że główna łodyga lub inna część skanowanej rośliny jest jak najbardziej wyśrodkowana i zorientowana pionowo w doniczce. Fizyczne wymiary instrumentu HRCT Hutch ograniczają żywe rośliny do około jednego metra wysokości. W związku z tym obrazowanie żywych roślin najlepiej wykonywać na siewkach lub sadzonkach.

Uprawiane w małych doniczkach używają specjalnie wykonanego sztywnego aluminiowego uchwytu na doniczki, aby zamontować żywe rośliny doniczkowe. Wysokość górnej płyty należy dostosować, aby dostosować ją do różnych wysokości doniczek. W tym przypadku górna część płyty jest zaprojektowana tak, aby wyrównać się z górną częścią powierzchni gleby, a roślina wystaje ze środka dwuczęściowej płyty.

Po zamontowaniu w uchwycie zmierz potencjał wodny łodygi za pomocą komory ciśnieniowej w stylu lądownika SHO lub parametru liścia z klipsem, aby określić stan fizjologiczny rośliny przed skanowaniem. Skręć mały kawałek drutu miedzianego wokół łodygi, aby służył jako powiernik, aby zapewnić stałą lokalizację skanowania na roślinach, które będą skanowane wielokrotnie. Teraz umieść cienkościenny akrylowy cylinder nad rośliną na aluminiowym uchwycie na roślinę i zabezpiecz go, aby ustabilizować próbkę.

Należy użyć dodatkowej folii, ręczników papierowych i taśmy, aby jeszcze bardziej zminimalizować wibracje i ruch części roślin, które mogą powodować zniekształcenia obrazu. Przymocuj niestandardowy uchwyt garnka do etapu łożyska powietrznego i zablokuj go na miejscu umieszczonym między źródłem promieniowania rentgenowskiego a czujnikiem obrazowania i sprzętem fotograficznym. Pamiętaj, aby ustawić trzpień tak pionowo, jak to możliwe i wyśrodkować próbkę na podstawie uchwytu magnetycznego, aby upewnić się, że pozostaje w polu view Podczas rotacji świeży materiał roślinny, zwykle łodygi lub zwierzęta domowe, można zeskanować po natychmiastowym usunięciu z żywej rośliny.

Jeśli celem eksperymentu jest wizualizacja całej sieci ksylemu, woda w naczyniach musi najpierw zostać opróżniona i zastąpiona powietrzem. W tym celu należy zamontować próbkę w komorze ciśnieniowej typu oszczerstwo i przepychać sprężone powietrze lub azot przez próbkę pod niskim ciśnieniem przez około pięć minut. Gatunki będą się różnić pod względem czasu potrzebnego na ewakuację z sieci statków.

Jeśli celem jest ocena stopnia powstawania zatoru w świeżej tkance roślinnej, należy pobrać próbki z rośliny za pomocą świeżej żyletki, wykonując cięcia pod wodą. Następnie owiń próbkę warstwą paraformu, aby zapobiec wysuszeniu podczas skanowania, zamontuj próbkę w uchwycie wiertarskim przymocowanym do metalowej płytki przykręconej do środka stopnia z łożyskiem powietrznym i ustaw próbkę pionowo, jak opisano wcześniej, aby upewnić się, że próbka pozostaje w polu view. Aby przygotować próbki z wysuszonej tkanki drzewnej, zacznij od przycięcia próbek do około sześciu centymetrów długości.

Wybierz próbki, które są jak najbardziej proste w docelowym obszarze skanowania i mają średnicę około jednego centymetra. Następnym krokiem jest powolne odwadnianie całej próbki, aby zapewnić optymalną wizualizację próbki tkanki i kontrast obrazu. Umieść próbkę tkanki drzewnej w piecu do suszenia w niskiej temperaturze, aby powoli wysuszyć próbkę, nie powodując pękania lub pękania tkanki.

W niektórych sytuacjach może być pożądane dołączenie do próbki znacznika powierniczego. Gwarantuje to, że późniejsza sekcja i wizualizacja z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej może być zorientowana na określone punkty na obrazie HRCT. Aby to zrobić, przymocuj metalowy lub szklany koralik lub drut na zewnątrz łodygi za pomocą perfum.

Na koniec zamontuj próbkę w próbce wiertła i wyśrodkuj zgodnie z powyższym opisem przed skanowaniem. Określ powiększenie, które będzie najlepiej pasować do Twojego zastosowania. Zastosowana tutaj A LS Beamline 8.3 0.2 ma możliwość skanowania obiektywami o powiększeniach dwóch x pięć x i 10 x.

Ustaw energię promieniowania rentgenowskiego na 15 kiloelektronowoltów. Czasy ekspozycji są na ogół zależne od grubości i gęstości próbki i wynoszą od 100 do 1000 milisekund. Wybierz przyrost kątowy, który jest odpowiedni dla Twojej aplikacji.

Próbki są obracane o 180 stopni podczas skanowania, a liczba obrazów wykonanych podczas obrotu może mieć znaczący wpływ na rozmiar zestawu danych, długość interwału skanowania i końcową jakość obrazu. Typowe skany są wykonywane z przyrostem 0,25 stopnia, co daje 513 obrazów na skan. Krótsze interwały skanowania można osiągnąć przy użyciu ustawienia tomografii ciągłej, podczas której próbka obraca się w sposób ciągły, podczas gdy obrazy są rejestrowane dla każdego skanowania, należy również zbierać obrazy jasnego i ciemnego pola.

Obrazy w jasnym polu to obrazy bez próbki w wiązce. Są one często zbierane przed i po zeskanowaniu próbki poprzez poziome przesunięcie próbki. Ciemne pola są zbierane przez zamknięcie migawki rentgenowskiej.

Mierzy ilość sygnału, który kamera pokazuje bez promieniowania rentgenowskiego. Po zakończeniu skanowania przenieś nieprzetworzone obrazy TIFF 2D z komputera akwizycji na serwer plików, a następnie wyeksportuj je do komputera, który zostanie użyty do przetwarzania danych. Następnie obrazy muszą zostać przekonwertowane na procentową skalę transmisji.

Beamline 8.3 0.2 posiada niestandardową wtyczkę normalizacji tła, którą można pobrać i używać z darmowymi pakietami oprogramowania. Obraz J lub Fidżi ładuje znormalizowane obrazy do pakietu oprogramowania ośmiornicy, a następnie rekonstruuje zestaw danych 3D z plików obrazów 2D RAW TIFF przy użyciu wyznaczonych kroków przetwarzania. Następnie stos obrazów można zwizualizować w jednym z różnych pakietów oprogramowania.

W tym przypadku używany jest pakiet oprogramowania aviso, ładuj zestawy danych do pamięci systemowej i wyświetlaj próbkę w wirtualnej orientacji przekroju poprzecznego, podłużnego lub promieniowego Ze względu na atrybuty 3D zestawu danych, wirtualne przekroje przez próbkę można obracać w dowolnej płaszczyźnie, aby wyrównać się z obszarami zainteresowania. Po dokonaniu segmentacji możliwe jest ilościowe określenie docelowych struktur roślin lub zmian funkcjonalnych w objętości, długości, szerokości, obecności lub braku wody, powietrza i tak dalej. Synchrotronowe skany HRCT zostały z powodzeniem wdrożone na szerokiej gamie tkanek i gatunków roślin przy użyciu Beamline 8.3 0.2 i dostarczyły nowych informacji na temat struktury i funkcji ksylemu roślinnego w niespotykanej dotąd rozdzielczości w 3D.

Możliwości wizualizacji i eksploracji zapewniane przez rekonstrukcje 3D, jak widać tutaj, pozwalają na precyzyjne określenie lokalizacji i orientacji struktur z sieciami ksylemu zarówno na próbkach akcyzowych, jak i w żywych roślinach. Tutaj widzimy rekonstrukcję 3D pnia sekwoi poddanej stresowi suszy i wykazującej zarówno wypełnione powietrzem, jak i wodą tratry Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu kilku minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa, mogą być wykorzystane do walidacji struktur, które widzimy wewnątrz roślin i określenia progów wielkości, które są następnie wprowadzane do programów przetwarzających, których używamy do analizy danych.