Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni
16 lipca 2020
Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.
Glejaki o wysokim stopniu złośliwości, taki jak rozlany glejak mostu, są wysoce inwazyjnymi nowotworami o wysokiej śmiertelności. Pomimo wielu lat szeroko zakrojonych badań, bariera krew-mózg jest ważnym aspektem, ponieważ chemioterapia nie jest w stanie skutecznie dotrzeć do mózgu. Na szczęście zogniskowane ultradźwięki są w stanie tymczasowo i miejscowo otworzyć barierę krew-mózg w celu skutecznego leczenia.
Opracowaliśmy mały i ekonomiczny system ultrasonograficzny z neuronawigacją, który umożliwia naruszenie bariery krew-mózg. System ten zbudowany jest z dostępnych na rynku komponentów i dzięki wysokiemu stopniowi automatyzacji pozwala na prowadzenie przedklinicznych badań oceniających leki. Medycyna precyzyjna jest definiowana jako właściwy lek we właściwej dawce dla właściwego pacjenta we właściwym czasie.
Aby to osiągnąć, wiele wstępnie wybranych leków musi zostać poddanych badaniom przesiewowym. Nasz kompaktowy, wysokoprzepustowy, skoncentrowany system ultrasonograficzny do naruszania bariery krew-mózg pozwala nam to zrobić. Procedurę zademonstrują Rianne Haumann i Elvin t Hart, dwoje doktorantów z mojej grupy badawczej.
Przebieg pracy dla stereotaktycznego ultrasonografu skoncentrowanego na neuronawigacji sterowanej obrazem obejmuje obrazowanie interwencyjne i sprzężenie akustyczne dla sonoporacji na platformie ultrasonograficznej. Następnie można wykonać obrazowanie kontrolne. Wybierz odpowiedni przetwornik w oparciu o wymagania projektowanego eksperymentu.
Umieść go w wydrukowanym w 3D stożku wypełnionym odgazowaną wodą i zamkniętym od dołu akustycznie przezroczystą membraną Mylar. Podłącz przetwornik do generatora funkcyjnego i wzmacniacza mocy. Zamontuj przetwornik na zmotoryzowanym stoliku liniowym w celu automatycznego pozycjonowania w pionie i podłącz go do wzmacniacza mocy.
Korzystaj z odłączanej platformy stereotaktycznej, która obejmuje ogrzewanie o regulowanej temperaturze, paski zgryzowe i douszne, znieczulenie i multimodalne markery referencyjne. Przymocuj platformę do stolika liniowego 2D. Zanim system FUS będzie mógł być używany, należy go skalibrować i określić punkt ostrości przetwornika.
Punkt ostrości odpowiada pionowej pozycji zwierzęcia na platformie stereotaktycznej. Zaaklimatyzuj zwierzę w obiekcie przez co najmniej tydzień po przyjeździe i regularnie je waż. W dniu eksperymentu należy podać buprenorfinę we wstrzyknięciu podskórnym na 30 minut przed leczeniem FUS.
Po znieczuleniu myszy nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu. W razie potrzeby usuń włosy z czubka głowy zwierzęcia za pomocą maszynki do golenia i kremu do depilacji. Umyj skórę wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości.
W przypadku eksperymentów z modelami guzów BLI wstrzyknij 150 mikrolitrów D-lucyferyny dootrzewnowo za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 29. W celu podania mikropęcherzyków do otwarcia BBB należy wprowadzić cewnik do żyły ogonowej o rozmiarze od 26 do 30 i przepłukać żyłę niewielką objętością roztworu heparyny. Zabezpiecz cewnik taśmą tkankową, aby zapobiec odklejeniu.
Jeśli cewnikowanie się powiedzie, napełnij cewnik roztworem heparyny, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Umieść zwierzę na platformie stereotaktycznej o regulowanej temperaturze, aby uniknąć hipotermii. Przymocuj głowę zwierzęcia za pomocą pręta do gryzienia i prętów do uszu, a ogon i cewnik przyklej do platformy.
Przymocuj korpus myszy za pomocą paska. Umieść platformę stereotaktyczną z zamontowaną myszką w modalności obrazowania i zrób zdjęcia zwierzęcia. Ustal, czy zwierzę jest prawidłowo umieszczone na platformie.
Oznacz pozycję zwierzęcia za pomocą multimodalnych znaczników odniesienia w połączeniu z potokiem przetwarzania obrazu zgodnie z punktem ostrości przetwornika. Określ obszar docelowy, umieszczając kontur mózgu na uzyskanym obrazie rentgenowskim lub używając obrazów BLI do określenia środka guza. Przed ustawieniem przetwornika należy zabezpieczyć nozdrza i pysk zwierzęcia taśmą, aby żel ultradźwiękowy nie zakłócał oddychania.
Nałóż żel ultradźwiękowy na czubek głowy myszy, aby zapewnić prawidłowe przewodzenie dźwięku. Rejestruj kawitację mikropęcherzyków za pomocą hydrofonu igłowego, który umieszcza się w bezpośrednim sąsiedztwie kości potylicznej. Na podstawie wartości kalibracji poprowadź przetwornik do właściwej pozycji nad zwierzęciem.
Zastosuj wstępnie skonfigurowane ustawienia do wszystkich podłączonych urządzeń, aby celować w obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Po umieszczeniu przetwornika we właściwej pozycji rozpuść i aktywuj mikropęcherzyki zgodnie z opisem producenta. Przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków należy przepłukać cewnik żyły ogonowej solą fizjologiczną, aby potwierdzić dostęp do żyły ogonowej.
Rozpocznij trajektorię insonikacji i jednocześnie wstrzyknij mikropęcherzyki. Jednocześnie hydrofon igłowy będzie wykrywał i weryfikował kawitację mikropęcherzyków w czasie rzeczywistym. W razie potrzeby podać donaczyniowy środek kontrastowy lub lek po sonoporacji.
Monitoruj zwierzę do określonego z góry punktu czasowego. Ciśnienie akustyczne o wskaźniku mechanicznym 0,4 w połączeniu z mikropęcherzykami zapewniło bardzo czuły i niezawodny sposób stabilnego wykrywania kawitacji w porównaniu z brakiem wykrywania subharmonicznych, gdy nie wstrzykiwano mikropęcherzyków lub obserwacją kawitacji bezwładnościowej, gdy zastosowano MI 0,6. Podczas gdy ciśnienie akustyczne przy MI do 0,6 nie powodowało uszkodzeń makroskopowych, mikroskopijne uszkodzenia były udowodnione histologicznie przy MI 0,6.
Amplituda ciśnienia przy MI wynoszącym 0,8 powodowała makroskopowy krwotok mózgowy większych naczyń i rozległą lizę tkanek z wynaczynieniem erytrocytów. Dożylnie wstrzyknięto błękit Evansa w celu potwierdzenia otwarcia bariery krew-mózg w okolicy mostu. Wynaczynienie albuminy sprzężonej z błękitem Evansa zaobserwowano na poziomie mostu i móżdżku u myszy leczonej FUS i mikropęcherzykami, wykazując precyzyjne celowanie w obszar zainteresowania.
Najważniejszymi etapami tego protokołu są prawidłowe umieszczenie cewnika do żyły ogonowej, ułożenie i ukierunkowanie zwierzęcia oraz wstrzyknięcie mikropęcherzyków za pomocą zogniskowanych ultradźwięków z detekcją kawitacji. Ten samodzielnie wykonany zogniskowany system ultrasonograficzny można dostosować i przeprojektować pod kątem wielu pytań badawczych, co jest jednocześnie opłacalne i ma zautomatyzowany przepływ pracy, co czyni go odpowiednim dla stosunkowo niedoświadczonych badaczy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wysokiej wydajności do tymczasowego zakłócenia bariery krew-mózg (BBB) za pomocą modułowego systemu skupionego ultradźwięku (FUS). Dzięki wykorzystaniu sonopeporacji z mikroburzy, ta technika ułatwia efektywne wprowadzanie terapii do warunków, takich jak glejaki, które są utrudnione przez BBB. Metodologia jest zaprojektowana z myślą o dostępności, pozwalając niefachowcom na wdrożenie otwarcia BBB in vivo.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Inżynieria biomedyczna
- Dostarczanie terapii
Tło
- Wysokostopniowe glejaki są wysoce inwazyjnymi nowotworami o ograniczonych opcjach leczenia z powodu BBB.
- Skupiony ultradźwięk stał się obiecującą metodą zakłócenia BBB.
- Istnieje potrzeba tanich urządzeń, które mogą być łatwo obsługiwane przez niefachowców.
- Przedstawiony tu protokół ma na celu wzmocnienie badań przedklinicznych dotyczących oceny leków.
Cel badania
- Opracowanie systemu FUS o wysokiej wydajności do zakłócenia BBB.
- Ułatwienie przesiewania przedselekcjonowanych leków dla zastosowań w medycynie precyzyjnej.
- Wykazanie procedury skutecznie za pomocą zautomatyzowanego systemu.
Stosowane metody
- Do eksperymentów in vivo zastosowano modułowy system skupionego ultradźwięku.
- Modele na myszach zastosowano do badania zakłócenia BBB i wprowadzania środków terapeutycznych.
- Proces obejmuje obrazowanie interwencyjne i sprzężenie akustyczne do sonopeporacji.
- Kluczowe kroki obejmują aklimatyzację zwierząt, podawanie znieczulenia, kateterizację i precyzyjne pozycjonowanie przetwornika ultradźwiękowego.
Główne wyniki
- Procedura niezawodnie wykazała zdolność do zwiększenia wprowadzania leków przez BBB.
- Wykrycie kawitacji mikroburz było niezbędne do monitorowania skuteczności leczenia.
- Wyniki ilościowe potwierdziły precyzyjne zlokalizowanie zakłócenia BBB.
- Skuteczna ocena efektów ogólnoustrojowych po zastosowaniu ultradźwięków wykazała bezpieczeństwo i skuteczność.
Wnioski
- To badanie ustanawia praktyczną i skuteczną metodę zakłócenia BBB, pozwalającą na zwiększone interwencje terapeutyczne.
- Modułowy system FUS zapewnia podstawę do dalszych badań w dziedzinie dostarczania leków i leczenia chorób układu nerwowego.
- Uzyskane wglądy mogą pomóc w zaawansowaniu rozumienia medycyny precyzyjnej i ukierunkowanego leczenia w warunkach neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This high-throughput focused ultrasound system enables precise, reproducible blood-brain barrier opening in rodent models, directly supporting preclinical drug evaluation for CNS therapeutics. By integrating image-guided stereotactic navigation with automated cavitation monitoring, the system reduces variability and enhances data reliability in high-volume screening campaigns. Its cost-effective, modular design facilitates scalable implementation across discovery workflows targeting glioma and other brain diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of blood-brain barrier permeability for target validation in glioma models.
- Operational Value: Supports standardized, automated workflows that reduce intra-group variability and improve reproducibility in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time cavitation detection as a biomarker for successful blood-brain barrier opening.
- Operational Value: Enables high-throughput screening of preselected drug compounds through automated transducer positioning and microbubble delivery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Validated in patient-derived xenograft models of glioblastoma and diffuse midline glioma, ensuring disease-relevant preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by confirming precise, localized drug delivery across the blood-brain barrier.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling image-guided, reproducible blood-brain barrier disruption for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of blood-brain barrier modulation in glioma models through precise, stereotactic targeting.
- Screening: Delivers assay readiness via automated workflows, standardized microbubble injection, and real-time cavitation monitoring for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cavitation signals, Evans blue extravasation, and histological confirmation of barrier opening.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through validation in patient-derived glioma models, supporting biomarker-aligned therapeutic assessment.
- Enterprise Reuse: Built from commercially available components with a modular design, enabling adaptation across multiple research questions and repeated use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in blood-brain barrier penetration data, reducing mechanistic ambiguity in CNS drug delivery.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation and image-guided targeting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative blood-brain barrier opening data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS drug candidates based on confirmed, localized barrier disruption and drug delivery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, ultrasound physics, and microbubble handling.
- Needs instrumentation including function generator, power amplifier, motorized linear stage, needle hydrophone, and imaging modalities (X-ray, bioluminescence).
- Demands cross-team standardization of animal preparation, catheterization, and transducer calibration procedures.
- Involves adaptation considerations for different transducer frequencies, targeting coordinates, and model systems (e.g., rat vs. mouse).
- Practical limitations include the need for surgical skill in tail vein catheterization and potential variability in skull thickness affecting ultrasound transmission.
