Name: Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę otwierania bariery krew-mózg u myszy za pomocą skoncentrowanej ultrasonografii z nawigacją stereotaktyczną. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia skuteczną dostawę leków do mózgu w badaniach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Dziękujemy Ilyi Skachkovowi i Charlesowi Mougenotowi za ich wkład w rozwój systemu.

Wszystkie eksperymenty in vivo zostały zatwierdzone przez holenderską komisję etyczną (licencja numer AVD114002017841) oraz Organ ds. Opieki nad Zwierzętami Vrije Universiteit Amsterdam, Holandia. Badacze zostali przeszkoleni w zakresie podstaw systemu FUS w celu zminimalizowania dyskomfortu zwierząt.
1. Skoncentrowany system ultrasonograficzny
UWAGA: Opisana konfiguracja to zbudowany przez nas system zakłócający BBB, oparty na dostępnych na rynku komponentach i zawiera wydrukowany w 3D stożek wykonany na zamówienie oraz odłączaną platformę stereotaktyczną. System został zaprojektowany modułowo, co ułatwia modyfikacje w zależności od dostępnego wyposażenia i konkretnego zastosowania. Protokół opisuje procedurę sonoporacji większego obszaru w okolicy mostu mózgu myszy. Dostosowując lokalizację docelową, można celować w różne części mózgu. W pracy wykorzystano przetwornik monoelementowy 1 MHz o ogniskowej 75 mm, aperturze 60 mm i ogniskowej 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM ciśnienia szczytowego). Płaszczyzna ogniskowa przetwornika jest umieszczona przez czaszkę zwierzęcia w płaszczyźnie poziomej przecinającej się z listwami usznymi.
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni przetwornik do otwarcia BBB u gryzoni. 
	UWAGA: W oparciu o właściwości mikropęcherzyków i zastosowaną częstotliwość, ustawienia akustyczne, w szczególności indeks mechaniczny (MI), mogą ulec zmianie13,38.</li>
	<li>Umieść przetwornik w stożku wydrukowanym w 3D.</li>
	<li>Zastosuj akustycznie przezroczystą membranę mylarową na dolnym końcu stożka, aby uzyskać akustyczne sprzężenie ścieżki rozchodzenia się wiązki i napełnij stożek odgazowaną wodą.</li>
	<li>Zamontuj przetwornik nad zwierzęciem na zmotoryzowanym stoliku liniowym, jak pokazano na Rysunek 1, umożliwiając automatyczne ustawienie przetwornika w pionie.</li>
	<li>Zaprojektuj odłączaną platformę stereotaktyczną w oparciu o wymagania badania, która obejmuje ogrzewanie z regulacją temperatury, paski zgryzowe i douszne, znieczulenie i multimodalne markery referencyjne, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Mocowanie platformy stereotaktycznej składa się z liniowego systemu stolików 2D, który umożliwia precyzyjne automatyczne pozycjonowanie (< 0,1 mm) zwierzęcia pod belką.</li>
	<li>Podłącz przetwornik do łańcucha emisji akustycznej pokazanego na Rysunek 1 składającego się z przetwornika, generatora funkcyjnego i wzmacniacza mocy.</li>
	<li>Opracuj potok przetwarzania obrazu w celu wykrycia multimodalnych markerów fiducialnych, które umożliwiają precyzyjne ukierunkowanie sonoporacji na obszar zainteresowania mózgu i zbieranie danych kawitacji wykrytych przez hydrofon igłowy.</li>
	<li>Skalibruj system i określ punkt ostrości przetwornika zgodnie z pionowym ustawieniem zwierzęcia na platformie stereotaktycznej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
UWAGA: Następujący protokół jest określony dla myszy, ale może być dostosowany do szczurów. Do tych eksperymentów wykorzystano samice nagich myszy Foxn1-/- (w wieku 6-8 tygodni).
<ol>
	<li>Pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się przez co najmniej tydzień w obiekcie dla zwierząt i regularnie waż zwierzę.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,05 mg/kg) należy podać we wstrzyknięciu podskórnym (podskórnie) 30 minut przed leczeniem FUS w celu rozpoczęcia leczenia przeciwbólowego.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę 3% izofluranem, 2 l/minO2 i sprawdzić, czy zwierzę jest głęboko znieczulone. Utrzymuj zwierzęta w znieczuleniu podczas całego zabiegu i monitoruj częstotliwość oddechów i tętno, aby dostosować stężenie izofluranu zgodnie z wymaganiami.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu i uniknąć możliwych obrażeń.</li>
	<li>Usuń włosy na czubku głowy za pomocą maszynki do golenia i kremu do depilacji, a następnie umyj je wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości i uniknąć podrażnienia skóry.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z modelami guzów BLI wstrzyknij 150 μl D-lucyferyny (30 mg / ml) dootrzewnowo (i.p.) za pomocą strzykawki insulinowej 29 G w celu kontroli obrazu BLI.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej o sile 26-30 G i przepłukać cewnik i żyłę niewielką objętością roztworu heparyny (5 UI/ml). Napełnij cewnik roztworem heparyny, aby uniknąć krzepnięcia krwi. 
	UWAGA: Dobre cewnikowanie obserwuje się, gdy do cewnika dochodzi do refluksu krwi. Unikaj pęcherzyków powietrza w cewniku, aby zapobiec zatorowi. Aby uniknąć nadmiernego ciśnienia we wstrzyknięciu, należy upewnić się, że długość cewnika jest jak najkrótsza.</li>
	<li>Umieść zwierzę na platformie stereotaktycznej o regulowanej temperaturze, aby uniknąć hipotermii. 
	UWAGA: Hipotermia zmniejsza krążenie krwi, co może wpływać na wstrzykiwanie/krążenie mikropęcherzyków i farmakokinetykę leków39.</li>
	<li>Unieruchom i zamocuj głowę zwierzęcia na platformie stereotaktycznej za pomocą nauszników i drążka do gryzienia. Przymocuj ciało paskiem i przyklej ogon zwierzęcia do platformy.</li>
</ol>
3. Skoncentrowane ultradźwięki in vivo sterowane obrazem
UWAGA: Dla tego protokołu użyto monoelementowego przetwornika 1 MHz z impulsem tonalnym o czasie trwania 10 ms, MI 0,4 i częstotliwością powtarzania impulsów 1,6 Hz z 40 cyklami przez 240 s. Protokół jest zoptymalizowany dla mikropęcherzyków stabilizowanych fosfolipidami zawierającymi sześciofluorek siarki (SF6) jako nieszkodliwy gaz, przy czym średnia średnica pęcherzyków wynosi 2,5 μm, a ponad 90% pęcherzyków jest mniejszych niż 8 μm.
<ol>
	<li>Umieść platformę stereotaktyczną z zamontowanym zwierzęciem w trybie obrazowania (np. BLI lub rentgenowskim) i wykonaj zdjęcie (zdjęcia) zwierzęcia.</li>
	<li>Użyj multimodalnych znaczników odniesienia w połączeniu z potokiem przetwarzania obrazu, aby oznaczyć pozycję zwierzęcia zgodnie z punktem skupienia przetwornika.</li>
	<li>Określ obszar docelowy, umieszczając kontur mózgu na uzyskanym obrazie rentgenowskim lub używając obrazów BLI do określenia środka guza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Położenie poszczególnych części mózgu jest określone w Atlasie Mózgu Paxinos40 przy użyciu oznaczeń czaszki bregma i lambda jako punktów odniesienia. Na przykład pon znajduje się x=-1,0, y=-0,8 i z=-4,5 od lambda.</li>
	<li>Osłoń nozdrza i pysk zwierzęcia taśmą samoprzylepną, aby żel ultradźwiękowy nie zakłócał oddychania.</li>
	<li>Nałóż żel ultradźwiękowy na czubek głowy zwierzęcia.</li>
	<li>Zwiń skórę szyi zwierzęcia, nasmaruj hydrofon igłowy żelem ultradźwiękowym i umieść hydrofon igłowy w bezpośrednim sąsiedztwie kości potylicznej.</li>
	<li>Ustaw przetwornik we właściwej pozycji, korzystając z potoku przetwarzania obrazu i punktu ostrości.</li>
	<li>Zastosuj wstępnie skonfigurowane ustawienia do wszystkich podłączonych urządzeń i skieruj się na obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: W zależności od pytania badawczego, obszary guza lub mózgu mogą być sonoporowane jako pojedynczy punkt ogniskowy lub jako kształt wolumetryczny, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	<li>Aktywuj mikropęcherzyki zgodnie z opisem producenta. Wstrzyknąć jeden bolus zawierający 120 μl (5,4 μg) mikropęcherzyków.</li>
	<li>Przepłucz cewnik do żyły ogonowej solą fizjologiczną, aby sprawdzić otwarcie cewnika.</li>
	<li>Wstrzyknij mikropęcherzyki i rozpocznij insonację.</li>
	<li>Nagraj kawitację mikropęcherzyków za pomocą hydrofonu igłowego.</li>
	<li>Podać donaczyniowy środek kontrastowy lub lek po sonoporacji. Dawka, czas i planowanie zależą od celu badania i leku. 
	UWAGA: Niebieski Evans jest powszechnym czynnikiem kolorystycznym do oceny otwarcia BBB41.</li>
	<li>Monitorować zwierzę do ustalonego z góry punktu czasowego lub przed osiągnięciem humanitarnego punktu końcowego.</li>
</ol>
4. Analiza kawitacji mikropęcherzyków
UWAGA: Tutaj opisana jest zastosowana procedura, która jest odpowiednia do eksperymentów in vivo dla mikropęcherzykówSF 6-fosfolipidowych o średniej średnicy 2,5 μm (80% pęcherzyków poniżej 8 μm) wzbudzonych impulsem impulsowym o czasie trwania 10 ms i częstotliwości 1 MHz, jak pierwotnie zasugerowali McDannold et al.12.
<ol>
	<li>Przekształć Fouriera zarejestrowany sygnał PCD z dziedziny czasu na dziedzinę częstotliwości.</li>
	Zintegruj wynikową moc widmową w celu stabilnego wykrywania kawitacji wokół 2 i 3 harmonicznej (± 50 kHz), jak pokazano na Rysunek 3 (zielona ramka na 2 i 3 MHz).<li></li>
	<li>Zintegruj moc widmową do detekcji kawitacji bezwładnościowej, między częstotliwością główną, 2.i 3. harmoniczną, 1. i 2. ultraharmoniczną oraz pierwszą podharmoniczną (± 150 kHz), jak pokazano na <silnej klasie="xfig">Rysunek 3 (czerwone pola).</li>
	<li>Zintegruj moc widmową wokół częstotliwości podstawowej (1 MHz ± 50 kHz) w celu normalizacji obu wcześniej uzyskanych sygnałów PCD. 
	UWAGA: Sygnał PCD dla mikropęcherzyków SF 6-fosfolipidowych w eksperymentach in vivo przy 1 MHz nie wyświetla ultraharmonicznych ani podharmonicznych przed wystąpieniem kawitacji inercyjnej, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opracowaliśmy opłacalny system FUS oparty na obrazie do przejściowego zaburzenia BBB w celu zwiększonego dostarczania leków do miąższu mózgu. System został w dużej mierze zbudowany z dostępnych na rynku komponentów oraz w połączeniu z promieniami rentgenowskimi i BLI. Modułowość proponowanej konstrukcji pozwala na wykorzystanie kilku modalności obrazowania do planowania i oceny w przepływach pracy o wysokiej przepustowości. System można łączyć z bardziej kompleksowymi metodami obrazowania 3D o wysokiej rozd...

Bariera krew-mózg (BBB) jest główną przeszkodą w dostarczaniu leków do miąższu mózgu. Większość opracowanych leków terapeutycznych nie przekracza bariery krew-mózg ze względu na ich parametry fizykochemiczne (np. lipofilowość, masa cząsteczkowa, akceptory i donory wiązań wodorowych) lub nie jest zatrzymywana ze względu na ich powinowactwo do transporterów wypływu w mózgu1,2. Niewielka grupa leków, które mogą przenikać przez barierę krew-mózg, to zazwyczaj małe cząsteczki lipofilowe, które są skuteczne tylko w ograniczonej liczbie chorób mózgu1,2. W związku z tym w przypadku większości chorób mózgu możliwości leczenia farmakologicznego są ograniczone i potrzebne są nowe strategie dostarczania leków3,4.
Terapeutyczne ultradźwięki to nowa technika, która może być używana do różnych zastosowań neurologicznych, takich jak zaburzenia BBB (BBBD), neuromodulacja i ablacja4,5,6,7. W celu uzyskania otwarcia BBB za pomocą pozaustrojowego emitera ultradźwięków przez czaszkę, zogniskowane ultradźwięki (FUS) łączy się z mikropęcherzykami. FUS za pośrednictwem mikropęcherzyków powoduje zwiększoną biodostępność leków w miąższu mózgu5,8,9. W obecności fal dźwiękowych mikropęcherzyki zaczynają oscylować, inicjując transcytozę i przerwanie ścisłych połączeń między komórkami śródbłonka BBB, umożliwiając transport parakomórkowy większych cząsteczek10. Wcześniejsze badania potwierdziły korelację między intensywnością emisji akustycznej a wpływem biologicznym na otwarcie BBB11,12,13,14. FUS w połączeniu z mikropęcherzykami był już stosowany w badaniach klinicznych w leczeniu glejaka wielopostaciowego przy użyciu temozolomidu lub liposomalnej doksorubicyny jako chemioterapeutyku lub w terapii choroby Alzheimera i stwardnienia zanikowego bocznego5,9,15,16.
Ponieważ otwarcie BBB za pośrednictwem ultradźwięków daje zupełnie nowe możliwości dla farmakoterapii, potrzebne są badania przedkliniczne w celu klinicznego tłumaczenia, aby ocenić odpowiedź na terapię wybranych kandydatów na leki. Zazwyczaj wymaga to wysokowydajnego przepływu pracy z wysoką precyzją przestrzenną, a najlepiej zintegrowaną detekcją kawitacji w celu monitorowania docelowego otwarcia BBB z wysoką odtwarzalnością. Jeśli to możliwe, systemy te muszą być opłacalne zarówno pod względem początkowych kosztów inwestycji, jak i kosztów bieżących, aby można je było skalować w zależności od wielkości badania. Większość przedklinicznych systemów FUS jest połączona z MRI w celu prowadzenia obrazowania i planowania leczenia15,17,18,19. Chociaż rezonans magnetyczny dostarcza szczegółowych informacji na temat anatomii i objętości guza, jest to kosztowna technika, która jest zwykle wykonywana przez przeszkolonych/wykwalifikowanych operatorów. Ponadto rezonans magnetyczny o wysokiej rozdzielczości może nie zawsze być dostępny dla badaczy w placówkach przedklinicznych i wymaga długiego czasu skanowania na zwierzę, co czyni go mniej odpowiednim do wysokoprzepustowych badań farmakologicznych. Warto zauważyć, że w przypadku badań przedklinicznych z zakresu neuroonkologii, w szczególności modeli nowotworów naciekających, możliwość wizualizacji i ukierunkowania guza jest niezbędna dla powodzenia leczenia20. Obecnie wymóg ten jest spełniany tylko przez MRI lub przez nowotwory transdukowane fotoproteiną, co umożliwia wizualizację za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) w połączeniu z podaniem substratu fotoproteinowego.
Systemy FUS sterowane MRI często wykorzystują kąpiel wodną, aby zapewnić propagację fal ultradźwiękowych w zastosowaniach przezczaszkowych, gdzie głowa zwierzęcia jest częściowo zanurzona w wodzie, tak zwane systemy ''bottom-up''15,17,18. Chociaż projekty te sprawdzają się na ogół dobrze w mniejszych badaniach na zwierzętach, stanowią kompromis między czasem przygotowania zwierząt, przenośnością i realistycznie możliwymi do utrzymania standardami higienicznymi podczas użytkowania. Jako alternatywę dla MRI, inne metody naprowadzania do nawigacji stereotaktycznej obejmują użycie atlasu anatomicznego gryzoni21,22,23, celowanie wizualne wspomagane wskaźnikiem laserowym24, mechaniczne urządzenie do skanowania wspomaganego otworkami25, lub BLI26. Większość z tych konstrukcji to systemy "top-down", w których przetwornik jest umieszczony na czubku głowy zwierzęcia, przy czym zwierzę znajduje się w naturalnej pozycji. Przepływ pracy ''top-down'' składa się z kąpieli wodnej22,25,26 lub wypełnionego wodą stożka 21,24. Zaletą zastosowania przetwornika wewnątrz zamkniętego stożka jest bardziej kompaktowa powierzchnia, krótszy czas konfiguracji i proste możliwości dekontaminacji, które upraszczają cały przepływ pracy.
Interakcja pola akustycznego z mikropęcherzykami jest zależna od ciśnienia i waha się od oscylacji o niskiej amplitudzie (określanej jako stabilna kawitacja) do przejściowego zapadania się pęcherzyków (określanego jako kawitacja inercyjna)27,28. Istnieje utrwalony konsensus, że ultradźwięki-BBBD wymagają ciśnienia akustycznego znacznie powyżej stabilnego progu kawitacji, aby osiągnąć pomyślny próg BBBD, ale poniżej progu kawitacji inercyjnej, co jest ogólnie związane z uszkodzeniem naczyń krwionośnych/neuronów29. Najpowszechniejszą formą monitorowania i kontroli jest analiza (wstecznego) rozproszonego sygnału akustycznego za pomocą pasywnej detekcji kawitacji (PCD), zgodnie z sugestią McDannold et al.12. PCD opiera się na analizie widm Fouriera sygnałów emisyjnych mikropęcherzyków, w których siła i wygląd cech charakterystycznych stabilnej kawitacji (harmoniczne, subharmoniczne i ultraharmoniczne) oraz inercyjnych markerów kawitacji (odpowiedź szerokopasmowa) mogą być mierzone w czasie rzeczywistym.
A "jeden rozmiar dla wszystkich" Analiza PCD do precyzyjnej kontroli ciśnienia jest skomplikowana ze względu na polidyspersyjność formuły mikropęcherzyków (amplituda oscylacji zależy silnie od średnicy pęcherzyka), różnice we właściwościach powłoki pęcherzykowej między markami oraz oscylację akustyczną, która zależy silnie od częstotliwości i ciśnienia30,31,32. W związku z tym zaproponowano wiele różnych protokołów wykrywania PCD, które zostały dostosowane do określonych kombinacji wszystkich tych parametrów i były stosowane w różnych scenariuszach zastosowań (począwszy od eksperymentów in vitro, poprzez protokoły na małych zwierzętach, aż po PCD do zastosowań klinicznych) do solidnego wykrywania kawitacji, a nawet do wstecznej kontroli sprzężenia zwrotnego ciśnienia11, 14,30,31,32,33,34,35. Protokół PCD zastosowany w ramach tego badania wywodzi się bezpośrednio z McDannold et al.12 i monitoruje emisję harmonicznych pod kątem obecności stabilnej kawitacji i szumu szerokopasmowego do wykrywania kawitacji inercyjnej.
Opracowaliśmy sterowany obrazem system FUS do przejściowego otwierania bariery krew-mózg w celu zwiększenia dostarczania leków do miąższu mózgu. System oparty jest na dostępnych na rynku komponentach i można go łatwo dostosować do kilku różnych metod obrazowania, w zależności od dostępnych technik obrazowania w pomieszczeniu dla zwierząt. Ponieważ wymagamy pracy o wysokiej przepustowości, zdecydowaliśmy się na wykorzystanie promieni rentgenowskich i BLI do naprowadzania obrazów i planowania leczenia. Komórki nowotworowe transdukowane fotoproteiną (np. lucyferazą) nadają się do obrazowania BLI20. Po podaniu substratu fotoproteinowego komórki nowotworowe mogą być monitorowane in vivo, a wzrost i lokalizacja guza można określić20,36. BLI to tania metoda obrazowania, umożliwia śledzenie wzrostu guza w czasie, ma szybki czas skanowania i dobrze koreluje ze wzrostem guza mierzonym za pomocą MRI36,37. Zdecydowaliśmy się zastąpić kąpiel wodną stożkiem wypełnionym wodą przymocowanym do przetwornika, aby umożliwić swobodne przesuwanie platformy, na której zamontowany jest gryzoń8,24. Konstrukcja opiera się na odłączanej platformie wyposażonej w integrację (I) platformy stereotaktycznej dla małych zwierząt, (II) markerów odniesienia z kompatybilnością zarówno rentgenowską, jak i optyczno-obrazową, (III) szybko odłączanej maski anestezjologicznej oraz (IV) zintegrowanego systemu ogrzewania zwierząt o regulowanej temperaturze. Po wstępnym wprowadzeniu znieczulenia, zwierzę jest montowane w precyzyjnej pozycji na platformie, gdzie pozostaje przez cały zabieg. W związku z tym cała platforma przechodzi przez wszystkie stacje przepływu pracy całej interwencji, zachowując dokładne i powtarzalne pozycjonowanie oraz trwałe znieczulenie. Oprogramowanie sterujące umożliwia automatyczne wykrywanie markerów odniesienia i automatycznie rejestruje wszystkie rodzaje obrazów i modalności obrazowania (tj. mikrotomografię komputerową, promieniowanie rentgenowskie, BLI i obrazowanie fluorescencyjne) w układzie odniesienia platformy stereotaktycznej. Dzięki automatycznej procedurze kalibracji ogniskowa przetwornika ultradźwiękowego jest dokładnie znana w jego wnętrzu, co umożliwia automatyczne połączenie planowania interwencyjnego, dostarczania akustycznego i uzupełniającej analizy obrazowej. Jak pokazano na Rysunek 1 i Rysunek 2, ta konfiguracja zapewnia wysoki stopień elastyczności w projektowaniu dedykowanych eksperymentalnych przepływów pracy i umożliwia przeplatanie się ze zwierzęciem na różnych stacjach, co z kolei ułatwia eksperymenty o wysokiej przepustowości. Zastosowaliśmy tę technikę do skutecznego dostarczania leków do ksenoprzeszczepów myszy glejaka o wysokim stopniu złośliwości, takiego jak rozlany glejak linii środkowej.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml typu luer-lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>Plastipak</td></tr><tr><td>19 G igła</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>Igła 23 G</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna 3M Transpore</td><td>Nauka stosowana do życia</td><td>7000032707</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>Generator przebiegów arbitralnych</td><td>Siglent</td><td>n.a.SDG1025</td><td>, 25 MHz, 125 Msa/s</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany stereotakt</td><td>zbudowany we własnym</td><td></td> <td>zakresie.Stereotact ze wszystkimi elementami został zbudowany we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Bruker In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>n.a.Zawiera</td> <td>oprogramowanie</td></tr><tr><td>Buforowany roztwór NaCl</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek buprenorfiny</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.0.324</td> <td>mg</td></tr><tr><td>Wzbogacanie koszyka: masa papierowa inteligentny dom</td><td>Usługi biologiczne</td><td>b.a.Filtr</td><td></td></tr> <tr><td>węglowy</td><td>Bickford</td><td>NC0111395</td><td>Omnicon f/air</td></tr><tr><td>Łyżka ceramiczna</td><td>b.d.a.Waciki</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bawełniane</td><td></td> n.a.n.a.D-lucyferyna<td></td><td></td></tr><tr><td>, sól potasowa</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VUmc apteka</td><td>n.d.70</td><td>%</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius NaCl 0,9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.NaCl</td> <td>0,9 %, 1000 ml</td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun Surgical</td><td>n.a.Histoacryl</td> <td>0,5 mL</td></tr><tr><td>Hydrophone</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.Strzykawka</td><td></td></tr> <tr><td>insulinowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>324825/324826</td><td>0,5 ml i 0,3 ml</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Alfasan</td><td>n.d.10</td> <td>%, 10 ml</td></tr><tr><td>Karma dla myszy: Teklad global 18% białkowa dieta dla gryzoni</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik neoflonowy</td><td>Becton Dickinson</td><td>391349</td><td>26 GA 0,6 x 19 mm</td></tr><tr><td></td><td>Technologie Keysight</td><td>n.a.InfiniiVision</td> <td>DSOX024A</td></tr><tr><td>Rurki plastikowe</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Wzmacniacz mocy</td><td>Elektronika i Innovation Ltd</td><td>210L</td><td>Model 210L</td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz Łącznik DC</td><td>Precision Acoustics</td><td>n..</td><td>Numer seryjny: DCPS94</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Sedazine</td><td>AST Farma</td><td>n.a.2</td><td>%</td></tr><tr><td>SonoVue mikropęcherzyki</td><td>Bracco</td><td>n.a.8</td> <td>i micro; l/ml</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.1000</td> <td>mL</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>b.a.n.a.można</td><td></td> <td>używać różnych strzykawek</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.0.3</td> <td>mg/ml</td></tr><tr><td>Przetwornik</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.1</td> <td>MHz</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Żel do ultradźwięków</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>01-02</td><td>Aquasonic 100</td></tr><tr><td>Vidisic żel</td><td>Bausch + Lomb</td><td>n.d.10</td> <td>g</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Bariera krew-mózg (BBB) była główną przeszkodą w leczeniu różnych chorób mózgu. Komórki śródbłonka, połączone ścisłymi połączeniami, tworzą fizjologiczną barierę zapobiegającą przedostawaniu się dużych cząsteczek (>500 Da) do tkanki mózgowej. Zogniskowane ultradźwięki za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS) mogą być stosowane do indukowania przejściowego lokalnego otwarcia BBB, umożliwiając większym lekom przedostanie się do miąższu mózgu.
Oprócz dużych urządzeń klinicznych do tłumaczenia klinicznego, badania przedkliniczne do oceny odpowiedzi na terapię kandydatów na leki wymagają dedykowanych zestawów ultrasonograficznych dla małych zwierząt do ukierunkowanego otwierania BBB. Preferowane jest, aby systemy te umożliwiały wysokowydajne przepływy pracy zarówno z wysoką precyzją przestrzenną, jak i zintegrowanym monitorowaniem kawitacji, a jednocześnie były opłacalne zarówno pod względem początkowych kosztów inwestycyjnych, jak i bieżących.
Tutaj prezentujemy stereotaktyczny system FUS dla małych zwierząt sterowany bioluminescencją i promieniowaniem rentgenowskim, który bazuje na dostępnych na rynku komponentach i spełnia wyżej wymienione wymagania. Szczególny nacisk położono na wysoki stopień automatyzacji, ułatwiający sprostanie wyzwaniom zwykle napotykanym w szeroko zakrojonych badaniach przedklinicznych oceniających leki. Przykładami tych wyzwań są potrzeba standaryzacji w celu zapewnienia odtwarzalności danych, zmniejszenia zmienności wewnątrzgrupowej, zmniejszenia wielkości próby, a tym samym spełnienia wymogów etycznych i zmniejszenia niepotrzebnego obciążenia pracą. Proponowany system BBB został zwalidowany w ramach badań nad dostarczaniem leków z ułatwionym otwieraniem BBB na modelach ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów glejaka wielopostaciowego i rozlanego glejaka linii środkowej.

Opisany system FUS (Rysunek 1 i Rycina 2) oraz powiązany schemat postępowania zostały zastosowane u ponad 100 zwierząt i pozwoliły na uzyskanie powtarzalnych danych zarówno w przypadku myszy zdrowych, jak i z nowotworem. Na podstawie zarejestrowanej kawitacji oraz gęstości widmowej harmonicznych w szczytowym momencie wstrzyknięcia bolusa mikropęcherzyków, moc widmową każdej częstotliwości można obliczyć za pomocą analizy Fouriera, zgodnie z opisem w kroku 4 prot...

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Glejaki o wysokim stopniu złośliwości, taki jak rozlany glejak mostu, są wysoce inwazyjnymi nowotworami o wysokiej śmiertelności. Pomimo wielu lat szeroko zakrojonych badań, bariera krew-mózg jest ważnym aspektem, ponieważ chemioterapia nie jest w stanie skutecznie dotrzeć do mózgu. Na szczęście zogniskowane ultradźwięki są w stanie tymczasowo i miejscowo otworzyć barierę krew-mózg w celu skutecznego leczenia.Opracowaliśmy mały i ekonomiczny system ultrasonograficzny z neuronawigacją, który umożliwia naruszenie bariery krew-mózg. System ten zbudowany jest z dostępnych na rynku komponentów i dzięki wysokiemu stopniowi automatyzacji pozwala na prowadzenie przedklinicznych badań oceniających leki. Medycyna precyzyjna jest definiowana jako właściwy lek we właściwej dawce dla właściwego pacjenta we właściwym czasie.Aby to osiągnąć, wiele wstępnie wybranych leków musi zostać poddanych badaniom przesiewowym. Nasz kompaktowy, wysokoprzepustowy, skoncentrowany system ultrasonograficzny do naruszania bariery krew-mózg pozwala nam to zrobić. Procedurę zademonstrują Rianne Haumann i Elvin t Hart, dwoje doktorantów z mojej grupy badawczej.Przebieg pracy dla stereotaktycznego ultrasonografu skoncentrowanego na neuronawigacji sterowanej obrazem obejmuje obrazowanie interwencyjne i sprzężenie akustyczne dla sonoporacji na platformie ultrasonograficznej. Następnie można wykonać obrazowanie kontrolne. Wybierz odpowiedni przetwornik w oparciu o wymagania projektowanego eksperymentu.Umieść go w wydrukowanym w 3D stożku wypełnionym odgazowaną wodą i zamkniętym od dołu akustycznie przezroczystą membraną Mylar. Podłącz przetwornik do generatora funkcyjnego i wzmacniacza mocy. Zamontuj przetwornik na zmotoryzowanym stoliku liniowym w celu automatycznego pozycjonowania w pionie i podłącz go do wzmacniacza mocy.Korzystaj z odłączanej platformy stereotaktycznej, która obejmuje ogrzewanie o regulowanej temperaturze, paski zgryzowe i douszne, znieczulenie i multimodalne markery referencyjne. Przymocuj platformę do stolika liniowego 2D. Zanim system FUS będzie mógł być używany, należy go skalibrować i określić punkt ostrości przetwornika.Punkt ostrości odpowiada pionowej pozycji zwierzęcia na platformie stereotaktycznej. Zaaklimatyzuj zwierzę w obiekcie przez co najmniej tydzień po przyjeździe i regularnie je waż. W dniu eksperymentu należy podać buprenorfinę we wstrzyknięciu podskórnym na 30 minut przed leczeniem FUS.Po znieczuleniu myszy nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu. W razie potrzeby usuń włosy z czubka głowy zwierzęcia za pomocą maszynki do golenia i kremu do depilacji. Umyj skórę wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości.W przypadku eksperymentów z modelami guzów BLI wstrzyknij 150 mikrolitrów D-lucyferyny dootrzewnowo za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 29. W celu podania mikropęcherzyków do otwarcia BBB należy wprowadzić cewnik do żyły ogonowej o rozmiarze od 26 do 30 i przepłukać żyłę niewielką objętością roztworu heparyny. Zabezpiecz cewnik taśmą tkankową, aby zapobiec odklejeniu.Jeśli cewnikowanie się powiedzie, napełnij cewnik roztworem heparyny, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Umieść zwierzę na platformie stereotaktycznej o regulowanej temperaturze, aby uniknąć hipotermii. Przymocuj głowę zwierzęcia za pomocą pręta do gryzienia i prętów do uszu, a ogon i cewnik przyklej do platformy.Przymocuj korpus myszy za pomocą paska. Umieść platformę stereotaktyczną z zamontowaną myszką w modalności obrazowania i zrób zdjęcia zwierzęcia. Ustal, czy zwierzę jest prawidłowo umieszczone na platformie.Oznacz pozycję zwierzęcia za pomocą multimodalnych znaczników odniesienia w połączeniu z potokiem przetwarzania obrazu zgodnie z punktem ostrości przetwornika. Określ obszar docelowy, umieszczając kontur mózgu na uzyskanym obrazie rentgenowskim lub używając obrazów BLI do określenia środka guza. Przed ustawieniem przetwornika należy zabezpieczyć nozdrza i pysk zwierzęcia taśmą, aby żel ultradźwiękowy nie zakłócał oddychania.Nałóż żel ultradźwiękowy na czubek głowy myszy, aby zapewnić prawidłowe przewodzenie dźwięku. Rejestruj kawitację mikropęcherzyków za pomocą hydrofonu igłowego, który umieszcza się w bezpośrednim sąsiedztwie kości potylicznej. Na podstawie wartości kalibracji poprowadź przetwornik do właściwej pozycji nad zwierzęciem.Zastosuj wstępnie skonfigurowane ustawienia do wszystkich podłączonych urządzeń, aby celować w obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Po umieszczeniu przetwornika we właściwej pozycji rozpuść i aktywuj mikropęcherzyki zgodnie z opisem producenta. Przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków należy przepłukać cewnik żyły ogonowej solą fizjologiczną, aby potwierdzić dostęp do żyły ogonowej.Rozpocznij trajektorię insonikacji i jednocześnie wstrzyknij mikropęcherzyki. Jednocześnie hydrofon igłowy będzie wykrywał i weryfikował kawitację mikropęcherzyków w czasie rzeczywistym. W razie potrzeby podać donaczyniowy środek kontrastowy lub lek po sonoporacji.Monitoruj zwierzę do określonego z góry punktu czasowego. Ciśnienie akustyczne o wskaźniku mechanicznym 0,4 w połączeniu z mikropęcherzykami zapewniło bardzo czuły i niezawodny sposób stabilnego wykrywania kawitacji w porównaniu z brakiem wykrywania subharmonicznych, gdy nie wstrzykiwano mikropęcherzyków lub obserwacją kawitacji bezwładnościowej, gdy zastosowano MI 0,6. Podczas gdy ciśnienie akustyczne przy MI do 0,6 nie powodowało uszkodzeń makroskopowych, mikroskopijne uszkodzenia były udowodnione histologicznie przy MI 0,6.Amplituda ciśnienia przy MI wynoszącym 0,8 powodowała makroskopowy krwotok mózgowy większych naczyń i rozległą lizę tkanek z wynaczynieniem erytrocytów. Dożylnie wstrzyknięto błękit Evansa w celu potwierdzenia otwarcia bariery krew-mózg w okolicy mostu. Wynaczynienie albuminy sprzężonej z błękitem Evansa zaobserwowano na poziomie mostu i móżdżku u myszy leczonej FUS i mikropęcherzykami, wykazując precyzyjne celowanie w obszar zainteresowania.Najważniejszymi etapami tego protokołu są prawidłowe umieszczenie cewnika do żyły ogonowej, ułożenie i ukierunkowanie zwierzęcia oraz wstrzyknięcie mikropęcherzyków za pomocą zogniskowanych ultradźwięków z detekcją kawitacji. Ten samodzielnie wykonany zogniskowany system ultrasonograficzny można dostosować i przeprojektować pod kątem wielu pytań badawczych, co jest jednocześnie opłacalne i ma zautomatyzowany przepływ pracy, co czyni go odpowiednim dla stosunkowo niedoświadczonych badaczy.

a-high-throughput-image-guided-stereotactic-neuronavigation-focused

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wywoływanie przerwania bariery krew-mózg (BBB) za pomocą skupionego ultradźwięku z wykorzystaniem mikropęcherzyków jest obiecującą techniką nieinwazyjnego, celowanego dostarczania leków do mózgu1-3. Niniejszy protokół opisuje procedurę eksperymentalną dla transkranialnego przerwania BBB pod kontrolą MRI w modelu szczura.

Przełamywanie bariery krew-mózg pod kontrolą MRI z użyciem przezczaszkowego ultradźwiękowego ogniskowania w modelu szczura

Ten film opisuje metodę tymczasowego zakłócania bariery krew-mózg (BBB) poprzez tworzenie przejściowych otworów za pomocą zogniskowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). Te przejściowe lokalne otwory BBB mogą ostatecznie zostać wykorzystane do dostarczania większych cząsteczek leku bezpośrednio do miąższu mózgu.

Focus Ultrasounds Mikropęcherzykowe otwieranie bariery krew-mózg: technika tworzenia zlokalizowanych przejściowych otworów w barierze krew-mózg myszy za pomocą sonoporacji

Skoncentrowane ultradźwięki z mikropęcherzykami mogą otworzyć barierę krew-mózg punktowo i przejściowo. Technika ta została wykorzystana do dostarczania szerokiej gamy środków przez barierę krew-mózg. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół miejscowego dostarczania do mózgu gryzonia z lub bez wskazówek MRI.

Podejście laboratoryjne do specyficznego dla lokalizacji otworu bariery krew-mózg przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków w modelu szczurzym

Ten protokół określa kroki niezbędne do dostarczenia genu poprzez skoncentrowanie ultradźwięków na otwarciu bariery krew-mózg (BBB), ocenę wynikowej ekspresji genu oraz pomiar aktywności neuromodulacyjnej receptorów chemogenetycznych za pomocą testów histologicznych.

Zogniskowane ultradźwięki indukowane otwieraniem bariery krew-mózg w celu celowania w struktury mózgu i oceny neuromodulacji chemogenetycznej

Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

To badanie opisuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i protokół ultradźwięków o niskiej intensywności (FUS), wykorzystujący żywe szczury z cewnikowaniem żyły szyjnej do monitorowania otwarcia bariery krew-mózg (BBB).

Monitorowanie otwarcia bariery krew-mózg u szczurów za pomocą przedklinicznego systemu ultrasonograficznego

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

W niniejszym raporcie przedstawiamy w pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system umożliwiający jednoczesne badanie wielu zachowań poznawczych oraz rejestrację aktywności neuronów u gryzoni.

W pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system do badania wielorakich funkcji poznawczych i rejestracji aktywności neuronalnej u gryzoni

Opisano technikę szerokiego otwierania bariery krew-mózg u myszy z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków. Dzięki zastosowaniu tej metody do mózgu myszy można wprowadzić mangan. Ponieważ mangan jest środkiem kontrastowym do MRI, który kumuluje się w zdepolaryzowanych neuronach, podejście to umożliwia obrazowanie aktywności neuronalnej.

Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Poznaj metodę otwierania bariery krew-mózg u myszy za pomocą skoncentrowanej ultrasonografii z nawigacją stereotaktyczną. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia skuteczną dostawę leków do mózgu w badaniach przedklinicznych.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Przeglądaj więcej filmów