Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Glejaki o wysokim stopniu złośliwości, taki jak rozlany glejak mostu, są wysoce inwazyjnymi nowotworami o wysokiej śmiertelności. Pomimo wielu lat szeroko zakrojonych badań, bariera krew-mózg jest ważnym aspektem, ponieważ chemioterapia nie jest w stanie skutecznie dotrzeć do mózgu. Na szczęście zogniskowane ultradźwięki są w stanie tymczasowo i miejscowo otworzyć barierę krew-mózg w celu skutecznego leczenia.

Opracowaliśmy mały i ekonomiczny system ultrasonograficzny z neuronawigacją, który umożliwia naruszenie bariery krew-mózg. System ten zbudowany jest z dostępnych na rynku komponentów i dzięki wysokiemu stopniowi automatyzacji pozwala na prowadzenie przedklinicznych badań oceniających leki. Medycyna precyzyjna jest definiowana jako właściwy lek we właściwej dawce dla właściwego pacjenta we właściwym czasie.

Aby to osiągnąć, wiele wstępnie wybranych leków musi zostać poddanych badaniom przesiewowym. Nasz kompaktowy, wysokoprzepustowy, skoncentrowany system ultrasonograficzny do naruszania bariery krew-mózg pozwala nam to zrobić. Procedurę zademonstrują Rianne Haumann i Elvin t Hart, dwoje doktorantów z mojej grupy badawczej.

Przebieg pracy dla stereotaktycznego ultrasonografu skoncentrowanego na neuronawigacji sterowanej obrazem obejmuje obrazowanie interwencyjne i sprzężenie akustyczne dla sonoporacji na platformie ultrasonograficznej. Następnie można wykonać obrazowanie kontrolne. Wybierz odpowiedni przetwornik w oparciu o wymagania projektowanego eksperymentu.

Umieść go w wydrukowanym w 3D stożku wypełnionym odgazowaną wodą i zamkniętym od dołu akustycznie przezroczystą membraną Mylar. Podłącz przetwornik do generatora funkcyjnego i wzmacniacza mocy. Zamontuj przetwornik na zmotoryzowanym stoliku liniowym w celu automatycznego pozycjonowania w pionie i podłącz go do wzmacniacza mocy.

Korzystaj z odłączanej platformy stereotaktycznej, która obejmuje ogrzewanie o regulowanej temperaturze, paski zgryzowe i douszne, znieczulenie i multimodalne markery referencyjne. Przymocuj platformę do stolika liniowego 2D. Zanim system FUS będzie mógł być używany, należy go skalibrować i określić punkt ostrości przetwornika.

Punkt ostrości odpowiada pionowej pozycji zwierzęcia na platformie stereotaktycznej. Zaaklimatyzuj zwierzę w obiekcie przez co najmniej tydzień po przyjeździe i regularnie je waż. W dniu eksperymentu należy podać buprenorfinę we wstrzyknięciu podskórnym na 30 minut przed leczeniem FUS.

Po znieczuleniu myszy nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu. W razie potrzeby usuń włosy z czubka głowy zwierzęcia za pomocą maszynki do golenia i kremu do depilacji. Umyj skórę wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości.

W przypadku eksperymentów z modelami guzów BLI wstrzyknij 150 mikrolitrów D-lucyferyny dootrzewnowo za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 29. W celu podania mikropęcherzyków do otwarcia BBB należy wprowadzić cewnik do żyły ogonowej o rozmiarze od 26 do 30 i przepłukać żyłę niewielką objętością roztworu heparyny. Zabezpiecz cewnik taśmą tkankową, aby zapobiec odklejeniu.

Jeśli cewnikowanie się powiedzie, napełnij cewnik roztworem heparyny, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Umieść zwierzę na platformie stereotaktycznej o regulowanej temperaturze, aby uniknąć hipotermii. Przymocuj głowę zwierzęcia za pomocą pręta do gryzienia i prętów do uszu, a ogon i cewnik przyklej do platformy.

Przymocuj korpus myszy za pomocą paska. Umieść platformę stereotaktyczną z zamontowaną myszką w modalności obrazowania i zrób zdjęcia zwierzęcia. Ustal, czy zwierzę jest prawidłowo umieszczone na platformie.

Oznacz pozycję zwierzęcia za pomocą multimodalnych znaczników odniesienia w połączeniu z potokiem przetwarzania obrazu zgodnie z punktem ostrości przetwornika. Określ obszar docelowy, umieszczając kontur mózgu na uzyskanym obrazie rentgenowskim lub używając obrazów BLI do określenia środka guza. Przed ustawieniem przetwornika należy zabezpieczyć nozdrza i pysk zwierzęcia taśmą, aby żel ultradźwiękowy nie zakłócał oddychania.

Nałóż żel ultradźwiękowy na czubek głowy myszy, aby zapewnić prawidłowe przewodzenie dźwięku. Rejestruj kawitację mikropęcherzyków za pomocą hydrofonu igłowego, który umieszcza się w bezpośrednim sąsiedztwie kości potylicznej. Na podstawie wartości kalibracji poprowadź przetwornik do właściwej pozycji nad zwierzęciem.

Zastosuj wstępnie skonfigurowane ustawienia do wszystkich podłączonych urządzeń, aby celować w obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Po umieszczeniu przetwornika we właściwej pozycji rozpuść i aktywuj mikropęcherzyki zgodnie z opisem producenta. Przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków należy przepłukać cewnik żyły ogonowej solą fizjologiczną, aby potwierdzić dostęp do żyły ogonowej.

Rozpocznij trajektorię insonikacji i jednocześnie wstrzyknij mikropęcherzyki. Jednocześnie hydrofon igłowy będzie wykrywał i weryfikował kawitację mikropęcherzyków w czasie rzeczywistym. W razie potrzeby podać donaczyniowy środek kontrastowy lub lek po sonoporacji.

Monitoruj zwierzę do określonego z góry punktu czasowego. Ciśnienie akustyczne o wskaźniku mechanicznym 0,4 w połączeniu z mikropęcherzykami zapewniło bardzo czuły i niezawodny sposób stabilnego wykrywania kawitacji w porównaniu z brakiem wykrywania subharmonicznych, gdy nie wstrzykiwano mikropęcherzyków lub obserwacją kawitacji bezwładnościowej, gdy zastosowano MI 0,6. Podczas gdy ciśnienie akustyczne przy MI do 0,6 nie powodowało uszkodzeń makroskopowych, mikroskopijne uszkodzenia były udowodnione histologicznie przy MI 0,6.

Amplituda ciśnienia przy MI wynoszącym 0,8 powodowała makroskopowy krwotok mózgowy większych naczyń i rozległą lizę tkanek z wynaczynieniem erytrocytów. Dożylnie wstrzyknięto błękit Evansa w celu potwierdzenia otwarcia bariery krew-mózg w okolicy mostu. Wynaczynienie albuminy sprzężonej z błękitem Evansa zaobserwowano na poziomie mostu i móżdżku u myszy leczonej FUS i mikropęcherzykami, wykazując precyzyjne celowanie w obszar zainteresowania.

Najważniejszymi etapami tego protokołu są prawidłowe umieszczenie cewnika do żyły ogonowej, ułożenie i ukierunkowanie zwierzęcia oraz wstrzyknięcie mikropęcherzyków za pomocą zogniskowanych ultradźwięków z detekcją kawitacji. Ten samodzielnie wykonany zogniskowany system ultrasonograficzny można dostosować i przeprojektować pod kątem wielu pytań badawczych, co jest jednocześnie opłacalne i ma zautomatyzowany przepływ pracy, co czyni go odpowiednim dla stosunkowo niedoświadczonych badaczy.