Name: Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę patch-clamp sterowaną obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu. Technika wykorzystuje widzenie komputerowe do detekcji komórek fluorescencyjnych, zwiększając przepustowość eksperymentów elektrofizjologicznych i umożliwiając farmakologiczne badania przesiewowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Fundacji Whitehall. Chcielibyśmy podziękować Samuelowi T. Kissingerowi za cenne uwagi.

1. Ustawienia systemu
<ol>
	<li>Zbuduj jednostkę sterującą ciśnieniem.
	<ol>
		<li>Zmontuj jednostkę sterującą ciśnieniem zgodnie z mapą obwodu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1). niezbędne części do płytki obwodu drukowanego (PCB) wyprodukowanej zgodnie ze schematem obwodu elektrycznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b). Używaj standardowych rezystorów, diod LED, tranzystorów polowych (MOSFET) z tlenku metalu, kondensatorów i złączy (patrz tabela materiałów). zawory elektromagnetyczne do płytki drukowanej. Podłącz pompę powietrza i czujnik ciśnienia powietrza do płytki drukowanej za pomocą przewodu elektrycznego. 
		UWAGA: Zbudowanie regulatora ciśnienia z dostępnymi wszystkimi niezbędnymi częściami powinno zająć około 2 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz płytę wtórnego akwizycji danych (DAQ).
	<ol>
		<li>Podłącz wyjścia danych z płytki drukowanej do płytki DAQ, postępując zgodnie z tabelą 1. 
		UWAGA: Płyta DAQ będzie działać w "trybie Single-ended". Mapę portów można znaleźć w instrukcji obsługi (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Podłącz "AIn Pr S" do jednego z kanałów wejścia analogowego (AI), a "R-Gr" do jednego z analogowych uziemień na wtórnej płycie DAQ.</li>
		<li>Podłącz główne wyjście ze wzmacniacza do jednego z kanałów AI, a masę do masy analogowej wtórnej płyty DAQ. 
		UWAGA: Do podłączenia głównego wyjścia ze wzmacniacza można użyć standardowego BNC.</li>
		<li>Zdejmij drugi koniec i podłącz sygnał dodatni (tj. rdzeń miedziany) do kanału AI, a masę (tj. cienki drut wokół rdzenia) do uziemienia analogowego. Powtórz ten krok dla drugiego kanału, jeśli używany jest więcej niż jeden kanał patch. 
		UWAGA: Wejście analogowe do karty DAQ zostanie skonfigurowane w późniejszych krokach.</li>
		<li>Podłącz zasilanie do wyjścia zasilania dodatkowej płyty DAQ. Użyj oddzielnego źródła zasilania 12 V dla pompy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz rurkę.
	<ol>
		<li>Podłączyć pompę powietrza i dwa zawory zgodnie z tabelą 2. W ostatnim kroku użyj złącza 3-drożnego, aby podłączyć miękki przewód z górnego portu zaworu 2, czujnik ciśnienia i uchwyt na pipety.</li>
		<li>Dodaj kolejne złącze 3-stykowe do rurki podłączonej do uchwytu pipety, jeśli używane są dwie pipety. Podczas łatania należy ręcznie przełączać się między zaworami a pipetami używanymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj Autopatcher IG. 
	UWAGA: Wymagania systemowe: Autopatcher IG został przetestowany tylko na komputerze z systemem Windows 7. Nie został zweryfikowany dla innych systemów operacyjnych. Opisana procedura dotyczy w szczególności sprzętu wymienionego w Tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Pobierz Autopatcher-IG z GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).</li>
		<li>Zainstaluj Pythona (zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z wersją i adresem pobierania).</li>
		<li>Odinstaluj bibliotekę PyQt4, wpisując "uninstall PyQt4" w terminalu wiersza poleceń. 
		UWAGA: System korzysta ze starszej wersji biblioteki PyQt4 w celu uzyskania kompatybilności z bibliotekami Qwt i Opencv.</li>
		<li>Zainstaluj biblioteki języka Python z historycznych plików kół (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Znajdź następujące pliki: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) i Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
		<ol>
			<li>Aby zainstalować pliki wheel, przejdź do katalogu, w którym pliki są zapisane i wpisz "install ***wheelfilename***.whl". Zastąp "***wheelfilename***" rzeczywistą nazwą pliku. 
			UWAGA: "cp27" w nazwie pliku koła oznacza Pythona 2.7, a "win32" oznacza 32-bitowy system Windows. Jeśli "win32" nie działa, spróbuj "win64".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby sterować kamerą CCD, pobierz i zainstaluj instalator dla wersji 64-bitowej (https://www.qimaging.com/support/software/). Następnie pobierz MicroManager dla wersji 64-bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release), aby sterować kamerą w Pythonie.</li>
		<li>Aby sterować manipulatorami i stolikiem mikroskopu, należy zainstalować oprogramowanie sterujące dostarczone przez producenta. 
		UWAGA: W ten sposób instalowany jest również sterownik niezbędny do sterowania manipulatorami. Pakiet instalacyjny jest zwykle dostarczany na płycie CD-ROM.</li>
		<li>Aby sterować dodatkową płytą DAQ, zainstaluj bibliotekę uniwersalną z płyty CD-ROM, dołączonej do zakupionej płyty DAQ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj sprzęt dla Autopatcher IG.
	<ol>
		<li>Podłącz stolik mikroskopu i sterowniki manipulatora do komputera za pomocą portów USB.</li>
		<li>Przypisz numery portów COM do jednostki 0: stolik mikroskopu, jednostki 1: lewy manipulator i jednostki 2: prawy manipulator, w tej kolejności, w pliku konfiguracyjnym "ports.csv" w folderze "configuration". Pozostałe parametry w pliku ports.csv (np. "SCI" i "1") pozostaw bez zmian. 
		UWAGA: Informacje o numerze portu COM można znaleźć, uruchamiając oprogramowanie konfiguracyjne manipulatora dostarczone przez producenta. Przejdź do zakładki "ustawienia", wybierz "ustawienia" i stronę "Ruch", a następnie przeczytaj etykiety dla każdej zakładki u góry. Alternatywnie informacje te można znaleźć w Menedżerze urządzeń PC.</li>
		<li>Przypisz numery kanałów wejściowych analogowych na płytce DAQ dla czujnika ciśnienia i kanału krosowego 1 i 2 (odpowiadających jednostce 1 i 2). Wprowadź numer kanału w pliku "DAQchannels.csv" w folderze "configuration". 
		UWAGA: Zaleca się otwieranie plików .csv za pomocą aplikacji Notatnik zamiast arkusza kalkulacyjnego, ponieważ może to zmienić informacje podczas zapisywania zmian.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom Autopatcher IG.
	<ol>
		<li>Włącz amplifier, kontroler mikroskopu i kontroler manipulatora. Upewnij się, że amplifier oprogramowanie jest uruchomione.</li>
		<li>Uruchom Autopatcher IG z Pythonem z terminala wiersza poleceń w następujący sposób: najpierw zmień katalog (polecenie "cd" dla najpopularniejszych terminali), w którym zainstalowany jest Autopatcher IG, wpisz "python Autopatcher_IG.pyw" w terminalu wiersza poleceń i naciśnij "Enter". 
		UWAGA: Nie uruchamiaj oprogramowania sterującego manipulatorem przed uruchomieniem Autopatcher IG, ponieważ zajmie ono stolik mikroskopu i manipulator, powodując, że Autopatcher IG nie będzie w stanie znaleźć sprzętu. Oprogramowanie sterujące manipulatorem może być uruchomione po pełnym uruchomieniu Autopatcher IG, jeśli istnieją dodatkowe moduły do sterowania (np. grzałka liniowa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj pipetę główną.
	<ol>
		<li>Wyciągnij pipety z plastrami zgodnie z wcześniejszym opisem9. Napełnij wyciągniętą szklaną pipetę roztworem wewnętrznym i załaduj ją na stolik głowicy. 
		UWAGA: Puste szklane pipety mają różny kontrast pod mikroskopem i mogą prowadzić do niedokładnej kalibracji.</li>
		<li>Przesuń końcówkę pipety w stronę pola widzenia mikroskopu i ustaw na niej ostrość. Jeśli klawiatura numeryczna jest używana do przesuwania manipulatorów i/lub stolika mikroskopu, zaktualizuj współrzędne, naciskając "z" na klawiaturze. 
		UWAGA: Ta czynność nie jest konieczna, jeśli klawiatura (stolik mikroskopu: A/D - oś x, W/S - oś y, R/F - oś z; manipulatory: H/K - oś x, U/J - oś y, O/L - oś z, 1/2 - numer jednostki) jest używana do sterowania ruchem, ponieważ współrzędne będą aktualizowane w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Rozpocznij kalibrację" w głównym graficznym interfejsie użytkownika (GUI) dla odpowiedniego urządzenia, do którego załadowana jest pipeta (Rysunek 2). 
		UWAGA: Po zakończeniu kalibracji pojawi się wyskakujące okienko. 
		UWAGA: Kalibracja zostanie przeprowadzona automatycznie, co zajmie około 3,5 min. Kliknięcie tego samego przycisku (przełączonego teraz na "anuluj kalibrację" po rozpoczęciu kalibracji) spowoduje przerwanie próby kalibracji.</li>
		<li>Zapisz kalibrację, klikając "zapisz kalibrację" na dole głównego GUI (zapisuje bieżącą kalibrację dla obu manipulatorów i można ją załadować w przyszłości). 
		UWAGA: Pole widzenia przy małym (4 lub 10x) i wysokim (40x) powiększeniu musi być wyrównane, aby kalibracja wtórna działała prawidłowo. Aby zapoznać się z procedurami wyrównywania, należy zapoznać się z instrukcją obsługi używanego układu optycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura automatycznego zaciskania łatki
<ol>
	<li>Przygotuj ostre wycinki mózgu, jak opisano wcześniej10.</li>
	<li>Przygotuj szklane pipety do zacisku krosowego.</li>
	<li>Umieść jeden plasterek mózgu na środku komory nagraniowej. Ustabilizuj plasterek za pomocą przytrzymania plasterka lub "harfy".</li>
	<li>Wykryj komórkę fluorescencyjną.
	<ol>
		<li>Znajdź obszar zainteresowania pod obiektywem 4X. Przesuń stolik mikroskopu, włączając tryb "kliknij, aby przesunąć" ("CTM") i kliknij środek obszaru zainteresowania. Alternatywnie, użyj klawiatury, aby przesunąć stolik mikroskopu (A/D - oś x, W/S - oś y, R/F - oś z).</li>
		<li>Przełącz się na obiektyw o dużym powiększeniu i wyreguluj ostrość, przesuwając mikroskop w osi z, używając R/F na klawiaturze. 
		UWAGA: Zaleca się regulację poziomu kąpieli wodnej tak, aby płaszczyzna ogniskowej pod soczewkami o małym i dużym powiększeniu była taka sama lub podobna w osi z.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Wykryj komórkę" w głównej kolumnie graficznego interfejsu użytkownika, "Jednostka 0". Jeśli dioda LED lub laserowe źródło światła konfiguracji nie może być sterowane sygnałem TTL, ręcznie włącz diodę LED/laser; po zakończeniu wykrywania komórki pojawi się wyskakujące okienko.
		<ol>
			<li>W razie potrzeby wyłącz diodę LED/laser; lista współrzędnych komórek pojawi się w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycje pamięci". Usuń niechciane komórki z listy, klikając przycisk "X" obok współrzędnych.</li>
			<li>Alternatywnie, jeśli komórki docelowe nie są oznaczone fluorescencyjnie, kliknij "Tryb myszy" w głównym graficznym interfejsie użytkownika. Kliknij komórkę, która Cię interesuje; na komórce pojawi się żółta kropka z liczbą, a współrzędne komórki pojawią się w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycje pamięci".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj pipetę wtórną.
	<ol>
		<li>Napełnij 1/3 szklanej pipety roztworem wewnętrznym. Załaduj pipetę do uchwytu na pipetę przymocowanego do głowicy.</li>
		<li>Użyj obiektywu o małym powiększeniu. Umieść pipetę w polu widzenia i wyreguluj ostrość za pomocą klawiatury (H/K - oś x, U/J - oś y, O/L - oś z). Użyj "1" i "2", aby przełączać się między jednostką 1 a jednostką 2.</li>
		<li>Załaduj kalibrację podstawową, klikając "Załaduj kalibrację". Kliknij przycisk "Kalibracja wtórna" w głównym graficznym interfejsie użytkownika pod używanym urządzeniem. Na przykład, jeśli używana jest jednostka 2, kliknij przycisk "Kalibracja wtórna" w kolumnie "Jednostka 2". Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w wyskakującym okienku, aby przełączyć się na obiektyw o dużym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Łatanie komórki docelowej.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że oprogramowanie "MultiClamp" (tj. amplifier) jest uruchomione. Kliknij przycisk "Kontrola poprawki", aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika "Kontrolka poprawki"; otwarcie tego graficznego interfejsu użytkownika może potrwać do kilku minut.</li>
		<li>Użyj obiektywu z 40-krotnym powiększeniem, sprawdzając "40X" w głównej kolumnie "Jednostka 0" w graficznym interfejsie użytkownika. Kliknij przycisk "idź do" obok interesującej Cię komórki na liście współrzędnych w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycja pamięci"; Mikroskop przeniesie się do komórki.</li>
		<li>Kliknij przycisk CTM używanej jednostki w głównym graficznym interfejsie użytkownika, aby umożliwić ruch po kliknięciu myszą. Kliknij komórkę, która Cię interesuje; Końcówka pipety przesunie się do celi.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Łatka" w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola poprawek". 
		UWAGA: Rozpocznie się automatyczne łatanie, a ciśnienie i opór można monitorować w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola łatki".
		<ol>
			<li>Użyj przycisku "Wybrano jednostkę 1", aby przełączyć sygnał wejściowy między dwiema jednostkami. 
			UWAGA: System zbliży się do komórki docelowej, zastosuje podciśnienie, dopasuje potencjał błony komórkowej i wykryje tworzenie się gigaseal w oparciu o szereg progów ciśnienia i oporu oraz logikę.</li>
			<li>Manipuluj automatycznym procesem w dowolnym momencie, klikając odpowiednie przyciski w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola poprawek". Na przykład kliknij ponownie przycisk "Łatka", aby anulować wersję próbną poprawki, a następnie kliknij "Następny etap", aby przejść proces łatania do następnego kroku, niezależnie od progu. 
			UWAGA: Wyskakujące okienko powiadomi użytkownika, gdy utworzy się gigaseal, a także zostanie przedstawiona opcja zastosowania zap wraz z dużym podciśnieniem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz "Tak", aby włamać się z połączonym zap-em i ssaniem. Alternatywnie wybierz "Nie", aby włamać się tylko z ssaniem. 
		UWAGA: Po pomyślnym zakończeniu łatania całej komórki, wyskakujące okienko przypomni użytkownikowi o zapisaniu dziennika poprawek eksperymentu.</li>
		<li>Zapisz dziennik poprawek eksperymentu. 
		UWAGA: Jeśli próba instalowania poprawek nie powiedzie się, użytkownik zostanie o tym powiadomiony w wyskakującym okienku, a proces łatania zostanie zresetowany.</li>
		<li>Wróć do kroku 2.4 i powtórz kroki z inną komórką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uściślij progi poprawek (opcjonalnie). 
	UWAGA: Progi początkowego zakresu oporu pipety, nadciśnienia i podciśnienia, oporu gigaseal itp. może być modyfikowany z pliku konfiguracyjnego.
	<ol>
		<li>Otwórz plik "PatchControlConfiguration.csv" w folderze "Konfiguracja" w miejscu docelowym, w którym zainstalowany jest system. Zmień liczby odpowiadające każdej wartości progowej. Nie zmieniaj nazw wartości; Spowoduje to nierozpoznawalne wpisy w systemie.</li>
		<li>Zaimplementuj nowe wartości progowe natychmiast, naciskając "Ctrl+L" bez ponownego uruchamiania programu; ponowne uruchomienie programu zaimplementuje najnowszą wartość progową z pliku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykonywanie nagrań
UWAGA: Tryb w sterowanym komputerowo wzmacniaczu mikroelektrod zostanie automatycznie ustawiony na Zacisk prądowy ("IC") przez oprogramowanie autopatchera po osiągnięciu pomyślnego łatania. Nagrania z użyciem clampów krosowych całych komórek można wykonać za pomocą wybranego oprogramowania do nagrywania (ten system nie zawiera funkcji nagrywania). Jeśli zidentyfikowano wiele komórek docelowych, po zakończeniu nagrywania wróć do kroku 2.4 i spróbuj użyć innej komórki.
<ol>
	<li>Przeprowadzaj eksperymenty z automatycznym miejscowym stosowaniem leków za pomocą picospritzera (opcjonalnie). 
	UWAGA: W tym przypadku eksperyment z lokalną aplikacją leku jest używany jako przykład w celu opisania, jak używać dodatkowej funkcji "Sekwencja poleceń" do sterowania zewnętrznym sprzętem za pomocą sygnałów TTL.
	<ol>
		<li>Podłącz port A, kanał 0 i masę na dodatkowej płycie DAQ do wejścia wyzwalacza startowego w digitizerze za pomocą odizolowanego BNC (zgodnie z opisem w kroku 1.2.3). Podłącz jeden cyfrowy kanał wyjściowy na digitizerze do zewnętrznego spustu na pikospritzerze.</li>
		<li>Przygotuj picospritzer zgodnie z instrukcją obsługi. Podłącz wylot powietrza picospritzer do uchwytu na pipetę do zaciągania się lekiem podłączonego do mikromanipulatora.</li>
		<li>Załaduj pipetę wypełnioną wybranym lekiem. Przymocuj go do uchwytu na pipety. Skalibruj pipetę zgodnie z opisem w kroku 1.7.</li>
		<li>Po załataniu komórki zgodnie z opisem w kroku 2.6 wybierz żądaną lokalizację do podania leku, klikając myszą w graficznym interfejsie użytkownika widoku kamery w "trybie myszy" (przełączonym z głównego graficznego interfejsu użytkownika). Alternatywnie, użyj graficznego interfejsu użytkownika "Siatka", aby zaprojektować siatkę, z każdym pikselem w siatce jako jedną z lokalizacji docelowych. 
		UWAGA: Siatką można manipulować w graficznym interfejsie użytkownika widoku kamery, przeciągając ją myszą.</li>
		<li>W graficznym interfejsie użytkownika "Sekwencja poleceń" wybierz manipulator, na którym zamontowana jest pipeta do leku. Kliknij "załaduj punkty myszy" lub "załaduj punkty siatki", aby zaimportować wszystkie współrzędne do dostarczania leku.
		<ol>
			<li>Kliknij każdy wpis współrzędnych, aby edytować określony sygnał TTL polecenia w prawej kolumnie. W pierwszym wpisie polecenia kliknij cyfrę po prawej stronie, aby zmienić ją z "0" na "1", wysyłając sygnał +5 V TTL. Ustaw czas (T) na żądany czas trwania sygnału TTL w ms.</li>
			<li>W drugim wpisie polecenia ustaw wszystkie cyfry na "0" i ustaw T na czas trwania nagrania próby. Edytuj polecenia dla wszystkich wpisów współrzędnych. Dodaj wpisy poleceń, klikając "+", jeśli potrzebnych jest wiele sygnałów TTL. 
			UWAGA: 8-cyfrowe bity reprezentują kanały 0-7 portu A na wtórnym DAQ (porty 1 - 3 są zajęte przez pompę i dwa zawory) można w razie potrzeby przełączyć.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utwórz protokół nagrywania w module akwizycji danych, tak aby rozpoczęcie przebiegu było wyzwalane przez zewnętrzny wyzwalacz startowy. Edytuj protokół, aby dostarczyć lek w żądanym czasie.</li>
		<li>W graficznym interfejsie użytkownika "Sekwencja poleceń" kliknij "Uruchom" po lewej stronie, aby uruchomić wszystkie współrzędne. Możesz też kliknąć "Uruchom" po prawej stronie, aby uruchomić tylko wybraną sekwencję. 
		UWAGA: Pipeta przesunie się do każdej współrzędnej i wykona sygnał TTL zgodnie z definicją, aby rozpocząć przemiatanie nagrywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li>
<li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li>
<li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630(2013).</li>
<li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACQ4%3A+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li>
<li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
</ol>

Nietymczasowe zgłoszenie patentowe "SYSTEMY I METODY AUTOMATYCZNEJ ELEKTROFIZJOLOGII PATCH-CLAMP STEROWANEJ OBRAZEM IN VITRO", numer seryjny USA: 15/353,719, zostało złożone 16 listopada 2016 r., Nr ref.: PRF 67270-02.

W tym miejscu opisujemy metodę automatycznych nagrań metodą patch clamp in vitro. Kluczowe kroki w tym procesie podsumowano w następujący sposób. Po pierwsze, komputerowe systemy wizyjne są wykorzystywane do automatycznego rozpoznawania końcówki pipety na podstawie serii obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopu. Informacje te są następnie wykorzystywane do obliczenia funkcji transformacji współrzędnych między mikroskopem a układami współrzędnych manipulatora. Widzenie komputerowe służy do automatycznego wykrywani...

Technika zaciskania krostek została po raz pierwszy opracowana przez Nehera i Sakmanna w latach siedemdziesiątych XX wieku do badania kanałów jonowych błon pobudliwych1. Od tego czasu zaciskanie plastrów zostało zastosowane w badaniu wielu różnych osób na poziomie komórkowym, synaptycznym i obwodowym - zarówno in vitro, jak i in vivo - w wielu różnych typach komórek, w tym neuronach, kardiomiocytach, oocytach Xenopus i sztucznych liposomach2. Proces ten obejmuje prawidłową identyfikację i ukierunkowanie na komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, skomplikowane sterowanie mikromanipulatorem w celu przesunięcia pipety z plastrem w bliską odległość od komórki, zastosowanie dodatniego i ujemnego ciśnienia do pipety w odpowiednim czasie w celu ustalenia szczelnej łatki gigaseal oraz włamanie w celu ustalenia konfiguracji łaty na całej komórce. Mocowanie łat jest zwykle wykonywane ręcznie i wymaga intensywnego szkolenia, aby je opanować. Nawet dla badacza doświadczonego z zaciskiem krosowym wskaźnik sukcesu jest stosunkowo niski. Ostatnio podjęto kilka prób zautomatyzowania eksperymentów z zaciskami krosowymi. W celu osiągnięcia automatyzacji rozwinęły się dwie główne strategie: rozszerzenie standardowych urządzeń do zaciskania krosówek w celu zapewnienia automatycznej kontroli procesu łatania oraz projektowanie nowych urządzeń i technik od podstaw. Pierwszą strategię można dostosować do istniejącego sprzętu i można ją stosować w różnych zastosowaniach, w tym w ślepych zaciskach in vivo3,4,5, in vitro patch clamp ostrych wycinków mózgu, organotypowych kultur warstwowych i hodowanych zdysocjowanych neuronów6. Umożliwia przeszukiwanie złożonych obwodów lokalnych przy użyciu wielu mikromanipulatorów jednocześnie7. Metoda łaty planarnej jest przykładem nowej strategii rozwoju, która może osiągnąć wysoką przepustowość jednoczesnego zacisku krosowego komórek w zawiesinie do celów badań przesiewowych leków8. Jednak metoda łaty płaskiej nie ma zastosowania do wszystkich typów komórek, w szczególności neuronów z długimi wyrostkami lub nienaruszonymi obwodami zawierającymi rozległe połączenia. Ogranicza to jego zastosowanie do mapowania skomplikowanych obwodów układu nerwowego, co jest kluczową zaletą tradycyjnej technologii zacisków krosowych.
Opracowaliśmy system, który automatyzuje proces ręcznego zaciskania krostek in vitro, rozszerzając standardowy sprzęt do zaciskania krostek. Nasz system, Autopatcher IG, zapewnia automatyczną kalibrację pipet, identyfikację docelowych komórek fluorescencyjnych, automatyczną kontrolę ruchu pipet, automatyczne łatanie całych komórek i rejestrowanie danych. System może automatycznie rejestrować wiele obrazów wycinków mózgu na różnych głębokościach; analizować je za pomocą wizji komputerowej; i wyodrębnij informacje, w tym współrzędne komórek znakowanych fluorescencyjnie. Informacje te można następnie wykorzystać do namierzania i automatycznego łatania interesujących komórek. Oprogramowanie jest napisane w Pythonie — darmowym języku programowania typu open source — przy użyciu kilku bibliotek typu open source. Zapewnia to jego dostępność dla innych badaczy oraz poprawia odtwarzalność i rygor eksperymentów elektrofizjologicznych. System ma konstrukcję modułową, dzięki czemu dodatkowy sprzęt można łatwo połączyć z obecnym systemem przedstawionym tutaj.

<table><tbody><tr><td>Kamera CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Zawiera mikroskop i manipulatory. Dostarczone przez producenta oprogramowanie sterujące manipulatorem pokazane w tym manuskrypcie to " Linlab2".</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>MultiClamp 700B</td><td>sterowany komputerowo wzmacniacz mikroelektrod</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td> Źródło światła LED <td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td> o <td>długości fali 488 nm</td></tr><tr><td>Płytka akwizycji danych</td><td>Pomiar Obliczenia</td><td>USB1208-FS</td><td>Wtórny DAQ. Zobacz instrukcję pod adresem : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Zawory elektromagnetyczne</td><td>The Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>Pompa powietrza</td><td>Przemysł wirtualny</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik ciśnienia powietrza</td><td>Półprzewodniki Freescale</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Docisk Slice</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Zestaw kotew Slice, płaski do komory RC-40, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>wersja 2.7 (32-bitowa dla systemu Windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Zaciski śrubowe</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Zaciski śrubowe 3,5 mm raster (2-pin)</td></tr><tr><td>(2-pin)N-kanałowy</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>Gniazda DIP Końcówka lutowana - 8-pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Czerwona 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Podstawowy zielony 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>Gniazdo/złącze zasilania beczki DC (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz ścienny - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Przewód połączeniowy - zestaw (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Blokada męska x żeńska x żeńska x żeńska</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Elastyczne rurki</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Średnica zewnętrzna: 1/8 cala Średnica wewnętrzna: 1/16 cala.</td></tr><tr><td>koncentryczny BNC męski na BNC męski</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>Rezystor 560 Ohm (tolerancja 5%)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Zawór ogólny</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Zacisk krosowy dla całych komórek to złoty standard do pomiaru właściwości elektrycznych pojedynczych komórek. Jednak zacisk krosowy in vitro pozostaje trudną i niskoprzepustową techniką ze względu na swoją złożoność i dużą zależność od obsługi i kontroli użytkownika. Manuskrypt ten demonstruje sterowany obrazem automatyczny system zaciskania krostek do eksperymentów in vitro z klamrami krosowymi całych komórek w ostrych wycinkach mózgu. Nasz system implementuje algorytm oparty na wizji komputerowej do wykrywania komórek znakowanych fluorescencyjnie i kierowania ich do w pełni automatycznego łatania za pomocą mikromanipulatora i wewnętrznej kontroli ciśnienia pipety. Cały proces jest wysoce zautomatyzowany, z minimalnymi wymaganiami dotyczącymi interwencji człowieka. Informacje eksperymentalne w czasie rzeczywistym, w tym opór elektryczny i ciśnienie wewnętrzne pipety, są dokumentowane elektronicznie w celu przyszłej analizy i optymalizacji pod kątem różnych typów komórek. Chociaż nasz system jest opisany w kontekście zapisów ostrych wycinków mózgu, można go również zastosować do zautomatyzowanego, sterowanego obrazem zacisku krosowego zdysocjowanych neuronów, organotypowych kultur warstwowych i innych typów komórek nieneuronalnych.

Nasz system został przetestowany pod kątem zdolności do patchowania komórek w ostrych skrawkach mózgu, mysich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSCs) zróżnicowanych w neurony oraz komórkach HEK 293 sztucznie wykazujących ekspresję interesujących nas kanałów. Rysunek 3 przedstawia eksperyment z wykorzystaniem myszy transgenicznych Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J), ukierunkowany na fluorescencyjnie oznakowane neurony pira...

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Ogólnym celem tej technologii jest wykorzystanie wizji komputerowej do automatycznego wykrywania fluorescencyjnych komórek i przeprowadzania zautomatyzowanego patch clampu tych komórek w ostrych skrawkach mózgu. Metoda ta może pomóc w pokonaniu kluczowych trudności w dziedzinie elektrofizjologii patch clamp, takich jak identyfikacja, celowanie i rejestracja metodą patch clamp komórek znakowanych fluorescencyjnie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość automatycznego wykrywania pipet do patch clampu oraz fluorescencyjnych komórek, a także integracja tych etapów z automatycznym patch clampem.Innowacja ta znacząco zwiększa przepustowość eksperymentalną. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę zaburzeń neurologicznych, ponieważ automatyczny patch clamp sterowany obrazem o wysokiej przepustowości może być wykorzystywany do przesiewów farmakologicznych w bardziej fizjologicznych preparatach neuronalnych. Metodę tę można zastosować również do innych preparatów in vitro, takich jak typowe organelle neuronalne, kultury plastrów, neurony dysocjowane, a także dowolne komórki nieneuronalne.Aby rozpocząć tę procedurę, włącz wzmacniacz, sterownik mikroskopu oraz sterownik manipulatora. Następnie uruchom program Autopatcher IG za pomocą języka python z terminala wiersza poleceń, zmieniając najpierw katalog, w którym zainstalowano Autopatcher IG. W dalszej kolejności wpisz Python Autopatcher_IG.Wpisz PYW w terminalu wiersza poleceń i naciśnij klawisz enter. Następnie napełnij całą szklaną pipetę roztworem wewnętrznym i zamocuj ją w uchwycie głowicy. Przesuń końcówkę pipety do pola widzenia mikroskopu i ustaw ostrość.Jeśli do przemieszczania manipulatorów w stole mikroskopu użyto pokrętła, należy zaktualizować współrzędne, naciskając klawisz Z na klawiaturze. Kalibracja podstawowa przelicza kąt i dystans ruchu manipulatora na system współrzędnych mikroskopu. Manipulator przemieszcza się w trzech kierunkach o zadaną odległość, a oprogramowanie wykrywa współrzędne końcówki pipety w polu widzenia mikroskopu.Kliknij przycisk start calibration w głównym interfejsie użytkownika (GUI) dla odpowiadającej jednostki, na której załadowana jest pipeta. Następnie zapisz kalibrację, klikając save calibration na dole głównego GUI. Tę kalibrację wstępną należy przeprowadzić tylko raz, chyba że zmieniono fizyczną konfigurację urządzenia.Na tym etapie należy umieścić jeden plaster mózgu w centrum komory rejestracyjnej. Plaster mózgu należy ustabilizować za pomocą uchwytu do plastrów lub harfy. Aby wykryć fluorescencyjną komórkę, należy odnaleźć obszar zainteresowania przy czterokrotnym powiększeniu.Następnie przesuń stolik mikroskopu, włączając tryb przesuwania jednym kliknięciem i klikając w centrum obszaru zainteresowania. Alternatywnie można użyć klawiatury numerycznej do przesuwania stolika mikroskopu. Następnie przełącz na obiektyw o dużym powiększeniu i ustaw ostrość, przesuwając mikroskop w osi Z za pomocą przycisku RF na klawiaturze.Oprogramowanie steruje mikroskopem i kamerą w celu wykonania serii obrazów na różnych głębokościach. Następnie obrazy te są poddawane przetwarzaniu za pomocą wizji komputerowej w celu zlokalizowania komórek znakowanych fluorescencyjnie. Wynikiem końcowym jest lista współrzędnych wykrytych komórek.Kliknij przycisk detect cell w głównej kolumnie interfejsu GUI dla jednostki zero. Jeśli źródło światła LED lub laser w układzie nie może być sterowane sygnałem TTL, włącz LED lub laser ręcznie. W razie potrzeby wyłącz LED lub laser.W interfejsie graficznym pozycji pamięci pojawi się lista współrzędnych komórek. Usuń niepożądane komórki z listy, klikając przycisk X obok współrzędnych. Alternatywnie, jeśli komórki docelowe nie są znakowane fluorescencyjnie, kliknij tryb myszy (mouse mode) w głównym interfejsie graficznym.Następnie należy kliknąć wybraną komórkę; na komórce pojawi się żółta kropka z numerem, a jej współrzędne zostaną wyświetlone w interfejsie graficznym pozycji pamięci. Aby przeprowadzić kalibrację wtórną w celu wykrycia współrzędnych przesunięcia pipety, należy napełnić 1/3 szklanej pipety roztworem wewnętrznym. Następnie należy umieścić pipetę w uchwycie do pipet przymocowanym do zespołu głowicy.Przy małym powiększeniu użyj klawiszy jeden i dwa na klawiaturze, aby przełączać się między jednostką pierwszą a jednostką drugą. Następnie wprowadź pipetę w pole widzenia i dostosuj ostrość za pomocą klawiatury. W następnym kroku załaduj kalibrację podstawową, klikając w opcję ładuj kalibrację.Przełącz obiektyw mikroskopu na duże powiększenie i kliknij 40 razy w głównym GUI. Przenieś końcówkę pipety do środka. Następnie kliknij przycisk kalibracji wtórnej w głównym GUI, pod jednostką, która jest aktualnie używana.Aby przeprowadzić patch-clamp komórki docelowej, kliknij przycisk sterowania patch-clamp, aby otworzyć interfejs graficzny sterowania. Kliknij przycisk przejścia („go to”) obok wybranej komórki na liście współrzędnych w interfejsie pozycji w pamięci. Następnie kliknij przycisk CTM jednostki w głównym interfejsie graficznym, aby umożliwić ruch.Kliknij wybraną komórkę, aby przenieść końcówkę pipety do tej komórki. Ze względu na ograniczenia mechaniczne manipulatora, przy przemieszczaniu się na odległość przekraczającą 500 micrometer może wystąpić niewielki błąd pozycjonowania. Aby zapobiec dużemu błędowi pozycjonowania mechanicznego, w pobliżu komórki docelowej należy przeprowadzić kalibrację wtórną.Następnie należy użyć przycisku wyboru jednostki (unit one selected), aby przełączyć sygnał wejściowy między dwiema jednostkami. Kliknij przycisk patch w interfejsie graficznym (GUI) sterownika patch. Rozpocznie się automatyczny patching, a ciśnienie i rezystancję można monitorować w interfejsie graficznym sterownika patch.Algorytm automatycznego uszczelniania monitoruje rezystancję i kontroluje ciśnienie poprzez serię pętli logicznych w celu utworzenia gigaseala. Okno pop-up powiadamia o utworzeniu gigaseala. System wykorzystuje zmianę rezystancji do rozpoznania kontaktu z powierzchnią komórki.W sytuacji, gdy kontakt z powierzchnią komórki nie zostanie wykryty na czas, należy użyć przycisku „next”, aby przejść do etapu patchowania, pozostając w ramach tej samej automatycznej próby patchowania. Proces automatyczny można modyfikować w dowolnym momencie, klikając odpowiednie przyciski w interfejsie GUI sterowania patchowaniem. Następnie należy wybrać „yes”, aby wymusić wejście za pomocą połączonego impulsu Zap i ssania.Alternatywnie, wybierz opcję „no”, aby wykonać przebicie membrany wyłącznie za pomocą ssania. Następnie zapisz dziennik łatania eksperymentalnego. Rysunek ten przedstawia wybrane lokalizacje załadowane do GUI sekwencji poleceń.Lewa kolumna przedstawia listę współrzędnych, a prawa kolumna listę poleceń w formie sygnałów TTL dla każdej lokalizacji. Poniżej znajdują się zrzuty ekranu z eksperymentu aplikacji leku, odpowiadające trzem wybranym lokalizacjom. Roztwór KCL zmieszano z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji.Jednostka pierwsza była pipetą zawierającą KCl, a jednostka druga była pipetą do patch-clampu. Na tym rysunku wstrzyknięcia prądu skokowego obrazują regularnie wyładowujący neuron. Przedstawione są tutaj zapisy z rejestracji metodą clampowania napięcia (voltage clamp) podczas lokalnej aplikacji 500 mM roztworu chlorku potasu w trzech miejscach.Czerwony ślad z prądem wewnątrzkomórkowym został zarejestrowany podczas próby, w której aplikacja chlorku potasu odbyła się w bliskim sąsiedztwie komórki poddanej patch-clampowi. Czerwona strzałka wskazuje moment aplikacji chlorku potasu. Stosując tę metodę, można przeprowadzić próbę patch-clamp w ciągu czterech minut bez konieczności przechodzenia rozległego szkolenia w porównaniu do manualnego patchowania.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak optogenetyka, chemogenetyka i manipulacje farmakologiczne, w celu udzielenia odpowiedzi na pytania związane z projektem badawczym. Po jej opracowaniu technika ta może utorować drogę badaczom z dziedziny neuronauki do prowadzenia wysokoprzepustowych badań nad receptorami synaptycznymi i kanałami jonowymi w różnych preparatach in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów automatycznego patch clampu z prowadzeniem obrazowym.

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Ten film pokazuje umieszczanie pipety o cienkim czubku w pobliżu wycinków mózgu, tworząc pieczęć z komórką neuronalną. Zasysanie przerywa błonę komórkową, tworząc w ten sposób klamrę krosową całej komórki, która umożliwia pomiary prądu do eksperymentów elektrofizjologicznych.

Ustalenie konfiguracji cęgów napięciowych całej komórki dla zapisów elektrofizjologicznych w wycinkach mózgu

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

W tym filmie wycinki mózgu są unieruchomione w komorze nagraniowej, a interesujące komórki są lokalizowane i skupiane za pomocą mikroskopu sterowanego komputerowo. Zautomatyzowany system przetwarzania obrazu precyzyjnie ustawia pipetę z plastrem w celu uszczelnienia błony komórkowej i monitorowania sygnałów elektrycznych.

Zautomatyzowana technika zaciskania krosowego sterowana obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

W tym artykule opisujemy użyteczną metodę badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach ostro izolowanych wycinków mózgu.  Metoda ta polega na użyciu mikropipety wypełnionej lekiem do miejscowego nakładania leków na neurony zarejestrowane przy użyciu standardowych technik patch clamp.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Poznaj zautomatyzowaną metodę patch-clamp sterowaną obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu. Technika wykorzystuje widzenie komputerowe do detekcji komórek fluorescencyjnych, zwiększając przepustowość eksperymentów elektrofizjologicznych i umożliwiając farmakologiczne badania przesiewowe.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów