Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Ogólnym celem tej technologii jest wykorzystanie widzenia komputerowego do automatycznego wykrywania komórek fluorescencyjnych i wykonywania automatycznego zaciskania tych komórek w ostrych wycinkach mózgu. Metoda ta może pomóc w przezwyciężeniu kluczowych trudności w dziedzinie elektrofizjologii patch clamp, takich jak identyfikacja, celowanie i patch clamp komórek znakowanych fluorescencyjnie. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona automatycznie wykrywać pipety krosowe, komórki fluorescencyjne i integrować kroki z automatycznym zaciskiem krosowym.

Ta innowacja znacznie zwiększa przepustowość eksperymentalną. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę zaburzeń neurologicznych, ponieważ wysokowydajny automatyczny zacisk plastrowy sterowany obrazem może być stosowany do farmakologicznych badań przesiewowych w bardziej fizjologicznych preparatach neuronalnych. Metoda ta może być również stosowana do innych preparatów in vitro, takich jak organelle neuronalne typowe lub hodowle warstwowe, dysocjujące neurony, a także wszelkie komórki nieneuronalne.

Aby rozpocząć tę procedurę, włącz amplifier, kontroler mikroskopu i kontroler manipulatora. Następnie uruchom Autopatcher IG z pythonem z terminala wiersza poleceń, najpierw zmieniając katalog, w którym zainstalowany jest Autopatcher IG. Następnie wpisz Python Autopatcher_IG.

PYW w terminalu wiersza poleceń i naciśnij Enter. Następnie napełnij całą szklaną pipetę roztworem wewnętrznym i załaduj ją do stopnia głównego. Przesuń końcówkę pipety w kierunku pola widzenia mikroskopu i ustaw na niej ostrość.

Jeśli klawiatura numeryczna jest używana do przesuwania manipulatorów w stoliku mikroskopu, zaktualizuj współrzędne, naciskając Z na klawiaturze. Kalibracja pierwotna konwertuje kąt i odległość ruchu manipulatora na układ współrzędnych mikroskopu. Manipulator porusza się w trzech kierunkach z zadaną odległością, a oprogramowanie wykrywa współrzędne końcówki pipety w polu widzenia mikroskopu.

Kliknij przycisk rozpoczęcia kalibracji w głównym graficznym interfejsie użytkownika dla odpowiedniego urządzenia, do którego załadowana jest pipeta. Następnie zapisz kalibrację, klikając przycisk Zapisz kalibrację u dołu głównego graficznego interfejsu użytkownika. Ta pierwotna kalibracja jest konieczna do wykonania tylko raz, chyba że fizyczna organizacja platformy zostanie zmieniona.

W tym kroku umieść jeden plasterek mózgu na środku komory nagraniowej. Ustabilizuj wycinek mózgu za pomocą przytrzymania plasterka lub harfy. Aby wykryć komórkę fluorescencyjną, znajdź obszar zainteresowania pod czterokrotnym powiększeniem.

Następnie przesuń stolik mikroskopu, włączając tryb klikania, aby przesunąć i kliknij środek obszaru zainteresowania. Alternatywnie, użyj klawiatury, aby przesunąć stolik mikroskopu. Następnie przełącz się na obiektyw o dużym powiększeniu i wyreguluj ostrość, przesuwając mikroskop w osi Z za pomocą RF na klawiaturze.

Oprogramowanie kieruje mikroskopem i kamerą w celu wykonania serii zdjęć na różnych głębokościach. Następnie obrazy te są poddawane komputerowemu przetwarzaniu wizyjnemu w celu znalezienia komórek znakowanych fluorescencyjnie. Końcowym wynikiem jest lista wykrytych współrzędnych komórek.

Kliknij przycisk wykrywania komórki na głównej kolumnie GUI jednostki zero. Jeśli dioda LED lub laserowe źródło światła zestawu nie może być sterowane za pomocą sygnału TTL, ręcznie włącz diodę LED lub laser. W razie potrzeby wyłącz diodę LED lub laser.

Lista współrzędnych komórek pojawi się w graficznym interfejsie użytkownika pozycji pamięci. Usuń niechciane komórki z listy, klikając przycisk X obok współrzędnych. Alternatywnie, jeśli komórki docelowe nie są znakowane fluorescencyjnie, kliknij przycisk myszy na głównym graficznym interfejsie użytkownika.

Następnie kliknij interesującą Cię komórkę, na komórce pojawi się żółta kropka z liczbą, a współrzędne komórki pojawią się w GUI pozycji pamięci. Aby przeprowadzić kalibrację wtórną w celu wykrycia współrzędnych przesunięcia pipety, należy napełnić 1/3 szklanej pipety roztworem wewnętrznym. Następnie załaduj pipetę do uchwytu pipety przymocowanego do stopnia głowicy.

Przy małym powiększeniu użyj jedynki i dwójki na klawiaturze, aby przełączać się między jednostką pierwszą a drugą. Następnie umieść pipetę w polu widzenia i wyreguluj ostrość za pomocą klawiatury. Następnie załaduj kalibrację podstawową, klikając kalibrację obciążenia.

Przełącz obiektyw mikroskopu na duże powiększenie i kliknij 40 razy na głównym graficznym interfejsie użytkownika. Przesuń końcówkę pipety do środka. Następnie kliknij przycisk kalibracji pomocniczej w głównym graficznym interfejsie użytkownika, pod używaną jednostką.

Aby załatać komórkę docelową, kliknij przycisk kontroli łatki, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika kontrolki poprawki. Kliknij przycisk Idź do obok interesującej Cię komórki na liście współrzędnych w graficznym interfejsie użytkownika pozycji pamięci. Następnie kliknij przycisk CTM jednostki w głównym graficznym interfejsie użytkownika, aby umożliwić ruch.

Kliknij interesującą Cię komórkę, aby przesunąć końcówkę pipety do tej komórki. Ze względu na ograniczenia mechaniczne manipulatora, przy podróży na odległość większą niż 500 mikrometrów może wystąpić niewielki błąd pozycjonowania. Aby zapobiec dużemu błędowi pozycjonowania mechanicznego, kalibrację wtórną należy przeprowadzić w pobliżu celi docelowej.

Następnie użyj jednego wybranego przycisku urządzenia, aby przełączyć sygnał wejściowy między dwiema jednostkami. Kliknij przycisk łatki w graficznym interfejsie użytkownika kontrolki poprawki. Rozpocznie się automatyczne łatanie, a ciśnienie i opór można monitorować w graficznym interfejsie użytkownika kontroli poprawek.

Algorytm automatycznego łatania monitoruje opór i kontroluje ciśnienie za pomocą szeregu pętli logicznych, tworząc gigaseal. Wyskakujące okienko informuje o utworzeniu gigaseal. System wykorzystuje zmianę rezystancji do rozpoznawania kontaktu z powierzchnią komórki.

W sytuacji, gdy kontakt komórka-powierzchnia nie zostanie wykryty na czas, użyj przycisku Dalej, aby przejść do etapu łatania, pozostając w tej samej próbie automatycznego łatania. Manipuluj automatycznym procesem w dowolnym momencie, klikając odpowiednie przyciski w graficznym interfejsie użytkownika kontroli poprawek. Następnie wybierz tak, aby włamać się z połączonym Zap i ssaniem.

Alternatywnie wybierz opcję nie, aby włamać się tylko z ssaniem. Następnie zapisz dziennik poprawek eksperymentu. Na tym rysunku przedstawiono wybrane lokalizacje załadowane do graficznego interfejsu użytkownika sekwencji poleceń.

Lewa kolumna pokazuje listę współrzędnych, a prawa kolumna pokazuje listę poleceń w postaci sygnałów TTL dla każdej lokalizacji. Poniżej znajdują się zrzuty ekranu z eksperymentu z zastosowaniem leku, odpowiadające trzem wybranym lokalizacjom. Roztwór KCL zmieszano z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji.

Jednostka pierwsza to pipeta zawierająca KCL, a jednostka druga to pipeta do łatania. Na tym rysunku zastrzyki prądu krokowego pokazują regularny neuron impulsowy. Pokazano tutaj cęgi napięciowe rejestrujące ślady z miejscowego nałożenia 500-milimolowego roztworu chlorku potasu w trzech miejscach.

Czerwony ślad z prądem wewnętrznym zarejestrowano z próby, gdy aplikacja chlorku potasu była blisko komórki krosowej. Czerwona strzałka wskazuje czas aplikacji chlorku potasu. Korzystając z tej metody, można przeprowadzić próbę zacisku łatowego w ciągu czterech minut bez intensywnego szkolenia w porównaniu z łataniem ręcznym.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak optogenetyka, chemogenetyka i manipulacje farmakologiczne, aby odpowiedzieć na pytania związane z Twoim projektem badawczym. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania wysokoprzepustowych badań receptorów synaptycznych i kanałów jonowych w różnych preparatach in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać eksperymenty z automatycznym zaciskiem krosowym sterowane obrazem.