Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Ogólnym celem tej technologii jest wykorzystanie wizji komputerowej do automatycznego wykrywania fluorescencyjnych komórek i przeprowadzania zautomatyzowanego patch clampu tych komórek w ostrych skrawkach mózgu. Metoda ta może pomóc w pokonaniu kluczowych trudności w dziedzinie elektrofizjologii patch clamp, takich jak identyfikacja, celowanie i rejestracja metodą patch clamp komórek znakowanych fluorescencyjnie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość automatycznego wykrywania pipet do patch clampu oraz fluorescencyjnych komórek, a także integracja tych etapów z automatycznym patch clampem.

Innowacja ta znacząco zwiększa przepustowość eksperymentalną. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę zaburzeń neurologicznych, ponieważ automatyczny patch clamp sterowany obrazem o wysokiej przepustowości może być wykorzystywany do przesiewów farmakologicznych w bardziej fizjologicznych preparatach neuronalnych. Metodę tę można zastosować również do innych preparatów in vitro, takich jak typowe organelle neuronalne, kultury plastrów, neurony dysocjowane, a także dowolne komórki nieneuronalne.

Aby rozpocząć tę procedurę, włącz wzmacniacz, sterownik mikroskopu oraz sterownik manipulatora. Następnie uruchom program Autopatcher IG za pomocą języka python z terminala wiersza poleceń, zmieniając najpierw katalog, w którym zainstalowano Autopatcher IG. W dalszej kolejności wpisz Python Autopatcher_IG.

Wpisz PYW w terminalu wiersza poleceń i naciśnij klawisz enter. Następnie napełnij całą szklaną pipetę roztworem wewnętrznym i zamocuj ją w uchwycie głowicy. Przesuń końcówkę pipety do pola widzenia mikroskopu i ustaw ostrość.

Jeśli do przemieszczania manipulatorów w stole mikroskopu użyto pokrętła, należy zaktualizować współrzędne, naciskając klawisz Z na klawiaturze. Kalibracja podstawowa przelicza kąt i dystans ruchu manipulatora na system współrzędnych mikroskopu. Manipulator przemieszcza się w trzech kierunkach o zadaną odległość, a oprogramowanie wykrywa współrzędne końcówki pipety w polu widzenia mikroskopu.

Kliknij przycisk start calibration w głównym interfejsie użytkownika (GUI) dla odpowiadającej jednostki, na której załadowana jest pipeta. Następnie zapisz kalibrację, klikając save calibration na dole głównego GUI. Tę kalibrację wstępną należy przeprowadzić tylko raz, chyba że zmieniono fizyczną konfigurację urządzenia.

Na tym etapie należy umieścić jeden plaster mózgu w centrum komory rejestracyjnej. Plaster mózgu należy ustabilizować za pomocą uchwytu do plastrów lub harfy. Aby wykryć fluorescencyjną komórkę, należy odnaleźć obszar zainteresowania przy czterokrotnym powiększeniu.

Następnie przesuń stolik mikroskopu, włączając tryb przesuwania jednym kliknięciem i klikając w centrum obszaru zainteresowania. Alternatywnie można użyć klawiatury numerycznej do przesuwania stolika mikroskopu. Następnie przełącz na obiektyw o dużym powiększeniu i ustaw ostrość, przesuwając mikroskop w osi Z za pomocą przycisku RF na klawiaturze.

Oprogramowanie steruje mikroskopem i kamerą w celu wykonania serii obrazów na różnych głębokościach. Następnie obrazy te są poddawane przetwarzaniu za pomocą wizji komputerowej w celu zlokalizowania komórek znakowanych fluorescencyjnie. Wynikiem końcowym jest lista współrzędnych wykrytych komórek.

Kliknij przycisk detect cell w głównej kolumnie interfejsu GUI dla jednostki zero. Jeśli źródło światła LED lub laser w układzie nie może być sterowane sygnałem TTL, włącz LED lub laser ręcznie. W razie potrzeby wyłącz LED lub laser.

W interfejsie graficznym pozycji pamięci pojawi się lista współrzędnych komórek. Usuń niepożądane komórki z listy, klikając przycisk X obok współrzędnych. Alternatywnie, jeśli komórki docelowe nie są znakowane fluorescencyjnie, kliknij tryb myszy (mouse mode) w głównym interfejsie graficznym.

Następnie należy kliknąć wybraną komórkę; na komórce pojawi się żółta kropka z numerem, a jej współrzędne zostaną wyświetlone w interfejsie graficznym pozycji pamięci. Aby przeprowadzić kalibrację wtórną w celu wykrycia współrzędnych przesunięcia pipety, należy napełnić 1/3 szklanej pipety roztworem wewnętrznym. Następnie należy umieścić pipetę w uchwycie do pipet przymocowanym do zespołu głowicy.

Przy małym powiększeniu użyj klawiszy jeden i dwa na klawiaturze, aby przełączać się między jednostką pierwszą a jednostką drugą. Następnie wprowadź pipetę w pole widzenia i dostosuj ostrość za pomocą klawiatury. W następnym kroku załaduj kalibrację podstawową, klikając w opcję ładuj kalibrację.

Przełącz obiektyw mikroskopu na duże powiększenie i kliknij 40 razy w głównym GUI. Przenieś końcówkę pipety do środka. Następnie kliknij przycisk kalibracji wtórnej w głównym GUI, pod jednostką, która jest aktualnie używana.

Aby przeprowadzić patch-clamp komórki docelowej, kliknij przycisk sterowania patch-clamp, aby otworzyć interfejs graficzny sterowania. Kliknij przycisk przejścia („go to”) obok wybranej komórki na liście współrzędnych w interfejsie pozycji w pamięci. Następnie kliknij przycisk CTM jednostki w głównym interfejsie graficznym, aby umożliwić ruch.

Kliknij wybraną komórkę, aby przenieść końcówkę pipety do tej komórki. Ze względu na ograniczenia mechaniczne manipulatora, przy przemieszczaniu się na odległość przekraczającą 500 micrometer może wystąpić niewielki błąd pozycjonowania. Aby zapobiec dużemu błędowi pozycjonowania mechanicznego, w pobliżu komórki docelowej należy przeprowadzić kalibrację wtórną.

Następnie należy użyć przycisku wyboru jednostki (unit one selected), aby przełączyć sygnał wejściowy między dwiema jednostkami. Kliknij przycisk patch w interfejsie graficznym (GUI) sterownika patch. Rozpocznie się automatyczny patching, a ciśnienie i rezystancję można monitorować w interfejsie graficznym sterownika patch.

Algorytm automatycznego uszczelniania monitoruje rezystancję i kontroluje ciśnienie poprzez serię pętli logicznych w celu utworzenia gigaseala. Okno pop-up powiadamia o utworzeniu gigaseala. System wykorzystuje zmianę rezystancji do rozpoznania kontaktu z powierzchnią komórki.

W sytuacji, gdy kontakt z powierzchnią komórki nie zostanie wykryty na czas, należy użyć przycisku „next”, aby przejść do etapu patchowania, pozostając w ramach tej samej automatycznej próby patchowania. Proces automatyczny można modyfikować w dowolnym momencie, klikając odpowiednie przyciski w interfejsie GUI sterowania patchowaniem. Następnie należy wybrać „yes”, aby wymusić wejście za pomocą połączonego impulsu Zap i ssania.

Alternatywnie, wybierz opcję „no”, aby wykonać przebicie membrany wyłącznie za pomocą ssania. Następnie zapisz dziennik łatania eksperymentalnego. Rysunek ten przedstawia wybrane lokalizacje załadowane do GUI sekwencji poleceń.

Lewa kolumna przedstawia listę współrzędnych, a prawa kolumna listę poleceń w formie sygnałów TTL dla każdej lokalizacji. Poniżej znajdują się zrzuty ekranu z eksperymentu aplikacji leku, odpowiadające trzem wybranym lokalizacjom. Roztwór KCL zmieszano z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji.

Jednostka pierwsza była pipetą zawierającą KCl, a jednostka druga była pipetą do patch-clampu. Na tym rysunku wstrzyknięcia prądu skokowego obrazują regularnie wyładowujący neuron. Przedstawione są tutaj zapisy z rejestracji metodą clampowania napięcia (voltage clamp) podczas lokalnej aplikacji 500 mM roztworu chlorku potasu w trzech miejscach.

Czerwony ślad z prądem wewnątrzkomórkowym został zarejestrowany podczas próby, w której aplikacja chlorku potasu odbyła się w bliskim sąsiedztwie komórki poddanej patch-clampowi. Czerwona strzałka wskazuje moment aplikacji chlorku potasu. Stosując tę metodę, można przeprowadzić próbę patch-clamp w ciągu czterech minut bez konieczności przechodzenia rozległego szkolenia w porównaniu do manualnego patchowania.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak optogenetyka, chemogenetyka i manipulacje farmakologiczne, w celu udzielenia odpowiedzi na pytania związane z projektem badawczym. Po jej opracowaniu technika ta może utorować drogę badaczom z dziedziny neuronauki do prowadzenia wysokoprzepustowych badań nad receptorami synaptycznymi i kanałami jonowymi w różnych preparatach in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów automatycznego patch clampu z prowadzeniem obrazowym.