Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu
31 lipca 2017
Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.
Ogólnym celem tej technologii jest wykorzystanie widzenia komputerowego do automatycznego wykrywania komórek fluorescencyjnych i wykonywania automatycznego zaciskania tych komórek w ostrych wycinkach mózgu. Metoda ta może pomóc w przezwyciężeniu kluczowych trudności w dziedzinie elektrofizjologii patch clamp, takich jak identyfikacja, celowanie i patch clamp komórek znakowanych fluorescencyjnie. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona automatycznie wykrywać pipety krosowe, komórki fluorescencyjne i integrować kroki z automatycznym zaciskiem krosowym.
Ta innowacja znacznie zwiększa przepustowość eksperymentalną. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę zaburzeń neurologicznych, ponieważ wysokowydajny automatyczny zacisk plastrowy sterowany obrazem może być stosowany do farmakologicznych badań przesiewowych w bardziej fizjologicznych preparatach neuronalnych. Metoda ta może być również stosowana do innych preparatów in vitro, takich jak organelle neuronalne typowe lub hodowle warstwowe, dysocjujące neurony, a także wszelkie komórki nieneuronalne.
Aby rozpocząć tę procedurę, włącz amplifier, kontroler mikroskopu i kontroler manipulatora. Następnie uruchom Autopatcher IG z pythonem z terminala wiersza poleceń, najpierw zmieniając katalog, w którym zainstalowany jest Autopatcher IG. Następnie wpisz Python Autopatcher_IG.
PYW w terminalu wiersza poleceń i naciśnij Enter. Następnie napełnij całą szklaną pipetę roztworem wewnętrznym i załaduj ją do stopnia głównego. Przesuń końcówkę pipety w kierunku pola widzenia mikroskopu i ustaw na niej ostrość.
Jeśli klawiatura numeryczna jest używana do przesuwania manipulatorów w stoliku mikroskopu, zaktualizuj współrzędne, naciskając Z na klawiaturze. Kalibracja pierwotna konwertuje kąt i odległość ruchu manipulatora na układ współrzędnych mikroskopu. Manipulator porusza się w trzech kierunkach z zadaną odległością, a oprogramowanie wykrywa współrzędne końcówki pipety w polu widzenia mikroskopu.
Kliknij przycisk rozpoczęcia kalibracji w głównym graficznym interfejsie użytkownika dla odpowiedniego urządzenia, do którego załadowana jest pipeta. Następnie zapisz kalibrację, klikając przycisk Zapisz kalibrację u dołu głównego graficznego interfejsu użytkownika. Ta pierwotna kalibracja jest konieczna do wykonania tylko raz, chyba że fizyczna organizacja platformy zostanie zmieniona.
W tym kroku umieść jeden plasterek mózgu na środku komory nagraniowej. Ustabilizuj wycinek mózgu za pomocą przytrzymania plasterka lub harfy. Aby wykryć komórkę fluorescencyjną, znajdź obszar zainteresowania pod czterokrotnym powiększeniem.
Następnie przesuń stolik mikroskopu, włączając tryb klikania, aby przesunąć i kliknij środek obszaru zainteresowania. Alternatywnie, użyj klawiatury, aby przesunąć stolik mikroskopu. Następnie przełącz się na obiektyw o dużym powiększeniu i wyreguluj ostrość, przesuwając mikroskop w osi Z za pomocą RF na klawiaturze.
Oprogramowanie kieruje mikroskopem i kamerą w celu wykonania serii zdjęć na różnych głębokościach. Następnie obrazy te są poddawane komputerowemu przetwarzaniu wizyjnemu w celu znalezienia komórek znakowanych fluorescencyjnie. Końcowym wynikiem jest lista wykrytych współrzędnych komórek.
Kliknij przycisk wykrywania komórki na głównej kolumnie GUI jednostki zero. Jeśli dioda LED lub laserowe źródło światła zestawu nie może być sterowane za pomocą sygnału TTL, ręcznie włącz diodę LED lub laser. W razie potrzeby wyłącz diodę LED lub laser.
Lista współrzędnych komórek pojawi się w graficznym interfejsie użytkownika pozycji pamięci. Usuń niechciane komórki z listy, klikając przycisk X obok współrzędnych. Alternatywnie, jeśli komórki docelowe nie są znakowane fluorescencyjnie, kliknij przycisk myszy na głównym graficznym interfejsie użytkownika.
Następnie kliknij interesującą Cię komórkę, na komórce pojawi się żółta kropka z liczbą, a współrzędne komórki pojawią się w GUI pozycji pamięci. Aby przeprowadzić kalibrację wtórną w celu wykrycia współrzędnych przesunięcia pipety, należy napełnić 1/3 szklanej pipety roztworem wewnętrznym. Następnie załaduj pipetę do uchwytu pipety przymocowanego do stopnia głowicy.
Przy małym powiększeniu użyj jedynki i dwójki na klawiaturze, aby przełączać się między jednostką pierwszą a drugą. Następnie umieść pipetę w polu widzenia i wyreguluj ostrość za pomocą klawiatury. Następnie załaduj kalibrację podstawową, klikając kalibrację obciążenia.
Przełącz obiektyw mikroskopu na duże powiększenie i kliknij 40 razy na głównym graficznym interfejsie użytkownika. Przesuń końcówkę pipety do środka. Następnie kliknij przycisk kalibracji pomocniczej w głównym graficznym interfejsie użytkownika, pod używaną jednostką.
Aby załatać komórkę docelową, kliknij przycisk kontroli łatki, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika kontrolki poprawki. Kliknij przycisk Idź do obok interesującej Cię komórki na liście współrzędnych w graficznym interfejsie użytkownika pozycji pamięci. Następnie kliknij przycisk CTM jednostki w głównym graficznym interfejsie użytkownika, aby umożliwić ruch.
Kliknij interesującą Cię komórkę, aby przesunąć końcówkę pipety do tej komórki. Ze względu na ograniczenia mechaniczne manipulatora, przy podróży na odległość większą niż 500 mikrometrów może wystąpić niewielki błąd pozycjonowania. Aby zapobiec dużemu błędowi pozycjonowania mechanicznego, kalibrację wtórną należy przeprowadzić w pobliżu celi docelowej.
Następnie użyj jednego wybranego przycisku urządzenia, aby przełączyć sygnał wejściowy między dwiema jednostkami. Kliknij przycisk łatki w graficznym interfejsie użytkownika kontrolki poprawki. Rozpocznie się automatyczne łatanie, a ciśnienie i opór można monitorować w graficznym interfejsie użytkownika kontroli poprawek.
Algorytm automatycznego łatania monitoruje opór i kontroluje ciśnienie za pomocą szeregu pętli logicznych, tworząc gigaseal. Wyskakujące okienko informuje o utworzeniu gigaseal. System wykorzystuje zmianę rezystancji do rozpoznawania kontaktu z powierzchnią komórki.
W sytuacji, gdy kontakt komórka-powierzchnia nie zostanie wykryty na czas, użyj przycisku Dalej, aby przejść do etapu łatania, pozostając w tej samej próbie automatycznego łatania. Manipuluj automatycznym procesem w dowolnym momencie, klikając odpowiednie przyciski w graficznym interfejsie użytkownika kontroli poprawek. Następnie wybierz tak, aby włamać się z połączonym Zap i ssaniem.
Alternatywnie wybierz opcję nie, aby włamać się tylko z ssaniem. Następnie zapisz dziennik poprawek eksperymentu. Na tym rysunku przedstawiono wybrane lokalizacje załadowane do graficznego interfejsu użytkownika sekwencji poleceń.
Lewa kolumna pokazuje listę współrzędnych, a prawa kolumna pokazuje listę poleceń w postaci sygnałów TTL dla każdej lokalizacji. Poniżej znajdują się zrzuty ekranu z eksperymentu z zastosowaniem leku, odpowiadające trzem wybranym lokalizacjom. Roztwór KCL zmieszano z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji.
Jednostka pierwsza to pipeta zawierająca KCL, a jednostka druga to pipeta do łatania. Na tym rysunku zastrzyki prądu krokowego pokazują regularny neuron impulsowy. Pokazano tutaj cęgi napięciowe rejestrujące ślady z miejscowego nałożenia 500-milimolowego roztworu chlorku potasu w trzech miejscach.
Czerwony ślad z prądem wewnętrznym zarejestrowano z próby, gdy aplikacja chlorku potasu była blisko komórki krosowej. Czerwona strzałka wskazuje czas aplikacji chlorku potasu. Korzystając z tej metody, można przeprowadzić próbę zacisku łatowego w ciągu czterech minut bez intensywnego szkolenia w porównaniu z łataniem ręcznym.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak optogenetyka, chemogenetyka i manipulacje farmakologiczne, aby odpowiedzieć na pytania związane z Twoim projektem badawczym. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania wysokoprzepustowych badań receptorów synaptycznych i kanałów jonowych w różnych preparatach in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać eksperymenty z automatycznym zaciskiem krosowym sterowane obrazem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę przeprowadzania automatycznych eksperymentów patch-clamp pod kierunkiem obrazów przy użyciu zaawansowanej technologii komputerowego widzenia. To podejście zwiększa efektywność identyfikacji i lokalizacji komórek z oznaczeniem fluorescencyjnym w ostrych kawałkach mózgu.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauki
- Techniki obrazowania
Tło
- Elektrofizjologia patch-clamp jest niezbędna do badania aktywności neuronalnej.
- Identyfikacja i lokalizacja określonych komórek może być wyzwaniem.
- Zautomatyzowane techniki mogą poprawić wydajność eksperymentów.
- Oznaczenia fluorescencyjne ułatwiają identyfikację komórek.
Cel badania
- Automatyzowanie wykrywania fluorescencyjnych komórek do eksperymentów patch-clamp.
- Zwiększenie efektywności rejestracji elektrofizjologicznych.
- Ułatwienie badań farmakologicznych w preparatach neuronowych.
Stosowane metody
- Technologia komputerowego widzenia do wykrywania komórek.
- Zautomatyzowany zestaw patch-clamp do rejestracji.
- Integracja procesów wykrywania i rejestracji.
- Zastosowanie do różnych preparatów neuronowych in vitro.
Główne wyniki
- Udana automatyzacja identyfikacji komórek i patch-clampingu.
- Zwiększona wydajność eksperymentów elektrofizjologicznych.
- Potencjalne zastosowania w badaniach farmakologicznych.
- Wszechstronność w zastosowaniu do różnych typów komórek.
Wnioski
- Ta technika znacznie zwiększa efektywność eksperymentów.
- Rozwiązuje kluczowe wyzwania w tradycyjnych metodach patch-clamp.
- Podejście ma zastosowanie w badaniach zaburzeń neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
