Dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego

Tylko niewielka część przeciwciał terapeutycznych jest pobierana przez mózg. Dzięki naszej metodzie przeciwciała są dostarczane do mózgu poprzez przejściowe otwarcie bariery krew-mózg. Ta technika pozwala nam dostarczać przeciwciała do mózgu myszy w sposób nieinwazyjny.

Aby przeprowadzić kontrolę jakości mikropęcherzyków za pomocą licznika komórek, usuń roztwór mikropęcherzyków z amalgamatora i użyj igły o rozmiarze 19, aby przebić przegrodę fiolki z roztworem mikropęcherzyków. Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 19, aby rozcieńczyć 100 mikrolitrów mikropęcherzyków w pięciu mililitrach przefiltrowanego roztworu przepływowego i odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu mikropęcherzyków w 10 mililitrach przefiltrowanego roztworu przepływowego w kuwecie. Zablokuj kuwetę na miejscu na platformie licznika komórek i upewnij się, że do pobrania próbki zostanie użyty otwór o średnicy 30 mikronów.

W oprogramowaniu załaduj standardową metodę działania i wybierz opcję edycji standardowej metody operacyjnej i stężenia. Wprowadź 5 000 razy dla rozcieńczenia, a następnie kliknij przycisk Zastosuj i OK. Kliknij edytuj informacje, aby wybrać odpowiednią nazwę pliku. Wybierz podgląd i sprawdź, czy stężenie próbki mikropęcherzyków jest mniejsze niż 10%Wybierz start i OK, aby rozpocząć pobieranie próbki.

Po pomiarze przepłukać otwór licznika komórek przefiltrowanym roztworem przepływowym. Sonikować kuwetę z rozcieńczonym roztworem mikropęcherzyków przez 30 sekund w łaźni wodnej. Zmierz sonikowany roztwór mikropęcherzyków, jak pokazano, i kliknij edytuj informacje, aby oznaczyć dane jako puste.

Po zmierzeniu ślepej próby odejmij końcowy odczyt od początkowego odczytu, aby wykluczyć wszelkie cząstki, które nie są mikropęcherzykami. Aby oznaczyć skrawki fluorescencyjnym przeciwciałem anty-mysim IgG, oznacz jeden miligram mysiego przeciwciała IgG mąką Alexa Flour 647 w 0,1-molowym buforze wodorowęglanowym sodu zgodnie z instrukcjami producenta przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji załadować znakowany fluorescencyjnie roztwór przeciwciała na kolumnę wirową i oczyścić przeciwciało przez odwirowanie.

Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie białka. Aby skonfigurować system ultrasonograficzny ze zogniskowanym skaningiem, dodaj pięciomilimetrową przestrzeń do bolusa wodnego, aby ustawić ognisko ultradźwięków dziewięć milimetrów poniżej dna bolusa wodnego. Napełnij bolus wodny około 300 mililitrami odgazowanej wody dejonizowanej i umieść układ pierścieniowy w napełnionym bolusie wodnym.

Użyj lusterka dentystycznego, aby sprawdzić, czy na powierzchni nie ma pęcherzyków powietrza i uruchom aplikację. W menu przebiegu wybierz ustaw cykl pracy przebiegu i ustaw częstotliwość powtarzania impulsów na 10 Hz, cykl pracy na 10%, ostrość na 80 milimetrów, częstotliwość środkową na jeden megaherc, amplitudę na 0,65 megapaskali i indeks mechaniczny na 0,65. Naciśnij set, aby zdefiniować przebieg i zapisać przebieg w pamięci.

Po wybraniu planu leczenia otwórz zakładkę skanowania w oknie kontrolera ruchu i wprowadź wartości start, stop i przyrost ruchu w wymiarze X oraz wartości start, stop i przyrost ruchu w kierunku Y. Aby zdefiniować działania dla miejsc leczenia, kliknij zdarzenie i otwórz okno edycji skryptu. Wybierz listę działań, które będą wykonywane w wybranej kolejności dla każdego miejsca zabiegowego i ustaw typ ruchu na siatkę rastrową.

W zakładce zdarzenia wybierz dodaj akcje i przenieś ruch synchronicznie uruchamiaj wyzwalacz ARB wait i stop wyzwalaj akcje ARB do panelu skryptu. Następnie kliknij akcję oczekiwania i wybierz czas oczekiwania wynoszący 6 000 milisekund. Aby przygotować zwierzę do analizy, po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy, należy za pomocą markera permanentnego oznaczyć środek głowy, a następnie przykleić folię do dna małej łódki wagowej z odcięciem dna i napełnić łódkę do ważenia żelem ultradźwiękowym.

W przypadku zogniskowanego leczenia ultradźwiękami odwróć fiolkę z mikropęcherzykami i delikatnie załaduj jeden mikrolitr roztworu na gram masy ciała myszy do strzykawki insulinowej o rozmiarze 29. Dodać 100 mikrolitrów znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała do strzykawki i delikatnie odwrócić i przetoczyć strzykawkę między kciukiem a palcem wskazującym, aby wymieszać przeciwciało i mikropęcherzyki w strzykawce. Ostrożnie i powoli wstrzyknij myszowi 150 mikrolitrów roztworu mikropęcherzyków i przeciwciał i ustaw minutnik na dwie minuty.

Nałóż maść okulistyczną, a następnie umieść mysz w uchwycie na głowę i zamocuj jej nos w uchwycie. Umieść małą łódź do ważenia wypełnioną żelem ultradźwiękowym na czubku głowy i opuść bolus wodny, aż znajdzie się na żelu ultradźwiękowym w łodzi do ważenia. Następnie użyj joysticka, aby wizualnie ustawić ostrość przetwornika w środku głowy.

Gdy timer się wyłączy, w zakładce ruchu oprogramowania wybierz resetuj początek i wybierz pełne skanowanie. Po zakończeniu leczenia nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia i umieść mysz w rozgrzanej komorze rekonwalescencji. Tutaj pokazane są reprezentatywne wyniki pomiarów licznika kultur dotyczące wielkości i stężenia, które można uzyskać, gdy mikropęcherzyki są wytwarzane prawidłowo.

Wychwyt przeciwciał przez mózg można łatwo zobrazować w całym mózgu lub skrawkach tkanek za pomocą skanera na podczerwień lub mikroskopii fluorescencyjnej tych skrawków. Jak wykazano na tych obrazach, reprezentatywne barwienie markerów mikrogleju można zastosować w celu określenia, czy mikroglej staje się bardziej fagocytarny po dostarczeniu przeciwciała. Ważne jest, aby zapewnić dobrostan i bezpieczeństwo zwierząt, zwłaszcza podczas wykonywania iniekcji zaoczodołowych i umieszczania przetwornika nad głowami myszy.

Metoda ta pozwala na zastosowanie różnych wzorców skanowania w celu ukierunkowania na różne obszary mózgu, takie jak hipokamp, kora mózgowa lub poszczególne półkule mózgowe. Technika ta może być wykorzystana do opracowania nowych terapii i leków, które przenikają przez barierę krew-mózg oraz do badania mechanizmu powstawania i otwierania bariery krew-mózg.