Name: Dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę dostarczania przeciwciał do mózgu poprzez przejściowe otwieranie bariery krew-mózg u myszy za pomocą zogniskowanego ultradźwięku. Technika umożliwia nieinwazyjną terapię i badanie aktywacji mikrogleju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie ze strony Estate of Dr Clem Jones AO, National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], Metal Foundation oraz Rządu Stanowego Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Queensland.
1. Przygotowanie mikropęcherzyków we własnym zakresie
<ol>
	<li>Odważyć stosunek molowy 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[amino(glikolu polietylenowego)-2000] (soli amonowej) w stosunku molowym. Wymagane jest 0,5 mg mieszaniny lipidów na 1 ml roztworu mikropęcherzyków. Alternatywnie, lipidy można kupić już w chloroformie, jeśli używasz wstępnie rozpuszczonych lipidów, przejdź do kroku 1.3.</li>
	<li>Rozpuść lipid w małej objętości chloroformu w szklanej zlewce.</li>
	<li>Odparować chloroform za pomocą parownika lub strumienia azotu.</li>
	<li>Ponownie nawodnić wysuszony film lipidowy za pomocą 10 ml roztworu PBS + 10% glicerolu + 10% glikolu propylenowego, który został przefiltrowany przez filtr 0,22 μm.</li>
	<li>Umieścić uwodniony roztwór lipidowy w sonikatorze łaźni wodnej ustawionym na 55 °C (powyżej temperatury topnienia lipidów) i sonikować aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Podwielokrotny roztwór lipidów przelać do autoklawowanych fiolek HPLC o pojemności 1,5 ml i zakręcić nakrętki przegród.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę 27 G należy odessać całe powietrze z fiolki i wytworzyć podciśnienie w fiolce.</li>
	<li>Dodaj oktofluoropropan do fiolki za pomocą dołączonej strzykawki, pobierając gaz z kanistra. Napełnij fiolkę 1-2 ml oktafluoropropanu, odczytując objętość w strzykawce.</li>
	<li>Uszczelnij każdą fiolkę folią parafinową i wstaw do lodówki.</li>
	<li>W dniu eksperymentu doprowadzić fiolkę do temperatury pokojowej, dodać 0,5 ml 0,9% roztworu NaCl do fiolki, a następnie umieścić fiolkę w amalgamatorze i mieszać przez 45 s (ustawiony czas) w celu wytworzenia mikropęcherzyków.</li>
</ol>
2. Kontrola jakości mikropęcherzyków za pomocą licznika redlic
<ol>
	<li>Wyjąć roztwór mikropęcherzyków z amalgamatora i odpuścić gaz z fiolki, przekłuwając przegrody igłą o sile 19 G.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór mikropęcherzyków, wykonując dwuetapowe seryjne rozcieńczenia w stosunku 1:5 000, dodając 100 μl roztworu mikropęcherzyków do 5 ml przefiltrowanego roztworu przepływowego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 19 G, a następnie pobierając 100 μl rozcieńczonego roztworu mikropęcherzyków w stosunku 1:50 i pipetując do 10 ml przefiltrowanego roztworu przepływowego w kuwecie za pomocą pipety.</li>
	<li>Sprawdź, czy zbiornik elektrolitu ma wystarczający przepływ roztworu i czy zbiornik na odpady jest pusty.</li>
	<li>Umieść kuwetę na platformie licznika redlic i zablokuj ją na miejscu. Do pobierania próbki należy użyć otworu 30 μm.</li>
	<li>W oprogramowaniu załaduj standardową metodę operacyjną (SOM), a następnie wybierz opcję Edytuj SOM | stężenie. Wprowadź rozcieńczenie 5000x.</li>
	<li>W oprogramowaniu wybierz odpowiednią nazwę pliku. Na przykład microbubble_1_date.</li>
	<li>Załaduj i zabezpiecz kuwetę na platformę.</li>
	<li>W oprogramowaniu wybierz Uruchom| Wyświetlić podgląd i sprawdzić, czy stężenie próbki jest mniejsze niż 10%. Jeśli liczba ta jest wyższa niż 10%, należy przeprowadzić nowe rozcieńczenie mikropęcherzyków o wyższym współczynniku rozcieńczenia.</li>
	<li>Wybierz opcję "Start", aby rozpocząć pobieranie próbki w celu uzyskania początkowego odczytu.</li>
	<li>Po każdym pomiarze przepłukać otwór licznika redlic przefiltrowanym roztworem przepływowym. Powtórz kroki 2.2-2.9, aby uzyskać 3 powtórzenia.</li>
	<li>Umieść kuwetę z rozcieńczonym roztworem mikropęcherzyków w łaźni wodnej sonikatora i sonikuj przez 30 sekund.</li>
	<li>Odmierzyć roztwór za pomocą sonikowanych mikropęcherzyków i oznaczyć jako pustą.</li>
	<li>W oprogramowaniu odejmij końcowy odczyt od początkowego odczytu. Spowoduje to odjęcie wszelkich cząstek, które nie są mikropęcherzykami i nie zawierają gazu.</li>
	<li>Wybierz opcję Wyświetl wyniki w oprogramowaniu, aby wyświetlić stężenie mikropęcherzyków, rozkład wielkości, średni rozmiar i stężenie objętościowe.</li>
</ol>
3. Znakowanie przeciwciałami fluorescencyjnymi
<ol>
	<li>Otrzymać 1 mg/ml roztworu mysiej IgG w PBS bez żadnych dodatków.</li>
	<li>Oznaczyć 1 mg mysiej IgG za pomocą AlexaFluor 647 w 0,1 M buforze wodorowęglanowym sodu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta znajdującymi się w zestawie. Ta ilość znakowanej fluorescencyjnie IgG jest wystarczająca do przeprowadzenia tej procedury na 5-7 dorosłych myszach, u których podaje się dawkę przeciwciał 5 mg / kg.</li>
	<li>Dodać barwnik do roztworu IgG w 0,1 M buforze wodorowęglanu sodu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oczyść znakowane fluorescencyjnie przeciwciało, pipetując roztwór przeciwciała do kolumny wirowej i odwirowując przy 1,000 x g przez 5 minut. Wolny barwnik pozostanie w łożu kolumny.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie białka. Zmierzyć absorbancję sprzężonego roztworu przy 280 nm i 650 nm (A280 i A650). Obliczyć stężenie białka w próbce, korzystając z równania: 
	Stężenie białka (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x współczynnik rozcieńczenia / 203 000.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby obliczyć stopień oznakowania za pomocą równania: 
	Barwnik molowy na białko molowe = A650 x współczynnik rozcieńczenia / 239 000 x stężenie białka (M). 
	UWAGA: Dopuszczalny stopień znakowania to 3-7 moli barwnika na białko molowe, a zazwyczaj uzyskiwany stopień znakowania wynosi około 6.</li>
</ol>
4. Ustawienie ultrasonograficzne
<ol>
	<li>Korzystając ze zogniskowanego systemu ultradźwiękowego, dodaj dystans 5 mm do bolusa wodnego, aby ustawić ognisko ultradźwiękowe 9 mm poniżej dna bolusa wodnego.</li>
	<li>Napełnij bolus wodny około 300 ml wody dejonizowanej, która była odgazowywana za pomocą odgazowywanego odgazowywacza liniowego przez 20 minut (zawartość tlenu powinna być poniżej 3 ppm). Umieść układ pierścieniowy w wypełnionym bolusie wodnym i użyj lusterka dentystycznego, aby sprawdzić, czy na powierzchni nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli znajduje się na powierzchni, usuń układ pierścieniowy i zastąp go bolusem wodnym.</li>
	<li>Uruchom aplikację. W menu kształtu fali wybierz opcję Ustaw cykl pracy przebiegu. Ustawienia to PRF (Hz) 10, cykl pracy 10%, ostrość 80 mm, częstotliwość środkowa 1 MHz, amplituda (szczytowe podciśnienie MPa) 0,65 MPa, indeks mechaniczny = 0,65. Naciśnij Set, aby zdefiniować przebieg i zapisać go w pamięci. 
	UWAGA: Zogniskowany system ultradźwiękowy jest wstępnie skalibrowany przez producenta na podstawie pomiarów wykonanych przez skalibrowany hydrofon.</li>
	<li>W oprogramowaniu systemu zogniskowanego systemu ultrasonograficznego zdefiniuj plan leczenia. Wymaga to zdefiniowania regionu leczenia składającego się z wielu indywidualnych miejsc leczenia i zdefiniowania działań, które należy podjąć w każdym z tych miejsc leczenia. W tym przypadku strefa leczenia to jedna półkula mózgu myszy.</li>
	<li>W oknie kontrolera ruchu przejdź do zakładki Skanowanie i wprowadź wartość start, stop i inkrementacja dla ruchu w wymiarze x oraz wartość start, stop i inkrementacja dla ruchu w kierunku y. Wprowadź wartości dla X: start -4, stop 3,50 i Y: -3,00, stop 3, Increment 1,5, # pętle: 1.</li>
	<li>Zdefiniuj działania dla leczonych miejsc. W oknie kontrolera ruchu wybierz przycisk Zdarzenie. W oknie Edycja skryptu należy wybrać listę czynności, które będą wykonywane w kolejności wybranej dla każdego miejsca zabiegowego. Ustaw Typ ruchu na siatkę rastrową w górnej części okna skryptu. Na karcie zdarzeń wybierz Dodaj akcje, aby przenieść je do panelu skryptu, a następnie dodaj Przenieś synchronicznie, Rozpocznij wyzwalacz arb, czekaj, Zatrzymaj wyzwalacz arb. Kliknij akcję oczekiwania i wybierz czas oczekiwania 6 000 ms. 
	UWAGA: Te ustawienia spowodują, że leczenie będzie siatką 6 x 5 punktów zabiegowych oddalonych od siebie o 1.5 mm, przy czym czas trwania każdego miejsca będzie wynosił 6 sekund. Całkowity czas sonikacji mózgu myszy wynosi około 3 minut. Ten rozmiar siatki zabiegowej jest odpowiedni dla dorosłych myszy C57/Bl6 o wadze około 30 g. Rozmiar siatki punktów zabiegowych można regulować w górę lub w dół w zależności od wielkości myszy.</li>
</ol>
5. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zważ mysz za pomocą wagi z dokładnością do 0.1 g.</li>
	<li>Znieczulić mysz 90 mg/kg ketaminy i 6 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo. Test na brak odruchów ze szczypnięciem palca u nogi. Alternatywnie, myszy można znieczulić izofluranem za pomocą odpowiedniego wziewnego aparatu znieczulającego z odpowiednią maską na twarz. W przypadku stosowania izofluranu mysz należy umieścić na poduszce grzewczej podczas badania ultradźwiękami, aby zapobiec hipotermii.</li>
	<li>Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia zgolić sierść z głowy zwierzęcia, następnie nałóż krem do depilacji patyczkiem kosmetycznym, pozostaw na 2-3 minuty lub do momentu, aż włosy zostaną wytarte do czysta wilgotnym kawałkiem gazy. Uważaj, aby krem do depilacji nie dostał się do oczu myszy.</li>
	<li>Zaznacz środek głowy myszy trwałym markerem. Przetwornik ma otwór w środku, a ostrość przetwornika i ognisko można wyrównać wizualnie.</li>
	<li>Napełnij małą łódkę wagową, która wcześniej miała odcięte dno i zastąpiona folią przyklejoną do dna łodzi wagowej żelem ultradźwiękowym. Służy to jako podkładka dystansowa 8 mm i zapewnia dobre sprzężenie z główką myszy oraz umożliwia wizualną kontrolę ostrości przetwornika wyrównanego z główką myszy.</li>
</ol>
6. Przygotowanie mikropęcherzyków
<ol>
	<li>Podgrzej fiolkę z mikropęcherzykami do temperatury pokojowej. Aby aktywować, dodaj 0,5 ml 0,9% roztworu NaCl do fiolki i umieść w amalgamatorze, aby mieszać przez 45 sekund w celu wytworzenia mikropęcherzyków.</li>
	<li>Odpowietrzyć fiolkę, przekłuwając przegrodę igłą o sile 27 G.</li>
</ol>
7. Leczenie ultradźwiękami
<ol>
	<li>Odwrócić fiolkę z mikropęcherzykami i delikatnie pobrać 1 μl/g masy ciała. Do tego dodać roztwór znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała i delikatnie wymieszać w strzykawce. Maksymalna wstrzykiwana objętość wynosi 150 μl. 
	UWAGA: Mikropęcherzyki przygotowane we własnym zakresie są około 60-krotnie mniej skoncentrowane niż mikropęcherzyki stosowane klinicznie (np. Mikropęcherzyki Definity). Dostosuj objętość lub stężenie w taki sposób, aby liczba wstrzykiwanych mikropęcherzyków była podobna do tych stosowanych klinicznie (tj. Definitywność 1,2 x 108 mikropęcherzyków/kg masy ciała).</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór mikropęcherzyków i przeciwciał zadoczodoczodołowo, uważając, aby wstrzykiwać delikatnie i powoli. Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy myszy.</li>
	<li>Umieść mysz w uchwycie na głowę (patrz Tabela materiałów) i zamocuj nos myszy. Następnie umieść małą łódkę do ważenia wypełnioną żelem ultradźwiękowym na czubku głowy.</li>
	<li>Obniż bolus wodny, aż znajdzie się na żelu ultradźwiękowym w łodzi do ważenia.</li>
	<li>Użyj joysticka, aby przesunąć ostrość przetwornika na środek głowy. Wybierz opcję Resetuj początek układu współrzędnych na karcie ruchu.</li>
	<li>Wybierz opcję Zakończ skanowanie. Kroki 7.3-7.6 zajmą 2 minuty.</li>
	<li>Aby zachować spójność, ustaw timer, aby zapewnić 2-minutowe opóźnienie między wstrzyknięciem mikropęcherzyków a wybraniem pełnego skanowania.</li>
	<li>Po zakończeniu zabiegu nałóż maść okulistyczną na oczy i umieść mysz w rozgrzanej komorze regeneracyjnej. Jeśli podczas zabiegu zaobserwuje się hipotermię, pod myszą można umieścić podkładkę rozgrzewającą, aby zapewnić dodatkowe ciepło podczas zabiegu.</li>
</ol>
8. Pobieranie i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>W interesującym nas czasie po podaniu ultradźwięków (co najmniej 1 godzina w celu wykrycia wysokiego poziomu przeciwciał w mózgu) głęboko znieczulić mysz przedawkowaniem roztworu Pentobarbitonu (100 mg / kg) i perfuzję przezsercową myszy za pomocą 30 ml PBS. Dobra perfuzja jest wymagana do specyficznego wykrycia znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał, które zostały dostarczone do mózgu.</li>
	<li>Zebrać mózg i utrwalić przez zanurzenie w 4% PFA na 24 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć PBS.</li>
	<li>Zobrazuj mózg w skanerze podczerwieni, umieszczając mózg na tacy i uzyskując obraz w kanale 700 nm. 
	UWAGA: Po utrwaleniu mózg jest usuwany z PFA, myty w PBS i dzielony na sekcje. Alternatywnie można go umieścić w roztworze krioprotektantu z glikolu etylenowego na 24 godziny w temperaturze 4 °C lub do momentu zanurzenia, a następnie przenieść do nowej fiolki zawierającej krioprotektant i umieścić w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Przekrój zimny mózg w PBS za pomocą wibratomu. Przyklej mózg do platformy i wytnij odcinki 30-40 μm i zbierz do PBS. 
	UWAGA: Autofluorescencja lizosomalna (powszechna w skrawkach zwierząt starszych niż około 12 miesięcy) powinna być bielona przez nocne oświetlenie skrawków w komorze świetlnej, w temperaturze pokojowej i w PBS zawierającym azydek (0,02%) w celu zablokowania wzrostu bakterii.</li>
</ol>
9. Barwienie tkanek i akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Przenieść skrawki do roztworu blokującego (5% BSA w 0,2% Triton/PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, następnie umyć skrawki 3x, zastępując roztwór 0,2% Tritonem/PBS.</li>
	<li>Inkubować skrawki w temperaturze 4 °C przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko Iba1 (rozcieńczenie 1:1 000) i CD68 (rozcieńczenie 1:500), w 0,2% Trytonie/PBS, a następnie 3-krotne przemycie 0,2% Tritonem/PBS.</li>
	<li>Inkubować sekcje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi (rozcieńczenie 1:500), a następnie 3 razy przemywać tylko 0,2% Tritonem/PBS. 
	UWAGA: Jądra można również barwić roztworem DAPI (0,5 μg/ml).</li>
	<li>Przenieś sekcje na szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z twardymi nośnikami montażowymi. Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby podłoże montażowe zestaliło się przed wizualizacją i akwizycją obrazu (przez noc).</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu konfokalnego uzyskaj obrazy stosu z (głębokość co najmniej 10 μm i rozmiar kroku 0,3 μm, 10 obrazów na zwierzę) obszaru mózgu docelowego za pomocą ultrasonografii za pomocą mikroskopu konfokalnego i obiektywu o powiększeniu co najmniej 40. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uzyskać obrazy w zakresie dynamiki sygnału, unikając niedoświetlenia/prześwietlenia. Zapisz pliki obrazów w odpowiednim formacie oprogramowania używanym przez mikroskop.</li>
</ol>
10. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Przekonwertuj pliki mikroskopii z-stack za pomocą importera plików oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	<li>Otwórz przekonwertowane pliki w oprogramowaniu i dostosuj intensywność kanału Iba1, aby obserwować komórki mikrogleju.</li>
	<li>Przytnij pojedynczą komórkę mikrogleju, rysując wokół niej ramkę, wybierz "przytnij" i zapisz nowy plik.</li>
	<li>Zbuduj renderowanie powierzchni 3D sygnału IBA1 poprzez:
	<ol>
		<li>Otwórz jednokomórkowy plik Imaris wygenerowany w poprzednim kroku.</li>
		<li>Dodaj powierzchnię do pliku.</li>
		<li>Wybierz kanał odpowiadający barwieniu Iba1.</li>
		<li>Zastosuj próg, który powinien zachodzić na barwienie Iba1</li>
		<li>Należy wybrać tylko tę strukturę, która tworzy interesującą nas komórkę mikrogleju</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończ proces
	<ol>
		<li>Uzyskać i zapisać objętość barwienia Iba1</li>
		<li>Tworzenie renderingu powierzchni 3D barwienia CD68</li>
		<li>Wewnątrz podzbioru powierzchni IBA1 zamaskuj kanał CD68 i usuń woksele na zewnątrz barwienia IBA1</li>
		<li>Dodawanie nowej powierzchni do pliku</li>
		<li>Wybierz kanał odpowiadający barwieniu CD68</li>
		<li>Zastosuj próg, który powinien zachodzić na barwienie CD68 i być jak najbardziej zbliżony do objętości barwienia</li>
		<li>Zakończ proces, ponieważ w tym pliku będą obecne tylko wewnątrzmikroglejowe struktury CD68, a zatem nie wymagają one kolejnego kroku filtrowania progowego</li>
		<li>Uzyskać i zapisać liczbę i średnią objętość dodatnich struktur CD68</li>
		<li>Obliczyć względną objętość struktur CD68 na odpowiadające im struktury IBA1 jako miarę aktywacji mikrogleju w stanie fagocytarnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Choi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+and+transient+blood-brain+barrier+opening+in+the+hippocampus+of+Alzheimer%27s+double+transgenic+mice+using+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonic+Imaging%22%5BJournal%5D)">Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound.</a> Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).</li>
<li>Lipsman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+opening+in+Alzheimer%27s+disease+using+MR-guided+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound.</a> Nature Communications. 9 (1), 2336(2018).</li>
<li>Pandit, R., Chen, L., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%3A+physiology+and+strategies+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238(2019).</li>
<li>Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+questions+for+Alzheimer%27s+disease+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy.</a> Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3(2014).</li>
<li>Nisbet, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+scanning+ultrasound+and+a+tau-specific+single+chain+antibody+in+a+tau+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model.</a> Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).</li>
<li>Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-mediated+blood-brain+barrier+opening+enhances+delivery+of+therapeutically+relevant+formats+of+a+tau-specific+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9255(2019).</li>
<li>Leinenga, G., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+ultrasound+removes+amyloid-beta+and+restores+memory+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Science Translational Medicine. 7 (278), 233(2015).</li>
<li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+neural+stem+cells+to+the+brain+using+MRI-guided+focused+ultrasound+to+disrupt+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier.</a> PLoS One. 6 (11), 27877(2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound-enhanced+intranasal+brain+delivery+of+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor.</a> Scientific Reports. 6, 28599(2016).</li>
<li>Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+treatment+of+neurological+diseases+-+current+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).</li>
<li>Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathogenesis+of+the+Tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathogenesis of the Tauopathies.</a> Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).</li>
<li>Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+ultrasound+treatment+of+tau+transgenic+mice+clears+neuronal+tau+by+autophagy+and+improves+behavioral+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions.</a> Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).</li>
<li>Karakatsani, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+Focused+Ultrasound-Induced+Blood-Brain+Barrier+Opening+Reduces+Phosphorylated+Tau+from+The+rTg4510+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model.</a> Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).</li>
<li>Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+Diffusion+of+Macromolecule+Delivery+to+the+Brain+via+Focused+Ultrasound+using+Magnetic+Resonance+and+Multispectral+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie mogą być dostarczane do mózgu za pomocą zogniskowanych ultradźwięków wraz z mikropęcherzykami aplikowanymi w trybie skanowania. Dostarczanie przeciwciał, morfologię mikrogleju i powiększenie lizosomów można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po skanowaniu ultradźwięków. Mikroglej może pobierać do swoich lizosomów przeciwciała i antygeny, z którymi przeciwciała związały się w procesie za pośrednictwem receptora Fc4.
Istn...

Ultrasonografia terapeutyczna to nowa technologia, której celem jest leczenie chorób mózgu w sposób nieinwazyjny, częściowo poprzez ułatwienie dostępu środków terapeutycznych do mózgu1,2,3. Ponieważ tylko niewielka część przeciwciał terapeutycznych skierowanych przeciwko chorobom mózgu jest wychwytywana i zatrzymywana w brain4, ultradźwięki terapeutyczne oferują możliwość zwiększenia ich wychwytu i docelowego zaangażowania5,6.
W naszym laboratorium rozwijamy metody leczenia chorób neurodegeneracyjnych, w których przeciwciało w różnych formatach jest dostarczane przez barierę krew-mózg (BBB) za pomocą mikropęcherzyków. Aby to osiągnąć, ultradźwięki są stosowane przez czaszkę do mózgu w wielu miejscach przy użyciu trybu skanowania, który nazywamy ultradźwiękiem skanującym (SUS)7. Mechaniczna interakcja między energią ultradźwięków, mikropęcherzykami wstrzykniętymi dożylnie i układem naczyniowym mózgu przejściowo oddziela ścisłe połączenia BBB w danej objętości sonikacji, umożliwiając przeciwciałom i innym ładunkom, w tym środkom terapeutycznym, skuteczne przekroczenie tej bariery7,8,9. Co więcej, wykazano, że ultradźwięki ułatwiają wychwyt przeciwciał ze śródmiąższowego mózgu do komórek mózgowych, takich jak neurony, gdzie przeciwciało rozprowadza się po całym ciele komórki, a nawet w procesach neurytycznych5,10.
Choroba Alzheimera charakteryzuje się patologią β amyloidu i tau11, a wiele modeli zwierzęcych jest dostępnych do analizy mechanizmów patogennych i walidacji strategii terapeutycznych. Podejście SUS, w którym ultradźwięki są stosowane sekwencyjnie w całym mózgu, gdy są powtarzane przez kilka sesji leczenia, może zmniejszyć patologię blaszek amyloidowych w mózgach myszy z mutacją białka prekursorowego amyloidu (APP) odkładającą β amyloid i aktywować mikroglej, który wychwytuje amyloid, prowadząc do poprawy funkcji poznawczych7. Otwarcie BBB za pomocą ultradźwięków i mikropęcherzyków zmniejsza również patologię tau u transgenicznych myszy pR5, K3 i rTg4510 tau5,12,13. Co ważne, podczas gdy mikroglej usuwa zewnątrzkomórkowe złogi białkowe, jednym z podstawowych mechanizmów usuwania patologii wewnątrzneuronalnych indukowanych przez SUS jest aktywacja autofagii neuronalnej12.
Tutaj opisujemy eksperymentalny proces, w którym fluorescencyjnie znakowane przeciwciała są przygotowywane, a następnie mieszane z wewnętrznymi mikropęcherzykami na bazie lipidów, a następnie wstrzykiwane po oczodołach znieczulonym myszom. Wstrzyknięcie zadoczodołowe jest alternatywą dla iniekcji do żyły ogonowej, która okazała się równie skuteczna i łatwiejsza do wielokrotnego wykonywania. Bezpośrednio po tym następuje zastosowanie SUS do mózgu. Aby określić wychwyt przeciwciał terapeutycznych, myszy są uśmiercane, a następnie określa się ilościowo zwiększone stężenie przeciwciał w mózgu. Jako wskaźnik zastępczy zmiany homeostazy mózgu, aktywność fagocytarna mikrogleju jest określana przez histologię i wolumetryczną rekonstrukcję 3D.
Wygenerowane dane sugerują, że ultradźwiękowe dostarczanie przeciwciał jest potencjalnie atrakcyjnym podejściem do leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Protokół może być podobnie stosowany do innych kandydatów na leki, a także do ładunków modelowych, takich jak znakowany fluorescencyjnie dektrans o określonych rozmiarach14.

<table><tbody>Zestaw do znakowania przeciwciał <tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfocholine</td><td>Avanti</td><td>850365C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[amino(polietylenoglikol)-2000]</td><td>Avanti</td><td>880128C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Zestaw do znakowania przeciwciał</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>CD68</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1957GA</td><td>Użyj rozcieńczenia</td></tr> <tr><td>1:1000Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Licznik redlic (Multisizer 4e)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo FIsher</td><td>A-11008</td><td>Użyj rozcieńczenia 1:500</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11077</td><td>Użyj rozcieńczenia</td></tr> <tr><td>1:500uchwyt na głowę (model SG-4N, Narishige Japonia)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Użyj rozcieńczenia 1:1000</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Beckman Coulter</td><td>#8547008</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie przepływu Isoflow</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43905</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania w bliskiej podczerwieni Odyssey Fc</td><td>Licor</td><td>2800-03</td><td></td></tr><tr><td>Oktafluoropropan</td><td>Arcadophta</td><td>0229NC</td><td></td></tr><tr><td>Glikol propylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4347</td><td></td></tr><tr><td>TIPS (system sondy do obrazowania terapii)</td><td>Philips</td><td>Research TIPS_007</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Tylko niewielka część przeciwciał terapeutycznych skierowanych przeciwko chorobom mózgu jest pobierana przez mózg. Skoncentrowane ultradźwięki dają możliwość zwiększenia wychwytu przeciwciał i zaangażowania poprzez przejściowe otwarcie bariery krew-mózg (BBB). W naszym laboratorium opracowujemy podejścia terapeutyczne do chorób neurodegeneracyjnych, w których przeciwciało w różnych formatach jest dostarczane przez barierę krew-mózg za pomocą mikropęcherzyków, czemu towarzyszy zogniskowana aplikacja ultradźwięków przez czaszkę w celu celowania w wiele miejsc, podejście, które nazywamy ultrasonografią skaningową (SUS). Mechaniczne działanie mikropęcherzyków i ultradźwięków na naczynia krwionośne zwiększa transport parakomórkowy przez barierę krew-mózg poprzez przejściowe oddzielanie ścisłych połączeń i wzmacnia transcytozę pęcherzykową, umożliwiając skuteczne przenikanie przeciwciał i środków terapeutycznych. Co więcej, ultradźwięki ułatwiają również wychwyt przeciwciał ze śródmiąższowego mózgu do komórek mózgowych, takich jak neurony, gdzie przeciwciało rozprowadza się po całym ciele komórki, a nawet w procesach neurytycznych. W naszych badaniach przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są przygotowywane, mieszane z przygotowanymi przez siebie mikropęcherzykami na bazie lipidów i wstrzykiwane myszom bezpośrednio przed zastosowaniem SUS do mózgu. Zwiększone stężenie przeciwciał w mózgu jest następnie oznaczane ilościowo. Aby wyjaśnić zmiany w normalnej homeostazie mózgu, fagocytoza mikrogleju może być wykorzystana jako marker komórkowy. Uzyskane dane sugerują, że ultradźwiękowe dostarczanie przeciwciał jest atrakcyjnym podejściem do leczenia chorób neurodegeneracyjnych.

Stosując niniejszy protokół, przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są dostarczane do mózgu i mogą być wykrywane wraz z aktywacją mikrogleju. Można wyciągnąć wniosek, że zastosowanie skoncentrowanych ultradźwięków i mikropęcherzyków znacznie zwiększa wychwyt przeciwciał przez mózg i pozwala na dostarczenie przeciwciał do całego mózgu lub półkuli myszy w przypadku zastosowania trybu skanowania. Rysunek 1 przedstawia urządzenie do aplikacji ultradźwięków TIPS (z opisanymi poszczególnymi kompo...

Prezentowany tutaj jest protokół przejściowego otwierania bariery krew-mózg (BBB) albo ogniskowo, albo przez mózg myszy, w celu dostarczenia fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał i aktywacji mikrogleju. Przedstawiono również metodę wykrywania dostarczania przeciwciał i aktywacji mikrogleju za pomocą histologii.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Tylko niewielka część przeciwciał terapeutycznych jest pobierana przez mózg. Dzięki naszej metodzie przeciwciała są dostarczane do mózgu poprzez przejściowe otwarcie bariery krew-mózg. Ta technika pozwala nam dostarczać przeciwciała do mózgu myszy w sposób nieinwazyjny.Aby przeprowadzić kontrolę jakości mikropęcherzyków za pomocą licznika komórek, usuń roztwór mikropęcherzyków z amalgamatora i użyj igły o rozmiarze 19, aby przebić przegrodę fiolki z roztworem mikropęcherzyków. Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 19, aby rozcieńczyć 100 mikrolitrów mikropęcherzyków w pięciu mililitrach przefiltrowanego roztworu przepływowego i odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu mikropęcherzyków w 10 mililitrach przefiltrowanego roztworu przepływowego w kuwecie. Zablokuj kuwetę na miejscu na platformie licznika komórek i upewnij się, że do pobrania próbki zostanie użyty otwór o średnicy 30 mikronów.W oprogramowaniu załaduj standardową metodę działania i wybierz opcję edycji standardowej metody operacyjnej i stężenia. Wprowadź 5 000 razy dla rozcieńczenia, a następnie kliknij przycisk Zastosuj i OK. Kliknij edytuj informacje, aby wybrać odpowiednią nazwę pliku. Wybierz podgląd i sprawdź, czy stężenie próbki mikropęcherzyków jest mniejsze niż 10%Wybierz start i OK, aby rozpocząć pobieranie próbki.Po pomiarze przepłukać otwór licznika komórek przefiltrowanym roztworem przepływowym. Sonikować kuwetę z rozcieńczonym roztworem mikropęcherzyków przez 30 sekund w łaźni wodnej. Zmierz sonikowany roztwór mikropęcherzyków, jak pokazano, i kliknij edytuj informacje, aby oznaczyć dane jako puste.Po zmierzeniu ślepej próby odejmij końcowy odczyt od początkowego odczytu, aby wykluczyć wszelkie cząstki, które nie są mikropęcherzykami. Aby oznaczyć skrawki fluorescencyjnym przeciwciałem anty-mysim IgG, oznacz jeden miligram mysiego przeciwciała IgG mąką Alexa Flour 647 w 0,1-molowym buforze wodorowęglanowym sodu zgodnie z instrukcjami producenta przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji załadować znakowany fluorescencyjnie roztwór przeciwciała na kolumnę wirową i oczyścić przeciwciało przez odwirowanie.Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie białka. Aby skonfigurować system ultrasonograficzny ze zogniskowanym skaningiem, dodaj pięciomilimetrową przestrzeń do bolusa wodnego, aby ustawić ognisko ultradźwięków dziewięć milimetrów poniżej dna bolusa wodnego. Napełnij bolus wodny około 300 mililitrami odgazowanej wody dejonizowanej i umieść układ pierścieniowy w napełnionym bolusie wodnym.Użyj lusterka dentystycznego, aby sprawdzić, czy na powierzchni nie ma pęcherzyków powietrza i uruchom aplikację. W menu przebiegu wybierz ustaw cykl pracy przebiegu i ustaw częstotliwość powtarzania impulsów na 10 Hz, cykl pracy na 10%, ostrość na 80 milimetrów, częstotliwość środkową na jeden megaherc, amplitudę na 0,65 megapaskali i indeks mechaniczny na 0,65. Naciśnij set, aby zdefiniować przebieg i zapisać przebieg w pamięci.Po wybraniu planu leczenia otwórz zakładkę skanowania w oknie kontrolera ruchu i wprowadź wartości start, stop i przyrost ruchu w wymiarze X oraz wartości start, stop i przyrost ruchu w kierunku Y. Aby zdefiniować działania dla miejsc leczenia, kliknij zdarzenie i otwórz okno edycji skryptu. Wybierz listę działań, które będą wykonywane w wybranej kolejności dla każdego miejsca zabiegowego i ustaw typ ruchu na siatkę rastrową.W zakładce zdarzenia wybierz dodaj akcje i przenieś ruch synchronicznie uruchamiaj wyzwalacz ARB wait i stop wyzwalaj akcje ARB do panelu skryptu. Następnie kliknij akcję oczekiwania i wybierz czas oczekiwania wynoszący 6 000 milisekund. Aby przygotować zwierzę do analizy, po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy, należy za pomocą markera permanentnego oznaczyć środek głowy, a następnie przykleić folię do dna małej łódki wagowej z odcięciem dna i napełnić łódkę do ważenia żelem ultradźwiękowym.W przypadku zogniskowanego leczenia ultradźwiękami odwróć fiolkę z mikropęcherzykami i delikatnie załaduj jeden mikrolitr roztworu na gram masy ciała myszy do strzykawki insulinowej o rozmiarze 29. Dodać 100 mikrolitrów znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała do strzykawki i delikatnie odwrócić i przetoczyć strzykawkę między kciukiem a palcem wskazującym, aby wymieszać przeciwciało i mikropęcherzyki w strzykawce. Ostrożnie i powoli wstrzyknij myszowi 150 mikrolitrów roztworu mikropęcherzyków i przeciwciał i ustaw minutnik na dwie minuty.Nałóż maść okulistyczną, a następnie umieść mysz w uchwycie na głowę i zamocuj jej nos w uchwycie. Umieść małą łódź do ważenia wypełnioną żelem ultradźwiękowym na czubku głowy i opuść bolus wodny, aż znajdzie się na żelu ultradźwiękowym w łodzi do ważenia. Następnie użyj joysticka, aby wizualnie ustawić ostrość przetwornika w środku głowy.Gdy timer się wyłączy, w zakładce ruchu oprogramowania wybierz resetuj początek i wybierz pełne skanowanie. Po zakończeniu leczenia nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia i umieść mysz w rozgrzanej komorze rekonwalescencji. Tutaj pokazane są reprezentatywne wyniki pomiarów licznika kultur dotyczące wielkości i stężenia, które można uzyskać, gdy mikropęcherzyki są wytwarzane prawidłowo.Wychwyt przeciwciał przez mózg można łatwo zobrazować w całym mózgu lub skrawkach tkanek za pomocą skanera na podczerwień lub mikroskopii fluorescencyjnej tych skrawków. Jak wykazano na tych obrazach, reprezentatywne barwienie markerów mikrogleju można zastosować w celu określenia, czy mikroglej staje się bardziej fagocytarny po dostarczeniu przeciwciała. Ważne jest, aby zapewnić dobrostan i bezpieczeństwo zwierząt, zwłaszcza podczas wykonywania iniekcji zaoczodołowych i umieszczania przetwornika nad głowami myszy.Metoda ta pozwala na zastosowanie różnych wzorców skanowania w celu ukierunkowania na różne obszary mózgu, takie jak hipokamp, kora mózgowa lub poszczególne półkule mózgowe. Technika ta może być wykorzystana do opracowania nowych terapii i leków, które przenikają przez barierę krew-mózg oraz do badania mechanizmu powstawania i otwierania bariery krew-mózg.

delivery-antibodies-into-brain-using-focused-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wywoływanie przerwania bariery krew-mózg (BBB) za pomocą skupionego ultradźwięku z wykorzystaniem mikropęcherzyków jest obiecującą techniką nieinwazyjnego, celowanego dostarczania leków do mózgu1-3. Niniejszy protokół opisuje procedurę eksperymentalną dla transkranialnego przerwania BBB pod kontrolą MRI w modelu szczura.

Przełamywanie bariery krew-mózg pod kontrolą MRI z użyciem przezczaszkowego ultradźwiękowego ogniskowania w modelu szczura

Zacznij od znieczulonej myszy z guzem i ogol jej głowę.Umieść go w skanerze MRI zintegrowanym z systemem zogniskowanego ultrasonografu.Wstępny skan MRI lokalizuje guz mózgu i pobliskie naczynia krwionośne.Wstrzyknąć dożylnie środek kontrastowy, a następnie podać znakowane fluorescencyjnie nanocząstki pokryte mikropęcherzykami wypełnionymi gazem.Środek kontrastowy i mikropęcherzyki krążą i docierają do mózgu.Zastosuj skoncentrowane fale ultradźwiękowe do miejsca guza.Ultradźwięki powodują, że...

Skoncentrowane dostarczanie nanocząstek wspomaganych ultradźwiękami w modelu mysim do terapii nowotworów

Ten film opisuje metodę tymczasowego zakłócania bariery krew-mózg (BBB) poprzez tworzenie przejściowych otworów za pomocą zogniskowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). Te przejściowe lokalne otwory BBB mogą ostatecznie zostać wykorzystane do dostarczania większych cząsteczek leku bezpośrednio do miąższu mózgu.

Focus Ultrasounds Mikropęcherzykowe otwieranie bariery krew-mózg: technika tworzenia zlokalizowanych przejściowych otworów w barierze krew-mózg myszy za pomocą sonoporacji

Ten film demonstruje technikę dostarczania przeciwciał do mózgu myszy za pomocą wspomagania konwekcji (CED). Czaszka znieczulonej myszy jest odsłaniana, a w obszarze docelowym tworzony jest otwór na zadziory w celu dostarczenia przeciwciał. W miejscu docelowym wprowadza się cewnik krokowy zawierający przeciwciała, a za pomocą pompy infuzyjnej wytwarzany jest gradient ciśnienia w celu dostarczania przeciwciał w kontrolowanej szybkości.

Konwekcyjne dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy

Ten film demonstruje procedurę dostarczania przeciwciał wspomaganych ultradźwiękami na modelu mysim. Mikropęcherzyki wstrzyknięte po oczodołach oscylują pod wpływem ultradźwięków, powodując przejściowe zakłócenie bariery krew-mózg, umożliwiając znakowanym przeciwciałom przedostanie się do mózgu.

Wspomagane ultradźwiękami dostarczanie przeciwciał w modelu mysim

Konwekcja wspomagana dostarczaniem (CED) to metoda umożliwiająca skuteczne dostarczanie leków do mózgu poprzez bezpośrednią perfuzję dużych objętości tkanek. Zabieg wymaga użycia cewników i zoptymalizowanej procedury iniekcji. Protokół ten opisuje metodologię CED przeciwciała w mózgu myszy.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją

Skoncentrowane ultradźwięki z mikropęcherzykami mogą otworzyć barierę krew-mózg punktowo i przejściowo. Technika ta została wykorzystana do dostarczania szerokiej gamy środków przez barierę krew-mózg. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół miejscowego dostarczania do mózgu gryzonia z lub bez wskazówek MRI.

Podejście laboratoryjne do specyficznego dla lokalizacji otworu bariery krew-mózg przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków w modelu szczurzym

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Ten protokół określa kroki niezbędne do dostarczenia genu poprzez skoncentrowanie ultradźwięków na otwarciu bariery krew-mózg (BBB), ocenę wynikowej ekspresji genu oraz pomiar aktywności neuromodulacyjnej receptorów chemogenetycznych za pomocą testów histologicznych.

Zogniskowane ultradźwięki indukowane otwieraniem bariery krew-mózg w celu celowania w struktury mózgu i oceny neuromodulacji chemogenetycznej

Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

To badanie opisuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i protokół ultradźwięków o niskiej intensywności (FUS), wykorzystujący żywe szczury z cewnikowaniem żyły szyjnej do monitorowania otwarcia bariery krew-mózg (BBB).

Monitorowanie otwarcia bariery krew-mózg u szczurów za pomocą przedklinicznego systemu ultrasonograficznego

Poznaj metodę dostarczania przeciwciał do mózgu poprzez przejściowe otwieranie bariery krew-mózg u myszy za pomocą zogniskowanego ultradźwięku. Technika umożliwia nieinwazyjną terapię i badanie aktywacji mikrogleju.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego

Przeglądaj więcej filmów