Name: Dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę wzmocnionego konwekcją dostarczania przeciwciał do mózgu myszy, omijającą barierę krew-mózg przy minimalnym uszkodzeniu tkanek. Technika ta umożliwia precyzyjne docieranie terapeutyków do układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Uniwersytetu w Zurychu (FK-15-057), Fundacji Novartis na rzecz badań medyczno-biologicznych (16C231) i Swiss Cancer Research (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) dla Johannesa vom Berga i BRIDGE Proof of Concept (20B1-1_177300) dla Lindy Schellhammer.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Szwajcarskie Kantonalne Biuro Weterynaryjne pod numerem licencji ZH246/15.
1. Przygotowanie cewników krokowych
<ol>
	<li>Przygotowanie rurki ze stopionej krzemionki do etapu cewnika
	<ol>
		<li>Przyciąć kapilarę z topionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 0,1 mm i grubości ścianki rurki 0,0325 mm na długość 30 mm.</li>
		<li>Sprawdź rurkę pod kątem pęknięć i wypoleruj na gorąco końce za pomocą mikrokuźni, aby upewnić się, że otwory rurki mają gładką powierzchnię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocowanie dętki w metalowej igle
	<ol>
		<li>Zamontuj igłę 27 G na strzykawce o pojemności 10 μl i umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym.</li>
		<li>Za pomocą robota przesunąć strzykawkę po twardej powierzchni i dotknąć jej końcówką igły. Pozycja ta powinna być zanotowana lub zapisana w oprogramowaniu, ponieważ będzie ona służyć jako powierzchnia odniesienia do ustawiania długości kroku cewnika.</li>
		<li>Podnieś igłę, aby umożliwić umieszczenie stopionej kapilary krzemionkowej wewnątrz igły</li>
		<li>Umieścić stopioną kapilę krzemionkową w igle tak, aby 20 mm kapilary wystawało z igły.</li>
		<li>Za pomocą pipety równomiernie rozprowadź 2 μl kleju cyjanoakrylowego o wysokiej lepkości na kapilarze, zaczynając od metalowej igły i kończąc 10 mm powyżej dolnego końca kapilary, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
		<li>Za pomocą robota stereotaktycznego opuść igłę, aż końcówka metalowej igły znajdzie się 1 mm nad powierzchnią odniesienia. W ten sposób stopiona kapilara krzemionkowa zostanie zamocowana w metalowej igle i utworzy krok 1 mm od końcówki metalowej igły. Usuń nadmiar kleju tworzący się na końcu metalowej igły, aby uniknąć stępienia stopnia. </li>
		<li>Odczekaj 15 minut, aż klej stwardnieje i wyjmij strzykawkę z cewnikiem z robota stereotaktycznego. Upewnij się, że na tym etapie cały nadmiar kleju został usunięty, sprawdzając końcówkę cewnika pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testowanie cewnika krokowego za pomocą bloku agarozy
	<ol>
		<li>Przygotuj 0,6% roztwór agarozy w PBS w konwencjonalnej żelowej tacce i poczekaj, aż się spolimeryzuje. Pokrój agarozę na bloki o wymiarach około 20 mm x 20 mm. Do czasu użycia trzymaj bloki zanurzone w PBS.</li>
		<li>Ręcznie napełnić strzykawkę z cewnikiem schodkowym 10 μl 0,4% roztworu przefiltrowanego błękitu trypanowego.</li>
		<li>Za pomocą robota stereotaktycznego dozować 1 μl w stężeniu 0,2 μl/min, aby ocenić szczelność stopnia cewnika podczas procedury mocowania. Roztwór błękitu trypanowego powinien być widoczny wyłącznie na końcówce cewnika. Wytrzyj go chusteczką papierową.</li>
		<li>Umieść blok agarozy w robocie stereotaktycznym i skalibruj robota tak, aby końcówka cewnika była skierowana do powierzchni bloku agarozowego.</li>
		<li>Zaprogramuj parametry wtrysku dla CED.
		<ol>
			<li>W przypadku objętości iniekcji wynoszącej 5 μl należy postępować zgodnie z następującymi krokami: 1 μl przy 0,2 μl/min, następnie 2 μl przy 0,5 μl/min i 2 μl przy 0,8 μl/min. Dostosować końcową objętość wstrzyknięcia zgodnie ze szczegółowym planem doświadczalnym, proporcjonalnie zmieniając czas trwania każdego z etapów.</li>
			<li>W celu wstrzyknięcia roztworu do mysiej skorupy ogoniastej (prążkowia) należy wykonać takie wstrzyknięcie w pozycji 1 mm czołowo i 1,5–2 mm bocznie od bregmy na głębokości 3,5 mm.</li>
			<li>Po wstrzyknięciu należy pozostawić cewnik na miejscu na 2 minuty, a następnie wycofać się z prędkością 1 mm/min, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie płynu w mózgu i uszczelnienie drogi iniekcyjnej podczas usuwania cewnika. 
			nuta: W zależności od konkretnego zastosowanego robota stereotaktycznego, wszystkie parametry można zaprogramować w jednym skrypcie. Przykładowy skrypt jest dostępny jako <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59675/CED_5_ul_striatum.txt" target="_blank">Materiał uzupełniający.</a>.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozpocznij procedurę CED i wstrzyknij 5 μl roztworu błękitu trypanowego do bloku agarozy.</li>
		<li>Oceń kształt chmury błękitu trypanowego w agarozie i potencjalny wyciek wzdłuż przewodu cewnika. Błękit trypanowy powinien tworzyć elipsoidę lub okrągłą chmurę ze środkiem wokół końcówki cewnika i średnicą co najmniej 1 mm. Nie powinien być widoczny żaden większy przepływ wsteczny przez końcówkę metalowej igły.</li>
		<li>Umieścić nowy blok agarozy i rozpocząć drugie wstrzyknięcie 1 μl w tempie 0,2 μl/min w celu oceny zatkania cewnika agarozą. Błękit trypanowy powinien ponownie zacząć tworzyć chmurę z końcówki cewnika natychmiast po rozpoczęciu wstrzyknięcia.</li>
		<li>Ocenić, czy pozostała objętość w strzykawce odpowiada 3 μl. Wszelkie zmiany mogą wskazywać na wyciek płynu przez mocowanie cewnika lub tłok strzykawki.</li>
		<li>Jeśli wszystkie wstrzyknięcia testowe zakończą się pomyślnie, cewnik jest dobrze uszczelniony, prosty i nie obserwuje się roztworu błękitu trypanowego z innych miejsc niż końcówka cewnika, umyj cewnik dejonizowanymH2O(dH2O), aż nie będą widoczne ślady błękitu trypanowego, a następnie przemyj dziesięć razy w następujący sposób: 70% etanolu i 100% etanolu, a następnie ponownie przepłucz 70% etanolem i czystą wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Cewnik należy przechowywać w suchych warunkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konwekcja wspomagana dostarczaniem roztworu przeciwciał do mysiego mózgu
UWAGA: W zależności od lokalnych przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt, różne rodzaje środków znieczulających, przeciwbólowych i antybiotyków mogą być stosowane do tej procedury. Protokół ten opisuje zastosowanie znieczulenia iniekcyjnego. Wziewne środki znieczulające, takie jak izofluran, mogą być również stosowane poprzez zamontowanie maski na nos na ramie stereotaktycznej. Ponadto zalecamy dodawanie antybiotyków do wody pitnej w celu zapobiegania infekcjom.
<ol>
	<li>Konfiguracja chirurgiczna
	<ol>
		<li>Przygotuj środki znieczulające i roztwory antidotum. Myszy można bezpiecznie znieczulić za pomocą trójskładnikowego środka znieczulającego zawierającego fentanyl (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) i medetomidynę (0,5 mg/kg) rozcieńczonych w sterylnymdH2O. Przeprowadzamy dwuetapową procedurę budzenia przy użyciu dwóch roztworów antidotum, jednego zawierającego flumazenil (0,5 mg/kg) i buprenorfinę (0,1 mg/kg) w sterylnymdH2O (pierwszy roztwór antidotum). Drugi zawiera atipamezol (2,5 mg/kg) w jałowymdH2O(drugi roztwór antidotum).</li>
		<li>Przygotować roztwór przeciwbólowy zawierający karprofen (5,667 mg/kg) rozcieńczony jałowymdH2O.</li>
		<li>Wyczyść ramę stereotaktyczną, poduszkę grzewczą i elementy robota stereotaktycznego. Należy pamiętać, że nie wszystkie części robota można wyczyścić bez ryzyka uszkodzenia. Zapoznaj się z instrukcją obsługi robota, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat czyszczenia i przygotowania do użycia.</li>
		<li>Połączyć strzykawkę z cewnikiem schodkowym i przepłukać ją kilkakrotniedH2O, 70% etanolem i 100% etanolem, a następnie ponownie przepłukać 70% etanolem idH2O. Na koniec przepłukać strzykawkę PBS lub innymi, które mają być użyte do przygotowania roztworu do wstrzykiwań wewnątrzczaszkowych, np. sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Tłok strzykawki powinien poruszać się płynnie i swobodnie podczas całego zabiegu.</li>
		<li>Skalibruj oprogramowanie robota stereotaktycznego z ramką stereotaktyczną.</li>
		<li>Przetestuj oprogramowanie robota stereotaktycznego, upewniając się, że ramiona robota poruszają się swobodnie, a pompa wtryskowa jest prawidłowo podłączona i może wykonywać procedurę CED bez żadnych zakłóceń. Obejmuje to testowanie ruchu robota, wstrzykiwanie z rampą, sprawdzanie 2-minutowego kroku oczekiwania i szybkości cofania cewnika. Wszystkie parametry powinny być zgodne z zaprogramowaną procedurą CED opisaną w ppkt 1.3.5.</li>
		<li>Włóż wiertło do wiertła. Zaleca się sterylizację wierteł przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciała przy użyciu PBS lub innych roztworów buforowych, takich jak aCSF. 1 do 20 μg przeciwciała w 5 μl można wstrzyknąć w jednej procedurze CED. Inne objętości i ilości białka powinny zostać zbadane przed przeprowadzeniem doświadczenia. Należy pamiętać, że stosowanie roztworów o wysokiej lepkości może prowadzić do zatkania cewnika.</li>
		<li>Ręcznie naładować strzykawkę rozcieńczonym przeciwciałem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja przeciwciała przez CED do prążkowia
	<ol>
		<li>Zważ mysz i wstrzyknij trójskładnikowy roztwór znieczulający do otrzewnej w zależności od masy ciała. Zwróć uwagę na czas wstrzyknięcia. Przenieś mysz do osobnej klatki ogrzewanej poduszką grzewczą.</li>
		<li>Obserwuj mysz, aby określić, kiedy zaczyna się sedacja. Gdy tylko mysz przestanie się poruszać, nałóż maść okulistyczną na oczy, aby chronić rogówkę przed wysuszeniem podczas zabiegu. Pełna sedacja rozpoczyna się zwykle po 10–15 minutach od wstrzyknięcia trójskładnikowego roztworu znieczulającego.</li>
		<li>Sprawdź reakcje bólowe za pomocą testu odruchu szczypania, aby zapewnić pełne znieczulenie zwierzęcia.</li>
		<li>Ogol głowę za pomocą trymera do włosów.</li>
		<li>Zdezynfekuj skórę wacikami nasączonymi roztworem jodu. Wyszoruj skórę trzy razy okrężnymi ruchami.</li>
		<li>Za pomocą skalpela wykonaj 10-milimetrowe nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej czaszki, kończąc na poziomie oczu.</li>
		<li>Zamocuj mysz w ramce stereotaktycznej za pomocą zacisku na nos i nauszników. Upewnij się, że powierzchnia czaszki jest pozioma i szczelnie zabezpieczona. Oprócz prawidłowej nawigacji anatomicznej, kluczowe jest również unikanie przechylania się czaszki podczas wiercenia i zabiegu CED.</li>
		<li>Umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym.</li>
		<li>Zsynchronizuj wiertło z końcówką cewnika w punkcie odniesienia. Bardzo ważne jest, aby zależność między położeniem wiertła a strzykawki była precyzyjnie określona w oprogramowaniu, aby wstrzyknięcie można było wykonać w pożądany obszar anatomiczny mózgu.</li>
		<li>Cofnij skórę za pomocą kleszczy i zlokalizuj bregma na powierzchni czaszki.</li>
		<li>Odwołaj się do bregmy w oprogramowaniu za pomocą końcówki wiertła.</li>
		<li>Przesuń wiertło do pozycji 1 mm z przodu i 2 mm z boku od bregmy i wywierć otwór na zadziory. Uważaj, aby nie uszkodzić opony twardej.</li>
		<li>Przesunąć strzykawkę nad otworem zadziorów.</li>
		<li>Dozować 0,5–1 μl ze strzykawki, aby upewnić się, że w cewniku nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Uruchomić program CED opisany w ppkt 1.3.5. Na powierzchni czaszki należy obserwować, czy nie ma śladów cofania się płynu z miejsca wstrzyknięcia. Monitoruj częstość oddechów zwierzęcia.</li>
		<li>Po zakończeniu programu CED i wyjęciu cewnika z mózgu należy uruchomić pompę iniekcyjną z prędkością 0,2 μl/min, aby sprawdzić, czy cewnik nie jest zatkany podczas CED. Jeśli nie doszło do zatkania, natychmiast powinna pojawić się kropla mieszanki do wstrzykiwań wypływająca z końcówki cewnika.</li>
		<li>Przed ponownym użyciem lub przechowywaniem cewnika należy wizualnie sprawdzić etap cewnika pod kątem oznak uszkodzenia lub zużycia pod mikroskopem i wyczyścić go jak w kroku 1.3.10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura budzenia
	<ol>
		<li>Delikatnie wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej.</li>
		<li>Umyć miejsce operacji sterylnym roztworem soli fizjologicznej.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy wypełnij otwór zadziorów woskiem kostnym.</li>
		<li>Zamknij skórę kleszczami z cienką końcówką i nałóż klej chirurgiczny za pomocą pipety 10 μl na nacięcie. Odczekaj 15–30 s, aż klej się spolimeryzuje.</li>
		<li>Zastosuj roztwór przeciwbólowy we wstrzyknięciu podskórnym. Zanotuj czas wstrzyknięcia.</li>
		<li>Zastosuj pierwszy roztwór antidotum. Zanotuj czas wstrzyknięcia.</li>
		<li>Przenieś mysz do osobnej klatki z poduszką grzewczą i monitoruj zwierzę pod kątem odruchów przerażenia.</li>
		<li>Jeśli mysz nie odzyskała pełnej przytomności po 15 minutach od podania pierwszego roztworu antidotum, należy zastosować drugi roztwór antidotum we wstrzyknięciu podskórnym.</li>
		<li>Monitoruj zwierzęta w fazie rekonwalescencji.</li>
		<li>Sprawdzić 1-2 godziny później, a także następnego dnia pod kątem powikłań pooperacyjnych. W razie potrzeby ponownie zastosuj środek przeciwbólowy.</li>
		<li>W profilaktyce zakażeń należy dodać sulfadoksynę (stężenie końcowe 0,08% w/v) i trimetoprim (stężenie końcowe 0,016% w/v) do wody pitnej, do której zwierzęta mają dostęp ad libitum przez 1 tydzień po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Scherrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+via+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Drug delivery via the blood-brain barrier.</a> Vascular Pharmacology. 38 (6), 349-354 (2002).</li>
<li>Barua, N. U., Gill, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+drug+delivery%3A+prospects+for+glioblastoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Oncology%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment.</a> CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).</li>
<li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li>
<li>Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-flow+microinfusion%3A+tissue+penetration+and+pharmacodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics.</a> American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).</li>
<li>Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-Enhanced+Delivery+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment.</a> Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).</li>
<li>Barua, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+convection-enhanced+delivery+results+in+widespread+perivascular+distribution+in+a+pre-clinical+model%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2(2012).</li>
<li>Shoji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+convection-enhanced+delivery+of+an+anti-CD40+agonistic+monoclonal+antibody+induces+antitumor+effects+in+mouse+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models.</a> Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).</li>
<li>Souweidane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%3A+a+single-centre%2C+dose-escalation%2C+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial.</a> The Lancet Oncology. , (2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+immune+checkpoints+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Targeting immune checkpoints in malignant glioma.</a> Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).</li>
<li>Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+drug+delivery+to+the+brain%3A+therapeutic+potential+and+neuropathological+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations.</a> Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).</li>
<li>Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-Enhanced+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Convection-Enhanced Delivery.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 358-371 (2017).</li>
<li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Nash, K. R., Gordon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection+Enhanced+Delivery+of+Recombinant+Adeno-associated+Virus+into+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).</li>
<li>Ohlfest, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+antiangiogenic+gene+therapy+by+nonviral+gene+transfer+using+the+sleeping+beauty+transposon+causes+tumor+regression+and+improves+survival+in+mice+bearing+intracranial+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma.</a> Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).</li>
<li>Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cannula+design+and+placement+for+convection-enhanced+delivery+in+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).</li>
<li>Mamot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+distribution+of+liposomes+in+rodent+brains+and+brain+tumors+following+convection-enhanced+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery.</a> Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).</li>
<li>Saito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+affinity+of+the+infusate+affects+the+distribution+volume+during+convection-enhanced+delivery+into+rodent+brains%3A+implications+for+local+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).</li>
<li>Oh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+distribution+of+small+molecules+and+viral+vectors+in+the+murine+brain+using+a+hollow+fiber+catheter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).</li>
<li>Barua, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+implantable+catheter+system+with+transcutaneous+port+for+intermittent+convection-enhanced+delivery+of+carboplatin+for+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma.</a> Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).</li>
<li>Rosenbluth, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+in-dwelling+cannula+for+convection-enhanced+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).</li>
<li>Debinski, W., Tatter, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+for+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors.</a> Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).</li>
<li>MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+in+brain+of+liposomes+after+convection+enhanced+delivery%3B+modulation+by+particle+charge%2C+particle+diameter%2C+and+presence+of+steric+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating.</a> Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).</li>
<li>Chen, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+realistic+brain+tissue+phantom+for+intraparenchymal+infusion+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies.</a> Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).</li>
<li>Sampson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+drug+distribution+as+a+possible+explanation+for+the+results+of+the+PRECISE+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial.</a> Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).</li>
<li>Wick, W., Weller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabedersen+to+target+transforming+growth+factor-beta%3A+when+the+journey+is+not+the+reward%2C+in+reference+to+Bogdahn+et+al.+%28Neuro-Oncology+2011%3B13%3A132-142%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142).</a> Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).</li>
<li>Saito, R., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+therapeutics+for+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologia+Medico-Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas.</a> Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).</li>
<li>Bedussi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+from+the+mouse+brain+by+convection+of+interstitial+fluid+towards+the+ventricular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 23(2015).</li>
<li>Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+glioblastoma%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22ESMO+Open%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of glioblastoma: a systematic review.</a> ESMO Open. 1 (6), e000144(2016).</li>
<li>Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+pressure+in+intracranial+tumours+in+patients+and+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents.</a> British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).</li>
<li>Glushakova, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+clinical+biomarkers+of+caspase-mediated+apoptosis+associated+with+neuronal+and+neurovascular+damage+following+stroke+and+other+severe+brain+injuries%3A+Implications+for+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Circulation%22%5BJournal%5D)">Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration.</a> Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).</li>
<li>Vom Berg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+IL-12%2FIL-23+signaling+reduces+Alzheimer%27s+disease-like+pathology+and+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline.</a> Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).</li>
<li>Vom Berg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+IL-12+combined+with+CTLA-4+blockade+elicits+T+cell-mediated+glioma+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).</li>
<li>Kurdi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+administration+of+the+mTORC1+inhibitor+everolimus+induces+tolerance+and+decreases+autophagy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).</li>
</ol>

Johannes vom Berg jest wymieniony jako wynalazca w zgłoszeniu patentowym (PCT/EP2012/070088) Uniwersytetu w Zurychu. Michal Beffinger, Linda Schellhammer i Johannes vom Berg są wymienieni jako wynalazcy w zgłoszeniu patentowym (EP19166231) Uniwersytetu w Zurychu. Autorzy nie posiadają żadnych dodatkowych interesów finansowych.

Konwekcyjne dostarczanie lub infuzja leków do mózgu za pośrednictwem ciśnienia została po raz pierwszy zaproponowana na początku 1990roku. Takie podejście obiecuje perfuzję dużych objętości mózgu za barierą krew-mózg w kontrolowany sposób2. Jednak do tej pory przeprowadzono tylko kilka badań klinicznych przy użyciu tego podejścia, częściowo dlatego, że CED w konfiguracji klinicznej okazał się technicznie wymagający24,25</...

Bariera krew-mózg (BBB) tworzy półprzepuszczalną granicę oddzielającą ośrodkowy układ nerwowy (OUN) od krążenia krwi. Dotarcie do OUN z terapią jest jednak konieczne w kontekście różnych chorób, takich jak między innymi guzy mózgu, choroba Alzheimera (AD) czy choroba Parkinsona (PD)1. Staje się to istotne przy opracowywaniu nowych terapii, zwłaszcza jeśli testowany lek wykazuje słabą przepuszczalność BBB lub jego ogólnoustrojowa ekspozycja może prowadzić do niebezpiecznej toksyczności1,2. Niektóre z klinicznie stosowanych przeciwciał wykazują obie te cechy. Rozwiązaniem tego problemu byłoby dostarczenie środków terapeutycznych bezpośrednio za barierę krew-mózg.
Dostarczanie wspomagane konwekcją (CED) to technika neurochirurgiczna umożliwiająca efektywną perfuzję dużych objętości mózgu. Osiąga się to poprzez chirurgiczne zainstalowanie jednego lub więcej cewników w obszarze docelowym. Podczas aplikacji leku w otworze cewnika powstaje gradient ciśnienia, który staje się siłą napędową dyspersji infuzji w tkance 3,4. Zatem to czas trwania infuzji, a nie współczynniki dyfuzji, określają zakres perfuzji2,4,5. Zapewnia to równomierne dostarczanie infuzji przez znacznie większą objętość mózgu w porównaniu z konwencjonalnymi, opartymi na dyfuzji metodami iniekcji domózgowych2,6. Jednocześnie ta metoda dostarczania wiąże się z mniejszym ryzykiem uszkodzenia tkanek2. W związku z tym CED może umożliwić bezpieczne i skuteczne podawanie konwencjonalnych chemioterapeutyków w leczeniu nowotworów OUN, a także dostarczanie środków immunomodulujących lub przeciwciał agonistycznych i antagonistycznych w wielu innych zaburzeniach OUN2,7,8,9. CED jest obecnie testowany w terapiach choroby Parkinsona, choroby Alzheimera, a także glejaka wysokiego stopnia2,7,8,10,11.
Konstrukcja cewnika i schemat iniekcji to jedne z najważniejszych czynników wpływających na wynik CED 10,12,13,14,15,16. Ponadto wymaga specyficznych właściwości fizykochemicznych naparu, w tym umiarkowanej wielkości cząstek, ładunku anionowego i niskiego powinowactwa do tkanek 10,17. Każdy z tych parametrów musi być potencjalnie dostosowany zgodnie z cechami histologicznymi obszaru mózgu, który ma być celem ataku2,10,17.
Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania CED roztworu przeciwciała do skorupy ogoniastej (prążkowia) myszy. Ponadto protokół obejmuje przygotowanie cewników krokowych w warunkach laboratoryjnych, przetestowanie ich in vitro i wykonanie CED.
W literaturze dostępnych jest wiele wzorów cewników, różniących się kształtem kaniuli, użytymi materiałami i liczbą otworów cewnika12,15,18,19,20,21,22. Używamy cewnika schodkowego wykonanego z kapilary ze stopionej krzemionki wystającej 1 mm z końca metalowej igły. Ta konstrukcja cewnika może być łatwo wyprodukowana w laboratorium badawczym i powtarzalnie daje dobre wyniki CED podczas testów in vitro z blokami agarozowymi o parametrach fizycznych przypominających miąższ mózgu in vivo23.
Ponadto, wdrażamy schemat zwiększania dawki 5 μL infuzji in vivo. W takim protokole szybkość wstrzykiwania jest zwiększona z 0,2 μl/min do maksymalnie 0,8 μl/min, minimalizując w ten sposób ryzyko refluksu infuzyjnego wzdłuż cewnika, a także ryzyko uszkodzenia tkanek16. Korzystając z tego protokołu, z powodzeniem podaliśmy myszom do 20 μg przeciwciał w 5 μl PBS w ciągu 11 minut 30 s.
Protokół można łatwo dostosować do innych objętości infuzji lub do wstrzykiwania różnych innych substancji, np. chemioterapeutyków, cytokin, cząsteczek wirusowych lub liposomów2,10,14,18,22. W przypadku stosowania infuzjatu o drastycznie odmiennych właściwościach fizykochemicznych w porównaniu z roztworem przeciwciał z roztworem przeciwciał buforowanym fosforanem (PBS) lub sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF), zalecane są dodatkowe kroki walidacji. W przypadku montażu cewnika, walidacji i CED opisujemy wszystkie etapy przy użyciu robota stereotaktycznego z wiertarką i jednostką iniekcyjną zamontowaną na zwykłej ramie stereotaktycznej. Procedura ta może być również wykonywana za pomocą ręcznej ramy stereotaktycznej podłączonej do programowalnej pompy mikroinfuzyjnej, która może napędzać opisywane szklane mikrostrzykawki.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; Strzykawka L</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>27 G igła z końcem</td><td>Hamilton</td><td>7762-01</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Janssen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>Braun</td><td>1029754</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Indivior Schweiz AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiertła dentystyczne, stalowe, rozmiar ISO 009</td><td>Hager & Meisinger</td><td>1RF009</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Reuss-Chemie AG</td><td>179-VL03K-/1</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Helvepharm AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran, 2000 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Labatec Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Wysoka lepkość klej cyjanoakrylowy</td><td>Migros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Orion Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Roche Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Bausch + Lomb</td><td>Witamina A Blache</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne kozie przeciwciało przeciw szczurom IgG (H+L) sprzężone z Alexa Fluor 647</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpele</td><td>Braun</td><td>BB518</td><td></td></tr><tr><td>Średnica wewnętrzna rurki krzemionkowej 0,1 mm, grubość ścianki 0,0325 mm</td><td>Postnova</td><td>Z-FSS-100165</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna dla myszy</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Robot stereotaktyczny</td><td>Neurostar</td> Robot <td></td><td>wiertniczo-iniekcyjne</td></tr><tr><td>Succrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Miejscowy klej tkankowy</td><td>Zoetis</td><td>GLUture</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Bichsel</td><td>1000004</td><td></td></tr></tbody></table>

dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Dostarczanie wspomagane konwekcją (CED) to technika neurochirurgiczna umożliwiająca efektywną perfuzję dużych objętości mózgu za pomocą systemu cewnikowego. Takie podejście zapewnia bezpieczną metodę dostarczania z pominięciem bariery krew-mózg (BBB), umożliwiając w ten sposób leczenie terapiami o słabej przepuszczalności BBB lub takimi, w przypadku których ekspozycja ogólnoustrojowa nie jest pożądana, np. ze względu na toksyczność. CED wymaga optymalizacji konstrukcji cewnika, protokołu iniekcji i właściwości infuzji. W tym protokole opisujemy, jak wykonać CED roztworu zawierającego do 20 μg przeciwciała do skorupy ogoniastej myszy. Opisano w nim przygotowanie cewników krokowych, testowanie ich in vitro i wykonywanie CED u myszy przy użyciu programu iniekcji narastającej. Protokół można łatwo dostosować do innych objętości infuzji i może być stosowany do wstrzykiwania różnych znaczników lub substancji farmakologicznie czynnych lub nieaktywnych, w tym chemioterapeutyków, cytokin, cząstek wirusowych i liposomów.

Niniejszy protokół umożliwia przygotowanie cewników stopniowych (Rycina 1) do zastosowania w procedurze CED w warunkach laboratoryjnych. Aby sprawdzić cewniki pod kątem nieszczelności, refluksu wzdłuż toru igły oraz zapchania, zaleca się wykonanie wtrysków barwnika, np. roztworu błękitu trypanu, do bloku agarozy. Rycina 3 przedstawia chmurę błękitu trypanu powstałą po wstrzyknięciu 1 µL z prędkością 0,5 µL/minute przy użyciu cewnika CED (Ryc...

Konwekcja wspomagana dostarczaniem (CED) to metoda umożliwiająca skuteczne dostarczanie leków do mózgu poprzez bezpośrednią perfuzję dużych objętości tkanek. Zabieg wymaga użycia cewników i zoptymalizowanej procedury iniekcji. Protokół ten opisuje metodologię CED przeciwciała w mózgu myszy.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Protokół ten może być stosowany do wykonywania porodu ze wzmocnieniem konwekcyjnym u małych gryzoni przy użyciu systemu cewnika krokowego do regulowanej jednolitej perfuzji docelowych obszarów mózgu. Zaletą dostarczania wspomaganego konwekcją jest to, że umożliwia dostarczanie substancji do obszaru zainteresowania z pominięciem bariery krew-mózg z niewielkim uszkodzeniem tkanek lub refluksem. Technika ta jest przydatna przede wszystkim do dostarczania substancji terapeutycznych, takich jak przeciwciała, do mózgu.I dlatego może być stosowany do celowania w wiele schorzeń neurologicznych. Procedurę zademonstruje Michał Beffinger, post-doc z mojego laboratorium. Zacznij od wycięcia kapilary ze stopionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 0,1 milimetra i grubości ścianki 0,325 milimetra na długość 30 milimetrów.Po zbadaniu rurki pod kątem pęknięć użyj mikrokuźni, aby wypolerować na gorąco końce, aby upewnić się, że otwory rurki mają gładką powierzchnię. Następnie zamontuj igłę o rozmiarze 27 na strzykawce o pojemności 10 mikrolitrów i umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym. Za pomocą robota przesunąć strzykawkę po twardej powierzchni i dotknąć jej końcówką igły.Po zanotowaniu tej pozycji należy podnieść igłę, aby umożliwić umieszczenie stopionej kapilary krzemionkowej wewnątrz igły w taki sposób, aby 20 milimetrów kapilary wystawało z igły. Za pomocą pipety równomiernie rozprowadź dwa mikrolitry kleju cyjanoakrylowego o wysokiej lepkości na kapilarze, zaczynając od metalowej igły i kończąc dziesięć milimetrów powyżej dolnego końca kapilary. Użyj robota stereotaktycznego, aby opuścić metalową igłę, aż końcówka igły znajdzie się o jeden milimetr nad powierzchnią odniesienia, aby zamocować stopioną kapilę krzemionkową w metalowej igle, tworząc jeden milimetrowy krok od końcówki metalowej igły.Usuń nadmiar kleju tworzący się na końcu metalowej igły, aby uniknąć osadzenia etapu cewnika. Sprawdź końcówkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że cały nadmiar kleju został usunięty. Następnie odczekaj 15 minut, aż klej stwardnieje i wyjmij strzykawkę z cewnikiem z robota.Do badania cewnika krokowego należy pokroić zestalony żel agarozowy 0,6% na bloki o wymiarach 20 na 20 milimetrów i ręcznie napełnić strzykawkę z cewnikiem schodkowym 10 mikrolitrami przefiltrowanego 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Za pomocą robota stereotaktycznego dozuj jeden mikrolitr barwnika w ilości 0,2 mikrolitra na minutę, aby ocenić szczelność kroku cewnika podczas procedury utrwalania. Roztwór błękitu trypanowego powinien być widoczny wyłącznie na końcówce cewnika.Zetrzyj barwnik chusteczką papierową i umieść blok agarozy w robocie stereotaktycznym. Skalibruj robota powiedział, że końcówka cewnika jest odniesiona do powierzchni bloku agarozy. Ustalić proporcję objętości wstrzyknięć zgodnie z określonym planem doświadczalnym.Aby wstrzyknąć roztwór do mysiej skorupy ogoniastej, należy ustawić wstrzyknięcie na jeden milimetr czołowy i półtora do dwóch milimetrów bocznych od pozycji bregma na głębokości 3,5 milimetra. Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, rozpocznij procedurę dostarczania ze wzmocnioną konwekcją i wstrzyknij pięć mikrolitrów roztworu błękitu trypanowego do bloku agarozy. Oceń kształt niebieskiej chmury trypanowej w agarozie i potencjalny wyciek wzdłuż przewodu cewnika.Nie powinien być widoczny żaden większy przepływ wsteczny przez końcówkę metalowej igły. Po wstrzyknięciu należy pozostawić cewnik na miejscu na dwie minuty, a następnie cofnąć igłę z prędkością jednego milimetra na minutę, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie płynu do mózgu i uszczelnienie drogi iniekcyjnej podczas usuwania. Umieść nowy blok agarozy w robocie i rozpocznij drugie wstrzyknięcie jednego mikrolitra w ilości 0,2 mikrolitra na minutę, aby ocenić zatkanie cewnika w agarozie.Błękit trypanowy powinien ponownie utworzyć chmurę z końcówki cewnika natychmiast po rozpoczęciu wstrzyknięcia. Następnie oceń, czy pozostała objętość w strzykawce odpowiada 3 mikrolitrom, ponieważ wszelkie zmiany mogą wskazywać na wyciek płynu przez mocowanie cewnika lub tłok strzykawki. W przypadku wstrzyknięcia przeciwciała do mysiego prążkowia potwierdź brak odpowiedzi na uszczypnięcie skóry u znieczulonej myszy i ogol głowę trymerem do włosów.Zdezynfekuj skórę wacikami nasączonymi roztworem jodu. Użyj skalpela, aby wykonać 10-milimetrowe nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej czaszki, kończąc na poziomie oczu. Zamocuj mysz w ramie stereotaktycznej za pomocą zacisku na nos i listew dousznych, uważając, aby powierzchnia czaszki była pozioma i szczelnie zabezpieczona.Umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym i zsynchronizuj wiertło z końcówką cewnika w punkcie odniesienia. Użyj kleszczy, aby cofnąć skórę i zlokalizować bregma na powierzchni czaszki. Odnieś bregma w oprogramowaniu za pomocą końcówki wiertła i przesuń wiertło na jeden milimetr z przodu i dwa milimetry bocznie od pozycji bregma.Wywierć otwór na zadziory, uważając, aby nie uszkodzić opony twardej i przesuń strzykawkę nad otworem na żarna. Dozować od 0,5 do jednego mikrolitra ze strzykawki, aby upewnić się, że w cewniku nie pozostały pęcherzyki powietrza. Rozpocznij wspomagane podawanie konwekcyjne, jak pokazano, obserwując powierzchnię czaszki pod kątem śladów cofania się płynu z miejsca wstrzyknięcia.Po zakończeniu podawania i wyjmowania cewnika należy uruchomić pompę iniekcyjną z prędkością 0,2 mikrolitra na minutę, aby sprawdzić, czy cewnik nie jest zatkany podczas wstrzykiwania. Jeśli nie doszło do zatkania, należy natychmiast zaobserwować kroplę mieszaniny do wstrzykiwań wypływającą z końcówki cewnika. Na tym zdjęciu chmury błękitu trypanowego tworzącej się po wstrzyknięciu jednego mikrolitra barwnika w ilości 0,5 mikrolitra na minutę za pomocą cewnika wzmocnionego konwekcyjnie, jak pokazano, nie było widać refluksu wzdłuż przewodu igły na początku etapu cewnika.A rozproszona chmura uformowała pożądany kulisty kształt. Na tym zdjęciu za pomocą igły z końcem można jednak zaobserwować znaczny refluks. Warto zauważyć, że wspomagane konwekcją dostarczanie umożliwia perfuzję dużych objętości do mysiego mózgu w jednolity i mniej uszkadzający tkanki sposób w porównaniu z konwencjonalnym wstrzykiwaniem.W obu typach podawania występuje typowy profil dystrybucji cząstek przeciwciała i dekstranu w ciele modzelowatym. Jednak profil dyspersji wstrzykniętego przeciwciała jest bardziej rozproszony niż obserwuje się to w przypadku dekstranu o dużej masie cząsteczkowej po dostarczeniu wzmocnionym konwekcyjnie, co ilustruje różnice w dystrybucji między różnymi infusanami. Ponieważ cewnik może potencjalnie zatkać się podczas infuzji mózgu, ważne jest, aby sprawdzić go natychmiast po jego zakończeniu, powoli dozując niewielką objętość infuzji.Procedura ta może służyć jako sposób dostarczania farmakologicznie aktywnych związków do mózgu i powinna być poprzedzona ścisłym monitorowaniem objawów choroby i oczekiwanych skutków ubocznych. Technika ta umożliwia infuzję precyzyjnego obszaru mózgu za pomocą środków terapeutycznych, w tym przeciwciał, otwierając nowe możliwości rozwoju terapii ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy.

delivery-antibodies-into-murine-brain-via-convection-enhanced

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Gruntowne testy przedkliniczne leków działających w ośrodkowym układzie nerwowym często obejmują ocenę i porównanie biodystrybucji leku w zależności od konkretnych dróg podania. W niniejszym materiale zaprezentowano na myszach trzy powszechnie stosowane metody podania ogólnoustrojowego (dożylne, dosytnieniowe oraz doustne), a także metodę podania miejscowego (podanie wspomagane konwekcją).

Systemiczne i miejscowe dostarczanie leków w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego w modelach gryzoni

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Kapsułkowanie leku zwiększa swoistość komórek nowotworowych i zmniejsza neurotoksyczność.

Wspomagane konwekcją dostarczanie naładowanych liposomów pokrytych glikolem polietylenowym do guza mózgu szczura

Źródło: Zamboni, M., et al., Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie do wnętrzełka. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę dostarczania induktora leku do cisterna magna znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie selektywnie indukuje ekspresję markerów fluorescencyjnych w komórkach powierzchni mózgu dostępnych za pośrednictwem płynu mózgowo-rdzeniowego, co potwierdza obrazowanie fluorescencyjne.

Celowane dostarczanie leków w modelu mysim za pomocą iniekcji Cisterna Magna

Ten film demonstruje technikę dostarczania przeciwciał do mózgu myszy za pomocą wspomagania konwekcji (CED). Czaszka znieczulonej myszy jest odsłaniana, a w obszarze docelowym tworzony jest otwór na zadziory w celu dostarczenia przeciwciał. W miejscu docelowym wprowadza się cewnik krokowy zawierający przeciwciała, a za pomocą pompy infuzyjnej wytwarzany jest gradient ciśnienia w celu dostarczania przeciwciał w kontrolowanej szybkości.

Konwekcyjne dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy

Ten film demonstruje procedurę dostarczania przeciwciał wspomaganych ultradźwiękami na modelu mysim. Mikropęcherzyki wstrzyknięte po oczodołach oscylują pod wpływem ultradźwięków, powodując przejściowe zakłócenie bariery krew-mózg, umożliwiając znakowanym przeciwciałom przedostanie się do mózgu.

Wspomagane ultradźwiękami dostarczanie przeciwciał w modelu mysim

Źródło: Leda, A. R., et al. Technika infuzji mikrochirurgicznej myszy do celowanego dostarczania substancji do OUN przez tętnicę szyjną wewnętrzną. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia procedurę mikrochirurgiczną mającą na celu ułatwienie celowanej infuzji substancji badanej do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). Zabieg polega na precyzyjnym szyciu i manipulacji naczyniami krwionośnymi w celu czasowego ograniczenia przepływu krwi, zapewniając kontrolowane dostarczanie. Rurka...

Celowane dostarczanie substancji do mózgu myszy poprzez infuzję do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Mysi model ludzkiej endoskopowej rekonstrukcji podstawy czaszki został opracowany, który tworzy półprzepuszczalny interfejs między mózgiem a nosem za pomocą przeszczepów błony śluzowej nosa. Metoda ta pozwala naukowcom badać dostarczanie do ośrodkowego układu nerwowego leków o dużej masie cząsteczkowej, które w przeciwnym razie są wykluczane przez barierę krew-mózg, gdy są podawane ogólnoustrojowo.

Heterotopowa procedura wszczepienia błony śluzowej w celu bezpośredniego dostarczania leku do mózgu u myszy

Obecny protokół opisuje technikę infuzji mikrochirurgicznej u myszy, która skutecznie dostarcza substancje bezpośrednio do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną.

Technika infuzji mikrochirurgicznej myszy do celowanego dostarczania substancji do OUN przez tętnicę szyjną wewnętrzną

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Prezentowany tutaj jest protokół przejściowego otwierania bariery krew-mózg (BBB) albo ogniskowo, albo przez mózg myszy, w celu dostarczenia fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał i aktywacji mikrogleju. Przedstawiono również metodę wykrywania dostarczania przeciwciał i aktywacji mikrogleju za pomocą histologii.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego

Poznaj metodę wzmocnionego konwekcją dostarczania przeciwciał do mózgu myszy, omijającą barierę krew-mózg przy minimalnym uszkodzeniu tkanek. Technika ta umożliwia precyzyjne docieranie terapeutyków do układu nerwowego.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją

Przeglądaj więcej filmów