Dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją

Protokół ten może być stosowany do wykonywania porodu ze wzmocnieniem konwekcyjnym u małych gryzoni przy użyciu systemu cewnika krokowego do regulowanej jednolitej perfuzji docelowych obszarów mózgu. Zaletą dostarczania wspomaganego konwekcją jest to, że umożliwia dostarczanie substancji do obszaru zainteresowania z pominięciem bariery krew-mózg z niewielkim uszkodzeniem tkanek lub refluksem. Technika ta jest przydatna przede wszystkim do dostarczania substancji terapeutycznych, takich jak przeciwciała, do mózgu.

I dlatego może być stosowany do celowania w wiele schorzeń neurologicznych. Procedurę zademonstruje Michał Beffinger, post-doc z mojego laboratorium. Zacznij od wycięcia kapilary ze stopionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 0,1 milimetra i grubości ścianki 0,325 milimetra na długość 30 milimetrów.

Po zbadaniu rurki pod kątem pęknięć użyj mikrokuźni, aby wypolerować na gorąco końce, aby upewnić się, że otwory rurki mają gładką powierzchnię. Następnie zamontuj igłę o rozmiarze 27 na strzykawce o pojemności 10 mikrolitrów i umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym. Za pomocą robota przesunąć strzykawkę po twardej powierzchni i dotknąć jej końcówką igły.

Po zanotowaniu tej pozycji należy podnieść igłę, aby umożliwić umieszczenie stopionej kapilary krzemionkowej wewnątrz igły w taki sposób, aby 20 milimetrów kapilary wystawało z igły. Za pomocą pipety równomiernie rozprowadź dwa mikrolitry kleju cyjanoakrylowego o wysokiej lepkości na kapilarze, zaczynając od metalowej igły i kończąc dziesięć milimetrów powyżej dolnego końca kapilary. Użyj robota stereotaktycznego, aby opuścić metalową igłę, aż końcówka igły znajdzie się o jeden milimetr nad powierzchnią odniesienia, aby zamocować stopioną kapilę krzemionkową w metalowej igle, tworząc jeden milimetrowy krok od końcówki metalowej igły.

Usuń nadmiar kleju tworzący się na końcu metalowej igły, aby uniknąć osadzenia etapu cewnika. Sprawdź końcówkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że cały nadmiar kleju został usunięty. Następnie odczekaj 15 minut, aż klej stwardnieje i wyjmij strzykawkę z cewnikiem z robota.

Do badania cewnika krokowego należy pokroić zestalony żel agarozowy 0,6% na bloki o wymiarach 20 na 20 milimetrów i ręcznie napełnić strzykawkę z cewnikiem schodkowym 10 mikrolitrami przefiltrowanego 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Za pomocą robota stereotaktycznego dozuj jeden mikrolitr barwnika w ilości 0,2 mikrolitra na minutę, aby ocenić szczelność kroku cewnika podczas procedury utrwalania. Roztwór błękitu trypanowego powinien być widoczny wyłącznie na końcówce cewnika.

Zetrzyj barwnik chusteczką papierową i umieść blok agarozy w robocie stereotaktycznym. Skalibruj robota powiedział, że końcówka cewnika jest odniesiona do powierzchni bloku agarozy. Ustalić proporcję objętości wstrzyknięć zgodnie z określonym planem doświadczalnym.

Aby wstrzyknąć roztwór do mysiej skorupy ogoniastej, należy ustawić wstrzyknięcie na jeden milimetr czołowy i półtora do dwóch milimetrów bocznych od pozycji bregma na głębokości 3,5 milimetra. Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, rozpocznij procedurę dostarczania ze wzmocnioną konwekcją i wstrzyknij pięć mikrolitrów roztworu błękitu trypanowego do bloku agarozy. Oceń kształt niebieskiej chmury trypanowej w agarozie i potencjalny wyciek wzdłuż przewodu cewnika.

Nie powinien być widoczny żaden większy przepływ wsteczny przez końcówkę metalowej igły. Po wstrzyknięciu należy pozostawić cewnik na miejscu na dwie minuty, a następnie cofnąć igłę z prędkością jednego milimetra na minutę, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie płynu do mózgu i uszczelnienie drogi iniekcyjnej podczas usuwania. Umieść nowy blok agarozy w robocie i rozpocznij drugie wstrzyknięcie jednego mikrolitra w ilości 0,2 mikrolitra na minutę, aby ocenić zatkanie cewnika w agarozie.

Błękit trypanowy powinien ponownie utworzyć chmurę z końcówki cewnika natychmiast po rozpoczęciu wstrzyknięcia. Następnie oceń, czy pozostała objętość w strzykawce odpowiada 3 mikrolitrom, ponieważ wszelkie zmiany mogą wskazywać na wyciek płynu przez mocowanie cewnika lub tłok strzykawki. W przypadku wstrzyknięcia przeciwciała do mysiego prążkowia potwierdź brak odpowiedzi na uszczypnięcie skóry u znieczulonej myszy i ogol głowę trymerem do włosów.

Zdezynfekuj skórę wacikami nasączonymi roztworem jodu. Użyj skalpela, aby wykonać 10-milimetrowe nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej czaszki, kończąc na poziomie oczu. Zamocuj mysz w ramie stereotaktycznej za pomocą zacisku na nos i listew dousznych, uważając, aby powierzchnia czaszki była pozioma i szczelnie zabezpieczona.

Umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym i zsynchronizuj wiertło z końcówką cewnika w punkcie odniesienia. Użyj kleszczy, aby cofnąć skórę i zlokalizować bregma na powierzchni czaszki. Odnieś bregma w oprogramowaniu za pomocą końcówki wiertła i przesuń wiertło na jeden milimetr z przodu i dwa milimetry bocznie od pozycji bregma.

Wywierć otwór na zadziory, uważając, aby nie uszkodzić opony twardej i przesuń strzykawkę nad otworem na żarna. Dozować od 0,5 do jednego mikrolitra ze strzykawki, aby upewnić się, że w cewniku nie pozostały pęcherzyki powietrza. Rozpocznij wspomagane podawanie konwekcyjne, jak pokazano, obserwując powierzchnię czaszki pod kątem śladów cofania się płynu z miejsca wstrzyknięcia.

Po zakończeniu podawania i wyjmowania cewnika należy uruchomić pompę iniekcyjną z prędkością 0,2 mikrolitra na minutę, aby sprawdzić, czy cewnik nie jest zatkany podczas wstrzykiwania. Jeśli nie doszło do zatkania, należy natychmiast zaobserwować kroplę mieszaniny do wstrzykiwań wypływającą z końcówki cewnika. Na tym zdjęciu chmury błękitu trypanowego tworzącej się po wstrzyknięciu jednego mikrolitra barwnika w ilości 0,5 mikrolitra na minutę za pomocą cewnika wzmocnionego konwekcyjnie, jak pokazano, nie było widać refluksu wzdłuż przewodu igły na początku etapu cewnika.

A rozproszona chmura uformowała pożądany kulisty kształt. Na tym zdjęciu za pomocą igły z końcem można jednak zaobserwować znaczny refluks. Warto zauważyć, że wspomagane konwekcją dostarczanie umożliwia perfuzję dużych objętości do mysiego mózgu w jednolity i mniej uszkadzający tkanki sposób w porównaniu z konwencjonalnym wstrzykiwaniem.

W obu typach podawania występuje typowy profil dystrybucji cząstek przeciwciała i dekstranu w ciele modzelowatym. Jednak profil dyspersji wstrzykniętego przeciwciała jest bardziej rozproszony niż obserwuje się to w przypadku dekstranu o dużej masie cząsteczkowej po dostarczeniu wzmocnionym konwekcyjnie, co ilustruje różnice w dystrybucji między różnymi infusanami. Ponieważ cewnik może potencjalnie zatkać się podczas infuzji mózgu, ważne jest, aby sprawdzić go natychmiast po jego zakończeniu, powoli dozując niewielką objętość infuzji.

Procedura ta może służyć jako sposób dostarczania farmakologicznie aktywnych związków do mózgu i powinna być poprzedzona ścisłym monitorowaniem objawów choroby i oczekiwanych skutków ubocznych. Technika ta umożliwia infuzję precyzyjnego obszaru mózgu za pomocą środków terapeutycznych, w tym przeciwciał, otwierając nowe możliwości rozwoju terapii ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy.