Name: Wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę komputerowej analizy obrazu do kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1. Technika zwiększa precyzję i eliminuje błędy liczenia, przyspieszając badania nad skutecznością terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) oraz National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Virginia Tech oraz zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykonanie tego protokołu wymaga zgody odpowiednich instytucji i przestrzegania wszystkich odpowiednich wytycznych.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotuj kompletne pożywki hodowlane (RPMI + 10% płodowa surowica bydlęca +1% paciorkowiec piórkowy). Ożywić komórki 4T1 zgodnie z protokołem ATCC 10 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w kolbie T-25 aż do konfluencji. Zmień pożywkę następnego dnia po ożywieniu, aby usunąć martwe komórki, i ponownie, jeśli pożywka zostanie zużyta, zanim komórki zlewają się wystarczająco do przejścia.</li>
	<li>Gdy kolba T-25 zlewa się, przełóż komórki do kolby T-75, odrzucając pożywkę, przemywając kolbę 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) i dodając 500 μl trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą.
	<ol>
		<li>Po odłączeniu dodaj do komórek 5 ml podgrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej. Odessać i przenieść 5 ml do kolby T-75 zawierającej 15 ml ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki pasażowe w kolbach T-75 co najmniej cztery razy. Zrób to, gdy kolba zlewa się, przemywając 8 ml 1x DPBS, dodając 1 ml trypsyny-EDTA w celu odłączenia komórek, dodając 10 ml podgrzanej pożywki do komórek i rozcieńczając 1:6-1:8 w nowej kolbie T-75 zawierającej 20 ml podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Komórki pasażowe do odpowiedniej liczby kolb T-150 zawierających 40 ml ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej dla liczby myszy, które mają być wstrzyknięte. Większość badań będzie wymagała wielu kolb T-150, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Kiedy myszy są gotowe do wstrzyknięcia (8 tygodni lub ważące ponad 20 g, w zależności od IACUC lub protokołów instytucjonalnych), zbieraj komórki, odrzucając pożywkę, myjąc każdą kolbę 10 ml 1x DPBS i dodając 2 ml trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą.</li>
	<li>Przemyć kolbę 10 ml kompletnej pożywki i przenieść całą zawartość (10 ml pożywki + 2 ml mieszaniny trypsyny i komórek EDTA) do następnej kolby. Kontynuuj mycie i zbieranie komórek z każdej kolby przy użyciu tych samych 10 ml pożywki, aby uniknąć użycia nadmiernej ilości pożywki.
	<ol>
		<li>Po zebraniu wszystkich kolb przenieść ich zawartość do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Pobrać próbkę o objętości 10 μl do policzenia w probówce do mikrowirówki i odwirować probówkę stożkową o pojemności 50 ml przy 125 x g przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas wirowania komórek dodaj 10 μl błękitu trypanowego do 10 μl próbki komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Po określeniu całkowitej liczby komórek oblicz stężenie komórek potrzebnych do wstrzyknięcia myszy dla 1,2 x 106 komórek na mysz (na 100 μl).</li>
	<li>Po odwirowaniu zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości sterylnego 1x DPBS na 1,2 x 106 komórek na 100 μL. Podziel mieszaninę komórek/DPBS na probówki mikrowirówkowe, aby uzyskać łatwy dostęp za pomocą strzykawki podczas zasysania komórek do wstrzykiwań. Utrzymuj komórki na lodzie i wstrzyknij wkrótce potem, ponieważ komórki zaczną obumierać po dłuższym przebywaniu na lodzie.</li>
</ol>
2. Zastrzyki
<ol>
	<li>Przygotować komórki do wstrzyknięcia, stukając lub delikatnie mieszając probówkę mikrowirówki w celu ponownego zawieszenia komórek, a następnie odessać 600 μl do strzykawki o pojemności 1 ml. Obrócić strzykawkę do góry i pociągnąć tłok w dół, aby usunąć komórki z otworu strzykawki. Postukać w strzykawkę, aby usunąć z niej pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Przymocuj igłę skośnie do góry i dozuj komórki z powrotem do probówki mikrowirówkowej, aż w strzykawce pozostanie tylko 500 μl. Umieścić strzykawkę płasko na lodzie. 
	UWAGA: Ogniwa 4T1 szybko wypadają z zawieszenia. Dlatego ważne jest, aby wymieszać komórki z powrotem w zawiesinę poprzez częste stukanie.</li>
	<li>Znieczulij 8-tygodniową/>20 g samicę myszy BALB/c za pomocą izofluranu lub innego zatwierdzonego środka znieczulającego. Monitoruj oddech myszy, aby ocenić głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, na co wskazuje brak odruchu rogówkowego, połóż mysz na jej grzbiecie. Używając kciuka, wskaźnika i środkowego palca, delikatnie przytrzymaj mysz. Użyj palca wskazującego i środkowego, aby przytrzymać górną część ciała myszy i kciuk tylnej lewej nogi. Bądź delikatny, ale stanowczy.</li>
	<li>Skosem igły do góry wstrzyknąć 100 μl komórek podskórnie w lewą poduszeczkę tłuszczową sutka myszy. Monitoruj dobre pęcherzyki i wszelkie wycieki oraz upewnij się, że mysz budzi się i łatwo porusza po wstrzyknięciu.
	<ol>
		<li>Zmieniaj igły między każdą myszką. 
		UWAGA: Nie dopuścić do przedostania się igły do jamy otrzewnej. Spowodowałoby to, że rak szybko się rozprzestrzeniałby i nie byłby reprezentatywny dla modelu. Aby zapewnić wstrzyknięcie podskórne, należy delikatnie pociągnąć igłę do góry po wprowadzeniu do lewej poduszeczki tłuszczowej w jamie brzusznej. Jeśli igłę można łatwo podnieść do góry, jest ona prawidłowo umieszczona podskórnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Monitorowanie
<ol>
	<li>Monitoruj myszy co najmniej 3 razy w tygodniu pod kątem wagi, oceny kondycji ciała, wielkości guza, stanu guza, oddychania, poziomu aktywności, wyglądu i ruchu. Gdy guz osiągnie średnicę 0,7-0,8 cm, zacznij codziennie monitorować.
	<ol>
		<li>Rozważ eutanazję, gdy rozmiar guza osiąga 1,5 cm lub utrata masy ciała osiąga 20%, lub gdy obserwuje się poważne kliniczne pogorszenie oceny kondycji ciała, stanu guza, oddychania, poziomu aktywności, wyglądu lub ruchu w oparciu o wytyczne instytucjonalne. 
		UWAGA: Ocena kondycji ciała ma kluczowe znaczenie do monitorowania, ponieważ masa ciała może rosnąć wraz ze wzrostem guza, negując utratę kondycji ciała z powodu obciążenia chorobą. Dokładne protokoły monitorowania będą zależeć od zatwierdzonych protokołów IACUC lub protokołów instytucjonalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sekcja zwłok
<ol>
	<li>Eutanazja myszy za pomocą CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem w celu dezynfekcji. Wykonaj nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej myszy, aby odsłonić jamę ciała.</li>
	<li>Usuń nerkę. Kontynuuj cięcie linii środkowej, aż przepona będzie widoczna. Użyj nożyczek, aby przebić przeponę, aby opróżnić płuca. Przytnij membranę, aby uzyskać lepszy dostęp do wnęki.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby przeciąć środek klatki piersiowej. Przypnij klatkę piersiową z powrotem, aby odsłonić płuca i serce.</li>
	<li>Przeprowadź fuzję serca za pomocą 2 ml niesterylnego 1x DPBS, wprowadzając igłę do wierzchołka serca, aż zgromadzi się w jamie brzusznej, z której usunięto nerkę.</li>
	<li>Aby usunąć serce i płuca, użyj nożyczek, aby przeciąć przełyk i tchawicę bezpośrednio nad sercem. Za pomocą kleszczy zacznij odciągać serce od ciała i odetnij tkankę łączną, która utrzymuje je w przyczepieniu. Płuca wyjdą z sercem.</li>
	<li>Zidentyfikuj płuca wielopłatkowe (po prawej) i jednopłatkowe (po lewej). Trzymaj serce przywiązane jako odniesienie, ale po zidentyfikowaniu płuc odetnij serce.</li>
	<li>Oznacz 12-dołkową płytkę zawierającą 1x zrównoważony roztwór soli fizjologicznej Hanka (HBSS) w każdym dołku. Każda mysz potrzebuje 2 dołków. Umieścić płuco wielopłatkowe (prawe) w płytce 12-dołkowej w celu oceny przerzutów i trzymać na lodzie. Na razie utrzymuj sąsiednią studnię pustą. 
	UWAGA: Ważne jest, aby używać tego samego płuca (wielopłatkowego) każdej myszy, aby upewnić się, że każda próbka jest zbliżona pod względem wielkości. Płuco jednopłatkowe może być następnie wykorzystane do innych analiz, takich jak histopatologia. 
	UWAGA: Próbki są stabilne na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie tkanek
UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji powinny być wykonane przy użyciu sterylnej techniki.
<ol>
	<li>Oznaczyć 1 stożkową probówkę o pojemności 15 ml na mysz i dodać 2,5 ml mieszaniny kolagenazy typu IV i 30 jednostek elastazy do każdej probówki. Aby przygotować mieszaninę kolagenazy typu IV, rozpuść 2 mg kolagenazy typu IV na ml 1x HBSS i sterylny filtr. Można go przechowywać do 12 miesięcy w temperaturze -20 °C i w razie potrzeby rozmrozić.</li>
	<li>Przenieś płuco do drugiego, oczyść 1x studzienkę HBSS dla tej próbki. Zawiruj za pomocą kleszczy, aby usunąć pozostałą krew. Przenieść czyste płuco na pustą płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 3,5 cm. Zmiel płuco nożyczkami. Przepłucz płytkę 2,5 ml 1x HBSS, przenieś 1x HBSS i kawałki płuc do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej już koktajl kolagenazy/elastazy (łącznie 5 ml).</li>
	<li>Inkubować przez 75 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie kontynuować mieszanie próbek, a więc umieścić probówki na wahaczu lub obracającym się kole. Podczas tego etapu inkubacji oznacz 50 ml probówek wirówkowych i 10 cm płytek do hodowli tkankowych dla każdej myszy. Jeśli wykonujesz rozcieńczenie, oznacz wystarczającą ilość 10 cm płytek do hodowli tkankowych na rozcieńczenia. 
	UWAGA: Oznacz pokrywę płytek do hodowli tkankowych. W przypadku etykietowania samej tabliczki napis będzie zakłócał analizę Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Doprowadzić objętość każdej probówki do 10 ml za pomocą 1x HBSS. Wlać zawartość przez sitko o wielkości 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dla każdej próbki. Użyj tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, aby delikatnie zmielić próbkę przez sitko, aby umożliwić przefiltrowanie większej liczby komórek.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej (RT). Wyrzucić supernatant i przepłukać osad 10 ml 1x HBSS. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej 60 μM 6TG, RPMI lub IMDM. Próbki należy rozmieścić na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych, w razie potrzeby stosując schemat rozcieńczania. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 dni. 
	UWAGA: 1:2, 1:10 i 1:100 to typowe rozcieńczenia, które będą musiały zostać empirycznie określone na podstawie parametrów badania. 
	UWAGA: 6TG jest toksyczny. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się i postępuj zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa dotyczącymi utylizacji.</li>
</ol>
6. Płytki do barwienia
<ol>
	<li>Wlać pożywkę hodowlaną z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady. Utrwalić komórki, dodając 5 ml nierozcieńczonego metanolu na płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że metanol wiruje tak, aby pokrył całą płytkę. 
	UWAGA: Metanol jest niebezpieczny w przypadku spożycia, wdychania lub kontaktu ze skórą. Do tego kroku użyj dygestorium.</li>
	<li>Wlej metanol z talerzy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Opłucz płytki 5 ml wody destylowanej na płytkę i wlej wodę do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodać 5 ml 0,03% błękitu metylenowego na płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwór błękitu metylenowego jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę.</li>
	<li>Wlej błękit metylenowy do odpowiedniego pojemnika na odpady. Ponownie opłucz płytki 5 ml wody destylowanej na płytkę. Odwróć talerze do góry nogami i ocieraj się o ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść talerz na pokrywie i pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze RT. 
	UWAGA: Kolonie z przerzutami będą niebieskie. Po wysuszeniu płytki można je przechowywać w RT przez czas nieokreślony.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Usuń oznaczone wieczka z płytek, zwracając uwagę na wyraźną identyfikację próbek. Ułóż wszystkie poplamione płytki płuc na czystej, jasnej powierzchni, aby zrobić zdjęcie wszystkich płytek na jednym obrazie.</li>
	<li>Zrób zdjęcie kolekcji talerzy w dobrze oświetlonym miejscu, upewniając się, że minimalizujesz odbicia, ponieważ talerze są bardzo odblaskowe. Odbicia w płytkach będą miały wpływ na analizę obrazu i dlatego należy ich unikać. 
	UWAGA: Fiji-ImageJ ma górny limit 2 gigapikseli. Większość nowoczesnych smartfonów będzie miała wystarczającą liczbę aparatów. Nie używaj aparatu o rozdzielczości mniejszej niż 8 megapikseli. Aparat użyty w tym eksperymencie miał 12,2 megapiksela w Google Pixel 2.</li>
	<li>Przytnij obraz, aby uwzględnić płyty, ale wyklucz pokrywy lub inne elementy tła obrazu. Prześlij przycięty obraz do Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Zmień obraz na czarno-biały za pomocą następujących poleceń: Obraz, Dostosuj, Próg koloru, Metoda progowania: Domyślna, Kolor progu: czarno-biały, Przestrzeń progowa: Lab. Usuń zaznaczenie pola Ciemne tło. Obraz powinien być teraz czarno-biały. reprezentuje jasne tło, a biały reprezentuje niebieskie kolonie przerzutów.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Okrąg na pasku narzędzi Fiji-ImageJ wybierz obszar, który ma zostać przeanalizowany. Narysuj jeden okrąg, który będzie używany dla wszystkich płyt, aby upewnić się, że każda płyta jest analizowana dla obszaru o tym samym rozmiarze. Wybierz rozmiar, który maksymalizuje analizowany obszar na płytach, jednocześnie minimalizując szum tła, który pojawia się na krawędziach płyt. Rozmiar pojawia się na pasku narzędzi w takiej postaci, w jakiej jest rysowany, więc możliwe jest utworzenie idealnego okręgu, monitorując wysokość i szerokość podczas rysowania okręgu.</li>
	<li>Przeanalizuj wybrany okrąg, aby określić, jaki procent obszaru jest biały, co reprezentuje obszar płytki, który ma niebieskie kolonie przerzutowe. Użyj następujących poleceń: 
	Analizuj, Analizuj cząstki, Rozmiar (pixel2): 0-nieskończoność, Okrągłość: 0,00-1,00, Pokaż: Nic i zaznacz pole Podsumowanie. Uderz OK.</li>
	<li>Zapisz wynik % powierzchni. Jest to procent wybranego obszaru, który jest biały, a zatem reprezentuje obciążenie przerzutami. 
	UWAGA: Zaleca się zapisanie wyników w Fiji-ImageJ lub skopiowanie/wklejenie całej strony wyników do osobnego dokumentu. Jeśli wyniki % obszaru są nieoczekiwane lub podejrzane, można sprawdzić, czy którykolwiek z pozostałych pomiarów był również podejrzany lub czy % obszaru został zarejestrowany nieprawidłowo.</li>
	<li>Przesuń okrąg, nie zmieniając jego rozmiaru, chwytając go w środku, do następnej płytki na obrazku. Powtórz kroki 7.6 i 7.7 dla wszystkich płyt na rysunku.</li>
	<li>Powtórz kroki 7.1 – 7.8 na co najmniej dwóch kolejnych obrazach. Po przeanalizowaniu wszystkich płyt i obrazów należy uśrednić wyniki procentowej powierzchni między różnymi obrazami dla każdej płyty, aby złagodzić wszelkie niespójności między obrazami.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Facts+%26+Figures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Cancer+Society%22%5BJournal%5D)">Cancer Facts & Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li>
<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+4T1+breast+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li>
<li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333(2019).</li>
<li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li>
<li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak wykazano, ręczne liczenie kolonii przerzutów na każdej płytce płucnej może być niedokładną i nieprecyzyjną metodą ilościowego określania przerzutów do płuc, co wskazuje na potrzebę lepszego sposobu oznaczania ilościowego (ryc. 2). Analiza histopatologiczna różniła się nieznacznie zarówno od ręcznego liczenia, jak i analizy Fidżi-ImageJ (ryc. 2B i 4D), prawdopodobnie dlatego, że szkiełka H&E nie są reprezentatywną próbką całego narządu. Proto...

U jednej na osiem kobiet zostanie zdiagnozowany rak piersi w ciągu swojego życia, a mimo to pomimo wielu opcji leczenia, rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem u amerykańskich kobiet1. Te kobiety nie umierają z powodu pierwotnego guza w piersi. Zamiast tego obciążenie przerzutami jest odpowiedzialne za śmiertelność tej choroby, ponieważ często rozprzestrzenia się na płuca, kości, mózg, wątrobę i węzły chłonne2. Z tego powodu modele raka piersi muszą oceniać przerzuty, aby przyczynić się do ograniczenia śmiertelności z powodu tej choroby. Mysi model raka piersi 4T1 jest doskonałym protokołem, aby to osiągnąć. Opisana tutaj metoda oferuje ulepszenie modelu 4T1 dzięki wykorzystaniu Fiji-ImageJ do ilościowego określenia przerzutów do płuc, dając spójne i szybkie wyniki.
Model 4T1 jest dobrze ugruntowany, a większość laboratoriów korzysta z protokołów takich jak te opisane przez Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga w 2001 roku3. Linia komórkowa 4T1 jest oporna na 6-tioguaninę (6TG) i reprezentuje stadium IV, potrójnie ujemnego raka piersi3,4,5. Jest to klinicznie istotne, ponieważ jest to model ortotopowy i spontanicznie daje przerzuty do tych samych narządów, co w ludzkim raku piersi3,4. Komórki 4T1 spontanicznie dają przerzuty w przewidywalnym tempie na podstawie ilości wstrzykniętych komórek3,4. Co ważne, różnice genetyczne między wykorzystanymi tutaj myszami spowodowały oczekiwaną zmienność międzyosobniczą obciążenia przerzutowego. Aby ocenić przerzuty, pobiera się tkanki w celu zebrania i ilościowego określenia komórek rakowych w odległych miejscach przy użyciu selekcji 6TG i barwienia błękitem metylenowym. Rezultatem jest zbiór płytek do hodowli tkankowych z niebieskimi kropkami reprezentującymi kolonie przerzutowe. Jednak protokół Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga określa ilościowo kolonie przerzutów poprzez ich ręczne liczenie, a zatem jest to standardowy sposób oceny przerzutów w tym modelu. Chociaż jest to łatwe w przypadku tkanek o niskim obciążeniu przerzutami, tkanki takie jak płuca są często obciążone przerzutami. Ponieważ płytki płucne mogą być silnie zlewne, dokładne i precyzyjne określanie ilościowe kolonii przerzutów za pomocą ręcznego liczenia jest trudne i podatne na błędy ludzkie. Aby lepiej określić ilościowo obciążenie przerzutami, opisujemy użycie Fiji-ImageJ do komputerowego rozwiązania błędu liczenia przez człowieka. Analiza histopatologiczna z barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) jest kolejnym sposobem ilościowego oznaczania przerzutów do płuc i, co ciekawe, została również ulepszona dzięki oprogramowaniu Fiji-ImageJ6,7. Ponieważ jednak analiza histopatologiczna obserwuje pojedynczy wycinek płuca, może być niedokładna i niereprezentatywna. Dzieje się tak, ponieważ model 4T1 powoduje kilka zmian przerzutowych w całym narządzie, które nie są równomiernie rozłożone. Chociaż ogólne trendy między analizą histopatologiczną a ręcznym liczeniem mogą być podobne8, poszczególne wartości mogą się różnić, dlatego analiza histopatologiczna nie powinna być stosowana jako jedyny sposób oceny ilościowej. Wykazujemy korzyści w porównaniu z analizą histopatologiczną i niespójności w ręcznym liczeniu między różnymi licznikami, jednocześnie wykazując spójność stosowania Fiji-ImageJ. Dodatkowo pokazujemy, że ta metoda może skrócić czas inkubacji z 10-14 dni do 5 dni, co oznacza, że badacze mogą analizować dane ze swojego badania znacznie szybciej niż w przypadku polegania na ręcznym liczeniu.
Ta metoda jest zbiorem prostych poprawek do protokołu Pułaskiego i Ostranda-Rosenberga3. Ponieważ model 4T1 jest szeroko stosowany, a przerzuty do płuc są krytycznym parametrem do pomiaru w modelach przedklinicznych, uważamy, że metoda ta może być szeroko stosowana i jest bardzo cenna dla badaczy raka piersi. Jedyne dodatkowe materiały potrzebne to kamera i dostęp do komputera z Fiji-ImageJ, darmowym oprogramowaniem często używanym do analizy obrazu9. Metoda ta koncentruje się w szczególności na przerzutach do płuc, ale może być stosowana w przypadku innych tkanek o znacznym obciążeniu przerzutami.

<table><tbody><tr><td>Komora anestezjologiczna</td><td>Zobacz komentarze</td><td>Zobacz komentarze Korzystaj</td> z <td>zatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji Środek</td></tr><tr><td>znieczulający</td><td>Zobacz</td><td>komentarze Zobacz komentarze</td><td>Korzystaj z zatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji</td></tr><tr><td>BALB/c Samice myszy</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>Kalkulator</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td></td></tr><tr><td>kamera</td><td></td><td>Dowolna</td><td>Minimum 8 megapikseli</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Dowolna Dowolna</td><td>Musi</td><td>być zdolna do 125 x g i 300 x g</td></tr><tr><td>Konfiguracja eutanazji CO2</td><td>Zobacz komentarze</td><td>Zobacz komentarze Korzystaj</td> z <td>zatwierdzonych materiałów w zasadach swojej instytucji</td></tr><tr><td>Chłodnia, lodówka, chłodnia</td><td>Dowolna Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputer z Fiji-ImageJ</td><td>Dowolny</td><td>Musi</td><td>być w stanie uruchomić Fiji-ImageJ</td></tr><tr><td>Komora licząca</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td></td></tr><tr><td>Elastaza</td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Dowolna Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator lodowy</td><td>Nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zobacz komentarze Zobacz</td><td>komentarze Zobacz komentarze</td><td>Musi być zdolny do 5% CO2 oraz 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki lub igły</td><td></td><td>Dowolne Dowolny</td><td>Do przygniażdżania myszy podczas sekcji</td></tr> zwłok <tr><td>Suwmiarki plastikowe</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 Średni</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Rocker lub koło obrotowe</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostre nożyczki</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr jednorazowy z membraną PES</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Kolby</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>Kolby Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T-75</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Trójkątna plastikowa zlewka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>Służy do ważenia myszy</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm płytki do hodowli tkankowych</td><td>Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml probówki do mikrowirówek</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>10 cm płytki do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1X Sól fizjologiczna buforowana phostfatem Dulbecco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>1X Hank' s Zrównoważony roztwór soli fizjologicznej (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1/2 cala igieł</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1 (ATCC&reg; CRL&nieśmiały; 2539&handel ;)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-tioguanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtr siatkowy M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Rozcieńczyć do 70% wodą DI</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4t1

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Rak piersi jest wyniszczającym nowotworem, odpowiadającym za 40 000 zgonów kobiet i 30% nowych diagnoz raka u kobiet w samych Stanach Zjednoczonych w samym tylko 2019 roku. Główną przyczyną zgonów związanych z rakiem piersi jest obciążenie przerzutami. Dlatego modele przedkliniczne raka piersi muszą analizować obciążenie przerzutami, aby były istotne klinicznie. Model raka piersi 4T1 zapewnia spontanicznie przerzutowy, ilościowy mysi model ludzkiego raka piersi w IV stadium. Jednak większość protokołów 4T1 określa ilościowo obciążenie przerzutami poprzez ręczne liczenie barwionych kolonii na płytkach do hodowli tkankowych. Chociaż jest to wystarczające w przypadku tkanek o mniejszym obciążeniu przerzutami, błąd ludzki podczas ręcznego liczenia powoduje niespójne i zmienne wyniki, gdy płytki są zlewające się i trudne do policzenia. Ta metoda oferuje komputerowe rozwiązanie błędu liczenia przez człowieka. W tym przypadku oceniamy protokół za pomocą płuc, tkanki o wysokim stopniu przerzutów w modelu 4T1. Obrazy płytek zabarwionych na niebiesko metylenem są pozyskiwane i przesyłane do analizy w Fiji-ImageJ. Następnie Fiji-ImageJ określa procent wybranego obszaru obrazu, który jest niebieski, reprezentując procent płytki z przerzutami. To podejście komputerowe zapewnia bardziej spójne i szybsze wyniki niż ręczne liczenie lub ocena histopatologiczna w przypadku tkanek o silnych przerzutach. Spójność wyników Fiji-ImageJ zależy od jakości obrazu. Mogą wystąpić niewielkie różnice w wynikach między obrazami, dlatego zaleca się wykonanie wielu zdjęć i uśrednienie wyników. Pomimo minimalnych ograniczeń, metoda ta stanowi ulepszenie w ilościowym określaniu obciążenia przerzutami w płucach, oferując spójne i szybkie wyniki.

Metoda ta zawiera proste modyfikacje protokołu Pulaskiego i Ostrand-Rosenberga dla komórek 4T13, a jej przebieg przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku, gdy trzech niezależnych badaczy manualnie zliczało kolonie przerzutowe w 12 płytkach z płucami (rozcieńczenie 1:10), wyniki między poszczególnymi osobami zliczającymi były bardzo niespójne (Rysunek 2A). Wszyscy badacze otrzymali instrukcję, aby „zliczyć kolonie przerzutowe widoczne jako n...

Opisujemy bardziej spójną i szybką metodę ilościowego oznaczania przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1 za pomocą Fiji-ImageJ.

Wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Protokół ten określa ilościowo przerzuty do płuc, które są agresywną i częstą przyczyną zgonów związanych z rakiem piersi, ze zwiększoną precyzją i skutecznością w przedklinicznym modelu raka piersi. W porównaniu z oryginalną techniką, protokół ten zapewnia naukowcom szybsze i bardziej spójne wyniki. Zmniejsza błąd liczenia przez człowieka dzięki łatwej w użyciu technologii komputerowej.Technika ta może być z pewnością rozszerzona na badania przedkliniczne badające wpływ terapii raka piersi na przerzuty do płuc, umożliwiając naukowcom wykazanie zmniejszonego obciążenia przerzutami po skutecznym leczeniu. Zacznij od oznaczenia stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na próbkę tkanki. Następnie dodaj 2,5 mililitra mieszaniny kolagenazy typu czwartego i 30 jednostek elastazy do probówki.Przenieś płuco do czystej studzienki 1X HBSS i zakręć nią kleszczami, aby usunąć pozostałą krew, a następnie przenieś ją na pustą 3,5-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej. Zmiel płuco nożyczkami, a następnie przepłucz płytkę 2,5 mililitra HBSS i przenieś HBSS z kawałkami płuc do przygotowanej 15-mililitrowej stożkowej rurki z kolagenazą i koktajlem elastazy. Inkubować probówkę przez 75 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kołysce lub obracającym się kole.W międzyczasie oznacz jedną 50-mililitrową probówkę wirówkową i jedną 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej dla każdej myszy. Jeśli wykonujesz rozcieńczenie, oznacz wystarczającą ilość płytek do hodowli tkankowych dla rozcieńczeń. Doprowadź objętość probówki do 10 mililitrów za pomocą 1X HBSS, a następnie przelej zawartość przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie przetrzeć próbkę przez sitko. Odwirować probówkę przez pięć minut przy 350 razy G i wyrzucić supernatant, a następnie dwukrotnie przemyć osad 10 mililitrami 1X HBSS. Zawiesić osad w 10 mililitrach 60 mikromolowych 6-tioguaninowych kompletnych pożywek hodowlanych i w razie potrzeby umieścić próbki na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych, stosując schemat rozcieńczania.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni. Nalewać pożywki hodowlane z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady. Aby utrwalić komórki, dodaj pięć mililitrów nierozcieńczonego metanolu do każdej płytki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że metanol jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę.Wlej metanol z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady, a następnie przepłucz każdą płytkę pięcioma mililitrami wody destylowanej. Dodaj pięć mililitrów 0,03% błękitu metylenowego na płytkę i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwór błękitu metylenowego jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę. Wlać błękit metylenowy do odpowiedniego pojemnika na odpady i ponownie przepłukać każdą płytkę pięcioma mililitrami wody destylowanej.Odwróć talerz do góry nogami i osusz go ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść talerz na pokrywce i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Kolonie przerzutowe będą niebieskie.Po wyschnięciu płytki można je przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony. Zdjąć oznaczone wieczka z płytek, zwracając uwagę na wyraźną identyfikację próbek. Ułóż wszystkie poplamione płytki płucne na czystej, jasnej powierzchni.Zrób zdjęcie kolekcji talerzy w dobrze oświetlonym miejscu, upewniając się, że minimalizujesz odbicia. Odbicia w płytkach będą miały wpływ na analizę obrazu i należy ich unikać. Zwróć szczególną uwagę na wykonane zdjęcia i zrób kilka zdjęć pod kilkoma kątami.Po sfotografowaniu płyt przytnij obraz, aby wykluczyć pokrywy lub cokolwiek w tle. Otwórz obraz w Fiji ImageJ i zmień go na czarno-biały, klikając obraz, dostosuj i próg koloru. Następnie wybierz opcję domyślna dla metody progowania, czarno-biała dla koloru progu i lab dla przestrzeni kolorów.Upewnij się, że pole ciemnego tła nie jest zaznaczone. Obraz powinien być teraz czarno-biały. reprezentuje jasne tło, a biały reprezentuje niebieskie kolonie przerzutów.Użyj narzędzia okrąg, aby wybrać obszar do analizy. Narysuj jeden okrąg, który będzie używany dla wszystkich płyt, aby upewnić się, że każda płyta jest analizowana dla obszaru o tym samym rozmiarze. Wybierz rozmiar, który maksymalizuje analizowany obszar na płytach, jednocześnie minimalizując szum tła, który pojawia się na krawędziach płyt.Rozmiar jest wyświetlany na pasku narzędzi w takiej postaci, w jakiej jest rysowany. Przeanalizuj zaznaczony okrąg, aby określić procent obszaru, który jest biały. Kliknij Analizuj i analizuj cząstki, a następnie wybierz od zera do nieskończoności dla rozmiaru, od zera do jednego dla kołowości i nic dla pokazania.Zaznacz pole podsumowania i kliknij OK. Przesuń okrąg na następną płytkę na obrazku, chwytając go za środek i powtórz analizę. Skopiuj wynik i wklej go do arkusza kalkulacyjnego.Obszar procentowy, czyli procent wybranego obszaru, który jest biały, reprezentuje obciążenie przerzutowe. Po przeanalizowaniu wszystkich płyt i obrazów należy uśrednić procentowe wyniki obszaru między różnymi obrazami dla każdej płyty, aby złagodzić wszelkie niespójności między obrazami. Analizę Fiji ImageJ porównano z ręcznym liczeniem i analizą histopatologiczną.Kiedy trzech oddzielnych badaczy ręcznie policzyło kolonie z przerzutami, wyniki były niespójne między licznikami. Wyniki Fiji ImageJ były spójne między licznikami dla każdego z trzech obrazów. Wyniki z trzech obrazów i trzech liczników połączono dla każdej płytki płucnej.Wyniki zostały uśrednione dla każdej płytki, aby uwzględnić różnice między obrazami, co zapewniło spójne wyniki między licznikami. Podczas szeregowania płytek od największej do najmniej przerzutowej, ręczne liczenie zgadzało się na najbardziej zlewającą się płytkę, ale wszystkie kolejne rangi były niespójne. Rangi ze średnich wyników Fiji ImageJ były znacznie bardziej spójne między licznikami.Aby zademonstrować, jak ważne jest unikanie odbić na obrazach, obraz z odbiciem dłoni i jego późniejszą analizą Fiji ImageJ jest wyświetlany wraz z obrazem tej samej płyty bez odbicia. Ciemne skazy spowodowane brudną powierzchnią tła lub pozostałościami próbki krwi na płytkach mogą również negatywnie wpłynąć na analizę Fiji ImageJ. Ta płytka krwi ma tylko dwie kolonie przerzutowe, ale ciemna pozostałość spowodowała, że Fiji ImageJ uznał ją za 31,6% przerzutów.Próbując skorzystać z tego protokołu, pamiętaj, aby dokładnie przyjrzeć się zdjęciom pod kątem odbicia, użyć okręgu o tym samym rozmiarze dla każdej płyty na obrazie i uśrednić wyniki dla każdej płyty między co najmniej trzema oddzielnymi obrazami.

using-computer-based-image-analysis-to-improve-quantification-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Protokół ten opisuje, jak używać ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (QRT-PCR) do wykrywania mRNA specyficznego dla komórek nowotworowych reprezentującego przerzuty w tkance płucnej myszy.

Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

W tym protokole opisujemy, jak wykorzystać pozytonową tomografię emisyjną [18F]-2-fluoro-2-deoksy-D-glukozy i obrazowanie tomografii komputerowej (18F-FDG PET/CT) do pomiaru odpowiedzi metabolicznej guza na terapię celowaną MLN0128 w mysim modelu raka płuc z mutacją Kras/Lkb1 oraz obrazowania sprzężonego z autoradiografią ex vivo o wysokiej rozdzielczości i histologią ilościową.

Wykorzystanie obrazowania PET/CT 18F-FDG i histologii ilościowej do pomiaru dynamicznych zmian w metabolizmie glukozy w mysich modelach raka płuc

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj metodę komputerowej analizy obrazu do kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1. Technika zwiększa precyzję i eliminuje błędy liczenia, przyspieszając badania nad skutecznością terapii.

Wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1

Przeglądaj więcej filmów