Wykorzystanie komputerowej analizy obrazu w celu poprawy kwantyfikacji przerzutów do płuc w modelu raka piersi 4T1

Protokół ten określa ilościowo przerzuty do płuc, które są agresywną i częstą przyczyną zgonów związanych z rakiem piersi, ze zwiększoną precyzją i skutecznością w przedklinicznym modelu raka piersi. W porównaniu z oryginalną techniką, protokół ten zapewnia naukowcom szybsze i bardziej spójne wyniki. Zmniejsza błąd liczenia przez człowieka dzięki łatwej w użyciu technologii komputerowej.

Technika ta może być z pewnością rozszerzona na badania przedkliniczne badające wpływ terapii raka piersi na przerzuty do płuc, umożliwiając naukowcom wykazanie zmniejszonego obciążenia przerzutami po skutecznym leczeniu. Zacznij od oznaczenia stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na próbkę tkanki. Następnie dodaj 2,5 mililitra mieszaniny kolagenazy typu czwartego i 30 jednostek elastazy do probówki.

Przenieś płuco do czystej studzienki 1X HBSS i zakręć nią kleszczami, aby usunąć pozostałą krew, a następnie przenieś ją na pustą 3,5-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej. Zmiel płuco nożyczkami, a następnie przepłucz płytkę 2,5 mililitra HBSS i przenieś HBSS z kawałkami płuc do przygotowanej 15-mililitrowej stożkowej rurki z kolagenazą i koktajlem elastazy. Inkubować probówkę przez 75 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kołysce lub obracającym się kole.

W międzyczasie oznacz jedną 50-mililitrową probówkę wirówkową i jedną 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej dla każdej myszy. Jeśli wykonujesz rozcieńczenie, oznacz wystarczającą ilość płytek do hodowli tkankowych dla rozcieńczeń. Doprowadź objętość probówki do 10 mililitrów za pomocą 1X HBSS, a następnie przelej zawartość przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie przetrzeć próbkę przez sitko. Odwirować probówkę przez pięć minut przy 350 razy G i wyrzucić supernatant, a następnie dwukrotnie przemyć osad 10 mililitrami 1X HBSS. Zawiesić osad w 10 mililitrach 60 mikromolowych 6-tioguaninowych kompletnych pożywek hodowlanych i w razie potrzeby umieścić próbki na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych, stosując schemat rozcieńczania.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć dni. Nalewać pożywki hodowlane z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady. Aby utrwalić komórki, dodaj pięć mililitrów nierozcieńczonego metanolu do każdej płytki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że metanol jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę.

Wlej metanol z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady, a następnie przepłucz każdą płytkę pięcioma mililitrami wody destylowanej. Dodaj pięć mililitrów 0,03% błękitu metylenowego na płytkę i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwór błękitu metylenowego jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę. Wlać błękit metylenowy do odpowiedniego pojemnika na odpady i ponownie przepłukać każdą płytkę pięcioma mililitrami wody destylowanej.

Odwróć talerz do góry nogami i osusz go ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść talerz na pokrywce i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Kolonie przerzutowe będą niebieskie.

Po wyschnięciu płytki można je przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony. Zdjąć oznaczone wieczka z płytek, zwracając uwagę na wyraźną identyfikację próbek. Ułóż wszystkie poplamione płytki płucne na czystej, jasnej powierzchni.

Zrób zdjęcie kolekcji talerzy w dobrze oświetlonym miejscu, upewniając się, że minimalizujesz odbicia. Odbicia w płytkach będą miały wpływ na analizę obrazu i należy ich unikać. Zwróć szczególną uwagę na wykonane zdjęcia i zrób kilka zdjęć pod kilkoma kątami.

Po sfotografowaniu płyt przytnij obraz, aby wykluczyć pokrywy lub cokolwiek w tle. Otwórz obraz w Fiji ImageJ i zmień go na czarno-biały, klikając obraz, dostosuj i próg koloru. Następnie wybierz opcję domyślna dla metody progowania, czarno-biała dla koloru progu i lab dla przestrzeni kolorów.

Upewnij się, że pole ciemnego tła nie jest zaznaczone. Obraz powinien być teraz czarno-biały. reprezentuje jasne tło, a biały reprezentuje niebieskie kolonie przerzutów.

Użyj narzędzia okrąg, aby wybrać obszar do analizy. Narysuj jeden okrąg, który będzie używany dla wszystkich płyt, aby upewnić się, że każda płyta jest analizowana dla obszaru o tym samym rozmiarze. Wybierz rozmiar, który maksymalizuje analizowany obszar na płytach, jednocześnie minimalizując szum tła, który pojawia się na krawędziach płyt.

Rozmiar jest wyświetlany na pasku narzędzi w takiej postaci, w jakiej jest rysowany. Przeanalizuj zaznaczony okrąg, aby określić procent obszaru, który jest biały. Kliknij Analizuj i analizuj cząstki, a następnie wybierz od zera do nieskończoności dla rozmiaru, od zera do jednego dla kołowości i nic dla pokazania.

Zaznacz pole podsumowania i kliknij OK. Przesuń okrąg na następną płytkę na obrazku, chwytając go za środek i powtórz analizę. Skopiuj wynik i wklej go do arkusza kalkulacyjnego.

Obszar procentowy, czyli procent wybranego obszaru, który jest biały, reprezentuje obciążenie przerzutowe. Po przeanalizowaniu wszystkich płyt i obrazów należy uśrednić procentowe wyniki obszaru między różnymi obrazami dla każdej płyty, aby złagodzić wszelkie niespójności między obrazami. Analizę Fiji ImageJ porównano z ręcznym liczeniem i analizą histopatologiczną.

Kiedy trzech oddzielnych badaczy ręcznie policzyło kolonie z przerzutami, wyniki były niespójne między licznikami. Wyniki Fiji ImageJ były spójne między licznikami dla każdego z trzech obrazów. Wyniki z trzech obrazów i trzech liczników połączono dla każdej płytki płucnej.

Wyniki zostały uśrednione dla każdej płytki, aby uwzględnić różnice między obrazami, co zapewniło spójne wyniki między licznikami. Podczas szeregowania płytek od największej do najmniej przerzutowej, ręczne liczenie zgadzało się na najbardziej zlewającą się płytkę, ale wszystkie kolejne rangi były niespójne. Rangi ze średnich wyników Fiji ImageJ były znacznie bardziej spójne między licznikami.

Aby zademonstrować, jak ważne jest unikanie odbić na obrazach, obraz z odbiciem dłoni i jego późniejszą analizą Fiji ImageJ jest wyświetlany wraz z obrazem tej samej płyty bez odbicia. Ciemne skazy spowodowane brudną powierzchnią tła lub pozostałościami próbki krwi na płytkach mogą również negatywnie wpłynąć na analizę Fiji ImageJ. Ta płytka krwi ma tylko dwie kolonie przerzutowe, ale ciemna pozostałość spowodowała, że Fiji ImageJ uznał ją za 31,6% przerzutów.

Próbując skorzystać z tego protokołu, pamiętaj, aby dokładnie przyjrzeć się zdjęciom pod kątem odbicia, użyć okręgu o tym samym rozmiarze dla każdej płyty na obrazie i uśrednić wyniki dla każdej płyty między co najmniej trzema oddzielnymi obrazami.