Name: Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów w bioreaktorze z wieloma wskazówkami. Badanie wykorzystuje dynamiczną ko-kulturę makrofagów i miofibroblastów na elektroprzędzonych rusztowaniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane finansowo przez ZonMw w ramach programu LSH 2Treat (436001003) oraz Holenderską Fundację Nerek (14a2d507). N.A.K. dziękuje za wsparcie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (851960). Z wdzięcznością dziękujemy za Program Grawitacyjny "Materials Driven Regeneration", finansowany przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (024.003.013).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany w niniejszym dokumencie bioreaktor pozwala na systematyczną ocenę wpływu poszczególnych i łącznych skutków naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania na stan zapalny i regenerację tkanek w rurowych rusztowaniach resorbowalnych. Podejście to umożliwia również wykonywanie wielu różnych analiz na konstruktach naczyniowych, czego przykładem jest sekcja dotycząca wyników reprezentatywnych. Wyniki te pokazują charakterystyczny wpływ różnych reżimów obciążenia hemodynamicznego (tj. różnych kombinacji ścinania i rozc...

Inżynieria tkanek sercowo-naczyniowych (TE) jest poszukiwana jako alternatywna opcja leczenia dla obecnie stosowanych stałych protez sercowo-naczyniowych (np. przeszczepy naczyniowe, wymiana zastawek serca), które są nieoptymalne dla dużych kohort pacjentów1,2,3,4. Bardzo poszukiwane zastosowania obejmują przeszczepy naczyniowe inżynierii tkankowej (TEVG)5,6 i zastawki serca (TEHVs)7,8. Najczęściej metodologie TE układu sercowo-naczyniowego wykorzystują resorbowalne biomateriały (naturalne lub syntetyczne), które służą jako pouczające rusztowanie dla nowej tkanki, która ma zostać utworzona. Tworzenie nowej tkanki może być albo całkowicie zmodyfikowane in vitro, poprzez zasianie rusztowania komórkami i hodowla w bioreaktorze przed implantacją (in vitro TE)9,10,11, lub bezpośrednio in situ, w którym syntetyczne rusztowanie jest wszczepiane bez wstępnego hodowli w celu wywołania tworzenia nowej tkanki bezpośrednio w organizmie (in situ TE)12,13,14. Zarówno w przypadku metod TE sercowo-naczyniowych in vitro, jak i in situ, skuteczna regeneracja funkcjonalna zależy głównie zarówno od odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wszczepiony konstrukt, jak i od odpowiedniego obciążenia biomechanicznego.
Znaczenie obciążenia biomechanicznego dla układu sercowo-naczyniowego TE jest dobrze znane15. W przypadku implantów sercowo-naczyniowych komórki zasiedlające rusztowanie są narażone na cykliczne naprężenia rozciągające i ścinające, które powstają w wyniku środowiska hemodynamicznego. Liczne badania wykazały stymulujący wpływ (cyklicznego) rozciągania na tworzenie składników matrycy, takich jak collagen16,17,18,19, glikozaminoglikany (GAG)20 i elastin21,22, według różnych typów komórek. Na przykład Huang i wsp. wykazali, że rozciągliwość dwuosiowa zwiększa odkładanie i organizację kolagenu i elastyny w TEVG in vitro przy użyciu bioreaktora naczyniowego23. Podczas gdy nacisk zwykle kładzie się na rozciąganie jako dominujące obciążenie, badania te często wykorzystują bioreaktory napędzane przepływem, w których próbka jest również narażona na przepływ ścinający. Chociaż stosunkowo niewiele wiadomo na temat izolowanego wpływu naprężeń ścinających na tworzenie tkanek i stan zapalny w 3D, dostępne są pewne dane. Na przykład Hinderer i in. oraz Eoh i wsp. wykazali, że przepływ ścinający, oprócz mikrostruktury rusztowania 3D, był ważny dla tworzenia dojrzałej elastyny przez ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych w systemie modelowym in vitro24,25. Podsumowując, odkrycia te ilustrują znaczenie zarówno cyklicznego rozciągania, jak i naprężenia ścinającego dla układu sercowo-naczyniowego.
Innym ważnym czynnikiem decydującym o sukcesie lub porażce implantów TE jest odpowiedź immunologiczna gospodarza na wszczepiony przeszczep26. Jest to szczególnie ważne w przypadku strategii TE opartych na materiale in situ, które w rzeczywistości opierają się na ostrej odpowiedzi zapalnej na rusztowanie, aby uruchomić kolejne procesy napływu komórek oraz tworzenia i przebudowy tkanek endogennych27. Makrofag jest kluczowym inicjatorem funkcjonalnej regeneracji tkanek, co zostało wykazane w wielu badaniach28,29,30. Analogicznie do gojenia się ran, regeneracja tkanek jest regulowana przez sygnalizację parakrynną między makrofagami a komórkami wytwarzającymi tkanki, takimi jak fibroblasty i miofibroblasty31,32,33. Oprócz koordynowania depozycji nowych tkanek, makrofagi biorą udział w aktywnej resorpcji obcego materiału rusztowania34,35. W związku z tym odpowiedź makrofagów in vitro na biomateriał została zidentyfikowana jako parametr predykcyjny dla sukcesu implantów in vivo 36,37,38.
Reakcja makrofagów na wszczepione rusztowanie zależy od cech projektu rusztowania, takich jak skład materiału i mikrostruktura35,39,40. Oprócz właściwości rusztowania, na odpowiedź makrofagów na rusztowanie i ich wzajemne oddziaływanie z miofibroblastami wpływają również obciążenia hemodynamiczne. Na przykład wykazano, że cykliczne rozciąganie jest ważnym modulatorem fenotypu makrofagów41,42,43,44 i wydzielanie cytokin43,44,45,46 w rusztowaniach elektroprzędzonych 3D. Korzystając z systemu kohodowli makrofagów i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, Battiston i in. wykazali, że obecność makrofagów prowadzi do zwiększonego poziomu elastyny i GAG oraz że umiarkowane poziomy cyklicznego rozciągania (1,07–1,10) stymulują odkładanie się kolagenu I i elastyny47. W poprzednich pracach wykazaliśmy, że naprężenie ścinające jest ważnym czynnikiem determinującym rekrutację monocytów do elektrowirowanych rusztowań 3D48,49, oraz że zarówno naprężenie ścinające, jak i cykliczne rozciąganie wpływają na sygnalizację parakrynną między ludzkimi monocytami a mezenchymalnymi komórkami zrębu50. Fahy i wsp. wykazali, że przepływ ścinający zwiększa wydzielanie cytokin prozapalnych przez ludzkie monocyty51.
Razem wzięte, powyższe dowody pokazują, że odpowiednie zrozumienie i kontrola obciążeń hemodynamicznych jest kluczowe dla sercowo-naczyniowej TE, i że ważne jest, aby wziąć pod uwagę reakcję zapalną, aby to osiągnąć. Wiele bioreaktorów zostało opisanych wcześniej dla klasy in vitro<sup="xref">52,53,54,55,56,57,58 lub ex vivo59,60,61 hodowla tkanek sercowo-naczyniowych. Jednak wszystkie te systemy są zaprojektowane tak, aby w jak największym stopniu naśladować fizjologiczne warunki obciążenia hemodynamicznego. Chociaż jest to bardzo cenne w celu tworzenia tkanek sercowo-naczyniowych in vitro lub utrzymywania kultur ex vivo, takie systemy nie pozwalają na systematyczne badania nad indywidualnymi efektami poszczególnych sygnałów. Dzieje się tak, ponieważ zastosowanie zarówno cyklicznego rozciągania, jak i ścinania w tych bioreaktorach jest napędzane przez ten sam przepływ pod ciśnieniem, który nierozerwalnie je łączy. Podczas gdy mikrosystemy, które pozwalają na dokładną manipulację mechaniczną wieloma wskazówkami, zostały opisane dla podłoży 2D62 lub konfiguracji hydrożelowych 3D63,64, takie konfiguracje nie pozwalają na włączenie elastomerowych rusztowań z biomateriału 3D.
Tutaj prezentujemy zastosowanie systemu bioreaktora rurowego, który w unikalny sposób umożliwia rozdzielenie naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania oraz pomaga mechanicznie badać ich indywidualne i łączne efekty. System ten pozwala na testowanie szerokiej gamy przeszczepów naczyniowych wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej (np. pochodzenia syntetycznego lub naturalnego, różnej mikroarchitektury, różnej porowatości). Aby skutecznie oddzielić zastosowanie naprężeń ścinających od rozciągania, kluczowymi koncepcjami wykorzystywanymi w bioreaktorze są (1) oddzielenie kontroli naprężeń ścinających i rozciągania za pomocą odrębnych systemów pomp oraz (2) stymulacja rusztowań w sposób "od wewnątrz na zewnątrz" z wymiarami sterowanymi obliczeniowo. Przepływ jest doprowadzany do zewnętrznej powierzchni rusztowania rurowego za pomocą pompy przepływowej, natomiast rozciąganie obwodowe rusztowania jest indukowane przez rozciągnięcie silikonowej rurki, na której montuje się rusztowanie za pomocą oddzielnej pompy naprężającej. Wymiary rurki silikonowej i rurki szklanej, w której znajduje się konstrukcja, są starannie dobierane i weryfikowane za pomocą symulacji obliczeniowej dynamiki płynów, aby zapewnić, że naprężenie ścinające na rusztowaniu (spowodowane przepływem) i rozciągnięcie obwodowe (spowodowane rozszerzaniem się rury) nie wpływają na siebie znacząco. Ten projekt od wewnątrz na lewą stronę ma kilka praktycznych przesłanek. Jeśli rozciąganie jest wywierane przez ciśnienie płynu świetlnego (podobne do obciążenia fizjologicznego), z natury wymaga to, aby projekt próbki był szczelny. Ponadto ciśnienie wymagane do rozciągnięcia próbki byłoby całkowicie określone przez sztywność próbki, która może się zmieniać w zależności od próbki i w obrębie próbki w czasie, co utrudnia kontrolowanie rozciągania. Ten bioreaktor montuje przeszczep inżynierii tkankowej wokół silikonowej rurki i umożliwia przyłożenie naprężeń ścinających ścianę (WSS) na zewnętrzną ścianę przeszczepu i zwiększa ciśnienie w przeszczepie od wewnątrz. W ten sposób można zapewnić równe warunki obciążenia między próbkami i w próbkach w czasie, a ponadto próbki mogą być nieszczelne, jak to zwykle bywa w przypadku porowatych rusztowań naczyniowych19. Ten bioreaktor typu inside-out jest specjalnie przeznaczony do systematycznych badań nad skutkami ścinania i/lub rozciągania, a nie do inżynierii natywnego naczynia krwionośnego in vitro, do którego bardziej odpowiednie są tradycyjne konfiguracje bioreaktorów naczyniowych. Zobacz Rysunek 1A–B dla rysunków projektowych bioreaktora, a odpowiadająca mu Tabela 1 dla opisu funkcjonalnego i uzasadnienia głównych komponentów bioreaktora.
Użycie bioreaktora zostało zademonstrowane na podstawie serii ostatnich badań przeprowadzonych przez naszą grupę, w których badaliśmy indywidualne i połączone wpływy naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania na stan zapalny i tworzenie tkanek w resorbowalnych rusztowaniach elektroprzędzonych dla tkanki sercowo-naczyniowej in situ19,43,44. W tym celu wykorzystaliśmy ludzkie makrofagi i miofibroblasty w monokulturze lub w kohodowli, aby symulować różne fazy kaskady regeneracyjnej in situ. Wykazaliśmy, że na wydzielanie cytokin przez ludzkie makrofagi wyraźnie wpływa zarówno cykliczne rozciąganie, jak i naprężenie ścinające, wpływając na odkładanie i organizację macierzy przez ludzkie miofibroblasty w tych rusztowaniach, zarówno poprzez sygnalizację parakrynną, jak i bezpośredni kontakt19,43,44. Warto zauważyć, że badania te wykazały, że w przypadku połączonego zastosowania naprężeń ścinających i rozciągania, wpływ na tworzenie tkanek i stan zapalny jest albo zdominowany przez jedno z dwóch obciążeń, albo występują synergiczne efekty obu obciążeń. Wyniki te ilustrują znaczenie oddzielenia obu obciążeń w celu lepszego zrozumienia wpływu środowiska mechanicznego na procesy TE. Wiedza ta może być wykorzystana do systematycznej optymalizacji parametrów konstrukcyjnych rusztowania w odpowiednich reżimach obciążenia hemodynamicznego. Ponadto dane mechanistyczne z takich dobrze kontrolowanych środowisk mogą służyć jako dane wejściowe dla modeli numerycznych, które są opracowywane w celu przewidywania przebiegu przebudowy tkanek in situ, jak ostatnio zgłoszono dla TEVGs65 lub TEHVs66, w celu dalszej poprawy zdolności predykcyjnej.

<table><tbody><tr><td>zaawansowany Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka do hodowli komórkowych EagleMedium (aDMEM)</td> <td>Gibco</td><td>12491-015</td> do <td>hodowli fibroblastów</td></tr><tr><td>Aqua Stabil</td><td>Julabo</td><td>8940012</td><td>zapobiega rozwojowi mikroorganizmów w bioreaktorze-zbiorniku hydraulicznym</td></tr><tr><td>Fibrynogen bydlęcy</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td>do przygotowania żelu fibrynonowego do wysiewu komórek na rusztowaniu elektroprzędzonym</td></tr><tr><td>Trombin bydlęcy</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td>do przygotowania żelu fibrynogenowego do wysiewu komórek na rusztowaniu elektroprzędzonym</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td>do odwirowania komórek i kondycjonowanego podłoża</td></tr><tr><td>Nożyczki zaciskowe - "kleszcze Kelly'ego"</td><td>Almedic</td><td>P-422</td><td>zaciśnij rurkę silikonową i nałóż wstępne rozciągnięcie na rusztowanie, aby rusztowanie można było wszyć w wygrawerowany rowek (autoklaw w kroku 1, kroku 7)</td></tr><tr><td>Inkubatory do hodowli komórkowych CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-170AIC-PE</td><td>do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Zbiornik sprężonego powietrza</td><td>Festo</td><td>CRVZS-5</td><td>wygładza wahania ciśnienia powietrza i tworzy opóźnienia czasowe dla wzrostu ciśnienia</td></tr><tr><td>Niestandardowy skrypt Matlab do obliczania maksymalnych rozciągnięć</td><td>Matlab</td><td>R2017. Mathworks, Natick, MA</td><td>oblicza minimalną i maksymalną średnicę zewnętrzną rusztowania elektroprzędzonego</td></tr><tr><td>Tablica akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td>przetwarzanie danych między systemem wzmacniacza a komputerem</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>VWRK4096-9005</td><td>w celu utrzymania sterylnych warunków pracy</td></tr><tr><td>Surowica cielęca bydła płodowego (FBS)</td> <td>Greiner</td><td>758087</td><td>suplement pożywki do hodowli komórkowych; surowica-suplement</td></tr><tr><td>Komory do hodowli przepływowej, składające się z przewodu ciśnieniowego z wygrawerowanymi rowkami i małymi otworami do wywierania nacisku na rurki silikonowe, gwintem śrubowym, stożkiem nosowym, górną komorą z wlotem przepływu i wylotem przepływu komory dolnej, tuleją adaptera</td><td>Wykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td><td>n.a.komory</td> <td>komory hodowli przepływowej (autoklaw w kroku 1, krok 7)</td></tr> <tr><td>Szklany asystent pipety Pasteura</td><td></td><td>HE40567002</td><td>zastosować próżnię na rusztowaniu elektroprzędzonym (autoklaw w kroku 1)</td></tr> <tr><td>Szklane rurki komory kulturowej przepływowej</td><td>wykonane przez Custon, sprzęt i Centrum Prototypów, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td><td>brak części</td> <td>komory do hodowli przepływowej (czyste i przechowywane w 70% etanolu, na etapie 1 i 7)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>pożywka do hodowli komórkowych suplement aminokwasowy, minimalizuje gromadzenie się amoniaku Kamera</td></tr><tr><td>szybkoobrotowa</td><td>MotionScope</td><td>M-5</td><td>monitorować rozciąganie podczas hodowli; Zdjęcia poklatkowe rusztowań są wykonywane z częstotliwością 30 Hz przez 6 sekund (tj. 3 cykle rozciągania)</td></tr><tr><td>Obiektyw szybkiego aparatu - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - obiektyw</td><td>Nikon</td><td>JAA616AB</td><td>do monitorowania rozciągania podczas hodowli; Zdjęcia poklatkowe rusztowań są wykonywane z częstotliwością 30 Hz przez 6 sekund (tj. 3 cykle rozciągania)</td></tr><tr><td>Opaska</td> zaciskowa <td>ibidi GmbH</td><td>10821</td><td>blok przepływu medium (autoklaw w kroku 1, Krok 7)</td></tr> <tr><td>Zbiornik hydrauliczny z 8 gwintami śrubowymi dla 8 przepływowych komór hodowlanych</td><td>Wykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td><td>n.a.</td> <td>w celu wywarcia nacisku na konstrukcje zamontowane w silikonie (wyczyść na zewnątrz chusteczką papierową z 70% etanolem, przepłucz zbiornik 70% etanolem, a następnie wodą demineralizowaną, w kroku 1 i 7)</td></tr><tr><td>System pomp Ibidi (8x), w tym pompa ibidi, oprogramowanie PumpControl, jednostka fluidyczna, zestaw perfuzyjny (rurka średnia), rurka ciśnieniowa powietrza, butelki suszące z pomarańczowymi kulkami krzemionki</td><td>Konfiguracja ibidi GmbH</td><td>10902</td><td>służy do sterowania przepływem w komorach kulturowych. Uwaga 1: pompy ibidi zostały zmodyfikowane przez producenta, aby umożliwić wydajność 200 mbar. Uwaga 2: może być zastąpiony przez system pompowy innego producenta, o ile można zastosować te same reżimy przepływu.</td></tr><tr><td>Noże (nr 10 sterylnych ostrzy, indywidualne opakowanie foliowe) i rękojeść skalpela (stal nierdzewna, pakowane pojedynczo)</td><td>Swann Morton</td><td>0301; 0933</td><td>do cięcia rurki silikonowej w rozmiarze odpowiednim dla rusztowania i do cięcia materiału do szycia</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>wersja 2018</td><td>do kontrolowania rozciągania zastosowanego na rusztowaniach</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym ze światłem UV</td><td>Labconco</td><td>302310001</td><td>w celu zapewnienia sterylnych warunków pracy. Promieniowanie UV służy do odkażania wszystkiego, czego nie można zautoklawować lub dotknąć po autoklawowaniu</td></tr><tr><td>Duże i małe szalki Petriego</td><td>Greiner</td><td>664-160</td><td>do sterylnych warunków pracy</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan (witamina C)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td> suplement <td>pożywki do hodowli komórkowych, ważny dla produkcji kolagenu</td></tr><tr><td>Źródło światła LED KL2500</td><td>Zeiss</td><td>Schott AG</td><td>aby pomóc w wizualizacji upływu czasu rusztowań podczas monitorowania rozciągania</td></tr><tr><td>Zamki i łączniki Luer (żeńskie i męskie), białe nasadki Luer</td><td>ibidi GmbH</td><td>różne, patrz (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td><td>aby zamknąć lub połączyć części bioreaktora i pompy ibidi (autoklaw w kroku 1, kroku 7)</td></tr><tr><td>Wzmacniacz pomiarowy (PICAS)</td><td>PEEKEL instruments B.V.</td><td>n.d.w</td> <td>celu wzmocnienia sygnału z czujnika ciśnienia i sprzężenia zwrotnego do LabView</td></tr><tr><td>Zbiornik Medium (duże strzykawki 60 ml) i uchwyty zbiorników</td><td>ibidi GmbH</td><td>10974</td><td>zbiornik medium (autoklaw w kroku 1, kroku 7)</td></tr><tr><td>Medium rurka o średnicy zewnętrznej 4,25 mm i średnicy wewnętrznej 1 mm</td><td>Guma BV</td><td>1805</td><td>Aby umożliwić większe natężenie przepływu, zastosowano rurkę ibidi Medium o większej średnicy. Uwaga: część rurki medium prowadzona przez zawory jednostki fluidycznej jest taka sama jak domyślna rurka medium ibidi</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Motion Studio</td><td>Idtvision</td><td>2.15.00</td><td>do tworzenia obrazów poklatkowych z dużą prędkością do monitorowania rozciągania</td></tr><tr><td>Igła (19G)</td><td>BD Microlance</td><td>301700</td><td>wraz z cienką elastyczną rurką służącą do napełniania zbiornika hydraulicznego ultraczystą wodą bez dodawania pęcherzyków powietrza</td></tr><tr><td>Sterownik</td> <td>igłowyAdson</td><td>2429218</td><td>do przenoszenia igły nylonowego szwu przez silikonową rurkę (autoklaw w kroku 1, kroku 7)</td></tr> <tr><td>Chusteczki papierowe</td><td>Kleenex</td><td>38044001</td><td>do czyszczenia sprzętu 70% etanolem</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td>Sigma P7793-1EA</td><td>szybka naprawa w przypadku wystąpienia wycieku</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (P/S)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>suplement pożywki do hodowli komórkowych; zapobiegać bakteriom Zanieczyszczenie</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>do etapów przechowywania i mycia (autoklaw na etapie 1)</td></tr><tr><td>Pojemniki plastikowe (60 ml) z czerwonymi nakrętkami</td><td>Greiner</td><td>206202</td><td>do przygotowania roztworu fibrynogenu</td></tr><tr><td>Siłownik pneumatyczny</td><td>Festo</td><td>AEVC-20-10-I-P</td><td>do uruchamiania miecha teflonowego (wyczyść chusteczką papierową z 70% etanolem w kroku 1 i 7)</td></tr><tr><td>Rusztowania rurowe z polikaprolaktonu bisurea (PCL-BU) (średnica wewnętrzna 3 mm, 200 &mikro; m grubość ścianki, długość 20 mm)</td><td>SyMO-Chem, Eindhoven, Holandia</td><td>n.d.a.</td> <td>produkowane metodą elektroprzędzenia z 15% (w/w) roztworów polimerów chloroformu (Sigma; 372978). Więcej informacji można znaleźć w Van Haaften i in. Inżynieria tkankowa część C (2018)</td></tr><tr><td>Przewód ciśnieniowy bez otworów (do kontroli statycznej)</td><td>Wykonany na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td><td>n.a.</td> <td>do montażu rurek elektroprzędzonych na rurkach silikonowych (autoklaw w kroku 1, kroku 7)</td></tr><tr><td>Czujnik ciśnienia i przetwornik</td><td>BD</td><td>TC-XX i P 10 EZ</td><td>Ciśnienie powietrza docierającego do pompy uruchamianej pneumatycznie jest podnoszone, aż osiągnie ustawione ciśnienie</td></tr><tr><td>Proporcjonalny zawór regulacji ciśnienia powietrza i czujnik ciśnienia</td><td>Festo</td><td>MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td><td>dostarcza sprężone powietrze do pompy uruchamianej pneumatycznie</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>pożywka do hodowli komórkowych monocytów/makrofagów</td></tr><tr><td>Bezpieczny zamek Probówki Eppendorfa (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>wielu zastosowań (autoklaw w kroku 1)</td></tr><tr><td>Roztwór dodecylosiarczanu sodu 20%</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Służy do czyszczenia materiałów, w stężeniu 0,1%.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Silikonowe O-ringi</td><td>Technirub</td><td>1250S</td><td>zapobiegające wyciekom (autoklaw w kroku 1, kroku 7)</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa (średnica zewnętrzna 2,8 mm, grubość ścianki 400 um)</td><td>Guma BV</td><td>1805</td><td>do montażu rurek elektroprzędzonych na przewodach ciśnieniowych (autoklaw w kroku 1)</td></tr><tr><td>Sterylna rurka (15 ml)</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td>wielu zastosowań</td></tr><tr><td>Szew, 5-0 prolen z wstępnie przymocowaną igłą</td> <td>stożkowąEthicon, Johnson & Drut</td><td></td><td>do szycia Johnson EH7404H Prolene 5-0 (długość 75 cm, igła stożkowa TF, 1/2 koła, długość igły 13 mm)</td></tr><tr><td>Strzykawka (24 ml)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>2057932</td><td>do dodawania ultraczystej wody lub pożywki do zbiornika hydraulicznego lub komory hodowli przepływowej</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,2 &mikro; m)</td> <td>Satorius</td><td>17597-K</td><td>do filtrowania roztworu fibrynogenu</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T150 z nasadką filtrującą</td><td>Nunc</td><td>178983</td><td>do odgazowania pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>T75 Kolba do hodowli komórkowych z nasadką filtrującą</td><td>Nunc</td><td>156499</td><td>do hodowli próbek kontroli statycznej</td></tr><tr><td>Mieszek teflonowy</td><td>Wykonane na zamówienie, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td><td>n.a.</td><td>do załadowania zbiornika hydraulicznego (wyczyść na zewnątrz chusteczką papierową z 70% etanolem w kroku 1 i 7)</td></tr><tr><td>Taca (stal nierdzewna)</td><td>PolarWare</td><td>15-248</td><td>do łatwego transportu komór do hodowli fluidalnej i bioreaktora z inkubatora do komory laminarnej i z powrotem (wyczyść chusteczką papierową z 70% etanolem przed i po użyciu)</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Wironit</td><td>4910</td><td>sterylne obchodzenie się z poszczególnymi częściami (autoklaw na etapie 1 i 7)</td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Stakpure</td><td>Omniapure UV 18200002</td><td>do korekcji parowania średniego, zmieszana z mieszanką aqua stabil i stosowana jako płyn hydrauliczny. (Woda ultraczysta w autoklawie w kroku 1)</td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>Philips</td><td>TUV 30W/G30 T8</td><td>do odkażania szczepów i części bioreaktora przed siewem</td></tr></tbody></table>

bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

Wykorzystanie resorbowalnych biomateriałów do wywołania regeneracji bezpośrednio w organizmie jest atrakcyjną strategią z punktu widzenia translacji. Takie materiały wywołują reakcję zapalną po implantacji, która jest motorem późniejszej resorpcji materiału i regeneracji nowej tkanki. Strategia ta, znana również jako inżynieria tkankowa in situ, jest stosowana w celu uzyskania zamienników układu sercowo-naczyniowego, takich jak przeszczepy naczyniowe inżynierii tkankowej. Zarówno procesy zapalne, jak i regeneracyjne są determinowane przez lokalne sygnały biomechaniczne na rusztowaniu (tj. naprężenia rozciągające i ścinające). W tym miejscu szczegółowo opisujemy zastosowanie specjalnie opracowanego bioreaktora, który w unikalny sposób umożliwia oddzielenie naprężeń rozciągających i ścinających na rusztowaniu rurowym. Pozwala to na systematyczną i wystandaryzowaną ocenę zdolności zapalnych i regeneracyjnych rusztowań rurowych pod wpływem dobrze kontrolowanych obciążeń mechanicznych, co wykazujemy na podstawie dynamicznego eksperymentu z udziałem ludzkich makrofagów i miofibroblastów. Szczegółowo omówiono kluczowe praktyczne kroki w tym podejściu – budowę i ustawienie bioreaktora, przygotowanie rusztowań i wysiewu komórek, zastosowanie i utrzymanie przepływu rozciągającego i ścinającego oraz pobieranie próbek do analizy.

Ten bioreaktor został opracowany w celu badania indywidualnego i połączonego wpływu naprężeń ścinających oraz cyklicznego rozciągania na wzrost i przebudowę tkanki naczyniowej w trójwymiarowych rusztowaniach z biomateriałów. Konstrukcja bioreaktora umożliwia hodowlę do ośmiu konstruktów naczyniowych w różnych warunkach obciążenia (Rysunek 1A). Konstrukty naczyniowe są umieszczone w komorze hodowli przepływowej (Rysunek 1B), w której zarówno rozciąganie obwodowe,...

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

Do tej pory bardzo trudno było zidentyfikować związki przyczynowo-skutkowe między hemodynamiką a regeneracją tkanki naczyniowej. Dzieje się tak dlatego, że kontrolowanie poszczególnych obciążeń mechanicznych jest wyzwaniem. Ten bioreaktor umożliwia nam mechanistyczne badanie indywidualnego i łącznego wpływu zwykłego stresu i cyklicznego rozciągania na potencjał regeneracyjny szerokiej gamy przeszczepów naczyniowych wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej.Tę procedurę zademonstruje Suzanne Koch, doktorantka w naszej grupie. I dr Tamar Wissing, która jest doktorem habilitowanym z naszego laboratorium. Aby zamontować rusztowanie wirowane elektrycznie na silikonowej rurce, nawlecz szew prolenowy 4-0 na jeden koniec kawałka silikonowej rurki i na drugi.Zrób mały węzeł po obu stronach rury, pozostawiając około 10 centymetrów drutu na obu węzłach i wykonaj trzeci węzeł na tych dwóch. Po wyjęciu igły do szycia przytnij krawędzie silikonowej rurki do trójkątnego kształtu i wykonaj ostatni węzeł na końcu dwóch 10-centymetrowych drutów. Zanurz rusztowanie wirowane elektrycznie w 30% etanolu i umieść rusztowanie na jednym końcu drutu do swobodnego szwu.Następnie delikatnie rozciągnij obie strony silikonowej rurki i 10-centymetrowego węzła szwowego, podczas gdy drugi badacz używa pęsety z gładką wewnętrzną końcówką, aby delikatnie przesunąć rusztowanie wirowane elektrycznie po rurce. Powoli zwolnij odcinek na silikonowej rurce, jednocześnie wygładzając rusztowanie wirowane elektrycznie za pomocą pęsety. I zanurz rusztowanie i silikonowe rurki w ultra czystej wodzie dwa razy.Zbuduj dolną komorę i upewnij się, że O-ring jest prawidłowo umieszczony. Umieść tuleję adaptera w górnej części dolnej komory i umieść przewód ciśnieniowy z otworami przez dolną komorę. Zasznuruj silikonowy O-ring wokół dolnego końca przewodu ciśnieniowego, aby zapobiec wyciekom.I przykręć dolną część dolnej komory do górnej części dolnej komory, aby zabezpieczyć przewód ciśnieniowy. Upewnij się, że dolny grawerowany rowek przewodu ciśnieniowego znajduje się około trzech do pięciu milimetrów nad krawędzią tulei adaptera dolnej komory. Przeciągnij silikonową rurkę z rusztowaniem elektro wirowanym przez przewód ciśnieniowy i wykonaj skinienie głową i drut do szycia na dolnym końcu rusztowania elektroprzędzionego, w miejscu wygrawerowanego rowka na przewodzie ciśnieniowym.Zrób drugie skinienie po przeciwnej stronie, aby szczelnie zabezpieczyć silikonową rurkę za pomocą elektrowirowanego przeszczepu. I umieszczając zacisk nożycowy wyposażony w linijkę na górnym końcu silikonowej rurki, pociągnij zacisk nożycowy do góry w konsekwentny sposób i delikatnie pociągnij za rusztowanie elektryczne, aby usunąć wszelkie zmarszczki. Użyj drutu do szycia, aby wykonać dwa węzły na obu końcach rusztowania w górnym wygrawerowanym rowku przewodu ciśnieniowego.Po wykonaniu obu węzłów zwolnij zacisk nożycowy i użyj noża, aby usunąć nadmiar silikonowej rurki. Przykręć stożki nosowe do gwintu śrubowego przewodów ciśnieniowych dla próbek, które będą ładowane dynamicznie. Zanurz przewód ciśnieniowy, rurkę i rusztowanie raz w 30% etanolu i dwa razy w ultraczystej wodzie, aby wstępnie zwilżyć zestaw.Umieść szklaną rurkę nad przewodem ciśnieniowym i delikatnie popchnij dolną komorę, aby zamocować szklaną rurkę na miejscu. Następnie umieść prostownik przepływu, silikonowy O-ring i tuleję adaptera w górnej komorze. I zabezpiecz komorę nad otwartym końcem szklanej rurki.Wyjmij męską zatyczkę przynęty z wylotu przepływu, pracuj w sterylnej komorze z przepływem laminarnym. Otwórz białą nasadkę przynęty i umieść chusteczkę do nasączania etanolem przed wylotem przepływu. Zdekonstruuj komorę hodowli przepływowej, zdejmując szklaną rurkę z górną komorą.Umieść próżniową rurę pastwiskową, dodaj na rusztowaniu wirowanym elektrycznie, aby usunąć jak najwięcej medium. I dodaj roztwór fibrynogenu w stosunku jeden do jednego z zawiesiną komórkową uzupełnioną trombiną. Jednokrotnie odpipetować roztwór w górę i w dół i natychmiast rozlać roztwór na całej długości rusztowania.Po dostarczeniu wszystkich komórek powoli przesuwaj rusztowanie od lewej do prawej oraz w górę iw dół, aby uzyskać równomierne rozmieszczenie komórek. Po obsianiu obu stron rusztowania ostrożnie zrekonstruuj komorę hodowli przepływowej, wkładając z powrotem szklaną rurkę i górną komorę. I umieść komorę hodowli przepływowej w inkubatorze, aby włókno zestaliło się.Aby połączyć bioreaktor z systemem pomp, umieść przepływową komorę hodowlaną na jednym z ośmiu gwintów śrubowych w podstawie bioreaktora. I umieść klips hosta na średniej rurce. Zdejmij białą nasadkę przynęty, zakrywając wlot przepływu z górnej komory komory hodowli przepływowej i wyjmij żeński łącznik przynęty z pożywki rurki.Podłącz rurkę medium z jedną stroną wlotu przepływu w górnej komorze. A druga strona z wylotem przepływu w dolnej komorze. Przenieś kompletną konfigurację z komory z przepływem laminarnym do inkubatora.I podłącz jednostki hydrauliczne i podstawę bioreaktora do przewodu ciśnieniowego powietrza i elektrycznego. Uruchom oprogramowanie i zainicjuj pompy. Uruchom przepływ pożywki dla próbek jedna po drugiej.Następnie zmień parametry pompy naprężającej na żądane ustawienia i uruchom szczep. Monitoruj rozciąganie zastosowane na rusztowaniu co drugi dzień. Monitorowanie naprężeń rozciągających i ścinających ścian w długotrwałych okresach hodowli pokazuje, że wartości te mogą być utrzymywane na względnie stałym poziomie przez okres do 20 dni.Po trzech dniach obciążenia hemodynamicznego barwienie immunofluorescencyjne ujawnia jednorodny rozkład makrofagów i miofibroblastów pochodzących z monocytów w całym rusztowaniu. Po 20 dniach kohodowli, cykliczne rozciąganie powoduje odkładanie się liczniejszych i grubszych włókien kolagenu typu 1. Podczas gdy w połączonej grupie obciążenia hemodynamicznego, efekt cyklicznego rozciągania jest niwelowany przez czysty stres, co skutkuje mniej wyraźnym odkładaniem się kolagenu typu 1.Po ośmiu dniach monohodowli makrofagów obserwuje się erozję włókien i rozszczepienie włókien we wszystkich reżimach obciążenia hemodynamicznego, przy czym najbardziej wyraźną resorpcję obserwuje się w grupie statycznej, a najmniej wyraźną resorpcję obserwuje się w grupie czystego stresu. Zarówno cykliczne rozciąganie, jak i czysty stres wpływają na profil wydzielania cytokin w konfiguracji kohodowlanej. Co ciekawe, łączne efekty obu obciążeń wykazują albo dominację jednego z dwóch obciążeń, albo synergiczne efekty obu obciążeń.Eksperymenty z kokulturami pokazują również, że środowisko mechaniczne i wynikające z niego środowiska zapalne zależne od obciążenia modulują fenotyp miofibroblastów. Ponadto wzorce ekspresji genów markera skurczowego alfa aktyny mięśni gładkich korelują z syntezą białek. Najważniejszą rzeczą podczas wykonywania tego protokołu jest to, że zastosowanie stretch, ważne jest, aby Twoja konfiguracja była wolna od wycieków.

a-multi-cue-bioreactor-to-evaluate-inflammatory-regenerative-capacity

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Ten artykuł przedstawia metodę budowy i obsługi taniego, wielokanałowego systemu hodowli komórek perfuzyjnych do pomiaru dynamiki wydzielania i szybkości wchłaniania substancji rozpuszczonych w procesach komórkowych. System może również wystawiać komórki na działanie dynamicznych profili bodźców.

Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Komórka ścinająca jest przeznaczona do pomiarów rozpraszania neutronów pod małym kątem w płaszczyźnie gradientu prędkości-prędkości ścinania i służy do charakteryzowania złożonych płynów. Pomiary przestrzennie rozdzielcze w kierunku gradientu prędkości są możliwe do badania materiałów z pasmami ścinania. Zastosowania obejmują badania dyspersji koloidalnych, roztworów polimerowych i struktur samoorganizujących się.

Pomiar mikrostruktury materiału pod przepływem za pomocą rozpraszania neutronów w 1-2 płaszczyznach przepływu i małym kącie

Trwałość polimerów i kompozytów polimerowych wzmocnionych włóknami w eksploatacji jest krytycznym aspektem dla ich projektowania i konserwacji w oparciu o stan. Przedstawiamy nowatorską, niskokosztową platformę do badań laboratoryjnych do badania wpływu jednoczesnych obciążeń mechanicznych i środowiskowych, która może pomóc w projektowaniu bardziej wydajnych, a jednocześnie bezpieczniejszych struktur kompozytowych.

Platforma testowa do badań trwałości polimerów i kompozytów polimerowych wzmacnianych włóknami w warunkach jednoczesnych bodźców higrotermomechanicznych

Poznaj metodę oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów w bioreaktorze z wieloma wskazówkami. Badanie wykorzystuje dynamiczną ko-kulturę makrofagów i miofibroblastów na elektroprzędzonych rusztowaniach.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Przeglądaj więcej filmów