Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Do tej pory bardzo trudno było zidentyfikować związki przyczynowo-skutkowe między hemodynamiką a regeneracją tkanki naczyniowej. Dzieje się tak dlatego, że kontrolowanie poszczególnych obciążeń mechanicznych jest wyzwaniem. Ten bioreaktor umożliwia nam mechanistyczne badanie indywidualnego i łącznego wpływu zwykłego stresu i cyklicznego rozciągania na potencjał regeneracyjny szerokiej gamy przeszczepów naczyniowych wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej.

Tę procedurę zademonstruje Suzanne Koch, doktorantka w naszej grupie. I dr Tamar Wissing, która jest doktorem habilitowanym z naszego laboratorium. Aby zamontować rusztowanie wirowane elektrycznie na silikonowej rurce, nawlecz szew prolenowy 4-0 na jeden koniec kawałka silikonowej rurki i na drugi.

Zrób mały węzeł po obu stronach rury, pozostawiając około 10 centymetrów drutu na obu węzłach i wykonaj trzeci węzeł na tych dwóch. Po wyjęciu igły do szycia przytnij krawędzie silikonowej rurki do trójkątnego kształtu i wykonaj ostatni węzeł na końcu dwóch 10-centymetrowych drutów. Zanurz rusztowanie wirowane elektrycznie w 30% etanolu i umieść rusztowanie na jednym końcu drutu do swobodnego szwu.

Następnie delikatnie rozciągnij obie strony silikonowej rurki i 10-centymetrowego węzła szwowego, podczas gdy drugi badacz używa pęsety z gładką wewnętrzną końcówką, aby delikatnie przesunąć rusztowanie wirowane elektrycznie po rurce. Powoli zwolnij odcinek na silikonowej rurce, jednocześnie wygładzając rusztowanie wirowane elektrycznie za pomocą pęsety. I zanurz rusztowanie i silikonowe rurki w ultra czystej wodzie dwa razy.

Zbuduj dolną komorę i upewnij się, że O-ring jest prawidłowo umieszczony. Umieść tuleję adaptera w górnej części dolnej komory i umieść przewód ciśnieniowy z otworami przez dolną komorę. Zasznuruj silikonowy O-ring wokół dolnego końca przewodu ciśnieniowego, aby zapobiec wyciekom.

I przykręć dolną część dolnej komory do górnej części dolnej komory, aby zabezpieczyć przewód ciśnieniowy. Upewnij się, że dolny grawerowany rowek przewodu ciśnieniowego znajduje się około trzech do pięciu milimetrów nad krawędzią tulei adaptera dolnej komory. Przeciągnij silikonową rurkę z rusztowaniem elektro wirowanym przez przewód ciśnieniowy i wykonaj skinienie głową i drut do szycia na dolnym końcu rusztowania elektroprzędzionego, w miejscu wygrawerowanego rowka na przewodzie ciśnieniowym.

Zrób drugie skinienie po przeciwnej stronie, aby szczelnie zabezpieczyć silikonową rurkę za pomocą elektrowirowanego przeszczepu. I umieszczając zacisk nożycowy wyposażony w linijkę na górnym końcu silikonowej rurki, pociągnij zacisk nożycowy do góry w konsekwentny sposób i delikatnie pociągnij za rusztowanie elektryczne, aby usunąć wszelkie zmarszczki. Użyj drutu do szycia, aby wykonać dwa węzły na obu końcach rusztowania w górnym wygrawerowanym rowku przewodu ciśnieniowego.

Po wykonaniu obu węzłów zwolnij zacisk nożycowy i użyj noża, aby usunąć nadmiar silikonowej rurki. Przykręć stożki nosowe do gwintu śrubowego przewodów ciśnieniowych dla próbek, które będą ładowane dynamicznie. Zanurz przewód ciśnieniowy, rurkę i rusztowanie raz w 30% etanolu i dwa razy w ultraczystej wodzie, aby wstępnie zwilżyć zestaw.

Umieść szklaną rurkę nad przewodem ciśnieniowym i delikatnie popchnij dolną komorę, aby zamocować szklaną rurkę na miejscu. Następnie umieść prostownik przepływu, silikonowy O-ring i tuleję adaptera w górnej komorze. I zabezpiecz komorę nad otwartym końcem szklanej rurki.

Wyjmij męską zatyczkę przynęty z wylotu przepływu, pracuj w sterylnej komorze z przepływem laminarnym. Otwórz białą nasadkę przynęty i umieść chusteczkę do nasączania etanolem przed wylotem przepływu. Zdekonstruuj komorę hodowli przepływowej, zdejmując szklaną rurkę z górną komorą.

Umieść próżniową rurę pastwiskową, dodaj na rusztowaniu wirowanym elektrycznie, aby usunąć jak najwięcej medium. I dodaj roztwór fibrynogenu w stosunku jeden do jednego z zawiesiną komórkową uzupełnioną trombiną. Jednokrotnie odpipetować roztwór w górę i w dół i natychmiast rozlać roztwór na całej długości rusztowania.

Po dostarczeniu wszystkich komórek powoli przesuwaj rusztowanie od lewej do prawej oraz w górę iw dół, aby uzyskać równomierne rozmieszczenie komórek. Po obsianiu obu stron rusztowania ostrożnie zrekonstruuj komorę hodowli przepływowej, wkładając z powrotem szklaną rurkę i górną komorę. I umieść komorę hodowli przepływowej w inkubatorze, aby włókno zestaliło się.

Aby połączyć bioreaktor z systemem pomp, umieść przepływową komorę hodowlaną na jednym z ośmiu gwintów śrubowych w podstawie bioreaktora. I umieść klips hosta na średniej rurce. Zdejmij białą nasadkę przynęty, zakrywając wlot przepływu z górnej komory komory hodowli przepływowej i wyjmij żeński łącznik przynęty z pożywki rurki.

Podłącz rurkę medium z jedną stroną wlotu przepływu w górnej komorze. A druga strona z wylotem przepływu w dolnej komorze. Przenieś kompletną konfigurację z komory z przepływem laminarnym do inkubatora.

I podłącz jednostki hydrauliczne i podstawę bioreaktora do przewodu ciśnieniowego powietrza i elektrycznego. Uruchom oprogramowanie i zainicjuj pompy. Uruchom przepływ pożywki dla próbek jedna po drugiej.

Następnie zmień parametry pompy naprężającej na żądane ustawienia i uruchom szczep. Monitoruj rozciąganie zastosowane na rusztowaniu co drugi dzień. Monitorowanie naprężeń rozciągających i ścinających ścian w długotrwałych okresach hodowli pokazuje, że wartości te mogą być utrzymywane na względnie stałym poziomie przez okres do 20 dni.

Po trzech dniach obciążenia hemodynamicznego barwienie immunofluorescencyjne ujawnia jednorodny rozkład makrofagów i miofibroblastów pochodzących z monocytów w całym rusztowaniu. Po 20 dniach kohodowli, cykliczne rozciąganie powoduje odkładanie się liczniejszych i grubszych włókien kolagenu typu 1. Podczas gdy w połączonej grupie obciążenia hemodynamicznego, efekt cyklicznego rozciągania jest niwelowany przez czysty stres, co skutkuje mniej wyraźnym odkładaniem się kolagenu typu 1.

Po ośmiu dniach monohodowli makrofagów obserwuje się erozję włókien i rozszczepienie włókien we wszystkich reżimach obciążenia hemodynamicznego, przy czym najbardziej wyraźną resorpcję obserwuje się w grupie statycznej, a najmniej wyraźną resorpcję obserwuje się w grupie czystego stresu. Zarówno cykliczne rozciąganie, jak i czysty stres wpływają na profil wydzielania cytokin w konfiguracji kohodowlanej. Co ciekawe, łączne efekty obu obciążeń wykazują albo dominację jednego z dwóch obciążeń, albo synergiczne efekty obu obciążeń.

Eksperymenty z kokulturami pokazują również, że środowisko mechaniczne i wynikające z niego środowiska zapalne zależne od obciążenia modulują fenotyp miofibroblastów. Ponadto wzorce ekspresji genów markera skurczowego alfa aktyny mięśni gładkich korelują z syntezą białek. Najważniejszą rzeczą podczas wykonywania tego protokołu jest to, że zastosowanie stretch, ważne jest, aby Twoja konfiguracja była wolna od wycieków.