Inżynieria biologicznych przeszczepów naczyniowych przy użyciu bioreaktora pulsacyjnego

Ogólnym celem tej procedury jest inżynieria biologicznych przeszczepów naczyniowych przy użyciu pulsacyjnego systemu bioreaktora. Osiąga się to poprzez przygotowanie biodegradowalnego rusztowania z siatki PGA, w którym komórki będą rosły w rzędzie i złożenie ich w komorze bioreaktora. Rusztowania są następnie osadzane z komórkami mięśni gładkich, a pokrywa z powietrzem i rurką zasilającą uszczelnia komorę bioreaktora.

Bioreaktor jest następnie podłączany do systemu przepływowego, aby zapewnić pulsacyjny przepływ do zbiorników w bioreaktorze. W reaktorze komórki wrastają w naczynia, które przechodzą testy immunochemiczne, biochemiczne i mechaniczne. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię choroby wieńcowej, ponieważ technika ta jest obiecującym podejściem do regeneracji wszczepialnych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy do pomostowania tętniczego.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w inżynierię naczyniową, może być stosowana do innych układów narządów, takich jak cykliczne siły fizjologiczne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy. Będziesz potrzebował dużo praktyki, aby w pełni opanować umiejętności.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego podejścia, gdy zdaliśmy sobie sprawę z tego, jak ważne jest zastosowanie fizjologicznej stymulacji mechanicznej do regeneracji konstruktów inżynieryjnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ proces śpiewania w bioreaktorze jest trudny do nauczenia, ponieważ składa się z wielu etapów i można go uzyskać tylko poprzez szczegółową demonstrację. Na początek użyj wody destylowanej do oczyszczenia 30-centymetrowych odcinków silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej o średnicy 3 milimetrów i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Użyj nożyczek, aby wyciąć odcinek siatki PGA o wymiarach 1,1 na osiem centymetrów dla każdego kawałka rurki za pomocą hemostatu, tak aby siatka PGA do rurki za pomocą szwu Dexon 6.0 zawiązała trzy węzły chirurgiczne, a następnie pojedyncze szwy z hemostatem, zabezpieczona siatka tworzy rusztowanie PGA. Umyj rusztowania, zanurzając je najpierw w jednym molowym wodorotlenku sodu na jedną do dwóch minut, a następnie trzykrotnie zanurzając je w wodzie destylowanej na dwie minuty na zanurzenie. Osusz je między praniami i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze przez 15 minut po trzecim praniu.

Po wyschnięciu zszyj jednocentymetrowe mankiety z dakronu na każdym końcu siatki za pomocą trzech szwów. Pozostaw rurkę o długości od dwóch do trzech milimetrów i nie przekłuwaj rurki. Pamiętaj, aby zostawić około 15 centymetrów wolnego szwu do późniejszego wykorzystania w tym protokole.

Wszystkie elementy i narzędzia bioreaktora są wcześniej automatycznie klawowane. Dzień przed rozpoczęciem hodowli bioreaktora bioreaktor musi być częściowo zmontowany, zanurzyć elementy bioreaktora w rusztowaniach, a więc siatkować silikonowe rurki, narzędzia chirurgiczne i cienki drut dłuższy niż długość bioreaktora w kąpieli 70% etanolowej przez co najmniej 30 minut podczas zanurzenia. Użyj drutu, aby przeciągnąć silikonową rurkę przez boczne ramiona reaktora.

Teraz wyjdź z bioreaktora i przymocuj rusztowania PGA do środka, mocując mankiety Dacron na rozszerzających się szklanych wargach. Użyj nadmiaru szwu, aby zawiązać każdy mankiet. Następnie, za pomocą łączników, przymocuj rurkę silikonową po jednej stronie rusztowania za pomocą jednej pary ramion bioreaktora i przymocuj rurkę po drugiej stronie rusztowania do pozostałych dwóch ramion.

Po zainstalowaniu złączy wyciągnij je z broni bocznej i przepłucz bioreaktor etanolem. Pozostaw reaktor do namoczenia na 10 minut z każdej strony. Ustaw bioreaktor na szalkach Petriego i wypłucz go kulturą tkankową.

Klasa wody. Za pomocą pipety należy również przepłukać siatkę i rurkę. Teraz umieść sterylne mieszadło w reaktorze do wykorzystania w przyszłości i wysusz urządzenie przez noc w kapturze z włączoną dmuchawą i wyłączonym promieniowaniem UV od tego momentu.

Nie pochylaj się nad reaktorem, ponieważ może to prowadzić do zanieczyszczenia Podczas konfiguracji wszystkie złącza należy przetrzeć alkoholem. Przed wykonaniem mocowań wiele połączeń jest następnie wzmacnianych paraformem, który przed nałożeniem musi być nasączony 70% etanolem. Więc miej dużo obu.

Na wszelki wypadek umieść sterylną szalkę Petriego nad każdym otworem bioreaktora, aby chronić rusztowanie PGA przed zanieczyszczeniami. Teraz rozpocznij konfigurację od podłączenia portu iniekcyjnego do trzeciego nieużywanego ramienia bioreaktora. Następnie podłącz worek dożylny do systemu przepływowego.

Za pomocą zestawu rurki morsa przywiąż niebieski koniec jak najbliżej złącza Y i zaciśnij rurkę. Przymocuj czerwoną rurkę do drugiego końca worka dożylnego. Następnie przymocuj białą rurkę po jednej stronie układu przepływowego.

Włóż trójdrogowy kurek odcinający do układu przepływowego. Przymocuj jeden koniec rurki przetwornika ciśnienia do kurka odcinającego, a drugi koniec przymocuj do środkowego otworu worka dożylnego. Teraz, aby częściowo napełnić system przepływu i sprawdzić, czy nie ma wycieków, dodaj 350 mililitrów PBS i 1% strefy grzybów do worka dożylnego.

Używając strzykawki o pojemności 60 mililitrów przed lub po podłączeniu do systemu przepływowego, wyreguluj kurek, aby kontrolować kierunek przepływu PBS i ściśnij worek, aby przepłukać system. Ten krok można wykonać przed lub po umieszczeniu w celi. Teraz komórki mogą być umieszczane w bioreaktorze.

W tym przykładzie resus zawiesił 8 milionów komórek SM, czyli około jednego zlejącego się T 75 w 1,25 mililitra pożywki i kapał je równomiernie na rusztowanie PGA od złącza Dacron do złącza Dacron. Po dodaniu komórek przetrzyj krawędź bioreaktora alkoholem. Unikaj unoszenia się nad reaktorem.

Następnie ostrożnie zamontuj silikonową pokrywę korka. Upewnij się, że nie odsłaniasz dolnej części pokrywy podczas wyjmowania jej z torby autoklawu lub podczas wykonywania któregokolwiek z poniższych etapów mocowania. Najpierw podłącz port wtryskowy do rurki zasilającej na złączu męskim.

Po drugie, podłącz filtry PTFE 0,20 mikrona do każdego z trzech lotnisk. Trzeci akapit, sfilmuj port wtryskowy. Włóż zmontowaną silikonową pokrywkę korka do szklanego bioreaktora.

Upewnij się, że rurka zasilająca nie dotyka osadzonych rusztowań PGA. Następnie uszczelnij za pomocą paraformu. Teraz podłącz bioreaktor do systemu przepływowego i umieść bioreaktor i system przepływu w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Na 25 do 30 minut reaktor musi być ustawiony na boku i obracany co pięć minut. Następnie, jeszcze w inkubatorze, napełnij komorę bioreaktora 400 mililitrami od czterech do 10 pożywek hodowlanych za pomocą pompy przez rurkę zasilającą. Teraz inkubuj rusztowania z nasionami bez pulsacyjnego pompowania przez sześć do siedmiu dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

W tym czasie nie ma potrzeby wymiany pożywki ani suplementacji witaminy C przed włączeniem pompy, sprawdź rurki pod kątem wycieków lub załamań. Następnie dostosuj prędkość pompy, aby utrzymać zakres ciśnienia od minus 30 do 270 milimetrów słupa rtęci. Monitoruj i utrzymuj to ciśnienie codziennie w całej kulturze.

Wymiana pożywki i suplementacja kwasu askorbinowego powinny być wykonywane dwa razy w tygodniu, podczas gdy rusztowanie rośnie z pulsacyjnym pompowaniem, aby najpierw podać świeżą pożywkę, przymocować port iniekcyjny i filtr PTFE do pokryw zasilających zarówno w celu wymiany pożywki, jak i usunięcia pożywki. Następnie umieść rurkę zasilającą w dwukierunkowej pompie i włóż jeden koniec do portu zasilającego bioreaktora, a drugi koniec do pokrywy zasilającej. Teraz powoli zacznij wypompowywać 200 mililitrów pożywki.

Stopniowo można zwiększać prędkość pompy. Następnie podłącz nową rurkę do karmienia i powoli zacznij pompować 200 mililitrów świeżego podłoża. Aby dodać kwas askorbinowy do reaktora, usuń 25 mililitrów pożywki za pomocą sterylnej 30-mililitrowej strzykawki.

Dodaj pięć mililitrów sterylnego roztworu kwasu askorbinowego, a następnie zwróć 25 mililitrów. Pożywki inżynieryjne będą wydawać się nieprzezroczyste i osiągną grubość ścianki około 250 mikronów po ośmiu tygodniach hodowli. W warunkach pulsacyjnych barwienie hematów, toiny i eozyny w zmodyfikowanych naczyniach wykazuje zmiany morfologii tkanek w czasie i pulsowaniu.

Świecąca strona naczyń jest oznaczona barwieniem tri CHRO L. Massona. W przypadku kolagenu, czterotygodniowe naczynie pulsacyjne ma więcej kolagenu niż jego odpowiednik bez impulsów, białe strzałki wskazują na pozostałe fragmenty PGA w naczyniach przez 12 tygodni. Analiza immunochemiczna pokazuje ekspresję wczesnego markera mięśni gładkich alfa aktyny, pośredniego markera mięśni gładkich cal poin one i późnego markera mięśni gładkich ciężkiego łańcucha miozyny Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu siedmiu do ośmiu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wykonać wszystko tak czysto i sterylnie, jak to tylko możliwe, zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak modyfikacja światła naczyń inżynieryjnych, mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak znaczenie modyfikacji powierzchni światła w konserwacji statków inżynieryjnych podczas badań in vivo. Po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową, zwłaszcza inżynierią naczyniową, do zbadania potencjalnych sposobów leczenia chorób wieńcowych na modelach zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać wszczepialne przeszczepy naczyniowe za pomocą dynamicznej kultury pocztowej. Nie zapominaj, że praca z wodorotlenkiem sodu może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak ochrona oczu i fartuch laboratoryjny.