Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie biologicznych zastąwek naczyniowych z wykorzystaniem pulsacyjnego systemu bioreaktora. Osiąga się to poprzez przygotowanie biodegradowalnego rusztowania z siatki PGA, na której będą rozwijać się komórki, a następnie umieszczenie go w komorze bioreaktora. Rusztowania są następnie zasiedlane komórkami mięśni gładkich, a komora bioreaktora zostaje zamknięta pokrywą z uszczelnieniami dla rurek doprowadzających powietrze i pożywkę.

Bioreaktor zostaje następnie podłączony do układu przepływowego w celu zapewnienia przepływu pulsacyjnego do naczyń w bioreaktorze. W reaktorze komórki przerastają w naczynia, które przechodzą testy immunochemiczne, biochemiczne i mechaniczne. Implikacje tej techniki obejmują terapię choroby wieńcowej, ponieważ metoda ta stanowi obiecujące podejście do regeneracji implantowalnych graftów naczyniowych o małej średnicy do pomostowania tętnic.

Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji w zakresie inżynierii naczyniowej, można ją zastosować również do innych układów organów poddawanych cyklicznym siłom fizjologicznym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności. Pełne opanowanie tych umiejętności wymaga znacznej praktyki.

Pomysł na to podejście pojawił się, gdy zdałyśmy sobie sprawę z znaczenia stosowania fizjologicznej stymulacji mechanicznej w celu regeneracji konstruktów inżynieryjnych. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ procesy w bioreaktorze są trudne do opanowania ze względu na liczne etapy i mogą zostać przyswojone jedynie dzięki szczegółowej demonstracji. Aby rozpocząć, należy użyć wody destylowanej do oczyszczenia 30 centymetrowych odcinków rurek silikonowych o średnicy wewnętrznej 3 mm, a następnie pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu.

Używając nożyczek, wytnij fragment siatki z PGA o wymiarach 1,1 centymetra na osiem centymetrów dla każdego odcinka rurki. Za pomocą hemostatu przymocuj siatkę z PGA do rurki, używając szwy Dexon 6.0; zawiąż trzy węzły chirurgiczne, a następnie wykonaj pojedyncze szwy hemostatem. Tak zabezpieczona siatka stanowi rusztowanie z PGA. Umyj rusztowania, najpierw zanurzając je w 1 M wodorotlenku sodu przez jedną do dwóch minut, a następnie trzykrotnie zanurz w wodzie destylowanej przez dwie minuty przy każdym zanurzeniu. Osusz je delikatnie między myciami, a po trzecim myciu pozostaw do wyschnięcia w dygestorium przez 15 minut.

Po wysuszeniu przyszyć mankiety z Dacronu o długości jednego centymetra do każdego końca siatki za pomocą trzech szwów. Pozostawić od dwóch do trzech milimetrów nakładki rurki, uważając, aby nie przebić rurki. Należy pozostawić około 15 centymetrów wolnej nici chirurgicznej do późniejszego wykorzystania w tym protokole.

Wszystkie komponenty i narzędzia bioreaktora należy uprzednio wysterylizować w autoklawie. W dniu poprzedzającym uruchomienie hodowli w bioreaktorze należy częściowo zmontować urządzenie, a następnie zanurzyć jego elementy – rusztowania (scaffolds), siatkę, rurki silikonowe, narzędzia chirurgiczne oraz cienki drut dłuższy niż długość bioreaktora – w 70% etanolu na co najmniej 30 minut. Za pomocą drutu należy przeciągnąć rurki silikonowe przez boczne króćce reaktora.

Następnie wyjmij bioreaktor i zamocuj wewnątrz rusztowania PGA, mocując mankiety z Dacronu na rozszerzonych krawędziach szklanych. Wykorzystaj nadmiar nici chirurgicznej, aby przywiązać każdy mankiet. Następnie, używając złączy, podłącz rurki silikonowe po jednej stronie rusztowania do jednej pary ramion bioreaktora, a rurki po drugiej stronie rusztowania do pozostałych dwóch ramion.

Po zainstalowaniu złączy wyciągnij je z odgałęzień bocznych i przepłucz bioreaktor etanolem. Pozostaw reaktor do namoczenia na 10 minut z każdej strony. Umieść bioreaktor na szalkach Petriego i przepłucz go pożywką do hodowli tkankowych.

Przepłucz wodę. Używając pipety, należy również przepłukać siatkę oraz rurki. Następnie umieść w reaktorze sterylny mieszadło magnetyczne do późniejszego użytku i susz aparat przez noc w dygestorium z włączonym nawiewem i wyłączonym promieniowaniem UV od tego momentu.

Nie należy pochylać się nad reaktorem, aby uniknąć zanieczyszczenia. Podczas przygotowania wszystkie złącza muszą zostać przetarte alkoholem. Przed połączeniem wiele złączy należy wzmocnić paraformą, którą przed nałożeniem trzeba namoczyć w 70% etanolu. Należy zatem przygotować odpowiednią ilość obu tych substancji.

W ramach środków ostrożności umieść sterylną szalkę Petriego nad każdym otworem bioreaktora, aby chronić znajdujące się wewnątrz rusztowanie PGA przed zanieczyszczeniami. Następnie rozpocznij konfigurację, mocując port wtryskowy do trzeciego, niewykorzystanego ramienia bioreaktora. W kolejnym kroku podłącz worek do wlewu z systemem przepływowym.

Za pomocą zestawu drenów walrus zawiąż niebieski koniec jak najbliżej rozgałęzienia w kształcie litery Y i zaklemuj dren. Podłącz czerwony dren do przeciwległego końca worka z płynem infuzyjnym. Następnie podłącz biały dren do jednej strony układu przepływowego.

Wprowadź trójdrożny kurek w system przepływu. Podłącz jeden koniec rurki przetwornika ciśnienia do kurka, a drugi koniec do środniego otworu worka do infuzji. Aby częściowo napełnić system przepływu i sprawdzić go pod kątem nieszczelności, dodaj do worka do infuzji 350 mililitrów PBS i 1% fungi zone.

Używając strzykawki o pojemności 60 ml przed lub po podłączeniu do systemu przepływowego, należy ustawić kurek, aby kontrolować kierunek przepływu PBS i ścisnąć worek w celu przepłukania systemu. Krok ten można wykonać zarówno przed, jak i po osadzeniu komórek. Teraz komórki mogą zostać osadzone w bioreaktorze.

W tym przykładzie resuspenduj 8 milionów komórek SM, co odpowiada około jednej konfluencyjnej hodowli T 75, w 1,25 mililitrach pożywki i nanieś je równomiernie kroplami na rusztowanie PGA, od złącza Dacron do złącza Dacron. Po dodaniu komórek przetrzyj krawędź bioreaktora alkoholem. Unikaj pochylania się bezpośrednio nad reaktorem.

Następnie ostrożnie złóż pokrywkę z silikonowym korkiem. Należy dopilnować, aby spód pokrywki nie miał kontaktu z otoczeniem podczas wyjmowania jej z worka autoklawizacyjnego lub w trakcie kolejnych etapów montażu. W pierwszej kolejności przymocuj port wtryskowy do rurki doprowadzającej w miejscu złącza męskiego.

Po drugie, przymocuj filtry PTFE 0,20 mikrona do każdego z trzech portów dostępowych. Po trzecie, zabezpiecz port wtryskowy folią. Włóż zmontowaną pokrywę z silikonowym korkiem do szklanego bioreaktora.

Należy upewnić się, że rurka doprowadzająca pożywkę nie dotyka osadzonych rusztowań PGA. Następnie należy uszczelnić całość paraformą. Teraz należy podłączyć bioreaktor do układu przepływowego, a następnie umieścić bioreaktor i układ przepływowy w inkubatorze w temperaturze 37 °C.

Przez 25 do 30 minut reaktor musi znajdować się w pozycji poziomej i być obracany co pięć minut. Następnie, wciąż wewnątrz inkubatora, należy napełnić komorę bioreaktora 400 mililitrami pożywki hodowlanej four to 10, używając pompy i rurki doprowadzającej. Teraz inkubuj zasiane rusztowania bez pulsacyjnego pompowania przez sześć do siedmiu dni w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

W tym czasie nie ma potrzeby wymiany pożywki ani suplementacji witaminą C; przed włączeniem pompy należy sprawdzić, czy przewody nie są nieszczelne lub pozaginane. Następnie należy dostosować prędkość pompy tak, aby utrzymać zakres ciśnienia od -30 do 270 mmHg. Ciśnienie to należy monitorować i utrzymywać codziennie przez cały okres hodowli.

Wymiana medium i suplementacja kwasem askorbinowym powinny być przeprowadzane dwa razy w tygodniu podczas wzrostu rusztowania z zastosowaniem pompowania pulsacyjnego w celu dostarczenia świeżego medium; najpierw należy przymocować port wtryskowy i filtr PTFE do pokryw zasilających, zarówno w celu wymiany medium, jak i usuwania zużytego medium. Następnie należy mocno umieścić rurkę zasilającą w pompie dwukierunkowej, wprowadzając jeden koniec do portu zasilającego bioreaktora, a drugi koniec do pokrywy zasilającej. Teraz należy powoli rozpocząć wypompowywanie 200 mililitrów medium.

Prędkość pompy można stopniowo zwiększać. Następnie należy podłączyć nową rurkę doprowadzającą i powoli rozpocząć pompowanie 200 mililitrów świeżej pożywki. Aby dodać kwas askorbinowy do reaktora, należy odessać 25 mililitrów pożywki za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 30 mililitrów.

Dodać 5 ml sterylnego roztworu kwasu askorbinowego, a następnie przywrócić 25 ml medium. Inżynieryjne naczynia będą sprawiać wrażenie nieprzezroczystych i osiągną grubość ścianki około 250 µm po ośmiotygodniowej hodowli. W warunkach pulsacyjnych barwienie hematoksyliną i eozyną inżynieryjnych naczyń wykazuje zmiany morfologii tkanki w czasie oraz pod wpływem pulsacji.

Strona luminalna naczyń jest zaznaczona literą L przy barwieniu tri-chromem Massona. W przypadku kolagenu naczynia poddane pulsacji przez cztery tygodnie wykazują go więcej niż ich odpowiedniki niepulsacyjne; białe strzałki wskazują pozostałe fragmenty PGA w naczyniach w 12. tygodniu. Analiza immunochemiczna wykazuje ekspresję wczesnego markera mięśni gładkich – aktyny alfa, pośredniego markera mięśni gładkich – kalponiny 1 oraz późnego markera mięśni gładkich – ciężkiego łańcucha miozyny. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w siedem do ośmiu godzin.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu maksymalnej czystości i sterylności zgodnie z opisany metodą. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak znaczenie modyfikacji powierzchni światła w utrzymaniu sztucznie wytworzonych naczyń podczas badań in vivo, można zastosować inne metody, na przykład modyfikację światła tych naczyń po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny inżynierii tkankowej, a w szczególności inżynierii naczyniowej, do poszukiwania potencjalnych metod leczenia chorób tętnic wieńcowych w modelach zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać implantowalne inżynieryjne przeszczepy naczyniowe poprzez dynamiczną kulturę pośmiertną. Należy pamiętać, że praca z wodorotlenkiem sodu może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak ochrona oczu i fartuch laboratoryjny.