Name: Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj technologię mikromacierzy fenotypowych do profilowania metabolicznego Chlamydomonas reinhardtii. Ta metoda umożliwia udoskonalanie modeli sieci metabolicznych mikroalg poprzez identyfikację nowych reakcji enzymatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Główne wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), ufundowane przez Tamkeen w ramach grantu New York University Abu Dhabi Research Institute (73 71210 CGSB9) i NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. był dodatkowo wspierany przez Program Stu Talentów Uniwersytetu Zhejiang. Dziękujemy Ashishowi Jaiswalowi za pomoc w nagraniu filmu. Dziękujemy Hong Cai za wygenerowanie danych o fenotypie metabolicznym.

1. Eksperymenty z mikromacierzami fenotypowymi
<ol>
	<li>Szczep C. reinhardtii CC-503 należy uzyskać w Centrum Zasobów Chlamydomonas na Uniwersytecie Minnesoty, USA (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Hoduj komórki w świeżych pożywkach tris-acetate-phosphate (TAP) class19 o końcowych stężeniach 400 μg/ml timentyny, 50 μg/ml ampicyliny i 100 μg/ml kanamycyny (w celu zahamowania wzrostu bakterii) poniżej 400 mikromolowych fotonów/m2s, w temperaturze 25 °C, przez dwa dni do połowy fazy logarytmicznej.</li>
	<li>Odwirować kulturę w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 22 °C i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
	<li>Przygotować świeżą pożywkę TAP zawierającą 0,1% barwnika fioletu tetrazolowego "D". 
	UWAGA: Zmodyfikuj pożywkę TAP na tym etapie, aby wykluczyć niektóre składniki odżywcze w zależności od kategorii metabolitów testowanych na każdej płytce (np. wyklucz chlorek amonu dla płytek źródłowych azotu).</li>
	<li>Zawiesić osad w świeżej pożywce TAP przygotowanej (od kroku 1.2) do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Użyj płytek do oznaczania związków chemicznych (źródła węgla, źródła azotu, płytki ze źródłami fosforu i siarki oraz źródła azotu peptydowego).</li>
	<li>Zaszczepić 100 μl podwielokrotności pożywki zawierającej komórki do każdego dołka na płytkach testowych. 
	UWAGA: Upewnij się, że zduplikowałeś testy.</li>
	<li>Umieść komórki na płytkach z ekstraktem drożdżowym/peptonem i wykonaj barwienie metodą Grama, jak w Smith i wsp.20 przed i po teście w celu monitorowania skażenia bakteryjnego.</li>
	<li>Włóż płytki do oznaczania związków chemicznych do systemu czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 30 °C przez okres do 7 dni i zaprogramować system czytnika mikropłytek tak, aby odczytywał zmianę koloru barwnika co 15 minut. 
	UWAGA: Ponieważ większość czytników mikropłytek nie zapewnia źródła ciągłego światła podczas inkubacji, glony powinny być w stanie przeprowadzić oddychanie heterotroficzne.</li>
</ol>
2. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksportuj surowe dane kinetyczne z czytnika mikropłytek jako pliki CSV, które następnie zostaną wykorzystane jako dane wejściowe do pakietu Omnilog Phenotype Microarray (OPM) w R. Dodaj informacje biologiczne jako metadane (np. oznaczenie szczepu, pożywka wzrostowa, temperatura itp.).
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania do konwersji danych PM Kinetic, załaduj pliki danych D5E i przekonwertuj je na pliki OKA za pomocą następujących wierszy poleceń w oprogramowaniu do analizy kinetycznej PM: 
		Obciążenie | Importuj (zlokalizuj folder z plikami OKA) | Wypełnianie filtrów | Import | Dodaj wszystkie płyty | Zamykać. 
		Eksport | wybierz odczytane dane (Kinetic), wybierz format (CSV) (Nagłówek tabeli) i wybierz płyty (każda płyta (indywidualne pliki)) | Eksport danych | Zapisać.</li>
		<li>Aby przeprowadzić analizę danych Phenotype Microarray (PM), użyj pakietu oprogramowania OPM21,22, który działa w środowisku oprogramowania R. Pakiet, samouczek i dokumentacja referencyjna są dostępne pod adresem: http://www.goeker.org/opm/. W programie RStudio, graficznym interfejsie użytkownika dla języka R, zainstaluj pakiet opm i jego zależności przy użyciu następujących poleceń: 
		źródło (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) 
		Biblioteka (OPM)</li>
		<li>Przejdź do katalogu zawierającego pliki CSV z danymi kinetycznymi i zaimportuj dane za pomocą funkcji read_opm: 
		x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))</li>
		<li>Agreguj i dyskretynuj dane kinetyczne za pomocą estymacji parametrów krzywej. 
		Dla (i in 1 :length(x)) { 
		x[[i]] <Robię _aggre(x[[i]], rozruch = 0 L, rdzenie = 1 L, metoda ="splajny", opcje = set_spline_options("smooth.spline"))<br />
		x[[i]] <- do_disc(x[[i]], odcięcie = FAŁSZ) 
		} 
		#Collection metadanych 
		metadane <- collect_template(".") 
		metadata$Szczep <- c("BLANK","CC- 503") 
		for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadane, zamień = PRAWDA)}</li>
		<li>Użyj funkcji xy_plot, aby odwzorować pomiary oddychania (lub wzrostu) (oś y) w funkcji czasu (oś x) dla badanych płytek 96-dołkowych. 
		print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Napięcie", theor.max = FAŁSZ))</li>
		<li>Wizualizuj dane w postaci mapy cieplnej za pomocą funkcji level_plot, aby umożliwić szybki przegląd porównawczy danych kinetycznych. 
		level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space = "Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)</li>
		<li>Wyodrębnij ważne informacje biologiczne, parametry krzywej, z surowych krzywych kinetycznych i uwzględnij fazę opóźnienia (λ), szybkość wzrostu (μ), maksymalne oddychanie komórek (A) i obszar pod krzywą (AUC)21. W celu zidentyfikowania metabolitów dodatnich należy użyć wartości A kontroli ujemnej, która reprezentuje reaktywność abiotyczną barwnika z pożywką, oprócz ślepej próby każdej płytki mikrodołkowej jako wartości odejmowania tła. Funkcja extract służy do uzyskiwania parametru A. 
		opm_opt("curve.param") 
		param <- extract (x, as.labels = list("Szczep")))</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja reakcji i genów związanych z nowymi metabolitami
<ol>
	<li>Przeszukaj KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) i MetaCyc (http://metacyc.org/), aby zidentyfikować numery Komisji Enzymów (EC) dla reakcji z użyciem metabolitów znalezionych w macierzach związków chemicznych23,2423,24.</li>
	<li>Użyj zidentyfikowanych numerów EC jako podstawy wyszukiwania w wielu dostępnych zasobach adnotacji glonów, takich jak Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) i recenzowane publikacje23,25,26,27.</li>
	<li>Jeśli zapytanie nie zwraca żadnych dowodów genetycznych dla danego numeru EC, zidentyfikuj odpowiednie powiązane białka w innych organizmach, zaczynając od gatunków najbliższych C. reinhardtii, a następnie przeprowadź wyszukiwanie oparte na profilu przy użyciu serwera NCBI PSI-BLAST z ustawieniami domyślnymi i użyj nieredundantnych białek (nr) w C. reinhardtii (taxid:3055) w celu zidentyfikowania genów kandydujących związanych z reakcją12.</li>
	<li>Ręcznie selekcjonuj trafienia PSI-BLAST z wartościami E < 0,05 pod kątem istotności dla wyszukiwanego numeru EC, wysyłając zapytanie o te trafienia BLAST za pośrednictwem serwerów przewidywania domen białek EMBL-EBI, Pfam (http://pfam.xfam.org/search) lub InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Należy pamiętać, że dwa ostatnie skany są krytycznymi krokami w celu zapewnienia identyfikacji prawidłowej aktywności enzymatycznej białka.</li>
</ol>
4. Udoskonalanie i ocena modelu
<ol>
	<li>Użyj najnowszego programu COBRA Toolbox v.3.028 w MATLAB29,30 w celu wykonania następujących kroków w celu udoskonalenia modelu. Program COBRA Toolbox można zainstalować, wykonując czynności opisane w następujący sposób: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Można też zauważyć, że COBRA Toolbox jest również implementowany w innych językach programowania typu open source, takich jak Python (COBRApy31) i jest dostępny pod adresem: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
	<ol>
		<li>Po zainstalowaniu programu COBRA Toolbox v.3.0 otwórz program MATLAB i wykonaj następujące polecenie, aby zainicjować przybornik: 
		initCobraSkrzynka narzędziowa;</li>
		<li>Dodaj zidentyfikowane reakcje wraz z powiązanymi z nimi genami do modelu metabolicznego, takiego jak iRC1080, za pomocą funkcji COBRA Toolbox addReaction i changeGeneAssociation. Przejdź do katalogu zawierającego model IRC1080, pobrany z http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 i wykonaj następujące polecenia, aby załadować model, zmienić jego nazwę i dodać nową reakcję oraz skojarzony z nią gen. 
		Load('iRC 1080 .mat') 
		modelNowy = iRC 1080; 
		modelNew = addReaction(modelNowy, 'D-ALA 2' , ... 
		{'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... 
		'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... 
		'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); 
		modelNEW = changeGeneAssociation(modelNowy, ... 
		"D-ALA 2","au.g 14655 _t 1");</li>
		<li>W niektórych przypadkach, gdy metabolit nie jest wytwarzany wewnątrzkomórkowo, ale jest pobierany z pożywki, należy dodać do modelu reakcje transportu nowych metabolitów. Te reakcje transportu reprezentują bierną dyfuzję metabolitu z pożywki zewnątrzkomórkowej do cytozolu. Ponadto należy dodać odpowiednią reakcję sztucznej wymiany za pomocą funkcji addExchangeRxn w celu wprowadzenia lub wyprowadzenia metabolitu do podłoża zewnątrzkomórkowego. 
		modelNew = addReaction(modelNowy, 'CYCPt' , ... 
		{'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)' 
		modelNew = addExchangeRxn(modelNowy, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );</li>
		<li>Przetestuj zachowanie nowego modelu wynikowego, np. iBD1106, przeprowadzając analizę bilansu strumienia (FBA) przy użyciu funkcji optimizeCbModel w jasnych i ciemnych warunkach w celu maksymalizacji biomasy jako funkcji celu. Dla wzrostu światła ustaw dolną i górną granicę reakcji świetlnych PRISM solar lito na 646,07 (maksymalna szybkość). W przypadku ciemnego wzrostu ustaw granice wszystkich reakcji światła PRISM na zero. Użyj zdefiniowanej wcześniej funkcji Biomasa10 dla wzrostu w ciemnych i jasnych warunkach. Roztwór FBA wygeneruje dwa wektory odpowiadające strumieniom reakcji (solution.v) i zmniejszonym kosztom (solution.w), a także jeden wektor odpowiadający cenom ukrytym metabolitów (solution.y). 
		%Symuluj wzrost w warunkach oświetleniowych: 
		modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... 
		% 'PRISM_solar_litho' , ... 
		'PRISM_solar_exo' , ... 
		'PRISM_incandescent_ 60 W' , ... 
		'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ... 
		'PRISM_metal_halide' , ... 
		'PRISM_high_pressure_sodium' , ... 
		'PRISM_growth_room' , ... 
		'PRISM_white_LED' , ... 
		"PRISM_red_LED_array_ 653 nm" , ... 
		"PRISM_red_LED_ 674 nm" , ... 
		'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ... 
		'PRISM_design_growth' , ... 
		}, 0, 'b' ); 
		modelNew = changeObjective(modelNowy, 'BIOMASS__mixo'); 
		FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNowy, 'max');</li>
		<li>Powtórz krok 4.1.4 dla iRC1080, aby porównać roztwory FBA otrzymane dla iBD1106 z roztworami uzyskanymi dla iRC1080.</li>
		<li>Dostępnych jest wiele metod COBRA, które można wykorzystać do porównywania modeli (np. analiza zmienności strumienia, badania delecji genów, analizy odporności, przewidywania podziału strumienia, FBA, pobieranie próbek itp.). Szczegółowe samouczki można znaleźć na stronie https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. W tym miejscu przedstawiono przykład, w którym model iRC1080 jest porównywany z jego udoskonaloną wersją, iBD1106, poprzez uzyskanie cen równoległych (wrażliwości obiektywnej funkcji biomasy na zmiany zmiennej systemowej) metabolitów uwzględnionych w każdym modelu. 
		Należy uzyskać ceny równoległe metabolitów: 
		shadowPrices = tabela(modelNowy.mets, ... 
		modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Fenotypowanie metaboliczne zielonej mikroalgi, C. reinhardtii, opisano tutaj przy użyciu wysokoprzepustowych płytek do oznaczania PM i niezmodyfikowanego PMI. Testy wykorzystano łącznie dla 190 źródeł węgla (PM01 i PM02), 95 źródeł azotu (PM03), 59 źródeł fosforu i 35 źródeł siarki (PM04) oraz peptydowych źródeł azotu (PM06-08). Dodatnie oddychanie zaobserwowano dla 148 składników odżywczych (jeden pozytywny test dla wykorzystania źródła C, cztery pozytywne testy dla każdego wykorzystania źródła S i P oraz 139 pozytywnych testów dla wykorzystania źródła N). Podłoża lub składniki pokarmowe (węgiel, azot, fosfor lub siarka) wchodzące w skład pożywki nie powinny być dodawane do zdefiniowanej pożywki po zastosowaniu do odpowiednich mikropłytek PM, które badają każde z tych źródeł.
Przedstawiona tutaj metoda jest skuteczna w charakteryzowaniu fenotypów metabolicznych mikroalg, które można wykorzystać do rozszerzenia istniejących modeli sieci metabolicznych lub kierowania rekonstrukcją nowych modeli. Ponadto, ponieważ wymagania żywieniowe większości mikroalg nie są znane, platforma ta może być wykorzystana do ich szybkiego zdefiniowania. Nelson i wsp.W ramach projektu 43 z powodzeniem zastosowano te metody w celu zidentyfikowania nowych związków, które wspomagają wzrost mikroalg Chloroidium sp. UTEX 3007 i wykorzystano uzyskane informacje do zdefiniowania metabolitów wprowadzających się do gatunków, które w przeciwieństwie do Chlamydomonas obejmują 40 różnych źródeł węgla.
Jednym z głównych ograniczeń PM do profilowania mikroalg jest to, że PMI nie ma oświetlenia w komorze inkubacyjnej, a mikroalgi muszą być w stanie przeprowadzać metabolizm heterotroficzny . Brak światła może wpływać na interpretację modeli, które uwzględniają światło do obliczania strumieni metabolicznych. Pary genów o funkcjach koordynacyjnych ewoluowały współewoluując, tworząc węzły sieci metabolicznej, a rozróżnienie między węzłami sieci fotosyntetycznych i niefotosyntetycznych można dokonać44. Ogólnie rzecz biorąc, węzły sieci fotosyntetycznych (tj. wysoce połączone węzły w modelu) zostałyby pominięte w modelach heterotroficznych. Ze względów praktycznych modelowanie heterotrofizmu u gatunków miksotroficznych powinno pomijać reakcje, o których wiadomo, że są napędzane przez światło, i uwzględniać różnice w bilansie energetycznym między warunkami. Tak więc modelowanie metabolizmu zależnego od światła i niezależnego od światła jest standardową praktyką w modelowaniu metabolicznym Chlamydomonas 6,45.
Niektóre zielone mikroalgi, takie jak Trebouxiophytes, są znane z asymilacji różnych cząsteczek węgla do wzrostu i uważa się, że wynika to z ich długiej historii ewolucyjnej jako członków porostów46. Podczas gdy chlorofity, takie jak Chlamydomonas, mogą wykorzystywać octan do wzrostu, brązowa mikroalga morska Tisochrysis lutea, znana ze swojego potencjału do komercyjnej produkcji bardzo długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (VLC-PUFA), nie może używać octanu, ale może używać glicerolu do wzrostu47. Koncentracja biomasy powyżej 100 g l−1 masy suchych komórek została osiągnięta przy użyciu chlorelli ze zoptymalizowanym dodatkiem źródeł węgla organicznego w trybie zasilaniawsadowego 48. Co więcej, dodanie cukru do Chlorellavulgaris może zwiększyć jego sekwestrację CO2 , zapewniając w ten sposób dodatkowe korzyści podczas wzrostu fotosyntetycznego49. Większość heterotroficznych mikroalg może również rosnąć miksotroficznie, ale wykazano, że chlorofit Chromochloris zofingiensis wyłącza fotosyntezę po dodaniu cukru50.
Okrzemki, należące do działu Bacillariophyta, są główną grupą fitoplanktonu. Chociaż większość okrzemek może rosnąć tylko fotoautotroficznie, niektóre z nich mogą być uprawiane miksotroficznie lub heterotroficznie51. Na przykład stwierdzono, że glicerol wspomaga wzrost w świetle przy braku CO2 w niektórych okrzemkach, w tym w gatunku modelowym Phaeodactylum tricornutum52. Ponadto niektóre okrzemki bentosowe, takie jak Nitzschia linearis , mogą rosnąć na węglowodanach w ciemności53. Jest prawdopodobne, że testy PM zostaną rozszerzone na okrzemki i inne grupy glonów poprzez uzupełnienie odpowiednich źródeł węgla organicznego, aby umożliwić komórkom heterotroficzny wzrost, a strategia miksotrofii może być również potencjalnie zastosowana w przypadku obligatoryjnych autotroficznych mikroalg zapewniających minimalny wymagany dopływ światła.
Aby ocenić odtwarzalność danych, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie podwójnych testów dla wszystkich płytek. Oznaczenie można uznać za dodatnie tylko wtedy, gdy po odjęciu od kontroli ujemnej i odpowiednich studzienek ślepych, absorbancja (wartość PMI) jest dodatnia. Opis ten, w obecności badanego związku, jest odzwierciedleniem abiotycznej reakcji barwnika z pożywką.

Optymalizacja metabolizmu glonów w celu zwiększenia i stabilnej produkcji docelowych metabolitów wymaga opracowania złożonych strategii inżynierii metabolicznej poprzez analizy sieci metabolicznych na poziomie systemów. Modele sieci metabolicznych mogą kierować racjonalnymi projektami szybkiego rozwoju strategii optymalizacji1,2,3,4. Chociaż zsekwencjonowano około 160 gatunków mikroglonów5, według naszej wiedzy dostępne są tylko 44 modele metabolizmu glonów4,6,7. Ze względu na trudności w uzyskaniu wysokoprzepustowych danych fenotypowych metabolicznych do eksperymentalnej walidacji informacji genomicznej, rekonstrukcja wysokiej jakości modeli sieciowych pozostaje w tyle za szybkim rozwojem sekwencjonowania genomu glonów.
C. reinhardtii jest atrakcyjnym modelowym systemem do badań na bazie glonów. Gatunek ten może rosnąć fotoautotroficznie lub heterotroficznie i jest szeroko stosowany jako organizm modelowy w badaniach podstawowych i stosowanych. Jego sekwencja genomu została opublikowana w 2007 roku8, a następnie zrekonstruowano modele metaboliczne w skali genomu dla gatunku9,10,11. Model w skali genomu C. reinhardtii (iRC1080) został zrekonstruowany przez Changa i wsp.10 na podstawie dowodów genomicznych i literatury (obejmujących ~250 źródeł). Ma 1 706 metabolitów z 2 190 reakcjami10; Nie można było jednak zweryfikować kompletności modelu poza dostępnymi w tym czasie dowodami eksperymentalnymi.
Technologia mikromacierzy fenotypowych (PMs) to platforma o wysokiej przepustowości, która może dostarczyć informacji o profilowaniu metabolicznym mikroorganizmów heterotroficznych, jak również komórek hodowli tkankowej. W szczególności może być wykorzystany do wypełnienia luki w wiedzy na temat fenotypu i genotypu w mikroalgach, jak po raz pierwszy zgłoszono dla Chlamydomonas reinhardtii12, a następnie dla gatunku Chloroidium13 i Chlorella14. Badając reakcje komórek na tysiące metabolitów, cząsteczek sygnałowych, osmolitów i cząsteczek efektorowych, testy PM mogą zapewnić funkcjonalne profilowanie metaboliczne i zaoferować wgląd w funkcję, metabolizm i wrażliwość środowiskową15,16,17. W szczególności testy PM wykrywają wykorzystanie metabolitów w komórkach w 96-dołkowych mikropłytkach z różnymi składnikami odżywczymi, metabolitami lub osmolitami zawartymi w każdym dołku. Co więcej, możliwe jest również oznaczanie cząsteczek bioaktywnych, takich jak antybiotyki i hormony. Zgodnie z intensywnością produkcji koloru przez redukcję NADH barwnika redoks na bazie tetrazolium, metaboliczne wykorzystanie substratów jest oceniane pod kątem oddychania komórkowego15,16,17. Eksperymenty na 96-dołkowych mikropłytkach mogą być monitorowane i wyznaczane automatycznie w czasie za pomocą platformy phenotype microarray instrument (PMI). Dwadzieścia 96-dołkowych mikropłytek zostało zaprojektowanych tak, aby reprezentowały wspólny zestaw metabolitów do badania fenotypów komórkowych w celu wykorzystania źródeł węgla, azotu, siarki i fosforu, a także różnych efektów osmotycznych / jonowych i pH. Technologia PM została z powodzeniem wykorzystana do aktualizacji i unowocześnienia wielu istniejących modeli metabolicznych mikroorganizmów w skali genomu15,16,17,18.
Protokół i dane pokazane tutaj są oparte na wcześniej opublikowanych pracach Chaiboonchoe et al.12 Prezentowana praca szczegółowo opisuje wykorzystanie metody testu PM do scharakteryzowania fenotypów metabolicznych mikroalg i rozszerzenia istniejącego modelu metabolizmu glonów C. reinhardtii, jak również do kierowania rekonstrukcją nowych modeli metabolicznych.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>97062-796</td><td></td></tr><tr><td>Płytki testowe Biolog [ PM01-08]</td> <td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolog Omnilog Instrument</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczep Chlamydomonas reinhardtii CC-503</td><td>Chlamydomonas Resource Center na Uniwersytecie Minnesoty, USA.</td><td></td><td>Regenci University of Minnesota</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>VWR</td><td>0408-EU-10G</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik fioletu tetrazolowego " D"</td><td>Biolog, Hayward, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td><td>42010012-2</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Modele metaboliczne są rekonstruowane na podstawie dostępnych adnotacji genomu organizmu i dostarczają narzędzi predykcyjnych do badania procesów metabolicznych na poziomie systemu. Modele metaboliczne w skali genomu mogą zawierać luki, a także reakcje, które nie są zweryfikowane eksperymentalnie. Zrekonstruowane modele nowo wyizolowanych gatunków mikroglonów spowodują słabości wynikające z tych luk, ponieważ zwykle dostępnych jest niewiele dowodów biochemicznych na metabolizm takich izolatów. Technologia mikromacierzy fenotypowych (PM) jest skuteczną, wysokoprzepustową metodą, która funkcjonalnie określa komórkową aktywność metaboliczną w odpowiedzi na szeroki wachlarz metabolitów wejściowych. Połączenie wysokoprzepustowych testów fenotypowych z modelowaniem metabolicznym może umożliwić szybką rekonstrukcję lub optymalizację istniejących modeli sieci metabolicznych poprzez dostarczenie dowodów biochemicznych wspierających i rozszerzających dowody genomowe. Praca ta pokaże zastosowanie testów PM do badania mikroglonów na przykładzie modelu zielonej mikroglonów Chlamydomonas reinhardtii. Dowody eksperymentalne dla ponad 254 reakcji uzyskanych przez PM wykorzystano w tym badaniu w celu rozszerzenia i udoskonalenia modelu sieci metabolicznej C. reinhardtii w skali genomu, iRC1080, o około 25 procent. Stworzony tutaj protokół może być wykorzystany jako podstawa do funkcjonalnego profilowania metabolizmu innych mikroalg, w tym znanych mutantów mikroalg i nowych izolatów.

Ten protokół demonstruje użycie platformy technologicznej mikromacierzy fenotypowej (PM) do zdefiniowania wymagań metabolicznych Chlamydomonas reinhardtii, zielonej mikroalgi, i udoskonalenia istniejącego modelu sieci metabolicznej.

Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

Technologia mikromacierzy fenotypowych jest skuteczną metodą wysokoprzepustową, która funkcjonalnie określa komórkową aktywność metaboliczną w odpowiedzi na szeroki wachlarz metabolitów wejściowych. Wykorzystanie w tej technologii jest mierzone w postaci oddychania komórkowego określonego przez stopień rozwoju koloru wytwarzanego przez redukcję NADH barwnika redoks na bazie tetrazolium. W niniejszej pracy przedstawimy zastosowanie fenotypowych testów mikromatrycowych w kontekście mikroalg z wykorzystaniem gatunku modelowego Chlamydomonas reinhardtii.Celem tego badania jest ustalenie wiarygodnej metody charakteryzowania fenotypowania metabolicznego mikroglonów, która może być wykorzystana do rozszerzenia istniejących modeli sieci metabolicznej glonów lub pokierowania rekonstrukcją nowych modeli. Szczep Chlamydomonas reinhardtii CC-503 można uzyskać w centrum zasobów Chlamydomonas na University of Minnesota, USA. Hoduj komórki w świeżym pożywce z fosforanem tris-octanu do połowy fazy logarytmicznej.Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są w dobrym stanie i nie są zanieczyszczone. Obracaj kulturę przy sile 2000 G przez 10 minut. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.Przygotuj świeżą pożywkę z kranu zawierającą 0,1% barwnika fioletu tetrazolowego D"Dodaj do pożywki różne antybiotyki, w tym tymerynę, ampicylinę i kanamycynę, aby zahamować rozwój bakterii. Podłoże tłuszczowe i ten krok należy pominąć w odżywkach, w zależności od każdego rodzaju płytki. Ponownie zawiesić granulki i świeże media z kranu do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr.Użyj płytek do oznaczania związków chemicznych, takich jak źródła węgla, źródła azotu, płytki ze źródłami fosforu i siarki oraz źródła azotu peptydowego. Zaszczepić 100 mikrolitrów odpowiedniej pożywki samozawierającej się do każdej studzienki płytek esejowych. Upewnij się, że zduplikowałeś testy.Należy zauważyć, że na tym etapie komórki powinny być testowane za pomocą barwienia Gram-ujemnego przed i po teście w celu monitorowania zanieczyszczenia bakteryjnego. Włóż płytki do oznaczania obszaru związków chemicznych do systemu czytnika mikropłytek. Inkubuj wszystkie płytki w temperaturze 30 stopni przez okres do siedmiu dni i zaprogramuj system czytnika mikropłytek tak, aby odczytywał zmianę koloru barwnika co 15 minut.Ponieważ większość czytników mikropłytek nie zapewnia źródła ciągłego światła podczas inkubacji, glony powinny być w stanie przeprowadzić oddychanie heterotroficzne. Eksportuj surowe dane kinetyczne z czytnika mikropłytek jako pliki CSV, które następnie zostaną wykorzystane jako dane wejściowe do pakietu oprogramowania do mikromacierzy fenotypowych i naszego oprogramowania. Aby przeprowadzić analizę danych mikromacierzy fenotypowej, należy użyć pakietu oprogramowania OmniLog micro Erik OPM, który działa w środowisku oprogramowania R.W R studio, graficznym interfejsie użytkownika dla języka R, zainstaluj pakiet OPM i jego zależności przy użyciu poleceń wyszczególnionych w manuskrypcie. Przejdź do katalogu zawierającego pliki CSV z danymi kinetycznymi i zaimportuj dane za pomocą funkcji odczytu OPM. Dane kinetyczne mogą być agregowane i dyskretyzowane za pomocą estymacji parametrów pref.Korzystanie z funkcji wykresu XY umożliwia odwzorowanie pomiarów oddychania lub wzrostu w funkcji czasu dla 96-dołkowych płytek testowych. Dane można wizualizować jako mapę cieplną przy użyciu wykresu poziomu funkcji, aby umożliwić szybki przegląd porównawczy danych kinetycznych. Kolejnym krokiem jest identyfikacja reakcji i genów związanych z nowymi metabolitami.W przypadku istnienia istniejącego modelu glonów, analiza danych z systemu mikromacierzy fenotypowych może być wykorzystana do udoskonalenia tego modelu. Poniżej przedstawiamy potok, który wykorzystaliśmy do udoskonalenia sieci metabolicznej w skali genomu dla modelu Chlamydomonas przy użyciu danych z mikromacierzy fenotypu. Gdy nowy związek jest pozytywny pod kątem użycia, odpowiednie profile reakcji związku są definiowane przy użyciu bazy wiedzy metabolicznej, podając powiązane numery prowizji enzymów.Pierwszym krokiem jest przeszukanie Kegga i MetaCyca w celu zidentyfikowania numerów komisji enzymatycznych, EC, dla reakcji z wykorzystaniem metabolizowanych znalezionych w układach związków chemicznych. Następnie używamy zidentyfikowanych numerów EC jako podstawy wyszukiwania w wielu dostępnych zasobach adnotacji glonów, takich jak Joint Genome Institute, JGI, Phytozome i recenzowane publikacje. Reakcje i metabolity są dodawane do opartego na COBRA modelu sieci metabolicznej Chlamydomonas reinhardtii, iRC1080, w celu rozszerzenia i udoskonalenia modelu.Jeśli nie zostaną znalezione dowody genetyczne na poparcie numeru EC, można przeprowadzić wyszukiwanie oparte na profilu, takie jak NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, w celu zidentyfikowania genów kandydujących związanych z reakcją. Wyniki są następnie oceniane ręcznie. Osoby, które przeszły ten krok kontroli jakości z wartościami E mniejszymi niż 0,05 dla istotności dla wyszukiwania numerów EC, są następnie dodawane do modelu metrycznego.Ostatnim krokiem tego protokołu jest dopracowanie modelu, ocena i porównanie modeli. Skorzystaj z najnowszego zestawu narzędzi COBRA w wersji 3.0 i platformy MATLAB, aby wykonać kroki w celu udoskonalenia modelu. Po zainstalowaniu zestawu narzędzi Cobra możesz pobrać model iRC1080.Następnie w MATLAB pierwszą rzeczą do zrobienia jest przejście do folderu zawierającego model referencyjny, iRC1080. Dodaj zidentyfikowane reakcje wraz z powiązanymi z nimi genami do modelu metabolicznego, takiego jak iRC1080, za pomocą funkcji zestawu narzędzi Cobra. Dodaj reakcję i zmień asocjację genów.Przejdź do katalogu zawierającego model iRC1080 i wykonaj polecenia, aby załadować model. Zmień jego nazwę i dodaj nową reakcję i związany z nią gen. W niektórych przypadkach, gdy metabolit nie jest wytwarzany wewnątrzkomórkowo, ale jest pobierany z pożywki, reakcje transportu nowych metabolitów muszą zostać dodane do modelu za pomocą funkcji reakcji dodawania/wymiany w celu wprowadzenia lub wyprowadzenia metabolitu do pożywki zewnątrzkomórkowej.Przetestuj zachowanie nowego wyniku i modelu, na przykład iBD1106, przeprowadzając analizę bilansu strumienia, FBA, wykorzystując funkcję optymalizacji modelu CB w jasnych i ciemnych warunkach w celu maksymalizacji biomasy jako funkcji obiektu. Rozwiązanie FBA generuje między innymi trzy wektory: strumienie reakcji, ceny cienia metabolitów i obniżone koszty reakcji. W tym miejscu przedstawiono przykład, w którym model iRC1080 jest porównywany z jego udoskonaloną wersją, iBD1106, poprzez uzyskanie cen równoległych, które reprezentują wrażliwość obiektywnej funkcji biomasy na zmiany i metabolity uwzględniane w każdym modelu.Tutaj pokazujemy wykresy XY oddychania i wykresy poziomu źródeł węgla i płytek do oznaczania źródeł azotu dla ślepej próby i CC-503 odpowiednio w kolorze turkusowym i fioletowym. W każdym dołku krzywe oddychania reprezentują konwersję barwnika przez redukcję w funkcji czasu. Podświetlony pik w panelu A reprezentuje wykrycie octanu jako jedynego źródła węgla z tej płytki, co jest zgodne z literaturą dotyczącą Chlamydomonas.Porównanie liczby metabolitów zidentyfikowanych przy użyciu trzech różnych metod: iRC1080, który jest dobrze dobranym modelem metabolicznym Chlamydomonas, czasu przelotu chromatografii gazowej GC-TOF oraz eseju o mikromacierzy fenotypowej pokazuje, że tylko sześć metabolitów nakłada się na siebie między trzema zestawami, podczas gdy 149 było wspólnych dla iRC1080 i zestawu testów mikromacierzy fenotypowych. Pokazuje to, że chociaż każda technologia ma mocne strony w badaniach nad profilowaniem metabolicznym, zestaw testów mikromacierzy fenotypowych może być znaczącym źródłem nowych informacji metabolicznych. Uzyskane informacje posłużyły do rozbudowy i udoskonalenia modelu sieci metabolicznej iRC1080.W tym miejscu porównujemy zawartość modelu iRC1080 i rozszerzonego modelu iBD1106, w tym liczbę reakcji, liczbę metabolitów i liczbę genów. Pokazujemy, że nasze udoskonalenie modelu dodało ponad 254 reakcje do nowej sieci wynikowej. Reakcje te dzielą się na aminokwasy, dipeptydy, tripeptydy i reakcje transportu.Nowo zidentyfikowane metabolity wykorzystano do rozbudowy sieci metabolicznej i udoskonalenia istniejącego modelu metabolicznego Chlamydomonas reinhardtii. Testy mikromacierzy fenotypowych mogą być wykorzystywane do charakteryzowania fenotypów metabolicznych istniejących i nowo wyizolowanych szczepów. Ponadto protokół, który zastosowaliśmy w kontekście mikroalg, może pomóc w udoskonaleniu modeli metabolicznych innych gatunków.

high-throughput-metabolic-profiling-for-model-refinements

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach na podstawie mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji oraz kwantyfikacji i identyfikacji kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej. Wewnętrzny wzorzec tripentadekaniny służy do kompensacji ewentualnych strat podczas ekstrakcji i niepełnej transestryfikacji.

Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

Integracja hodowli mikroalg z przemysłowymi gazami spalinowymi ostatecznie wprowadzi metale ciężkie i inne związki nieorganiczne do podłoża wzrostowego. W pracy przedstawiono procedurę zastosowaną do określenia końcowego losu i wpływu metali ciężkich i zanieczyszczeń nieorganicznych na wzrost Nannochloropsis salina hodowanych w fotobioreaktorach.

Kwantyfikacja metali ciężkich i innych zanieczyszczeń nieorganicznych na produktywność mikroglonów

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Dwuwymiarowa metoda chromatografii gazowej z czasem przelotu jest opisana do charakterystyki wodnej frakcji bioropy powstałej w wyniku hydrotermalnego upłynniania glonów. Protokół ten może być również stosowany do analizy frakcji wodnej produktów ciekłych z szybkiej pirolizy, szybkiej pirolizy katalitycznej, katalitycznego odtleniania i hydrorafinacji.

Charakterystyka jakościowa frakcji wodnej z hydrotermalnego skraplania glonów przy użyciu chromatografii gazowej 2D ze spektrometrią mas czasu przelotu

Ten artykuł opisuje proces montażu i działania laboratoryjnego bioreaktora fotosyntetycznego, który może być użyty, w połączeniu z innymi metodami, do oszacowania odpowiednich parametrów wzrostu kinetycznego. System ten stale monitoruje pH, światło i temperaturę za pomocą czujników, jednostki akwizycji i sterowania danymi oraz oprogramowania do akwizycji danych typu open source.

Budowa i konfiguracja laboratoryjnego bioreaktora fotosyntetycznego glonów z monitorowaniem temperatury, światła i pH do testów wzrostu kinetycznego

Tutaj prezentujemy protokół budowy fotobioreaktorów z bąbelkowymi kolumnami na skalę laboratoryjną i wykorzystania ich do hodowli mikroalg. Dostarcza również metody określania tempa wzrostu kultury i neutralnej zawartości lipidów.

Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów

Analiza wielu biomolekuł w całym systemie jest kluczowa dla uzyskania funkcjonalnego i mechanistycznego wglądu w procesy biologiczne. W niniejszym opisano obszerny protokół wysokoprzepustowej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki pobranej z zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas.

Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

Uprawa akseniczna na skalę laboratoryjną ułatwia charakterystykę mikroglonów i optymalizację produktywności przed kolejnym zwiększeniem skali procesu. Fotobioreaktory zapewniają niezbędną kontrolę dla wiarygodnych i powtarzalnych eksperymentów z mikroalgami i mogą być przystosowane do bezpiecznej hodowli mikroalg z gazami korozyjnymi (CO2, SO2, NO2) z emisji ze spalania komunalnego lub przemysłowego.

Uprawa mikroalg i kwantyfikacja biomasy w fotobioreaktorze laboratoryjnym z korozyjnymi gazami spalinowymi

Opisano protokół wykorzystania dwutlenku węgla z gazów spalinowych elektrowni na gaz ziemny do hodowli mikroalg w otwartych stawach torowych. Wtryskiwanie spalin jest kontrolowane za pomocą czujnika pH, a wzrost mikroalg jest monitorowany za pomocą pomiarów gęstości optycznej w czasie rzeczywistym.

Sprzężenie wychwytywania dwutlenku węgla z elektrowni z półautomatycznymi otwartymi stawami torowymi do uprawy mikroalg

Ta publikacja opisuje projekt laboratoryjnych fotobioreaktorów (PBR) z konfigurowalnymi reżimami oświetlenia. Wzrost sinic lub mikroalg, wykorzystujących wodorowęglan jako źródło węgla, jest stale monitorowany poprzez pomiar objętościowej produkcji tlenu. Te PBR ułatwiają szybkie, powtarzalne porównania wzrostu laboratoryjnego przy niewielkiej interwencji użytkownika podczas eksperymentów.

Obsługa fotobioreaktorów laboratoryjnych z pomiarami wzrostu online i konfigurowalnymi reżimami oświetlenia

Poznaj technologię mikromacierzy fenotypowych do profilowania metabolicznego Chlamydomonas reinhardtii. Ta metoda umożliwia udoskonalanie modeli sieci metabolicznych mikroalg poprzez identyfikację nowych reakcji enzymatycznych.

Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg

Przeglądaj więcej filmów