Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

Badania systemowe mają kluczowe znaczenie dla dogłębnego zrozumienia funkcji biologicznych. Jednak dla różnych platform omicznych wymaganych jest wiele niezależnych próbek, co wprowadza dużą zmienność do danych. Metoda ta oferuje solidną i wysokoprzepustową strategię jednoczesnej ekstrakcji chlorofilu, lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki modelowej zielonej algi, Chlamydomonas reinhardtii.

W celu ekstrakcji chlorofilu, lipidów i metabolitów ułóż probówki z zebranymi granulkami komórek Chlamydomonas w ciekłym azocie. Ponownie zawiesić osad w każdej probówce za pomocą jednego mililitra bufora ekstrakcyjnego o temperaturze 20 stopni. Aby uniknąć parowania buforu ekstrakcyjnego o niskiej lepkości, należy szybko wirować probówki, aż komórki będą dobrze homogenizowane w mieszaninie ekstrakcyjnej i podzielić roztwór na dwie mililitrowe probówki do mikrowirówek.

Sonikować kultury w kąpieli sonizacyjnej w lodowatej wodzie przez 10 minut przed inkubacją na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 1000 obrotów na minutę przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 650 mikrolitrów drugiego buforu ekstrakcyjnego i krótko zawirować próbki przed odwirowaniem. Aby podzielić frakcje, przenieś 500 mikrolitrów górnej fazy lipidowej MTBE do znakowanej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć fazę lipidową i przenieś 650 mikrolitrów dolnej polarnej i półpolarnej fazy metabolitu do nowych znakowanych probówek. Zassać nadmiar objętości, aby usunąć pozostałą dolną fazę i zamrozić stałe granulki w ciekłym azocie do przechowywania w 80 stopniach. W celu oznaczenia metabolitów polarnych należy ponownie zawiesić wysuszony osad fazy polarnej w roztworze pirydyny chlorowodorku metoksyaminy w celu metoksymizacji grup karbonylowych i podgrzewać próbki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut.

Pod koniec inkubacji pochodną próbek za pomocą n-metylo-n-trifluoracetamidu przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza zgodnie ze standardowymi protokołami. Do analizy metabolitów pierwotnych należy użyć chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas czasu przelotu. W celu oznaczania metabolitów niepolarnych, ponownie zawiesić wysuszony osad fazy niepolarnej w mieszaninie od siedmiu do trzech objętości acetonitrylu do izopropanolu i osadzać granulki przez odwirowanie.

Następnie oddzielić próbki na kolumnie C8 z odwróconymi fazami w systemie ultrasprawnej chromatografii cieczowej. W celu oznaczenia zawartości chlorofilu należy zmieszać 100 mikrolitrów fazy MTBE z 900 mikrolitrami 90% metanolu do ślepej próby metody, jak również próbek eksperymentalnych. Następnie zmierz absorbancję na spektrofotometrze przy długościach fal 655 i 652 nanometrów, aby odróżnić chlorofil a od chlorofilu b i oblicz zawartość chlorofilu a i b oraz całkowitą zawartość chlorofilu.

W celu ekstrakcji białek rozpuść osad dolnej fazy w 200 mikrolitrach buforu białkowego i inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę i przenieść supernatant zawierający białko do nowej probówki. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda.

Aby strawić białko, należy zredukować 15 mikrogramów próbki w pięciu milimolowych ditiotreitolach przez 30 minut, a następnie alkilować 10-milimolowym jodoacetamidem przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec alkilowania wymieszaj roztwór trypsyny/Lys-C w stosunku 25 do jednego białka do proteazy i inkubuj próbkę przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć próbkę sześciokrotnie w 50-milimolowym tris Hcl do całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka zakończyć trawienie kwasem trifluorooctowym do końcowego stężenia 0,5 do 1%Po mineralizacji stężyć próbki do prawie sucha, pozostawiając od dwóch do pięciu mikrolitrów roztworu w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania. Ponownie zawiesić próbkę w buforze ładowania. Analizować mieszaniny peptydów za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości połączonego z systemem nano ultraciśnieniowej chromatografii cieczowej.

Aby oddzielić peptydy, załaduj cztery mikrolitry próbki na 20-centymetrową kolumnę hybrydową z odwróconą fazą o średnicy wewnętrznej 75 mikrometrów i wielkości cząstek 1,7 mikrometra. Używaj ustawień offline częściowej pętli z gradientem izokratycznym ustawionym na 3% bufora B, utrzymywanym przez 14 minut przed przesunięciem pętli do pozycji online z kolumną, po czym gradient będzie zwiększany liniowo przez 50 minut, aż do osiągnięcia 20% bufora B. Zmianę objętości komórek można zaobserwować, gdy komórki rosną w całej fazie światła, a następnie uwalniają komórki potomne, począwszy od końca fazy świetlnej po 10 godzinach.

Gdy wszystkie komórki potomne zostaną uwolnione, można zaobserwować zmianę objętości komórki, ponieważ nowo uwolnione komórki potomne są usuwane do rozpoczęcia następnego cyklu. Na podstawie analizy spektrometrii mas chromatografii gazowej frakcji polarnej, w tym reprezentatywnym eksperymencie oznaczono 65 metabolitów. Analiza spektrometrii mas fazy obojętnej zawierającej lipidy za pomocą chromatografii cieczowej doprowadziła do zidentyfikowania 204 różnych gatunków lipidów obejmujących różne klasy lipidów.

Analiza głównych składowych może być wykorzystana do wizualizacji globalnych zmian metabolitów i lipidów w całym cyklu komórkowym z oddzieleniem faz jasnych i ciemnych, a także faz półcyklicznych obserwowanych zarówno dla danych metabolomicznych, jak i lipidomicznych. W tym miejscu przedstawiono przegląd funkcjonalnego wzbogacenia 2 463 zidentyfikowanych wzbogaconych białek. Pozostały osad po ekstrakcji białka może być wykorzystany do powtarzalnego oznaczania ilościowego skrobi, na co wskazuje niskie odchylenie standardowe między różnymi kontrpróbami.

Ważne jest, aby unikać wysuszania górnej fazy organicznej chlorofilu, ponieważ może to wpływać na poziom chlorofilu w rozpuszczalniku, wpływając na współczynnik normalizacji próbek. W celu charakterystyki biochemicznej wyekstrahowanych gatunków molekularnych można zastosować różne procedury analityczne.