Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego
27 lutego 2021
Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.
Protokół ten umożliwia inokulację wektorów wirusowych bezpośrednio w roślinach kukurydzy, które można łatwo zastosować w większości warunków laboratoryjnych bez konieczności stosowania drogiego specjalistycznego sprzętu. Bezpośrednia inokulacja eliminuje użycie alternatywnego gospodarza jako źródła inokulum, oszczędzając zarówno czas, jak i zasoby. Metodę tę można zastosować do dodatkowych wektorów wirusowych, linii kukurydzy i potencjalnie innych gatunków roślin jednoliściennych.
Zacznij od posadzenia od 1 do 2 nasion kukurydzy w podłożu uprawowym na bazie torfu w małych wkładkach umieszczonych na tacach. Umieść tace w komorze wzrostowej w ciągu 16-godzinnych dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 8-godzinnych nocy w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza lub w szklarni w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza z 16-godzinnymi dniami i 8-godzinnymi nocami. Regularnie podlewaj rośliny i nawozić raz w tygodniu płynnym nawozem 15-5-15 o stężeniu 330 części na milion.
Przygotować agrobacterium do wstrzyknięcia, zaszczepiając antybiotykami szczep agrobacterium zawierający pożądany konstrukt wirusowy w pożywce LB. Następnie inkubować kolbę lub probówki w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 225 obr./min przez 24 godziny. Następnego dnia osadzać bakterie przez odwirowywanie w temperaturze 4 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
Następnie umyj granulat jednym mililitrem wody dejonizowanej. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 10-milimolowego roztworu siarczanu magnezu i zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Następnie dostosuj go do 1.0.
Do wstrzykiwania agrobacterium należy używać sadzonek kukurydzy w wieku od 4 do 7 dni. Zmontować strzykawkę i igłę. Delikatnie wstrzyknij zawiesinę bakteryjną 2-3 milimetry powyżej węzła koleoptylowego, aż wypełni ona koleoptyl lub będzie widoczna w okółku, w oczekiwaniu na etap wzrostu roślin.
Wstrzyknąć wszystkie sadzonki i zmienić strzykawkę i igły do wstrzykiwania każdego konstruktu. Potwierdź infekcję fenotypową, obserwując zmiany spowodowane wyciszeniem genów kontrolnych, zmiany naśladującej 22 lub desaturazy fitoenowej na liściach. Użyj urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego do szybkich badań przesiewowych roślin i mikroskopii fluorescencyjnej, aby wykryć obecność ekspresji GFP.
Wykonaj analizę ekspresji genów w celu molekularnego wykrywania infekcji. Ekstrahować całkowite RNA z liści zakażonych roślin od 14 do 21 dni po zakażeniu i zsyntetyzować pierwszą nić cDNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Wykonaj PCR z odwrotną transkryptazą, aby potwierdzić infekcję i określić integralność genu lub fragment genu będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu określonych starterów przeznaczonych dla różnych konstruktów wirusa.
Wizualizuj produkt PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym barwnik kwasu nukleinowego, aby określić obecność lub brak wirusa i genu lub fragmentu genu. Protokół ten został wykorzystany do wprowadzenia rekombinowanych wirusów zmodyfikowanych pod kątem genu do siewek kukurydzy. Około 12 dni po wstrzyknięciu zaobserwowano na liściach fenotypy wyciszające w postaci nekrozy i fotobielenia.
Obecność konstruktu w liściach po zakażeniu wykryto poprzez obserwację ekspresji białka zielonej fluorescencji pod wpływem fluorescencji przy użyciu innego filtra GFP. Ekspresję białka zielonej fluorescencji w liściach zakażonych wirusem mozaiki wyczyńca uwidoczniono jako małe punktowe obszary fluorescencji rozmieszczone na liściach oraz jako duże plamy na liściach zakażonych wirusem mozaiki trzciny cukrowej. Za pomocą analizy ekspresji genów potwierdzono systemowe zakażenie wirusem mozaiki wyczyńca oraz zaobserwowano wyciszenie lub supresję genów desaturazy fitoenu i zmiany naśladującej 22.
Zastosowany konstrukt wpłynął również na skuteczność infekcji. W przypadku zakażenia wirusem mozaiki wyczyńca, pusty wektor wirusa mozaiki wyczyńca i zmiana uszkodzenia wirusa mozaiki wyczyńca naśladująca 22 zazwyczaj miały najwyższą skuteczność infekcji na poziomie odpowiednio 53% i 54%. Wirus mozaiki wyczyńca ogona fitoenowy desaturazy przy nieco niższej skuteczności na poziomie 39% i wirus mozaiki wyczyńca ogona o zielonej fluorescencji przy najniższej skuteczności na poziomie 16% Tymczasem skuteczność infekcji wirusa mozaiki trzciny cukrowej białka zielonej fluorescencji wyniosła 8% Czas i objawy będą oparte na zastosowanym wektorze wirusowym i linii kukurydzy.
Brak wizualnego fenotypu nie musi oznaczać braku wyciszenia lub ekspresji. Metoda ta może być również zastosowana w technologiach edycji genów poprzez ulepszenie metod dostarczania przewodnikowych RNA.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół dostarczania rekombinowanych wektorów wirusowych do siewek kukurydzy za pomocą Agrobacterium. Metoda ta umożliwia bezpośrednią inokulację konstruktów wirusowych w badaniach nad wyciszaniem genów oraz ekspresją genów, eliminując potrzebę stosowania alternatywnych roślin gospodarzy i specjalistycznego sprzętu. Podejście to zostało zoptymalizowane dla wektorów wirusa mozaiki lisiej kukurydzy (FoMV) i wirusa mozaiki trzciny cukrowej (SCMV) i może być dostosowane do różnych genotypów kukurydzy oraz potencjalnie do innych gatunków jednoliściennych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Molekularna biologia roślin
- Wirusologia roślin
- Inżynieria genetyczna
Wstęp
- Metody oparte na Agrobacterium są powszechnie stosowane do wprowadzania DNA do tkanek roślinnych.
- Wektory wirusowe ułatwiają wyciszanie i ekspresję genów u roślin.
- Tradycyjna inokulacja często wymaga gospodarza alternatywnego jako źródła wirusa.
- Metody bezpośredniego dostarczania mogą oszczędzić czas i zasoby w badaniach genetycznych roślin.
Cel badania
- Opracowanie i optymalizacja protokołu bezpośredniego wprowadzania wektorów wirusowych do siewek kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium.
- Wykazanie skuteczności tej metody w wyciszaniu i ekspresji genów przy użyciu konstruktów FoMV i SCMV.
- Udostępnienie szeroko dostępnej techniki do badań nad molekularną budową roślin.
Zastosowane metody
- Wzrost siewek kukurydzy w kontrolowanych warunkach (komora wzrostowa lub szklarnia).
- Przygotowanie Agrobacterium tumefaciens GV3101 niosącego rekombinowane konstrukty wirusowe w pCAMBIA1380.
- Iniekcja zawiesiny bakteryjnej w pobliżu węzła koleoptilarnego 4–7 dniowych siewek kukurydzy.
- Obserwacja fenotypowa (mimikra nekrotyczna lesion mimic 22, wyciszenie desaturazy fitoyenu, ekspresja GFP) oraz potwierdzenie molekularne za pomocą RT-PCR i elektroforezy w żelu agarozowym.
Główne wyniki
- Skuteczna infekcja systemiczna i rozprzestrzenianie się wirusów rekombinowanych w siewkach kukurydzy.
- Obserwowalne fenotypy: nekroza i fotoblanking w przypadku wyciszania genów, fluorescencja GFP w przypadku ekspresji genów.
- Wydajność infekcji różniła się w zależności od konstruktu: pusty wektor FoMV i les22 (53–54%), FoMV pds (39%), FoMV GFP (16%), SCMV GFP (8%).
- Metoda RT-PCR potwierdziła obecność i integralność konstruktów wirusowych w zainfekowanych roślinach.
Wnioski
- Protokół umożliwia wydajne, bezpośrednie wprowadzanie wektorów wirusowych do kukurydzy bez użycia specjalistycznego sprzętu.
- Jest on skuteczny zarówno w badaniach nad wyciszaniem genów, jak i ekspresją genów w kukurydzy.
- Metoda ta jest możliwa do dostosowania do innych wektorów wirusowych, linii kukurydzy oraz potencjalnie innych jedliściennych i może ułatwiać zastosowania w edycji genów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy rekombinowanymi wektorami wirusowymi usprawnia analizę funkcji genów oraz walidację cech w roślinach jednoliścieńnych. Podejście to eliminuje konieczność stosowania gospodarzy alternatywnych i specjalistycznego sprzętu, co przyspiesza wczesne etapy odkryć i umożliwia szybką weryfikację hipotez w procesach biotechnologii roślin. Metoda ta wspiera skalowalne i powtarzalne schematy pracy w badaniach nad wyciszaniem i ekspresją genów, zwiększając pewność prognostyczną w walidacji celów i inżynierii cech.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybkie badania z zakresu genomiki funkcjonalnej poprzez bezpośrednią dostarczenie konstruktów wyciszających ekspresję genów lub indukujących ich ekspresję.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki obserwowalnym zmianom fenotypowym powiązanym ze specyficznymi genami docelowymi.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze cech i priorytetyzacji celów w celu poprawy jakości upraw.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy kukurydzy do dalszych badań przesiewowych w celu analizy funkcji genów lub ekspresji cech.
- Standaryzuje protokoły infekcji i ekspresji, poprawiając powtarzalność wyników dla różnych genotypów i konstruktów.
- Generuje dane ilościowe za pomocą RT-PCR i obrazowania fluorescencyjnego w celu wiarygodnej oceny konstruktów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie badań nad funkcjami genów z cechami istotnymi z punktu widzenia chorób lub ważnymi agrotechnicznie w uprawach roślin jedliściennych.
- Zapewnia ciągłość procesu od wczesnego etapu odkryć do przedklinicznej walidacji cech w rurociągach biotechnologii roślinnej.
- Dostarcza informacji o mechanizmach, które pozwalają na dostosowanie do ryzyka rozwoju modyfikowanych cech.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół bezpośredniej agroinokulacji wpisuje się w kontinuum od odkrycia do walidacji w zakresie inżynierii cech roślin i genomiki funkcjonalnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie bezpośredniego wyciszania genów lub ich ekspresji u kukurydzy.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych dotyczących infekcji i ekspresji w celu porównania konstruktów.
- Analityka: Wykorzystuje RT-PCR i odczyty fluorescencyjne do potwierdzenia obecności konstruktu oraz efektów funkcjonalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne badania nad funkcją genów z przedkliniczną walidacją cech w odpowiednich systemach upraw.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko dostępną, adaptowalną platformę dla różnorodnych wektorów wirusowych i genotypów roślin jedliściennych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje dostarczanie genów bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu lub alternatywnych gospodarzy.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz poprawia efektywność kapitałową w procesach rozwoju cech.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój inżynieryjnych cech lub celów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu molekularnej biologii roślin oraz transformacji za pośrednictwem Agrobacterium.
- Niezbędna jest podstawowa infrastruktura laboratoryjna do hodowli roślin, hodowli bakterii oraz analiz molekularnych.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów iniekcji i analiz pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych genotypów kukurydzy i potencjalnie innych gatunków jedliściennych po optymalizacji protokołu.
- Wydajność infekcji i widoczność fenotypu mogą różnić się w zależności od konstruktu i genotypu, co wymaga potwierdzenia molekularnego.
