Name: Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniej agroinokulacji siewek kukurydzy wirusami FoMV i SCMV do badań nad wyciszaniem i ekspresją genów. Protokół eliminuje potrzebę roślin pośrednich oraz specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uniwersytet Stanowy Iowa jest częścią zespołu wspierającego program DARPA Insect Allies HR0011-17-2-0053. Prace te były również wspierane przez Instytut Nauk o Roślinach Uniwersytetu Stanowego Iowa, Centrum Bioinżynierii Upraw Uniwersytetu Stanowego Iowa, projekt USDA NIFA Hatch numer 3808 oraz Fundusze Stanu Iowa. K.L.H. był również częściowo wspierany przez program szkoleniowy dla absolwentów Iowa State University Predictive Plant Phenomics finansowany przez National Science Foundation (DGE #1545453) oraz przez grant Agricultural and Food Research Initiative nr 2019-07318 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań i gromadzeniu, analizie i interpretacji danych oraz w pisaniu manuskryptu. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy fundatorów.
Dziękujemy Nickowi Lauterowi (USDA-ARS, Ames, IA) za nasiona kukurydzy w liniach wsobnych, Christianowi F. Montes-Sereyowi (Iowa State University) za stworzenie klonu FoMV-GFP oraz Tylerowi Austinowi (Iowa State University) za pomoc techniczną.

1. Budowa plazmidu
UWAGA: Ten protokół może być stosowany do innych wektorów wirusowych lub szczepów Agrobacterium, ale może to wpłynąć na ogólny sukces inokulacji przez agroiniekcję. Zawsze wykonuj etapy inokulacji bakteryjnej i posiewu w okapie z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Konstrukcja tłumiąca FoMV 
	UWAGA: Pożywka Luria-Bertani (LB) (Miller) jest używana do wszystkich pożywek, chyba że określono inaczej. Płynny LB wytwarza się przez zawieszenie 25 g granulek w 1 000 ml wody destylowanej i autoklawowanie na 15 minut w temperaturze 121 °C. Stałe podłoże LB jest podobnie wytwarzane z dodatkiem 1,5% agaru przed autoklawowaniem. Antybiotyki dodaje się po schłodzeniu LB do ~60 °C, a roztwór wlewa się do płytek Petriego o wymiarach 95 x 15 mm. Stężenia antybiotyków, które należy stosować, są następujące: ryfampicyna (rif) w stężeniu 25 μg/ml, gentamycyna (gentamycyna) w stężeniu 50 μg/ml i kanamycyna (kan) w stężeniu 50 μg/ml.
	<ol>
		<li>PCR amplifikuje fragmenty genu kukurydzy, który ma zostać wyciszony (np. les22 lub pds) za pomocą startera do przodu z miejscem restrykcji PacI i startera odwrotnego z miejscem restrykcji XbaI. Umożliwi to ligację fragmentów genu do MCS1* wektora binarnego FoMV-pCAMBIA1380 w orientacji antysensownej. 
		UWAGA: Skonfiguruj PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności, starterów do przodu i do tyłu po 10 μM każdy, plazmidowej matrycy DNA i wody, zgodnie ze specyfikacjami polimerazy DNA. Amplifikuj przez 35 cykli, stosując temperaturę wyżarzania zgodnie z temperaturą topnienia polimerazy DNA i startera (Tm) oraz wydłużenie 30 s na kilozasadę, która ma być amplifikowana.</li>
		<li>Wykonaj oczyszczanie PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie ze specyfikacją zestawu.</li>
		<li>Trawić oczyszczony produkt PCR i FoMV-EV za pomocą enzymów restrykcyjnych XbaI i PacI. Użyj 1 μg plazmidu lub całego oczyszczonego produktu PCR, 2 μl 10x buforu, 1 μl enzymu restrykcyjnego i dodaj wodę, aby uzyskać 20 μl końcowej objętości reakcji. Inkubować zgodnie ze specyfikacją enzymu.</li>
		<li>Związać strawiony produkt PCR i FoMV-EV wraz z ligazą DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przekształć ligowany plazmid w chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α za pomocą metody szoku cieplnego.
		<ol>
			<li>Rozmrozić komórki na lodzie i dodać 3 μl plazmidu do probówki. Inkubować na lodzie przez 30 minut, a następnie szokować cieplnie przez 30 s w temperaturze 42 °C.</li>
			<li>Umieścić na lodzie na 5 minut, dodać 200 μl super optymalnego bulionu z represją kataboliczną (SOC) i pozwolić komórkom E. coli odzyskać sprawność w pożywce SOC przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min.</li>
			<li>Płytkę umieścić na pożywce LB selektywnej dla kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sprawdź kolonie pod kątem dokładnych klonów za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu starterów FM-5840F i FM-6138R (Tabela uzupełniająca 1). Prześlij 250 ng plazmidowego DNA do placówki, która wykona sekwencjonowanie Sangera. Na potrzeby tego eksperymentu próbki zostały wysłane do Iowa State University DNA Core Facility.</li>
		<li>Zaszczepić 2 ml płynnego LB wybraną kolonią i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min. Ekstrakcja plazmidowego DNA z hodowli nocnej za pomocą preparatu plazmidowego DNA do lizy alkalicznej52.</li>
		<li>Przekształć plazmidowe DNA w komórki szczepu Agrobacterium GV3101 metodą zamrażania i rozmrażania. Pozostawić 100 μl chemicznie kompetentnych komórek do rozmrożenia na lodzie, dodać 1-5 μl plazmidu i inkubować na lodzie przez 30 minut. Umieścić w ciekłym azocie na 1 minutę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Dodać 1 ml SOC, pozostawić do odzyskania na 2-3 godziny w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem, rozlać płytkę na pożywce rif, gent i kan selective LB i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Przesiać kolonie na obecność insertu za pomocą colony PCR. Wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną i wymieszaj ją z 30 μl wody. Przygotuj reakcję PCR, dodając 12,5 μl głównej mieszanki polimerazy, 1,25 μl każdego 10 μM startera, FM-5840F i FM-6138R, 3 μl zawiesiny kolonii bakteryjnej i wodę do końcowej objętości 25 μl. Cykl 35 razy w temperaturze wyżarzania 64 °C i czasie przedłużenia 1 min (1 min na każdy amplifikowany kb).</li>
		<li>Zaszczepić 2-5 ml płynnego LB (rif, gent, kan) odpowiednią kolonią Agrobacterium. Pozostaw na noc do wyrośnięcia w temperaturze 28 °C, wstrząsając przy 225 obr./min.</li>
		<li>Wymieszaj nocną kulturę z 50% roztworem glicerolu w stosunku 1:1. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukcja wyrażenia FoMV
	<ol>
		<li>PCR wzmacnia interesującą sekwencję kodowania, w tym kodony start i stop (np. GFP), jak opisano w 1.1.1, dodając miejsce restrykcyjne Bsu36I na starterze do przodu i miejsce restrykcyjne PspOMI na starterze odwrotnym, aby umożliwić klonowanie kierunkowe w orientacji sensownej do MCS2.</li>
		<li>Wykonaj oczyszczanie PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie ze specyfikacją zestawu.</li>
		<li>Trawić produkt PCR i FoMV-EV za pomocą enzymów restrykcyjnych Bsu36I i PspOMI, jak opisano w 1.1.3.</li>
		<li>Związać strawiony produkt PCR i FoMV-EV wraz z ligazą DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przekształcić w DH5α chemicznie kompetentne komórki E. coli przy użyciu metody szoku cieplnego, jak opisano w 1.1.5. Płytkę umieścić na pożywce LB selektywnej dla kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Sprawdź kolonie pod kątem dokładnych klonów za pomocą sekwencjonowania Sangera, jak opisano w 1.1.6, przy użyciu starterów 5AmuS2 i 5AmuA2 (Tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Zaszczepić 2 ml płynnego LB wybraną kolonią i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 225 obr./min. Ekstrakcja plazmidowego DNA z hodowli nocnej za pomocą preparatu plazmidowego DNA do lizy alkalicznej52.</li>
		<li>Przekształć plazmidowe DNA w chemicznie kompetentne komórki szczepu Agrobacterium GV3101 za pomocą metody zamrażania i rozmrażania, jak opisano w 1.1.8. Płytkę na pożywkach selektywnych LB rif, gent i kan i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Przesiać kolonie na obecność insercji za pomocą PCR kolonii przy użyciu starterów 5AmuS2 i 5AmuA2.</li>
		<li>Zaszczepić 2-5 ml płynnego LB (rif, gent, kan) odpowiednią kolonią Agrobacterium. Wstrząsać przez noc z prędkością 225 obr./min w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Wymieszaj nocną kulturę z 50% roztworem glicerolu w stosunku 1:1. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukcja wyrażenia SCMV
	<ol>
		<li>PCR amplifikuje gen będący przedmiotem zainteresowania (np. GFP) z wyłączeniem kodonu stop, jak opisano w 1.1.1, w tym miejsce trawienia PspOMI na starterze do przodu i miejsce trawienia SbfI na starterze odwrotnym, aby umożliwić kierunkowe klonowanie do wektora binarnego SCMV-pCAMBIA1380. 
		UWAGA: Insert musi być sklonowany w ramce z poliproteiną wirusa.</li>
		<li>Wykonaj oczyszczanie PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie ze specyfikacją zestawu.</li>
		<li>Trawić produkt PCR i SCMV-EV za pomocą enzymów restrykcyjnych PspOMI i SbfI, jak opisano w ppkt 1.1.3.</li>
		<li>Liżować strawiony produkt PCR i SCMV-EV wraz z ligazą DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przekształcić produkt w chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α przy użyciu metody szoku cieplnego, jak opisano w ppkt 1.1.5. Płytkę umieścić na pożywce kan selective LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Badanie przesiewowe kolonii w celu uzyskania dokładnych klonów za pomocą sekwencjonowania Sangera, jak opisano w 1.1.6 przy użyciu starterów SC-745F i HCProR1 (Tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Zaszczepić 2 ml płynnego LB wybraną kolonią i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min. Wyekstrahuj plazmidowe DNA z nocnej hodowli za pomocą preparatu DNA plazmidu do lizy alkalicznej52.</li>
		<li>Przekształć plazmidowe DNA w chemicznie kompetentne komórki szczepu Agrobacterium GV3101 przy użyciu metody zamrażania i rozmrażania, jak opisano w 1.1.8. Płytkę na pożywkach selektywnych LB rif, gent i kan i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Przesiać kolonie na obecność insertu z colony PCR ze starterami SC-745F i HCProR1, jak opisano w 1.1.9.</li>
		<li>Zaszczepić 2-5 ml płynnego LB (rif, gent, kan) odpowiednią kolonią Agrobacterium. Wstrząsać przez noc z prędkością 225 obr./min w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Wymieszaj nocną kulturę z 50% roztworem glicerolu w stosunku 1:1. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie sadzonek
<ol>
	<li>Posadź 1-2 nasiona kukurydzy (kukurydza cukrowa 'Golden Bantam', FR1064, B73 itp.) w podłożu uprawowym na bazie torfu w małych wkładkach umieszczonych w tacach na 4-7 dni przed wstrzyknięciem. Umieścić w komorze wzrostowej w ciągu 16 godzin dni w temperaturze 25 °C i 8 godzin nocy w temperaturze 22 °C (~185 promieniowania aktywnego fotosyntetycznie (PAR)) lub w szklarni poniżej 16 godzin dni w temperaturze 22-25 °C i 8 godzin nocy w temperaturze 22-25 °C (350-400 PAR). 
	UWAGA: Podatność na Agrobacterium różni się w zależności od genotypu kukurydzy, wpływając na wskaźniki sukcesu. Ponadto niektóre wektory wirusowe mogą być niezgodne z niektórymi genotypami kukurydzy.</li>
	<li>Podlewaj regularnie i nawozić raz w tygodniu płynnym nawozem 15-5-15 w ilości 330 części na milion (PPM).</li>
</ol>
3. Przygotowanie Agrobacterium
<ol>
	<li>Na dzień przed wstrzyknięciem należy przygotować płynną pożywkę LB z odpowiednim antybiotykiem (rif, gent, kan) i zaszczepić szczepem Agrobacterium przenoszącym pożądany konstrukt wirusowy. Zaleca się dodanie 20 μl bulionu glicerolu do 50 ml LB, który powinien dać wystarczającą ilość kultury bakteryjnej do zaszczepienia >100 roślin i może być skalowany w górę lub w dół w zależności od potrzeb. 
	UWAGA: Przygotuj wystarczającą ilość inokulum, aby uzyskać końcową ilość zawiesiny bakteryjnej co najmniej 1 ml przy gęstości optycznej 600 nm (OD>600) 1,0 na każde 4-5 roślin.</li>
	<li>Wytrząsać przy 225 obr./min w temperaturze 28 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Bakterie osadkowe przez 10 minut w 4 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dokładnie umyć granulki 1 ml wody dejonizowanej (DI), pipetując lub delikatnie wirując.</li>
	<li>Powtórz krok 3.3, aby osadzać bakterie.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml 10 mM roztworuMgSO4 przez pipetowanie lub delikatne wirowanie.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie dodać 200 μM acetosyringonu do roztworu. Chociaż powszechnie stosowany, acetosyringon zwiększa jedynie zdolność transformacyjną niektórych szczepów Agrobacterium. Autorzy nie stwierdzili, aby dodanie acetosyringonu wpływało na skuteczność tego protokołu (Tabela uzupełniająca 2). 
		UWAGA: 10 mM roztwórMgSO4 można przygotować z 1 M roztworu podstawowego o pH 6,3 przechowywanego w temperaturze pokojowej. Roztwór prawdopodobnie nie będzie wymagał regulacji pH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierzyć OD600 próbki za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć do 1,0 OD600 roztworem 10 mM MgSO4. 
	UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania. Zawiesina bakteryjna może być przechowywana w temperaturze pokojowej do 5 godzin przed wstrzyknięciem.</li>
</ol>
4. Wtrysk
UWAGA: Siewki kukurydzy w wieku od 4 do 7 dni mogą być używane do iniekcji. Na tempo wzrostu sadzonek duży wpływ mają między innymi warunki wzrostu, ilość PAR (tj. wyższy PAR w szklarni niż w komorze wzrostowej) oraz genotyp, który może być trudny do kontrolowania w warunkach szklarniowych. Rośliny można wstrzykiwać już w wieku 4 dni, gdy mają 2-3 cm wysokości bez rozwiniętych liści i mają nawet 7 dni, gdy rozszerza się najniższy liść o zaokrąglonym końcu. Wskaźnik sukcesu tej metody inokulacji gwałtownie spada, gdy rośliny starzeją się powyżej 7 dni po siewie. Miejsce wstrzyknięcia jest takie samo bez względu na wiek sadzonek.
<ol>
	<li>Zakładając okulary ochronne, wstrzyknij zawiesinę bakteryjną do sadzonek 2-3 mm powyżej węzła chrzęstnego za pomocą igły 25G x 5/8" przymocowanej do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Węzeł chrząstek pokoleniowy to miejsce, w którym ostatecznie uformują się korzenie korony. Jest to najniższy węzeł w zakładzie. Zazwyczaj następuje zmiana koloru z zielonego na biały w węźle i poniżej niego. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się tuż nad merystemem. Wypreparowanie kilku sadzonek na tym etapie może pomóc w wizualizacji lokalizacji merystemu, a co za tym idzie, prawidłowego miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Delikatnie uciskać strzykawkę, aż zawiesina wypełni chrząszcz lub stanie się widoczna w okółku, w zależności od etapu wzrostu roślin. Jest to około 100-200 μl zawiesiny. 
	UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie zawiesiny do sadzonki jest trudne, miejsce wstrzyknięcia może być zbyt niskie. Umiarkowane ciśnienie to wszystko, co powinno być potrzebne do wstrzyknięcia zawiesiny.</li>
	<li>Wstrzyknąć wszystkie sadzonki, zmieniając strzykawki i igły dla każdego konstruktu.</li>
</ol>
5. Ciągła pielęgnacja roślin
<ol>
	<li>Przeszczep wstrzyknięte sadzonki do doniczek o wymiarach 13 x 13 x 15 cm lub większych, gdy mają 7-8 dni.</li>
	<li>Utrzymuj warunki wzrostu (16 h fotoperiod i nawożenie raz w tygodniu).</li>
</ol>
6. Potwierdzenie zakażenia (Fenotypowo i RT-PCR)
<ol>
	<li>Fenotypowo oceniają rośliny w zakresie 14-21 DPI. Zmiany spowodowane wyciszeniem genów kontrolnych, zmiany naśladujące 22 lub desaturazy fitoenowej można łatwo zauważyć na liściach i różnią się one od objawów FoMV. Ekspresję GFP można wykryć za pomocą obrazowania mikroskopem fluorescencyjnym lub innym obrazowaniem światłem UV. 
	UWAGA: Niektóre konstrukty/wektory wirusowe mogą potrzebować więcej czasu, aby pokazać objawy lub mogą w ogóle nie wykazywać żadnych objawów. Warunki silnego oświetlenia znacznie zwiększają fenotypy spowodowane wyciszaniem zmiany naśladującej 22 i desaturazy fitoenowej. Zmiany chorobowe mogą być mniej widoczne lub nie występować, jeśli rośliny są utrzymywane w warunkach słabego oświetlenia, takich jak komora wzrostowa, jednak rzeczywisty wskaźnik infekcji określony za pomocą RT-PCR nie powinien być zakłócony (Tabela 1).</li>
	<li>Aby potwierdzić infekcję molekularną, należy pobrać próbkę liścia 6 o rozdzielczości 14-21 DPI i wyekstrahować całkowite RNA za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Wykorzystanie wyekstrahowanego RNA jako matrycy do generowania pierwszej nici cDNA.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj reakcję cDNA z maksymalnie 5 μg całkowitego RNA, 1 μl losowych starterów heksamerowych, 1 μl starterów oligo (dT)18, 1 μl dNTP, 1 μl odwrotnej transkryptazy i wodą, aby uzyskać końcową objętość 14,5 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając starterów przeznaczonych dla konstruktu wirusa i cDNA jako matrycy, należy przeprowadzić PCR na każdej próbce, aby potwierdzić infekcję wirusową i określić integralność genu lub fragmentu genu będącego przedmiotem zainteresowania, jak opisano w 1.1.1, z wyjątkiem redukcji cykli do 25 dla FoMV i 30 dla SCMV, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich.
	<ol>
		<li>W przypadku konstruktów wyciszających FoMV należy użyć starterów FM-5840F i FM-6138R w celu amplifikacji w poprzek MCS1*, który zawiera fragment genu kukurydzy. W przypadku konstruktów ekspresji FoMV użyj starterów 5AmuS2 i 5AmuA2 do amplifikacji w poprzek MCS2, który zawiera wstawiony gen.</li>
		<li>W przypadku konstruktów ekspresji SCMV użyj starterów SC745-F i HCProR1 do amplifikacji w poprzek MCS, który zawiera wstawiony gen (rysunek uzupełniający 3).</li>
		<li>W przypadku endogennego genu kontrolnego należy użyć starterów ZmActS i ZmActA, które amplifikują fragment mRNA aktyny kukurydzianej (GRMZM2G126010) lub starterów ZmUbiF i ZmUbiR, które amplifikują fragment mRNA poliubikwityny kukurydzianej (GRMZM2G409726_T01).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizuj produkt PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym barwnik kwasu nukleinowego, aby określić obecność lub brak wirusa i genu lub fragmentu genu.</li>
</ol>

Badacze nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Agrobacterium jest niezbędnym narzędziem, które ułatwia stosowanie wielu technik biologii molekularnej w badaniach związanych z roślinami. Badanie to dostarcza protokół agroiniekcji do inokulacji wektorów wirusowych FoMV i SCMV bezpośrednio w tkankach kukurydzy do zastosowań VIGS i VOX. Głównym celem jest zwiększenie łatwości i użyteczności technologii opartych na wirusach w badaniach nad roślinami jednoliściennymi. Chociaż w przypadku kilku wirusów odnotowano bezpośrednie agroinokulowanie kukurydzy, autorzy nie znają szczegółowego protokołu i nie ma przykładów zastosowań VIGS i VOX w tych badaniach19,22.
Doniesiono i potwierdzono podczas opracowywania tego protokołu, że miejsce wstrzyknięcia jest kluczowym czynnikiem skutecznego uruchomienia ogólnoustrojowej infekcji wirusowej za pomocą agroiniekcji19. Zakłada się, że konsekwentne wstrzykiwanie zalecanego miejsca na roślinie jest największą zmienną, ponieważ dokładne położenie merystemu w siewkach kukurydzy jest praktycznie niewykrywalne gołym okiem. Aby zminimalizować zmienność interpersonalną, zaleca się wypreparowanie kilku siewek kukurydzy aż do merystemu, aby lepiej zobrazować jej lokalizację (ryc. 3C). Położenie merystemu w stosunku do węzła chrząszczy powinno być mniej więcej takie samo dla roślin w wieku 4-7 dni. Dodatkowo, ćwiczenie wstrzykiwania barwioną cieczą zapewnia łatwo widoczną demonstrację, w jaki sposób "inokulum" wypełnia okółek liścia, a ponieważ miejsce wstrzyknięcia jest oznaczone barwnikiem, dokładność miejsca wstrzyknięcia może być potwierdzona (ryc. 3G, H). Tkanki merystematyczne są najbardziej podatne na agroiniekcję, ale wstrzykiwanie zawiesin Agrobacterium bezpośrednio do tej tkanki powoduje niepożądane efekty morfologiczne (ryc. 6)19. Rośliny z uszkodzonymi merystemami przeżywają, ale powstałe wady są niepożądane, dlatego należy unikać bezpośredniego wstrzykiwania tej tkanki.
Istnieje kilka zmiennych, które mogą mieć wpływ na pomyślne wprowadzenie ogólnoustrojowej infekcji wirusowej za pomocą agroiniekcji, ponieważ trzy złożone systemy biologiczne (roślina, wirus i szczep Agrobacterium ) muszą współdziałać w koordynacji. Ta złożona interakcja może być wspomagana przez szybko dzielące się komórki obszaru merystematycznego, co czyni go idealnym miejscem do agroinokulacji19. Szczep Agrobacterium musi być zdolny do infekowania komórek tkanek roślinnych w celu dostarczenia T-DNA przenoszącego genom wirusa, a roślina musi być podatna na wirusa, aby zainicjować replikację wirusa i infekcję ogólnoustrojową. Genotypy kukurydzy różnią się podatnością na wirusy (np. Mo17 jest odporny na FoMV) lub szczepy Agrobacterium , ale większość, które zostały przebadane, wydaje się być podatna zarówno na FoMV, jak i SCMV (Tabela 1 i Tabela 2)53. Na przykład linia wsobna FR1064 i odmiana kukurydzy cukrowej Golden Bantam mogą być szczególnie podatne zarówno na wektory GV3101 Agrobacterium , jak i na bazie FoMV.
Liczba liści, z których pobrano próbki, oraz czas pobierania próbek do RT-PCR mają kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny infekcji wirusowej. W pokazanych tutaj przykładach numer liścia został określony poprzez rozpoczęcie od pierwszego zaokrąglonego liścia (powszechnie znanego jako "liść kciuka") i liczenie w górę. Próbki liści pobierano po ich rozszerzeniu i rozpoczęciu pojawiania się następnego liścia. Jednak to, które liście są optymalne do pobierania próbek, może się różnić w zależności od użytego gatunku wirusa, warunków wzrostu i genotypu kukurydzy. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie wstępnego eksperymentu z przebiegiem czasowym przy stosowaniu tego protokołu do nowego systemu wirusowego w celu optymalizacji strategii pobierania próbek w odniesieniu do liści i czasu.
Zastosowana specyficzna konstrukcja znacząco wpływa na skuteczność tego protokołu. Na przykład puste wektory, FoMV-EV i SCMV-EV oraz FoMV-PDS i FoMV-LES22, które zawierają małe insercje (odpowiednio 313 pz i 329 pz), zazwyczaj wytwarzają najwyższy odsetek roślin z objawami wirusowymi w tych eksperymentach (tabele 1 i tabela 2). Jednak rekombinowane wirusy przenoszące większe insercje GFP ORF (720 pz) w FoMV-GFP i SCMV-GFP miały znacznie niższe wskaźniki infekcji w porównaniu z roślinami, którym wstrzyknięto pusty wektor lub konstrukty wyciszające geny. Tendencja ta może wynikać z negatywnego wpływu na sprawność wirusa spowodowanego rosnącą ilością egzogennego materiału genetycznego w genomie wirusa. Kilka badań wykazało, że stabilność wstawienia roślinnych wektorów wirusowych jest w dużej mierze zależna od wielkości i sekwencjiinsertów 36,54,55,56,57. Ponadto stwierdzono zauważalną różnicę w odsetku roślin, które zostają zainfekowane po zaszczepieniu pustym wektorem FoMV lub SCMV, co sugeruje, że potrzebne są dodatkowe prace w celu optymalizacji tego protokołu dla SCMV (Tabela 1). Wyniki te wskazują, że podczas opracowywania konstrukcji może być konieczne rozwiązywanie problemów, ponieważ sekwencja i długość fragmentu mogą wpływać na wydajność.
Ogólnie rzecz biorąc, badanie to wykazało, że agroiniekcja sadzonek kukurydzy jest skuteczną metodą inokulacji dwóch różnych wirusów roślinnych RNA, wielu konfiguracji wektorów i 11 genotypów kukurydzy. Ta praca z FoMV i SCMV, w połączeniu z wcześniejszymi pracami wykorzystującymi wstrzykiwanie wirusem chlorotycznej pstrości kukurydzy (MCMV) lub MSV, wskazuje, że agroiniekcja jest odpowiednia do inokulacji siewek kukurydzy zakaźnymi klonami wirusów zarówno RNA, jak i DNA 19,20,21,22. Ponadto praca ta pokazuje, że agroiniekcja jest opłacalną metodą dla wektorów VIGS i VOX i może być stosowana do roślin w wieku zaledwie czterech dni (tabela 3). Oczekuje się, że przedstawiony tutaj protokół zostanie łatwo zaadaptowany przez biologów zajmujących się kukurydzą, aby ułatwić badania w zakresie genomiki funkcjonalnej obejmującej przejściowe wyciszanie genów (VIGS) i nadekspresję (VOX). Agroiniekcja ma również zdolność do ułatwiania metod edycji genów opartych na wirusach (VEdGE), które w przeciwnym razie byłyby ograniczone przez zależność od transformacji roślin, potencjalnie poprawiając wydajność edycji, a także dostępność 58,59,60. Biorąc pod uwagę odpowiednie połączenie szczepu Agrobacterium, genotypów kukurydzy i wektorów wirusowych, oczekuje się, że inokulacja metodą agroiniekcji stanie się cennym narzędziem do analizy przejściowej funkcji genów w kukurydzy.

Zakaźne klony wielu wirusów roślinnych zostały zaprojektowane do indukowanego przez wirusa wyciszania genów (VIGS), nadekspresji genów (VOX), a ostatnio edycji genów za pomocą wirusa (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Wraz z opracowywaniem nowych konstruktów wirusowych należy również rozważyć metody skutecznego infekowania tkanek roślinnych tymi zmodyfikowanymi wirusami. Obecne metody wywoływania infekcji wirusowych w roślinach obejmują bombardowanie cząstkami, wcieranie transkryptów RNA in vitro lub klonów DNA, szczepienie nakłuciami naczyniowymi lub inokulację Agrobacterium tumefaciens (agroinokulacja)5,12,13,14,15,16,17. Każda z tych metod inokulacji ma swoje wady i zalety, do których należą koszty, zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt i wykonalność w ramach danego systemu wirusów roślinnych. Preferowane są metody wykorzystujące infiltrację lub wstrzyknięcie szczepów Agrobacterium zawierających binarne konstrukty T-DNA przeznaczone do dostarczania rekombinowanych wirusów, ponieważ są one proste i niedrogie. Brakuje jednak szczegółowych metod agroinokulacji gatunków jednoliściennych, takich jak Zea mays (kukurydza).
Jedno z pierwszych doniesień o agroinokulacji w celu dostarczania wirusa zostało opublikowane w 1986 roku, kiedy genom wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) został wstawiony do konstruktu T-DNA, a powstały Agrobacterium przenoszący ten konstrukt został wtarty w rośliny rzepy18. Od tego czasu opracowano dodatkowe metody agroinokulacji. Na przykład, w przypadku wirusa mozaiki wyczyńca (FoMV), Nicotiana benthamiana może być użyta jako żywiciel pośredni do generowania cząsteczek wirusa w liściach, które stanowią źródło inokulum6. Inokulacja kukurydzy metodą nacierania przy użyciu zakażonych liści N. benthamiana jest skuteczna, szybka i prosta, ale użycie żywiciela pośredniego nie działa w przypadku wszystkich wirusów infekujących kukurydzę. Na przykład wirus mozaiki trzciny cukrowej (SCMV) nie może zainfekować N. benthamiana, co wymaga użycia alternatywnych źródeł inokulum dla wektorów pochodzących z tego wirusa. W 1988 roku wirus DNA Agrobacterium zawierający wirusa smug kukurydzy (MSV), został wprowadzony do siewek kukurydzy przez iniekcję (agroiniekcję), co pokazuje, że metody inokulacji oparte na Agrobacterium są również przydatne dla roślin jednoliściennych19. Pomimo tego wczesnego sukcesu w agroiniekcji, opublikowano niewiele badań wykorzystujących tę technikę w kukurydzy, co pozostawia otwarte pytania dotyczące możliwości zastosowania tej metody w przypadku wirusów RNA i wektorów VIGS, VOX i VEdGE20,21,22. Jednak szerokie zastosowanie agroiniekcji w gatunkach jednoliściennych jest obiecujące, ponieważ to ogólne podejście zostało zastosowane w storczykach, ryżach i pszenicy23,24,25,26,27,28.
Ten protokół został zoptymalizowany dla FoMV i szczepu Agrobacterium GV3101 i został również zastosowany do wektora SCMV. FoMV to potexwirus o szerokim zakresie żywicieli, który obejmuje 56 gatunków jednoliściennych i dwuliściennych29. FoMV ma jednoniciowy genom RNA o dodatnim znaczeniu 6,2 kilozasady (kb), który koduje pięć różnych białek z pięciu otwartych ramek odczytu (ORF)30,31,32,33,34,35. FoMV został wcześniej opracowany zarówno jako wektor VIGS, jak i VOX dla kukurydzy poprzez włączenie zakaźnego klonu do szkieletu plazmidu T-DNA6,36,37. Genom wirusa został zmodyfikowany do zastosowań VIGS poprzez dodanie miejsca klonowania (MCS1*) bezpośrednio za białkiem płaszcza (CP) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) 36. W przypadku aplikacji VOX i VEdGE promotor CP został zduplikowany i dodano drugie miejsce klonowania (MCS2), aby umożliwić wstawianie interesujących sekwencji między ORF 4 a CP (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 1B) 6. Wektor FoMV zawierający zarówno MCS1, jak i MCS2 bez wstawień to pusty wektor FoMV (FoMV-EV) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
SCMV to niepowiązany wirus, który został opracowany dla VOX w kukurydzy38. Należy do rodziny Potyviridae, której kilka członków zostało zaprojektowanych do ekspresji obcych białek w planta39,40,41,42,43,44. Zakres żywicieli SCMV obejmuje kukurydzę, sorgo i trzcinę cukrową45,46, co czyni go cennym dla badań funkcjonalnych genów w tych głównych roślinach uprawnych36,38. SCMV ma dodatni sens, jednoniciowy genom RNA o długości około 10 kb47,48. Aby utworzyć wektor SCMV VOX, dobrze znane złącze P1/HCPro zostało wykorzystane jako miejsce insercji dla sekwencji heterologicznych38. Po tym miejscu klonowania następuje sekwencja kodująca miejsce rozszczepienia proteazy NIa-Pro, co prowadzi do produkcji białek niezależnych od poliproteiny SCMV (<silna klasa = "xfig" >Figura 1C).
Plazmidy T-DNA przenoszące zakaźne cDNA tych rekombinowanych wirusów zostały przekształcone w szczep Agrobacterium GV3101. GV3101 to szczep typu nopalinowego, który jest dobrze znany z tego, że jest w stanie przenosić T-DNA do gatunków jednoliściennych, w tym kukurydzy26,28,49. Dodatkowo, w poprzednich badaniach agroiniekcji wykorzystano szczepy C58 lub jego pochodną GV3101, a także19,20,22,27.
Trzy geny markerowe zostały użyte do opracowania tego protokołu: dwa do wyciszania genów i jeden do ekspresji genów. Fragment 329 par zasad (bp) z uszkodzenia genu kukurydzy naśladującego 22 (les22, GRMZM2G044074) wykorzystano do skonstruowania wektora wyciszającego FoMV-LES22. Kiedy les22 jest wyciszony w kukurydzy, wzdłuż unaczynienia liści pojawiają się małe, okrągłe plamy komórek nekrotycznych, które rozszerzają się i łączą w duże obszary nekrotycznej tkanki liścia50. FoMV-PDS, zawierający 313 pz fragmentu genu fitoenu desaturazy genu sorgo (PDS, LOC110436156, 96% identyczność sekwencji z PDS kukurydzy, GRMZM2G410515), indukuje wyciszenie PDS w kukurydzy, co skutkuje powstawaniem małych smug fotobielonych komórek wzdłuż układu naczyniowego liści, które wydłużają się z czasem51. Nienaruszona sekwencja kodująca białko zielonej fluorescencji (GFP) została wykorzystana do wykazania ekspresji białka zarówno dla FoMV (FoMV-GFP), jak i SCMV (SCMV-GFP). Ekspresja GFP w liściach jest zazwyczaj najbardziej wykrywalna po 14 dniach od inokulacji (DPI)6. Chociaż wcześniej przeprowadzono badania z wykorzystaniem agroiniekcji wektorów wirusowych w kukurydzy, eksperymenty te wykazały jedynie, że agroiniekcja może ułatwić infekcję wirusową z zakaźnego klonu w siewkach kukurydzy i nie rozprzestrzeniać się na rekombinowane wirusy przeznaczone do zastosowań VIGS lub VOX19,20,21,22. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na poprzednich metodach agroiniekcji, w szczególności Grismley et al.19. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda agroiniekcji jest kompatybilna z wektorami VIGS i VOX, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani alternatywnych gospodarzy jako źródeł inokulum oraz skraca całkowity czas i koszt wymagany do przygotowania i przeprowadzenia inokulacji w porównaniu z innymi powszechnymi metodami, które wymagają biolistyki lub transkrypcji in vitro. Protokół ten ułatwi badania genomiki funkcjonalnej w kukurydzy z zastosowaniami obejmującymi VIGS, VOX i VEdGE.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955450</td><td>alternatywnie, BD 309659</td></tr><tr><td>15 ml Falcon Tubes</td><td>Corning Science</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>1kb+ Ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10787018</td><td>Do oceny rozmiarów produktów PCR</td></tr><tr><td>Igły PrecisionGlide 25G x 5/8"</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>28&deg; C Inkubator</td><td></td><td></td><td>dla Agrobacterium</td></tr><tr><td>37&deg; C Inkubator</td><td></td><td></td><td>do E. coli</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>MilliporeSigma</td><td>D134406</td><td>Opcjonalny</td></tr><tr><td>agar</td><td>MilliporeSigma</td><td>A4800</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>GeneMate</td><td>E-3120</td><td>Do wytwarzania żeli sprawdzających stabilność wirusa/wkładki</td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens Szczep GV3101</td><td></td><td></td><td>Przenosi maszynerię transferu T-DNA kodującą plazmid vir, RifR, GmR, z magazynu laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Bsu36I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0524</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw cDNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1672</td><td>Maxima Zestaw do syntezy cDNA z pierwszej nici z chloroformem Dnazy</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>C298</td><td>do kuwet do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>miliporów</td><td>D-(+)-glukozySigma</td><td>G7528</td><td>Liza alkaliczna</td></tr><tr><td>DH5alpha Kompetentna E. Komórki em</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1422</td><td>Zestaw do szybkiej ligacji DNA</td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodiana)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td>Alkaliczny</td></tr> etanol <tr><td>do lizy</td><td></td><td></td><td></td> do ekstrakcji RNA</tr><tr><td>Nawóz</td><td></td><td></td><td>Peters Nawóz 15-15-15 Koncentrat</td></tr><tr><td>Płaskie wkładki</td><td>T.O. Plastics</td><td>715357C</td><td>Do kiełkowania nasion w tacach</td></tr><tr><td>Flats</td><td>T.O. Plastics</td><td>710245C</td><td>Do kiełkowania nasion w tacach</td></tr><tr><td>FluorCam</td><td>Photon Systemy Instrumenty</td><td></td><td>Do oceny roślin kukurydzy pod kątem ekspresji GFP przed mikroskopem</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Żel Elektroforeza Pudełko</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918</td><td></td></tr><tr><td>Octan lodowcowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38</td><td>Alkaliczna liza</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Do oszczędzania zamrożonych zapasów bakterii</td></tr><tr><td>Go-Taq, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>do roztworów pH</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Kanamycyna, Monosiarczan</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Duże garnki</td><td>Kordlok</td><td>SQL0550</td><td>5x5x4" lub większa.&nbsp; Do przesadzania sadzonek.</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Rosół, Miller</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu Siedmiowodny</td><td>Amresco</td><td>662</td><td></td></tr><tr><td>Kukurydza Golden Bantam Nasiona kukurydzy cukrowej</td><td>American Meadows, Zachodnie Wybrzeże Nasiona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kukurydzy Nasiona wsobne</td><td></td><td></td><td>Nasze nasiona pochodzą z naszej instytucji, ale jesteśmy <silni>nie </silni> w stanie zapewnić tego innym badaczom.</td></tr><tr><td>Maxima H Minus Odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific EP0753</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ</td><td>Elga</td><td></td><td>Purelab Ultra</td></tr><tr><td>Monarch PCR & Zestaw do czyszczenia DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>T1030</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td></td></tr><tr><td>Peters Excel 15-5-15 Nawóz</td><td>ICL Nawozy specjalistyczne</td><td>G99140</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego, 95 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P171Podkłady alkaliczne</td> do <td>lizy</td></tr><tr><td></td><td>Nasze startery zostały zsyntetyzowane przez nasz instytucjonalny ośrodek DNA lub za pośrednictwem IDT</td>PspOMI New England Biolabs R0653 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 Ryfampicyna EMD Millipore Corp 557303 Rnase A ThermoFisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>12091021</td><td>Alkaline Lysis</td></tr><tr><td>SbfI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0642</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td></td><td></td><td>Do ważenia chemikaliów do pożywek lub</td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>Alkaliczna liza</td></tr><tr><td>wodorotlenku sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>Alkaliczne</td></tr><tr><td>podłoże glebowe</td> do lizy <td>SunGro Horticulture</td><td>SS # 1-F1P</td><td>Sunshine Mix # 1 / Fafard-1P, wystarczy każda mieszanka gleby, w której kukurydza dobrze rośnie</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td>Do pomiaru OD600</td></tr><tr><td>Sybr Safe, 10 000X</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Do robienia żeli w celu sprawdzenia stabilności wirusa/wkładki</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td>do PCR</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154</td><td>Alkaliczna liza</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Papier wagowy Do</td><td></td><td></td><td>ważenia chemikaliów do pożywek lub</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Metody inokulacji oparte na Agrobacterium są szeroko stosowane do wprowadzania wektorów wirusowych do tkanek roślinnych. Badanie to szczegółowo opisuje protokół wstrzykiwania siewek kukurydzy w pobliżu tkanki merystematycznej z Agrobacterium przenoszącym wektor wirusowy. Do optymalizacji tej metody wykorzystano rekombinowane klony wirusa mozaiki wyczyńca (FoMV) zaprojektowane do wyciszania genów i ekspresji genów, a jej zastosowanie rozszerzono o rekombinowany wirus mozaiki trzciny cukrowej (SCMV) zmodyfikowany do ekspresji genów. Fragmenty genów lub sekwencje kodujące, które są przedmiotem zainteresowania, są wprowadzane do zmodyfikowanego, zakaźnego genomu wirusa, który został sklonowany do binarnego wektora plazmidowego T-DNA pCAMBIA1380. Powstałe w ten sposób konstrukty plazmidowe przekształcają się w szczep Agrobacterium tumefaciens GV3101. Siewki kukurydzy w wieku 4 dni można wstrzykiwać w pobliże węzła chrzęstnego z bakteriami zawieszonymi w roztworzeMgSO4. Podczas zakażenia Agrobacterium T-DNA niosące genom wirusa jest przenoszone do komórek kukurydzy, co pozwala na transkrypcję genomu wirusowego RNA. Gdy rekombinowany wirus replikuje się i rozprzestrzenia ogólnoustrojowo w roślinie, na liściach można zaobserwować objawy wirusowe i zmiany fenotypowe wynikające z wyciszenia genów docelowych, zmiany naśladującej 22 (les22) lub fitoen-desaturazy (PDS) lub ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) można wykryć po oświetleniu światłem UV lub mikroskopią fluorescencyjną. Aby jednocześnie wykryć wirusa i ocenić integralność wstawki, RNA jest ekstrahowane z liści wstrzykniętej rośliny, a RT-PCR przeprowadza się przy użyciu starterów flankujących miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) przenoszącego wstawioną sekwencję. Protokół ten został skutecznie zastosowany w kilku genotypach kukurydzy i może być łatwo rozszerzony na inne wektory wirusowe, oferując w ten sposób dostępne narzędzie do wprowadzania wektorów wirusowych do kukurydzy.

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Protokół ten umożliwia inokulację wektorów wirusowych bezpośrednio w roślinach kukurydzy, które można łatwo zastosować w większości warunków laboratoryjnych bez konieczności stosowania drogiego specjalistycznego sprzętu. Bezpośrednia inokulacja eliminuje użycie alternatywnego gospodarza jako źródła inokulum, oszczędzając zarówno czas, jak i zasoby. Metodę tę można zastosować do dodatkowych wektorów wirusowych, linii kukurydzy i potencjalnie innych gatunków roślin jednoliściennych.Zacznij od posadzenia od 1 do 2 nasion kukurydzy w podłożu uprawowym na bazie torfu w małych wkładkach umieszczonych na tacach. Umieść tace w komorze wzrostowej w ciągu 16-godzinnych dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 8-godzinnych nocy w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza lub w szklarni w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza z 16-godzinnymi dniami i 8-godzinnymi nocami. Regularnie podlewaj rośliny i nawozić raz w tygodniu płynnym nawozem 15-5-15 o stężeniu 330 części na milion.Przygotować agrobacterium do wstrzyknięcia, zaszczepiając antybiotykami szczep agrobacterium zawierający pożądany konstrukt wirusowy w pożywce LB. Następnie inkubować kolbę lub probówki w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 225 obr./min przez 24 godziny. Następnego dnia osadzać bakterie przez odwirowywanie w temperaturze 4 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.Następnie umyj granulat jednym mililitrem wody dejonizowanej. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 10-milimolowego roztworu siarczanu magnezu i zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Następnie dostosuj go do 1.0.Do wstrzykiwania agrobacterium należy używać sadzonek kukurydzy w wieku od 4 do 7 dni. Zmontować strzykawkę i igłę. Delikatnie wstrzyknij zawiesinę bakteryjną 2-3 milimetry powyżej węzła koleoptylowego, aż wypełni ona koleoptyl lub będzie widoczna w okółku, w oczekiwaniu na etap wzrostu roślin.Wstrzyknąć wszystkie sadzonki i zmienić strzykawkę i igły do wstrzykiwania każdego konstruktu. Potwierdź infekcję fenotypową, obserwując zmiany spowodowane wyciszeniem genów kontrolnych, zmiany naśladującej 22 lub desaturazy fitoenowej na liściach. Użyj urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego do szybkich badań przesiewowych roślin i mikroskopii fluorescencyjnej, aby wykryć obecność ekspresji GFP.Wykonaj analizę ekspresji genów w celu molekularnego wykrywania infekcji. Ekstrahować całkowite RNA z liści zakażonych roślin od 14 do 21 dni po zakażeniu i zsyntetyzować pierwszą nić cDNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Wykonaj PCR z odwrotną transkryptazą, aby potwierdzić infekcję i określić integralność genu lub fragment genu będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu określonych starterów przeznaczonych dla różnych konstruktów wirusa.Wizualizuj produkt PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym barwnik kwasu nukleinowego, aby określić obecność lub brak wirusa i genu lub fragmentu genu. Protokół ten został wykorzystany do wprowadzenia rekombinowanych wirusów zmodyfikowanych pod kątem genu do siewek kukurydzy. Około 12 dni po wstrzyknięciu zaobserwowano na liściach fenotypy wyciszające w postaci nekrozy i fotobielenia.Obecność konstruktu w liściach po zakażeniu wykryto poprzez obserwację ekspresji białka zielonej fluorescencji pod wpływem fluorescencji przy użyciu innego filtra GFP. Ekspresję białka zielonej fluorescencji w liściach zakażonych wirusem mozaiki wyczyńca uwidoczniono jako małe punktowe obszary fluorescencji rozmieszczone na liściach oraz jako duże plamy na liściach zakażonych wirusem mozaiki trzciny cukrowej. Za pomocą analizy ekspresji genów potwierdzono systemowe zakażenie wirusem mozaiki wyczyńca oraz zaobserwowano wyciszenie lub supresję genów desaturazy fitoenu i zmiany naśladującej 22.Zastosowany konstrukt wpłynął również na skuteczność infekcji. W przypadku zakażenia wirusem mozaiki wyczyńca, pusty wektor wirusa mozaiki wyczyńca i zmiana uszkodzenia wirusa mozaiki wyczyńca naśladująca 22 zazwyczaj miały najwyższą skuteczność infekcji na poziomie odpowiednio 53% i 54%. Wirus mozaiki wyczyńca ogona fitoenowy desaturazy przy nieco niższej skuteczności na poziomie 39% i wirus mozaiki wyczyńca ogona o zielonej fluorescencji przy najniższej skuteczności na poziomie 16% Tymczasem skuteczność infekcji wirusa mozaiki trzciny cukrowej białka zielonej fluorescencji wyniosła 8% Czas i objawy będą oparte na zastosowanym wektorze wirusowym i linii kukurydzy.Brak wizualnego fenotypu nie musi oznaczać braku wyciszenia lub ekspresji. Metoda ta może być również zastosowana w technologiach edycji genów poprzez ulepszenie metod dostarczania przewodnikowych RNA.

direct-agroinoculation-maize-seedlings-injection-with-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Źródło: Beernink, B. M. i in. Bezpośrednia agroinokulacja sadzonek kukurydzy poprzez wstrzyknięcie klonów zakaźnych wirusa mozaiki lisogona oraz wirusa mozaiki trzciny cukrowej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem Agrobacterium do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów. Opisuje proces zakażenia Agrobacterium , systemowe rozprzestrzenianie się wirusa oraz zmiany fenotypowe wywołane interferencją RNA.

Dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem agrobakterii do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis.  Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Tutaj prezentujemy protokół o wysokiej przepustowości do przejściowego transfekcji milionów protoplastów kukurydzy do testowania dużych bibliotek plazmidów w komórkach mezofilu kukurydzy.

Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy

Poznaj metodę bezpośredniej agroinokulacji siewek kukurydzy wirusami FoMV i SCMV do badań nad wyciszaniem i ekspresją genów. Protokół eliminuje potrzebę roślin pośrednich oraz specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Przeglądaj więcej filmów