Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Protokół ten umożliwia inokulację wektorów wirusowych bezpośrednio w roślinach kukurydzy, które można łatwo zastosować w większości warunków laboratoryjnych bez konieczności stosowania drogiego specjalistycznego sprzętu. Bezpośrednia inokulacja eliminuje użycie alternatywnego gospodarza jako źródła inokulum, oszczędzając zarówno czas, jak i zasoby. Metodę tę można zastosować do dodatkowych wektorów wirusowych, linii kukurydzy i potencjalnie innych gatunków roślin jednoliściennych.

Zacznij od posadzenia od 1 do 2 nasion kukurydzy w podłożu uprawowym na bazie torfu w małych wkładkach umieszczonych na tacach. Umieść tace w komorze wzrostowej w ciągu 16-godzinnych dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 8-godzinnych nocy w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza lub w szklarni w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza z 16-godzinnymi dniami i 8-godzinnymi nocami. Regularnie podlewaj rośliny i nawozić raz w tygodniu płynnym nawozem 15-5-15 o stężeniu 330 części na milion.

Przygotować agrobacterium do wstrzyknięcia, zaszczepiając antybiotykami szczep agrobacterium zawierający pożądany konstrukt wirusowy w pożywce LB. Następnie inkubować kolbę lub probówki w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 225 obr./min przez 24 godziny. Następnego dnia osadzać bakterie przez odwirowywanie w temperaturze 4 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.

Następnie umyj granulat jednym mililitrem wody dejonizowanej. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 10-milimolowego roztworu siarczanu magnezu i zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Następnie dostosuj go do 1.0.

Do wstrzykiwania agrobacterium należy używać sadzonek kukurydzy w wieku od 4 do 7 dni. Zmontować strzykawkę i igłę. Delikatnie wstrzyknij zawiesinę bakteryjną 2-3 milimetry powyżej węzła koleoptylowego, aż wypełni ona koleoptyl lub będzie widoczna w okółku, w oczekiwaniu na etap wzrostu roślin.

Wstrzyknąć wszystkie sadzonki i zmienić strzykawkę i igły do wstrzykiwania każdego konstruktu. Potwierdź infekcję fenotypową, obserwując zmiany spowodowane wyciszeniem genów kontrolnych, zmiany naśladującej 22 lub desaturazy fitoenowej na liściach. Użyj urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego do szybkich badań przesiewowych roślin i mikroskopii fluorescencyjnej, aby wykryć obecność ekspresji GFP.

Wykonaj analizę ekspresji genów w celu molekularnego wykrywania infekcji. Ekstrahować całkowite RNA z liści zakażonych roślin od 14 do 21 dni po zakażeniu i zsyntetyzować pierwszą nić cDNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Wykonaj PCR z odwrotną transkryptazą, aby potwierdzić infekcję i określić integralność genu lub fragment genu będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu określonych starterów przeznaczonych dla różnych konstruktów wirusa.

Wizualizuj produkt PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym barwnik kwasu nukleinowego, aby określić obecność lub brak wirusa i genu lub fragmentu genu. Protokół ten został wykorzystany do wprowadzenia rekombinowanych wirusów zmodyfikowanych pod kątem genu do siewek kukurydzy. Około 12 dni po wstrzyknięciu zaobserwowano na liściach fenotypy wyciszające w postaci nekrozy i fotobielenia.

Obecność konstruktu w liściach po zakażeniu wykryto poprzez obserwację ekspresji białka zielonej fluorescencji pod wpływem fluorescencji przy użyciu innego filtra GFP. Ekspresję białka zielonej fluorescencji w liściach zakażonych wirusem mozaiki wyczyńca uwidoczniono jako małe punktowe obszary fluorescencji rozmieszczone na liściach oraz jako duże plamy na liściach zakażonych wirusem mozaiki trzciny cukrowej. Za pomocą analizy ekspresji genów potwierdzono systemowe zakażenie wirusem mozaiki wyczyńca oraz zaobserwowano wyciszenie lub supresję genów desaturazy fitoenu i zmiany naśladującej 22.

Zastosowany konstrukt wpłynął również na skuteczność infekcji. W przypadku zakażenia wirusem mozaiki wyczyńca, pusty wektor wirusa mozaiki wyczyńca i zmiana uszkodzenia wirusa mozaiki wyczyńca naśladująca 22 zazwyczaj miały najwyższą skuteczność infekcji na poziomie odpowiednio 53% i 54%. Wirus mozaiki wyczyńca ogona fitoenowy desaturazy przy nieco niższej skuteczności na poziomie 39% i wirus mozaiki wyczyńca ogona o zielonej fluorescencji przy najniższej skuteczności na poziomie 16% Tymczasem skuteczność infekcji wirusa mozaiki trzciny cukrowej białka zielonej fluorescencji wyniosła 8% Czas i objawy będą oparte na zastosowanym wektorze wirusowym i linii kukurydzy.

Brak wizualnego fenotypu nie musi oznaczać braku wyciszenia lub ekspresji. Metoda ta może być również zastosowana w technologiach edycji genów poprzez ulepszenie metod dostarczania przewodnikowych RNA.