Name: Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj prosty test przesiewowy ziaren do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z białkiem przeciwgrzybiczym. Ta metoda pozwala ocenić odporność ziaren w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Davidowi Meintsowi, University of Arkansas za pomoc w rozwoju i analizie transgenicznej kukurydzy we wczesnych pokoleniach. Prace te otrzymały wsparcie finansowe projektu USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa USA. Polityka równych szans zatrudnienia (EEO) USDA-ARS nakazuje równe szanse dla wszystkich osób i zakazuje dyskryminacji we wszystkich aspektach polityki, praktyk i działań kadrowych Agencji.

1. Konstrukcje plazmidowe i transformacja kukurydzy
<ol>
	<li>PCR amplifikuje wkładkę Lablab AILP za pomocą starterów 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3' i 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Warunki PCR obejmują początkowy etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s (etap 1), następnie denaturację w temperaturze 98 °C przez 10 s (etap 2), wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s (etap 3), wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (etap 4), 31 cykli etapu 2 do etapu 4, i końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C przez 5 min. Sklonuj produkt PCR do zmodyfikowanego wektora pCAMBIA 1,300, używając miejsc ograniczeń XbaI i PstI. Zsekwencjonuj końcowy wektor docelowy rośliny, aby potwierdzić orientację i sekwencję sklonowanego genu AILP w wektorze.</li>
	<li>Przekształć szczep Agrobacterium EHA101 za pomocą końcowego konstruktu wektorowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), jak opisano wcześniej 16.</li>
	<li>Użyj przekształconego Agrobacterium zawierającego końcowy wektor docelowy rośliny, aby przekształcić niedojrzałe zarodki kukurydzy (Zea mays L. Hi-II) (wykonane w Zakładzie Transformacji Roślin Uniwersytetu Stanowego Iowa) 16.</li>
	<li>Uprawiaj rośliny T0 w szklarni (26–29 °C; 16/8 h fotoperiod uzupełniony wysokociśnieniowymi lampami Na) i wielokrotnie samozapylaj, aby uzyskać pokolenie T6, aby osiągnąć homozygotyczność dla cechy transgenicznej.</li>
</ol>
2. Test kiełkowania zarodników
<ol>
	<li>Pobrać próbki liści i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki liści zmielić moździerzem i tłuczkiem przy użyciu ciekłego azotu. Odważyć 0,5 g w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml, dodać 17 μl inhibitora proteazy i umieścić probówki na lodzie.</li>
	<li>Probówki wirować przez 10 minut przy 16 000 x g. Przenieś 225 μl ekstraktu roślinnego do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i umieść na lodzie.</li>
	<li>W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przygotuj 5 ml zawiesiny zarodników Aspergillus flavus 70 – GFP w 1% bulionie z dekstrozy ziemniaczanej (w/v). Odwiruj i dostosuj stężenie zarodników do 105 zarodników/ml za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: A. flavus wytwarza aflatoksyny, wszystkie prace z tym grzybem powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Inkubować w PDB w temperaturze 28 °C do momentu, gdy kultura osiągnie 50% inicjację kiełkowania zarodników, na co wskazuje wybrzuszenie zarodników.</li>
	<li>Wirować i podwielokrotność 25 μl roztworu przetrwalników do 225 μl ekstraktu roślinnego. Inkubować próbki przez 20 godzin w temperaturze 28 °C z przerywanym wstrząsaniem.</li>
	<li>Pobrać 25 μl roztworu zarodników na szkiełko mikroskopowe i zmierzyć długość zarodników probówek zarodkowych za pomocą oprogramowania aparatu cyfrowego. Należy użyć co najmniej 20 powtórzonych pomiarów dla każdej linii. 
	UWAGA: Na tym etapie umieść wszystkie kultury w temperaturze 4 °C, aby zatrzymać wzrost kolonii do momentu, gdy będą gotowe do liczenia.</li>
</ol>
3. Test przesiewowy jądra (KSA)
<ol>
	<li>Zbuduj nakrętki KSA, przyklejając 4 zaślepki (22 mm) na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm. Pozostaw klej do wyschnięcia na 48 godzin przed użyciem nakrętek. Każda czapka KSA to jedno powtórzenie. (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego spryskaj kwadratową tackę do testów biologicznych (24 cm x 24 cm) 70% etanolem:H2O(v/v) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Dodaj sterylną bibułę chromatograficzną do tacy. Spryskaj 9 nakrętek KSA 70% etanolem, pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i umieść na tacy do testów biologicznych.</li>
	<li>Dla każdej badanej linii kukurydzy transgenicznej wybierz 20 nieuszkodzonych ziaren i umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj 70% etanolu i odstaw na 4 minuty. Delikatnie potrząśnij probówkami podczas sterylizacji. Odlej etanol i opłucz ziarna trzy razy w sterylnym dejonizowanymH2O.</li>
	<li>Przygotuj zawiesinę zarodników Aspergillus flavus 70 – GFP17 z 6-dniowej kultury wyhodowanej na pożywce V8 (sok 5% V8, 2% agar, pH 5,2).
	<ol>
		<li>Dodać 20 ml sterylnego 0,02% Triton X-100/dejonizowanegoH2O(v/v) i zeskrobać zarodniki za pomocą sterylnej pętli. Odpipetować inokulum i umieścić w sterylnej zlewce o pojemności 300 ml.</li>
		<li>Przygotować 5-krotne rozcieńczenie z 0,02% Triton X-100, a następnie przeprowadzić liczenie zarodników za pomocą hemocytometru. W razie potrzeby ponownie rozcieńczyć, aby uzyskać 100 ml o stężeniu 4 x 106 zarodników/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść ziarna w sterylnej zlewce o pojemności 300 ml z mieszadłem. Dodaj inokulum do zlewki. 
	UWAGA: Dodanie ziaren do inokulum spowoduje rozpryskiwanie się roztworu. Umieść zlewkę na talerzu mieszającym na 3 minuty. Po 3 minutach odlać inokulum do pustej zlewki.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść ziarna w naczyniu do testów biologicznych (1 ziarno/nakrętka). Dodać 30 ml wody dejonizowanej na dno każdej tacki do testów biologicznych i inkubować w temperaturze 31 °C w ciemności przez 7 dni.</li>
	<li>Przygotuj ziarna do fotografii.
	<ol>
		<li>Odłóż na bok 4 ziarna z każdej linii do analizy mikroskopowej i fotografii. 
		UWAGA: Jądra można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 5 dni przed zakończeniem fotografowania.</li>
		<li>Zrób zdjęcia ziaren po siedmiu dniach od inokulacji A. flavus (<silna klasa="xfig">Ryc. 3).</li>
		<li>Oczyść zewnętrzną powierzchnię ziaren miękką chusteczką i wodą dejonizowaną. Wykonaj przekroje podłużne ziaren i natychmiast zrób zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj jądra do analizy.
	<ol>
		<li>Oczyść z zewnątrz pozostałe ziarna miękką chusteczką i wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Umieść 4 jądra, stanowiące 1 powtórzenie, w 15 ml zakręcanej fiolce z poliwęglanu zawierającej 2 kulki ze stali nierdzewnej. Natychmiast zamrozić fiolki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania i analizy.</li>
		<li>Wyjąć fiolki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i zmielić ziarna w homogenizatorze z prędkością 1 500 obr./min przez 3 minuty. 
		UWAGA: Trzymaj ziarna zamrożone ciekłym azotem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badania przesiewowe PCR transgenicznych ziaren kukurydzy
<ol>
	<li>Użyj zestawu do izolacji DNA, aby wyizolować genomowe DNA (gDNA) ze sproszkowanych ziaren kukurydzy zakażonych A. flavus zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko dodać 280 μl buforu F, 20 μl proteazy i 3 μl ditiotreitolu (DTT) do 10-15 mg sproszkowanych ziaren kukurydzy. Inkubować i wstrząsać w termomikserze (56 °C, 1 200 obr./min, 30 min). Wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę i przenieść klarowny supernatant do zrównoważonej kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i wirować przy 700 x g przez 1 minutę w celu elucji gDNA.</li>
	<li>Weź 0,8 μl wyekstrahowanego gDNA, aby ustawić reakcję PCR 20 μl dla każdej próbki za pomocą zestawu do PCR. Postępuj zgodnie z warunkami termocyklingu zgodnie z zaleceniami w protokole producenta. Warunki PCR obejmują początkowy etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 5 minut (etap 1), następnie denaturację w temperaturze 98 °C przez 5 s (etap 2), wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 5 s (etap 3), wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (etap 4), 40 cykli etapu 2 do etapu 4, i końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C przez 1 minutę (etap 5).</li>
	<li>Użyj startera do przodu 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' i startera wstecznego 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3', aby potwierdzić obecność genu Lablab AILP w transgenicznych ziarniach kukurydzy.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA, synteza cDNA i półilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Weź homogenizowane ziarna kukurydzy zakażone A. flavus uprzednio przechowywane w temperaturze -80°C w celu ekstrakcji RNA. Ekstrakcja RNA za pomocą zestawu do całkowitej izolacji RNA zgodnie z protokołem producenta, ale z niewielką modyfikacją18. Po dodaniu 50 mg homogenizowanego proszku z ziaren kukurydzy do buforu ekstrakcyjnego, należy go dobrze wymieszać (bez wirowania) za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i pozostawić na lodzie na 5-6 minut przed przejściem do kolejnych kroków zgodnie z opisem w protokole producenta.</li>
	<li>Przygotuj cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta 18.</li>
	<li>Użyj 0,5 μl nierozcieńczonego cDNA na reakcję PCR dla półilościowego RT-PCR, jak opisano wcześniej18. Do wykrywania ekspresji genu Lablab AILP należy użyć starterów do przodu i do tyłu qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' i qAILP-R 5'- CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA-3' oraz starterów do przodu i do tyłu qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ i qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ do ekspresji genu strukturalnego rybosomalnej kukurydzy (Rib), GRMZM2G02483819 jako genu utrzymania domu.</li>
</ol>
6. Kwant GFP
<ol>
	<li>Przygotować po 50 ml 0,2 M jednozasadowego fosforanu sodu (NaH2PO4) i 0,2 M dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4·7H2O) w dejonizowanymH2O.</li>
	<li>Uzupełnić 100 ml buforu fosforanowego Sorensona o pH 7,0. Aby uzyskać pH 7,0, dodaj 19,5 ml bulionu NaH2PO4, 30,5 ml NaHPO4·7H2O i 50 ml dejonizowanegoH2O.</li>
	<li>Odważyć 25 mg zmielonego materiału jądrowego (świeża masa, FW) i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,0 ml. Dodać 500 μl buforu fosforanowego do probówki wirówkowej i wirować przez 30 s.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 16 000 x g. Odmierzyć pipetę 100 μl supernatantu do czarnej płytki 96-dołkowej. Odczytać próbki za pomocą fluorometru (wzbudzenie 485 nm, emisja 528 nm).</li>
</ol>
7. Analiza całkowitej aflatoksyny
<ol>
	<li>Przetwarzanie próbek i ekstrakcja aflatoksyn
	<ol>
		<li>Suszyć próbki ziaren w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza przez 2 dni w temperaturze 60 °C. Zważyć próbki i umieścić je w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 ml ze szklanym korkiem.</li>
		<li>W dygestorium dodać 25 ml chlorku metylenu do każdej kolby. 
		UWAGA: Chlorek metylenu jest wysoce lotny i jest uważany za niebezpieczny (drażniący, rakotwórczy). Ani rękawice lateksowe, ani nitrylowe nie są bezpieczne do pracy z chlorkiem metylenu. Używaj ULEPSZONYCH, odpornych na rozpuszczalniki organiczne rękawic PolyVinylAlcohol.</li>
		<li>Wstrząsaj próbkami przez 30 minut na wytrząsarce nadgarstkowej. Po 30 minutach powoli przelać ekstrakt przez karbowane kółko z bibuły filtracyjnej do zlewki o pojemności 80 ml. Pozostaw zlewki do wyschnięcia na noc w dygestorium.</li>
		<li>Następnego dnia spryskaj chlorek metylenu (około 5 ml) wokół wewnętrznej krawędzi suchych zlewek, zamieszaj i wlej do 2 szklanych fiolek dram. Pozostawić fiolki otwarte do wyschnięcia w dygestorii na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza aflatoksyn
	<ol>
		<li>Dodać 4,0 ml 80% metanolu: dejonizowanego H2O (v / v) do fiolek.</li>
		<li>Użyj zestawu do ekstrakcji aflatoksyn do filtrowania, oczyszczania roztworu metanolu za pomocą dostarczonej kolumny. Przeanalizuj całkowity poziom aflatoksyny za pomocą fluorometru, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ismaiel, A., Papenbrock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycotoxins%3A+Producing+fungi+and+mechanisms+of+phytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%22%5BJournal%5D)">Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity.</a> Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).</li>
<li>Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+economic+losses+to+the+USA+corn+industry+from+aflatoxin+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination.</a> Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).</li>
<li>Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins+and+food+pathogens%3A+Impact+of+biologically+active+aflatoxins+and+their+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).</li>
<li>Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+aflatoxin-resistant+maize+lines+using+recent+advances+in+technologies+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants+-+Part+A+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review.</a> Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).</li>
<li>Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+of+aflatoxin+contamination+in+U.S.+crops+and+the+use+of+bioplastic+formulations+of+Aspergillus+flavus+biocontrol+strains+to+optimize+application+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).</li>
<li>Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+technologies+to+manage+aflatoxins+in+foods+and+feeds+and+the+profitability+of+application+%E2%80%93+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review.</a> Food Control. 76, 127-138 (2017).</li>
<li>Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+and+invertase+activity+as+influenced+by+Pythium+pleroticum+causing+rhizome+rot+of+ginger%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger.</a> Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).</li>
<li>Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectinolytic%2C+cellulolytic%2C+amylase+and+protease+production+by+three+isolates+of+Fusarium+solani+variable+in+their+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Mycology+and+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence.</a> Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amy1%2C+the+%CE%B1-amylase+gene+of+Aspergillus+flavus%3A+Involvement+in+aflatoxin+biosynthesis+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels.</a> Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).</li>
<li>Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylopectin+induces+Fumonisin+B1+production+by+Fusarium+verticillioides+during+colonization+of+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).</li>
<li>Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-based+silencing+of+the+a-amylase+%28amy1%29+gene+in+Aspergillus+flavus+decreases+fungal+growth+and+aflatoxin+production+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels.</a> Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).</li>
<li>Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+corn+trypsin+inhibitor+with+antifungal+activity+inhibits+Aspergillus+flavus+%CE%B1-amylase%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase.</a> Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+of+Aspergillus+flavus+and+fungal+%CE%B1-amylases+by+a+lectin-like+protein+from+Lablab+purpureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).</li>
<li>Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+among+proteins+in+the+phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase+inhibitor+family+of+the+common+bean+and+its+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives.</a> Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).</li>
<li>Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+expression+of+the+gene+encoding+an+inhibitor+against+Aspergillus+flavus+a-amylase%2C+a+novel+seed+lectin+from+Lablab+purpureus+%28Dolichos+lablab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab).</a> Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).</li>
<li>Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrame%2C+B+%22Plant+Embryo+Culture%22">Plant Embryo Culture</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+resistance+to+aflatoxin+contamination+in+kernels+of+maize+genotypes+using+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain.</a> World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aspergillus+flavus+growth+and+aflatoxin+production+in+transgenic+maize+kernels+expressing+a+tachyplesin-derived+synthetic+peptide%2C+AGM182%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182.</a> Plant Science. , 150-156 (2018).</li>
<li>Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+gene+expression+in+maize+seeds+during+colonization+by+Aspergillus+flavus+and+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides.</a> Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).</li>
<li>Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+losses+due+to+diseases+and+their+implications+for+global+food+production+losses+and+food+security%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security.</a> Food Security. 4, 519-537 (2012).</li>
<li>Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+exposure%2C+safety+issues%2C+and+risk+assessment+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).</li>
<li>Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins%3A+Characterisitcs+and+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Post%C4%99py+Higieny+i+Medycyny+Do%C5%9Bwiadczalnej+%28Online%29%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health.</a> Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).</li>
<li>Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain+to+study+fungal+invasion%2C+colonization%2C+and+resistance+in+cottonseed%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed.</a> Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).</li>
<li>Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+elements+in+the+promoter+region+of+the+Aspergillus+nidulans+gpdA+gene+encoding+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> Gene. 93 (1), 101-109 (1990).</li>
<li>Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+aflatoxin+biosynthetic+enzymes+Nor-1%2C+Ver-1%2C+and+OmtA+in+time-dependent+fractionated+colonies+of+Aspergillus+parasiticus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus.</a> Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).</li>
<li>Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+genetics+of+regulation+of+aflatoxin+production+and+Aspergillus+flavus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development.</a> Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).</li>
<li>Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+developing+maize+germplasm+with+resistance+to+accumulation+of+aflatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins.</a> World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).</li>
<li>Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chitin-binding+lectin+from+stinging+nettle+rhizomes+with+antifungal+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties.</a> Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).</li>
<li>Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hevein-an+antifungal+protein+from+rubber-tree+%28Hevea+brasiliensis%29+latex%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex.</a> Planta. 183, 258-264 (1991).</li>
<li>Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+properties+of+lectin+and+new+chitinases+from+potato+tubers%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Academie+des+Sciences+-+Series+III%22%5BJournal%5D)">Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers.</a> Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).</li>
<li>Wisessing, A., Choowongkomon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+inhibitors+in+plants%3A+Structures%2C+Functions+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications.</a> Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).</li>
<li>Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-amylase+inhibitor%3A+A+compelling+plant+defense+mechanism+against+insect%2Fpests%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+%26+Ecology%22%5BJournal%5D)">a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests.</a> Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).</li>
<li>Powers, J. R., Culbertson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+bean+amylase+inhibitor+on+insect+amylases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases.</a> Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).</li>
<li>Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a-amylase+inhibitors+on+insect+storage+pests%3A+Inhibition+of+a-amylase+in+vitro+and+effects+on+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).</li>
<li>Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+characterization+of+the+12-kDa+protease+a-amylase+inhibitor+present+in+maize+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds.</a> Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).</li>
<li>Abdollahi, A., Buchanan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aflatoxin+biosynthesis%3A+Induction+of+aflatoxin+production+by+various+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates.</a> Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).</li>
<li>Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nutrients+in+substrates+of+different+grains+on+aflatoxin+B1+production+by+Aspergillus+flavus%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus.</a> BioMed Research International. 2016, (2016).</li>
<li>Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-harvest+aflatoxin+contamination+and+soluble+sugars+of+peanut%5BTitle%5D)+AND+%22Peanut+Science%22%5BJournal%5D)">Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut.</a> Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Straty w plonach w uprawach rolnych spowodowane patogenami i szkodnikami stanowią problem globalny20. Obecnie stosowanie syntetycznych fungicydów i pestycydów jest dominującym sposobem zwalczania patogenów i szkodników roślin, ale szczątkowa toksyczność tych biochemikaliów w żywności i paszy może stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt21. Biorąc pod uwagę gospodarcze znaczenie kukurydzy jako rośliny spożywczej i pastewnej, zmniejszenie lub wyeliminowanie za...

Zanieczyszczenie mikotoksynami przez rodzaje grzybów, Aspergillus, Fusarium, Penicillium i Alternaria jest głównym problemem roślin spożywczych i paszowych uprawianych na całym świecie1,2,3. Spośród tych grzybów fitopatogenicznych Aspergillus ma największy niekorzystny wpływ na wartość upraw oraz zdrowie ludzi i zwierząt. Aspergillus flavus (A. flavus) jest oportunistycznym patogenem roślin, który infekuje uprawy bogate w olej, takie jak kukurydza, nasiona bawełny i orzeszki ziemne, i wytwarza silne czynniki rakotwórcze, aflatoksyny, a także liczne toksyczne metabolity wtórne (SM). Kukurydza jest ważną rośliną spożywczą i pastewną uprawianą na całym świecie i jest bardzo podatna na zanieczyszczenie przez A. flavus. Ekonomiczny wpływ zanieczyszczenia aflatoksynami na straty i zmniejszenie wartości kukurydzy może wynosić nawet 686,6 miliona dolarów/rok w USA.2 Biorąc pod uwagę przewidywane zmiany klimatu na świecie, wpływ aflatoksyn może spowodować większe straty ekonomiczne w kukurydzy z szacunkami sięgającymi nawet 1,68 miliarda dolarów rocznie w najbliższej przyszłości2. Biorąc pod uwagę niekorzystne skutki ekonomiczne i zdrowotne aflatoksyn dla ludzi i zwierząt gospodarskich, zwalczanie aflatoksyn w kukurydzy przed zbiorami może być najskuteczniejszym sposobem zapobiegania zanieczyszczeniu aflatoksynami w produktach spożywczych i paszowych.
Głównym podejściem do kontroli odporności kukurydzy na aflatoksyny, które było szeroko stosowane w ciągu ostatnich kilku dekad, jest przede wszystkim hodowla, która wymaga znacznej ilości czasu4. Ostatnio biokontrola odniosła pewne sukcesy w redukcji aflatoksyn w zastosowaniach polowych na dużą skalę5,6. Oprócz kontroli biologicznej, zastosowanie najnowocześniejszych narzędzi molekularnych, takich jak "wyciszanie genów indukowane przez gospodarza" (HIGS) za pomocą RNAi i transgeniczna ekspresja białek związanych z opornością, odniosło pewne sukcesy w ograniczaniu wzrostu A. flavus i produkcji aflatoksyn w badaniach laboratoryjnych i terenowych na małą skalę. Podejścia te są obecnie optymalizowane, a także identyfikowane są nowe potencjalne cele genów A. flavus do przyszłej manipulacji.
Oprócz genów, które są bezpośrednio zaangażowane w produkcję mykotoksyn jako potencjalne cele transgenicznych strategii kontroli, wykazano, że amylazy grzybowe odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu skutecznej patogenezy i produkcji mykotoksyn we wczesnych stadiach infekcji roślin żywicielskich. Kilka przykładów to Pythium pleroticum (czynnik wywołujący zgniliznę kłącza imbiru), Fusarium solani (czynnik wywołujący więdnięcie kalafiora), gdzie zaobserwowano pozytywne korelacje między patogennością a ekspresją i aktywnością α-amylazy7,8. Hamowanie aktywności α-amylazy poprzez nokaut genów lub metody knockdown negatywnie wpływa na wzrost grzybów i produkcję toksyn. Mutant A. flavus z nokautem α-amylazy nie był w stanie wytworzyć aflatoksyn, gdy był uprawiany na podłożu skrobiowym lub rozkiełkowanych ziarnach kukurydzy9. Podobnie w Fusarium verticillioides szczep nokautujący α-amylazy nie był w stanie wytworzyć fumonizyny B1 (mikotoksyny) podczas infekcji ziaren kukurydzy10. W nowszym badaniu Gilbert i in. (2018) wykazali, że oparte na RNAi powalenie ekspresji A. flavus α-amylazy przez HIGS znacznie zmniejszyło wzrost A. flavus i produkcję aflatoksyny podczas infekcji ziarna kukurydzy11.
Specyficzne inhibitory aktywności α-amylazy również dały podobne wyniki, jak uzyskane z obniżenia ekspresji α-amylazy. Pierwsze doniesienie na temat roli inhibitora α-amylazy w oporności na grzyby pochodziło z izolacji i scharakteryzowania inhibitora 14-kDa trypsyny-α-amylazy z linii kukurydzy odpornych na A. flavus12. Dalsze badania przesiewowe kilkuset gatunków roślin przeprowadzone przez Fakhoury'ego i Woloshuka doprowadziły do zidentyfikowania białka podobnego do inhibitora α-amylazy o masie 36 kDa (AILP) z nasion fasoli hiacyntowej, Lablab purpureus L.13. Sekwencja peptydowa AILP przypominała lektyny należące do rodziny inhibitorów lektyny-arceliny-α-amylazy opisanej w Common bean14,15. Oczyszczony AILP nie wykazuje żadnej aktywności hamującej w stosunku do trypsyny ssaków, a dalsza charakterystyka in vitro wykazała znaczące zahamowanie wzrostu A. flavus i kiełkowania konidiów13. Przedstawione tutaj doniesienia wyraźnie pokazują α-amylaza może służyć jako cel w podejściach kontrolnych w celu ograniczenia patogenów lub szkodników, które zależą od mobilizacji skrobi (poprzez aktywność α-amylazy) i pozyskiwania rozpuszczalnych cukrów jako źródła energii podczas ich patogennej interakcji z roślinami żywicielskimi.
Alfa-amylaza jest znana jako krytyczna w patogeniczności A. flavus9,10,11, i biorąc pod uwagę znaczenie AILP jako silnego środka anty-A. flavus (hamowanie α-amylazy/przeciwwzrost)13, wygenerowaliśmy transgeniczne rośliny kukurydzy wykazujące ekspresję Lablab AILP pod konstytutywnym promotorem CaMV 35S. Celem było zbadanie, czy heterologiczna ekspresja tego inhibitora α-amylazy w kukurydzy jest skuteczna przeciwko patogenezie A. flavus i produkcji aflatoksyny podczas infekcji ziarna kukurydzy. Nasze wyniki pokazują, że transgeniczne ziarna kukurydzy wykazujące ekspresję AILP znacznie zmniejszyły wzrost A. flavus i produkcję aflatoksyny podczas infekcji ziarna.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Keson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niesamowita morska goop</td><td>Eklektyczne produkty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch CFX96 System czasu rzeczywistego</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Szalki do hodowli tkankowych Sokoła, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 5424 Kolba do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer z korkiem, 50 ml</td><td>szkła Ace</td><td>6999-10</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoroQuant Afla</td><td>Romer Labs</td><td>COKFA1010</td><td></td></tr><tr><td>karbowane jakościowe koła z bibuły filtracyjnej, 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-14E</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik powietrzny</td><td>Force VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FQ-Reader</td><td>Romer Labs</td><td>EQFFM3010</td><td></td></tr><tr><td>Geno/Grinder 2010</td><td>OPS Diagnostics</td><td>SP 2010-115</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszone rękawice odporne na rozpuszczalniki organiczne z polialkoholu winylowego</td><td>Ansell</td><td>012-15-554</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora Innova 44</td><td>Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr> Zlewki Griffin z <tr><td>ciekłym azotem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>o niskiej formie, 100 ml</td><td>DKW Life Sciences</td><td>14000-100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td><td></td>metylenu</tr><tr><td>Nexttec 1-etapowy zestaw do izolacji DNA dla roślin Mikroskop</td><td>Nexttec</td><td>47N</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 z aparatem Nikon DS-Qi1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ25 z oświetlaczem episkopowym C-HGFI i kamerą sCMOS Andor Zyla 4.2 Kwadratowe</td><td></td> naczynia do testów biologicznych Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc</td> Zestaw do bezpośredniego PCR <td>ThermoFisher Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Phire Plant Fiolki</td> z poliwęglanu <td>ThermoFisher</td><td>Scientific F130WH</td><td></td></tr><tr><td>, 15 ml</td><td>OPS Diagnostics</td><td>PCRV 15-100-23</td><td></td></tr><tr><td>Ziemniak Zakrętka do bulionu</td><td></td><td></td><td></td>dekstrozowego</tr><tr><td>, 22 mm</td><td>DKW Nauki Przyrodnicze</td><td>242612</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr> Jednozasadowy zestaw Total <tr><td>RNA Spectrum Plant</td><td>Sigma-Aldrich Kule szlifierskie ze stali nierdzewnej Sigma-Aldrich</td><td></td> STRN50<td></td></tr>, <tr><td></td><td></td> 3/8''<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>OPS</td><td>Diagnostyka GBSS 375-1000-02</td><td></td></tr><tr><td>Płytka</td><td></td><td></td><td></td>mieszająca</tr><tr><td>Synergia 4 Fluorometr</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>V8 sok</td><td>Campbell's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Jakościowa klasa Gładkie arkusze, klasa 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-820P</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka na nadgarstek</td><td>Burrell Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hamowanie wzrostu aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z lablab purpureus l.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Zanieczyszczenie aflatoksynami w uprawach spożywczych i paszowych jest głównym wyzwaniem na całym świecie. Aflatoksyny, wytwarzane przez grzyby Aspergillus flavus (A. flavus), są silnymi czynnikami rakotwórczymi, które znacznie obniżają wartość upraw kukurydzy i innych roślin bogatych w olej, takich jak orzeszki ziemne, a także stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Różne podejścia, w tym tradycyjna hodowla, transgeniczna ekspresja białek związanych z opornością oraz wywołane przez gospodarza wyciszanie genów krytycznych celów genu A. flavus w oparciu o interferencję RNA (RNAi), są oceniane w celu zwiększenia odporności na aflatoksyny u podatnych upraw. Wcześniejsze badania wykazały ważną rolę α-amylazy w patogenezie A. flavus i produkcji aflatoksyny, co sugeruje, że ten gen/enzym jest potencjalnym celem w zmniejszaniu zarówno wzrostu A. flavus, jak i produkcji aflatoksyny. W związku z tym niniejsze badanie zostało podjęte w celu oceny heterologicznej ekspresji (pod kontrolą konstytutywnego promotora CaMV 35S) białka podobnego do inhibitora α-amylazy Lablab purpureus L. (AILP) w kukurydzy przeciwko A. flavus. AILP jest białkiem o masie 36 kDa, które jest kompetycyjnym inhibitorem enzymu A. flavus α-amylazy i należy do rodziny białek inhibitorów lektyny-arceliny-α-amylazy w fasoli zwyczajnej. Badania in vitro poprzedzające obecne prace wykazały rolę AILP w hamowaniu aktywności A. flavus α-amylazy i rozwoju grzybów. Wzrost grzybów i produkcja aflatoksyn w dojrzałych ziarnikach były monitorowane w czasie rzeczywistym przy użyciu szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP. Ten test przesiewowy jądra (KSA) jest bardzo prosty do skonfigurowania i zapewnia wiarygodne i powtarzalne dane na temat infekcji i zakresu rozprzestrzeniania się, które można określić ilościowo w celu oceny plazmy zarodkowej i linii transgenicznych. Fluorescencja szczepu GFP jest ściśle skorelowana ze wzrostem grzybów, a co za tym idzie, jest dobrze skorelowana z wartościami aflatoksyn. Celem obecnych prac było zastosowanie tej wcześniejszej wiedzy w uprawach o znaczeniu komercyjnym, takich jak kukurydza, w celu zwiększenia odporności na aflatoksyny. Nasze wyniki wskazują na 35%-72% zmniejszenie wzrostu A. flavus w transgenicznych ziarnach kukurydzy z ekspresją AILP, co z kolei przełożyło się na 62%-88% zmniejszenie poziomu aflatoksyny.

Transformacja kukurydzy i screening molekularny roślin transgenicznych
Niedojrzałe zarodki kukurydzy linii Hi-II poddano transformacji przy użyciu Agrobacterium tumefaciens szczep EHA101 zawierający końcowy wektor docelowy dla roślin wykazujący ekspresję *Lablab purpureus* AILP gen pod kontrolą CaMV 35S promotor. Pięć niezależnie transformowanych linii kukurydzy przeprowadzono...

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Tutaj przedstawiamy prosty test przesiewowy ziaren do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyny w ziarnach kukurydzy wykazujących ekspresję białka przeciwgrzybiczego. Korzystając z białka zielonej fluorescencji wykazującego ekspresję szczepu Aspergillus flavus, monitorujemy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Ten prosty test zapewnia wiarygodny sposób oceny zdolności ziarna kukurydzy do opierania się infekcji Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn.Wyniki tego testu laboratoryjnego przeprowadzonego w kontrolowanych warunkach na dojrzałych ziarnach dobrze korelują z wynikami infekcji w warunkach polowych. Procedurę zademonstruje dr Rajtilak Majumdar, doktor habilitowany z naszego laboratorium, wraz z Christine Sickler i Davidem Ambrosio, technikami nauk biologicznych również z naszego laboratorium. Na początek przyklej 20 dwumilimetrowych zatrzasków na szalce Petriego, aby utworzyć czapki KSA.Pozostaw klej do wyschnięcia na 48 godzin przed użyciem nakrętek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego spryskaj kwadratową tackę do testów biologicznych z 70% etanolem w wodzie. Pozostaw tacę do wyschnięcia na powietrzu.Dodaj sterylną bibułę chromatograficzną do suchej tacy. Spryskaj dziewięć nakrętek KSA 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść nakrętki na tacy do testów biologicznych.Dla każdej badanej linii transgenicznej kukurydzy wybierz 20 nieuszkodzonych ziaren i umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Za pomocą stołowego mikroskopu stereoskopowego wybierz do testu tylko nieuszkodzone jądra. Uszkodzone ziarna są bardziej podatne na atak Aspergillus i wytwarzają więcej aflatoksyny, co zniekształca wyniki i nie reprezentuje prawdziwych cech przeciwgrzybiczych lub przeciwdrobnoustrojowych odmiany.Dodaj 70% etanolu do każdej tubki. Pozwól ziarnom sterylizować się przez cztery minuty, od czasu do czasu delikatnie je potrząsając. Następnie delikatnie odlej etanol i delikatnie opłucz ziarna w sterylnej wodzie dejonizowanej trzy razy.Uzyskać sześciodniową hodowlę Aspergillus flavus stain 70 z ekspresją GFP wyhodowaną na pożywce V8. Dodaj 20 ml sterylnego 0,02%Triton X-100 do wody dejonizowanej. I użyj sterylnej pętli, aby zeskrobać zarodniki.Odpipetować inokulum i przenieść je do sterylnej zlewki o pojemności 300 ml. Przygotuj pięciokrotne rozcieńczenie 0,02% Triton X-100 i użyj hemocytometru, aby przeprowadzić liczenie zarodników. W razie potrzeby rozcieńczyć ponownie, aby uzyskać 100 ml o stężeniu czterech milionów zarodników na ml.Przelać inokulum do pustej zlewki. Umieść ziarna w sterylnej zlewce o pojemności 300 ml z mieszadłem i mieszaj przez trzy minuty. Za pomocą kleszczy przenieś ziarna do naczynia do testów biologicznych, upewniając się, że w każdej nasadce umieścisz tylko jedno ziarno.Dodaj 30 ml wody dejonizowanej na dno każdej tacki do testów biologicznych. I inkubować w temperaturze 31 stopni Celsjusza przez siedem dni. Po siedmiu dniach od zaszczepienia A.flavus zrób zdjęcia czterech ziaren, które były przeznaczone do analizy mikroskopowej i fotografii.Następnie użyj miękkiej chusteczki i dejonizowanej wody, aby oczyścić zewnętrzną część ziaren. Wykonaj przekroje podłużne ziaren i natychmiast zrób zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby przygotować ziarna do analizy, oczyść z zewnątrz pozostałe ziarna miękką chusteczką i wodą dejonizowaną.Umieść cztery jądra, które stanowią jedno powtórzenie, w 15 ml zakręcanej fiolce z poliwęglanu zawierającej dwie kulki ze stali nierdzewnej. Natychmiast zamrozić fiolki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu, gdy będą gotowe do dalszego przetwarzania i analizy. Gdy będą gotowe, wyjmij ziarna z zamrażarki i użyj homogenizatora, aby zmielić je z prędkością 1500 obr./min przez trzy minuty.Do analizy GFP, oznaczania aflatoksyn i analizy molekularnej należy używać tych samych materiałów mielonych, tak aby wszystkie wartości były reprezentatywne dla próbek. Chociaż zalecane są co najmniej trzy powtórzenia, więcej zawsze znaczy lepiej, w zależności od dostępności dobrej jakości ziaren. W tym badaniu niedojrzałe zarodki kukurydzy linii HI-II są przekształcane przy użyciu szczepu Agrobacterium tumefaciens EHA101 zawierającego końcowy wektor docelowy rośliny wyrażający gen Lablab purpureus AILP pod kontrolą promotora 35S z wirusa mozaiki kalafiora.Amplifikacja PCR docelowego genu AILP wykazała amplikon 548 pz obserwowany tylko w transgenicznych liniach kukurydzy. Gen AILP wykazywał ekspresję w liniach transgenicznych, podczas gdy w roślinach kontrolnych nie zaobserwowano ekspresji AILP. Zarodniki we wczesnym stadium kiełkowania są wystawione na działanie surowych ekstraktów z liści młodych transgenicznych roślin kukurydzy przez 20 godzin.Wysoka pełna długość od zarodników wystawionych na działanie transgenicznych ekstraktów z liści wykazuje redukcję od 58 do 80% w porównaniu z kontrolą negatywną. Zastosowany szczep A.flavus zawiera reporter GFP, który umożliwia monitorowanie i ilościowe określanie wzrostu grzybów w czasie rzeczywistym. Znaczące zmniejszenie fluorescencji GFP obserwuje się w transgenicznych ziarnach AILP w porównaniu z izogeniczną kontrolą ujemną.Obserwuje się znaczne zmniejszenie wzrostu grzybów w przypadku linii czwartej i piątej AILP, odpowiednio 69% i 72%. Pozostałe linie wykazują redukcję od 35 do 60% w porównaniu z jądrami kontrolnymi. W ziarnach AILP zaobserwowano zmniejszenie zawartości aflatoksyny o 62 do 88% w porównaniu z kontrolą.Linia czwarta ma najniższą zawartość aflatoksyny na poziomie 486 ng / g, a następnie inne linie mają zawartość w zakresie od 640 do 1498 ng / g. Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, takie jak użycie fluorometru do ilościowego określenia GFP i wzrostu grzybów. Do ilościowego oznaczania aflatoksyn można użyć komercyjnych zestawów immunologicznych lub HPLC lub EPLC.Dostępność KSA zapewnia szybki i prosty sposób określenia odporności na zanieczyszczenie aflatoksynami. Za pomocą tej techniki można szybko ocenić różne linie hodowli kukurydzy. Chociaż test przesiewowy ziarna nie jest niebezpieczny, operator powinien chronić się przed narażeniem na zarodniki Aspergillus flavus i stosować odpowiedni sprzęt ochronny.

inhibition-aspergillus-flavus-growth-aflatoxin-production-transgenic

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis.  Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Pokazujemy metodę analizy aflatoksyn i ekspresji transgenów w nasionach orzeszków ziemnych, które zawierają sygnały interferencji RNA do wyciszania genów syntezy aflatoksyn u grzyba Aspergillus flavus. Kontrola mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi nie została wcześniej zgłoszona.

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Aby osiągnąć supresję populacji Aedes aegypti przy użyciu systemu RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal), konieczne jest uwolnienie dużych liczb samców komarów. Wymaga to zastosowania technik i technologii masowej hodowli w celu zapewnienia niezawodnych systemów pozwalających na uzyskanie maksymalnej liczby wysokiej jakości samców komarów.

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Procedury oparte na mikropłytkach są opisane dla kolorymetrycznej lub fluorometrycznej analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych. Procedury te pozwalają na szybkie oznaczenie takiej aktywności na dużej liczbie próbek środowiskowych w rozsądnych ramach czasowych.

Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Poznaj prosty test przesiewowy ziaren do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z białkiem przeciwgrzybiczym. Ta metoda pozwala ocenić odporność ziaren w czasie rzeczywistym.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L. (Wideo) | JoVE Journal

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Przeglądaj więcej filmów