Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Tutaj przedstawiamy prosty test przesiewowy ziaren do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyny w ziarnach kukurydzy wykazujących ekspresję białka przeciwgrzybiczego. Korzystając z białka zielonej fluorescencji wykazującego ekspresję szczepu Aspergillus flavus, monitorujemy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Ten prosty test zapewnia wiarygodny sposób oceny zdolności ziarna kukurydzy do opierania się infekcji Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn.

Wyniki tego testu laboratoryjnego przeprowadzonego w kontrolowanych warunkach na dojrzałych ziarnach dobrze korelują z wynikami infekcji w warunkach polowych. Procedurę zademonstruje dr Rajtilak Majumdar, doktor habilitowany z naszego laboratorium, wraz z Christine Sickler i Davidem Ambrosio, technikami nauk biologicznych również z naszego laboratorium. Na początek przyklej 20 dwumilimetrowych zatrzasków na szalce Petriego, aby utworzyć czapki KSA.

Pozostaw klej do wyschnięcia na 48 godzin przed użyciem nakrętek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego spryskaj kwadratową tackę do testów biologicznych z 70% etanolem w wodzie. Pozostaw tacę do wyschnięcia na powietrzu.

Dodaj sterylną bibułę chromatograficzną do suchej tacy. Spryskaj dziewięć nakrętek KSA 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść nakrętki na tacy do testów biologicznych.

Dla każdej badanej linii transgenicznej kukurydzy wybierz 20 nieuszkodzonych ziaren i umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Za pomocą stołowego mikroskopu stereoskopowego wybierz do testu tylko nieuszkodzone jądra. Uszkodzone ziarna są bardziej podatne na atak Aspergillus i wytwarzają więcej aflatoksyny, co zniekształca wyniki i nie reprezentuje prawdziwych cech przeciwgrzybiczych lub przeciwdrobnoustrojowych odmiany.

Dodaj 70% etanolu do każdej tubki. Pozwól ziarnom sterylizować się przez cztery minuty, od czasu do czasu delikatnie je potrząsając. Następnie delikatnie odlej etanol i delikatnie opłucz ziarna w sterylnej wodzie dejonizowanej trzy razy.

Uzyskać sześciodniową hodowlę Aspergillus flavus stain 70 z ekspresją GFP wyhodowaną na pożywce V8. Dodaj 20 ml sterylnego 0,02%Triton X-100 do wody dejonizowanej. I użyj sterylnej pętli, aby zeskrobać zarodniki.

Odpipetować inokulum i przenieść je do sterylnej zlewki o pojemności 300 ml. Przygotuj pięciokrotne rozcieńczenie 0,02% Triton X-100 i użyj hemocytometru, aby przeprowadzić liczenie zarodników. W razie potrzeby rozcieńczyć ponownie, aby uzyskać 100 ml o stężeniu czterech milionów zarodników na ml.

Przelać inokulum do pustej zlewki. Umieść ziarna w sterylnej zlewce o pojemności 300 ml z mieszadłem i mieszaj przez trzy minuty. Za pomocą kleszczy przenieś ziarna do naczynia do testów biologicznych, upewniając się, że w każdej nasadce umieścisz tylko jedno ziarno.

Dodaj 30 ml wody dejonizowanej na dno każdej tacki do testów biologicznych. I inkubować w temperaturze 31 stopni Celsjusza przez siedem dni. Po siedmiu dniach od zaszczepienia A.flavus zrób zdjęcia czterech ziaren, które były przeznaczone do analizy mikroskopowej i fotografii.

Następnie użyj miękkiej chusteczki i dejonizowanej wody, aby oczyścić zewnętrzną część ziaren. Wykonaj przekroje podłużne ziaren i natychmiast zrób zdjęcia pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby przygotować ziarna do analizy, oczyść z zewnątrz pozostałe ziarna miękką chusteczką i wodą dejonizowaną.

Umieść cztery jądra, które stanowią jedno powtórzenie, w 15 ml zakręcanej fiolce z poliwęglanu zawierającej dwie kulki ze stali nierdzewnej. Natychmiast zamrozić fiolki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu, gdy będą gotowe do dalszego przetwarzania i analizy. Gdy będą gotowe, wyjmij ziarna z zamrażarki i użyj homogenizatora, aby zmielić je z prędkością 1500 obr./min przez trzy minuty.

Do analizy GFP, oznaczania aflatoksyn i analizy molekularnej należy używać tych samych materiałów mielonych, tak aby wszystkie wartości były reprezentatywne dla próbek. Chociaż zalecane są co najmniej trzy powtórzenia, więcej zawsze znaczy lepiej, w zależności od dostępności dobrej jakości ziaren. W tym badaniu niedojrzałe zarodki kukurydzy linii HI-II są przekształcane przy użyciu szczepu Agrobacterium tumefaciens EHA101 zawierającego końcowy wektor docelowy rośliny wyrażający gen Lablab purpureus AILP pod kontrolą promotora 35S z wirusa mozaiki kalafiora.

Amplifikacja PCR docelowego genu AILP wykazała amplikon 548 pz obserwowany tylko w transgenicznych liniach kukurydzy. Gen AILP wykazywał ekspresję w liniach transgenicznych, podczas gdy w roślinach kontrolnych nie zaobserwowano ekspresji AILP. Zarodniki we wczesnym stadium kiełkowania są wystawione na działanie surowych ekstraktów z liści młodych transgenicznych roślin kukurydzy przez 20 godzin.

Wysoka pełna długość od zarodników wystawionych na działanie transgenicznych ekstraktów z liści wykazuje redukcję od 58 do 80% w porównaniu z kontrolą negatywną. Zastosowany szczep A.flavus zawiera reporter GFP, który umożliwia monitorowanie i ilościowe określanie wzrostu grzybów w czasie rzeczywistym. Znaczące zmniejszenie fluorescencji GFP obserwuje się w transgenicznych ziarnach AILP w porównaniu z izogeniczną kontrolą ujemną.

Obserwuje się znaczne zmniejszenie wzrostu grzybów w przypadku linii czwartej i piątej AILP, odpowiednio 69% i 72%. Pozostałe linie wykazują redukcję od 35 do 60% w porównaniu z jądrami kontrolnymi. W ziarnach AILP zaobserwowano zmniejszenie zawartości aflatoksyny o 62 do 88% w porównaniu z kontrolą.

Linia czwarta ma najniższą zawartość aflatoksyny na poziomie 486 ng / g, a następnie inne linie mają zawartość w zakresie od 640 do 1498 ng / g. Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, takie jak użycie fluorometru do ilościowego określenia GFP i wzrostu grzybów. Do ilościowego oznaczania aflatoksyn można użyć komercyjnych zestawów immunologicznych lub HPLC lub EPLC

Dostępność KSA zapewnia szybki i prosty sposób określenia odporności na zanieczyszczenie aflatoksynami. Za pomocą tej techniki można szybko ocenić różne linie hodowli kukurydzy. Chociaż test przesiewowy ziarna nie jest niebezpieczny, operator powinien chronić się przed narażeniem na zarodniki Aspergillus flavus i stosować odpowiedni sprzęt ochronny.