Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Ten system eksperymentalny wykorzystuje agroinfiltrację w celu skutecznego dostarczenia konstruktów genowych do liści dla produkcji wysokich poziomów białka rekombinowanego. Najpierw należy hodować rośliny end hamana w kontrolowanym środowisku przez sześć tygodni, do trzech dni przed infiltracją. W dniu infiltracji przygotuj kultury agrobacterium zawierające gen docelowy, który ma zostać wyeksponowany w roślinach.

Wprowadź kultury agrobakterii do tkanki roślinnej za pomocą strzykawki lub infiltracji próżniowej. Wyniki, takie jak intensywność zielonej fluorescencji GFP w liściach tytoniu pod wpływem światła UV, wykazują silną ekspresję białek rekombinowanych w roślinach, która dorównuje obecnym systemom ekspresyjnym opartym na ssakach, bakteriach i owadach. Agroinfiltracja jest skuteczną metodą wprowadzania transgenów do komórek roślinnych, co prowadzi do wysokiego poziomu ekspresji białek rekombinowanych.

Metoda ta może być stosowana w odniesieniu do szerokiego zakresu gatunków roślin. Co najważniejsze, można ją skalować w celu komercyjnej produkcji białek farmaceutycznych. Dzięki temu metoda ta pozwala na analizę kinetyki i ekspresji GFP oraz może być zastosowana do innych białek, takich jak szczepionki podjednostkowe i rekombinowane przeciwciała monoklonalne, a także w terapiach nowotworów i chorób zakaźnych.

Pomyślny przebieg eksperymentu wymaga optymalnych warunków zarówno dla hodowli bakterii, jak i materiału roślinnego. Proces infiltracji ten jest łatwiejszy do powtórzenia po zapoznaniu się z demonstracją wizualną. Rozpocznij od umieszczenia do 60 pelletów torfowych w tacy do propagacji.

Dodaj cztery litry wody z kranu i pozostaw pelet torfowy na dwie godziny, aby wchłonął wodę. Następnie umieść po dwa nasiona hamana w każdym peletie torfowym i przykryj tackę przezroczystą plastikową kopułą w celu przeprowadzenia kiełkowania. Umieść nasiona w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 84%.

Dwa tygodnie po wysiewie zdjąć kopułę i przenieść rośliny do nowej tacy. Następnie dodać dwa litry roztworu nawozu Jack's o stężeniu 1,48 g/l. Kontynuować hodowlę roślin w temperaturze 25 °C.

Środowisko o wilgotności 50% co dwa dni. Podawaj dwa litry nawozu Jack's na każdą tacę. W czwartym tygodniu przenieś rośliny w pelletach torfowych do nowej tacy mieszczącej sześć roślin, aby kontynuować wzrost do szóstego tygodnia życia.

Wybierz cztery rośliny Nicotiana benthamiana w wieku sześciu tygodni, z pięcioma do sześciu liśćmi każda. Przeznacz trzy liście do pełnej infiltracji szczepami agrobakterii zawierającymi interesujące geny. Jeden liść potraktuj jako kontrolę negatywną, a jeden liść przeznacz do infiltracji punktowej. Za pomocą igły wykonaj niewielkie nacięcie w epidermie na spodniej stronie liścia, dbając o to, aby nie przebić liścia na wylot.

Mocno chwyć przednią stronę pierwszego liścia, wywierając jednocześnie delikatny nacisk przeciwstawny na szyjkę. Kciukiem jednej ręki przytrzymaj liść. Za pomocą strzykawki z igłą wstrzyknij mieszaniny agrobakterii w buforze do infiltracji w głąb szyjki.

Kontynuuj wstrzykiwanie mieszanin agrobacterium do nacięcia, aż ciemnozielony krąg przestanie się powiększać. Następnie wykonaj kolejne nacięcie i powtarzaj wstrzykiwania, aż cały liść zostanie zinfiltrowany i nabierze ciemnozielonego koloru. Przeprowadź pełną infiltrację trzech pierwszych liści, a w przypadku czwartego liścia każdej rośliny zastosuj infiltrację kombinacjami wektorów składającymi się albo z czterech wektorów wirusowych Gemini, albo z trzech wektorów magcon.

Następnie wykonaj jedno nacięcie dla każdej kombinacji szczepów agrobacterium i wprowadź do każdego nacięcia jedną kombinację. Po infiltracji przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka w okresie od 2 do 15 dni. Po infiltracji umieść kuwetę w desykatorze próżniowym i przelej trzy litrami buforu do infiltracji zawierającego szczepy agrobacterium.

Następnie podłącz deskryptor do membranowej pompy próżniowej znanej marki. Teraz umieść roślinę odwróconą do góry nogami na płytce deskryptora i opuszczaj płytkę z rośliną, aż cały system liścia i łodygi zostanie zanurzony w buforze infiltracyjnym, a płytka spocznie na górnej krawędzi kuwety. Następnie umieść uszczelkę typu O-ring wzdłuż krawędzi deskryptora.

Po nałożeniu pokrywy desykatora na komorę, włącz pompę próżniową i rozpocznij pomiar czasu w momencie, gdy ciśnienie próżni osiągnie 100 millibar. Po wyłączeniu pompy próżniowej, po jednej minucie przy ciśnieniu 100 millibar, powoli otwórz zawór wypuszczający w desykatorze, aby umożliwić wniknięcie bakterii *Agrobacterium* w przestrzenie międzykomórkowe zanurzonej tkanki roślinnej. Powtórz proces infiltracji.

Wykonaj inkubację przez jedną godzinę, aby zapewnić dobrą infiltrację. Następnie wyjmij roślinę z urządzenia do wysysania i ustaw ją ponownie w pozycji pionowej. Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka od drugiego do 15. dnia po infiltracji.

Aby zademonstrować skuteczność infiltracji tkanki roślinnej agrobakteriami za pomocą strzykawki, przetestowano ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych, GFP i Ds red, przy użyciu dwóch różnych zdekonstruowanych wirusowych wektorów roślinnych: Gemini viral oraz magcon for end. Liście Hamana zostały w całości poddane infiltracji agrobakteriami zawierającymi wektory Gemini viral. Ekspresję GFP zaobserwowano na całej powierzchni liścia pod światłem UV, poczynając już od 2 DPI, a szczyt akumulacji osiągnięto w 4 DPI.

W przeciwieństwie do nich, liście infiltrowane wektorem magcon zawierającym kombinacje agrobakterii wykazały fluorescencję GFP dopiero po pięciu DPI, a jej maksymalne nagromadzenie osiągnięto w siódmym DPI. Nie zaobserwowano zielonej fluorescencji w liściach infiltrowanych ujemnymi kontrolnymi mieszaninami agro-bakterii EP one 10 plus P 19, co wskazuje, że fluorescencja była specyficzna dla genu GFP i nie wynikała z autofluorescencji liści. W szczycie nagromadzenia fluorescencja GFP wyrażona za pomocą wektora magcon jest bardziej intensywna niż ta z wektora wirusowego Gemini.

Nie zaobserwowano istotnej nekrozy na liściach infiltrowanych konstruktami GFP; gdy oba białka fluorescencyjne były eksponowane na tym samym liściu za pomocą wirusowych wektorów Gemini poprzez infiltrację strzykawkową, wykryto je w oczekiwanych kolorach fluorescencyjnych w miejscu infiltracji. Co ciekawe, ko-infiltracja GFP i DS RED doprowadziła do powstania żółtawej fluorescencji. Zbadano również infiltrację próżniową w celu opracowania skalowalnej metody agroinfiltracji, która mogłaby być wykorzystana do wielkoskalowej produkcji białek rekombinowanych w systemach przejściowej ekspresji roślinnej.

Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano fluorescencję GFP we wszystkich liściach rośliny poddanej infiltracji w porównaniu z infiltracją za pomocą strzykawki. Metoda ta jest bardziej skuteczna i pozwala na przeprowadzenie infiltracji każdej rośliny w znacznie krótszym czasie. Po opanowaniu techniki proces ten można zrealizować w ciągu 48 godzin.

Większość czasu przeznaczona jest na hodowlę bakterii z rodzaju Agrobacterium, ponieważ właściwy czas infiltracji trwa zaledwie kilka minut. W celu uzyskania optymalnej wydajności agroinfiltracji i ukierunkowanej ekspresji białek należy postępować zgodnie z protokołem. Pamiętaj o kontrolowaniu krytycznych parametrów, w tym warunków wzrostu roślin, stężenia Agrobacterium, ciśnienia próżni oraz czasu trwania procesu w dziedzinie biotechnologii roślin.

To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania rozwoju i bioprodukcji nowych białek farmaceutycznych w szerokim zakresie gatunków roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak wykorzystać agroinfiltrację do wprowadzenia docelowych konstruktów genowych do rośliny oraz jak umożliwić systemom przejściowej ekspresji roślinnej produkcję białka rekombinowanego, dorównującego temu uzyskiwanemu z hodowli komórek ssaków, bakterii i owadów.