Name: Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj metodę agroinfiltracji roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie. Technika ta umożliwia skuteczną produkcję białek farmaceutycznych w tkankach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy R. Sunowi i innym studentom Laboratorium Chena za ich wkład w tworzenie materiału roślinnego. Dziękujemy również Dr. D. Green za wsparcie badań licencjackich w College of Technology and Innovation (CTI). Badania te były częściowo wspierane przez granty NIH U01 AI075549 i 1R21AI101329 dla Q. Chena oraz grant SSE od CTI z Arizona State University dla Q. Chena. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado i J. Stahnke są studentami studiów licencjackich wspieranymi przez grant SSE.

1. Wzrost roślin
<ol>
	<li>Umieść 60 granulek torfu na tacy rozmnożeniowej. Dodaj 4 l wody z kranu i pozwól granulkom torfu wchłonąć wodę przez 2 godziny.</li>
	<li>Dodaj 2 nasiona N. benthamiana do każdej granulki torfu za pomocą siewnika, przykryj tacę przezroczystą plastikową kopułą i pozwól im wykiełkować w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 84% z 16/8 godzinnym cyklem dnia i nocy (Rysunek 1A).</li>
	<li>Zdejmij kopułę dwa tygodnie po wysianiu, spuść wodę z tacy i dodaj 2 litry nawozu Jack's o stężeniu 1,48 g/l (rysunek 1B). Kontynuuj uprawę roślin w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 50% z 16/8 godzinnym cyklem dnia i nocy. Dostarczaj 2 litry nawozu Jack's co 2 dni na tacę.</li>
	<li>W 4. tygodniu przenieś rośliny z granulkami torfu na nową tacę, na której znajduje się sześć roślin, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do dalszego wzrostu (ryc. 1C), aż będą gotowe do infiltracji w wieku 6 tygodni (ryc. 1D).</li>
</ol>
2. A. tumefaciens Przygotowanie kultury
2.1 Przygotowanie do infiltracji strzykawki
<ol>
	<li>Szczepy Streak A. tumefaciens GV3101 zawierające wektory geminiwirusowe p19, pREP110, pBYGFP i pBYDsRed na płytkach agarowych LB zawierających kanamycynę (100 μg/ml). Umieść jedną odmianę na talerzu i hoduj w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Podobnie, smugi i wzrost szczepów GV3101 zawierających wektory MagnICON modułu 5' (pICH15879), modułu 3' zawierającego docelowy gen GFP lub DsRed (pICH-GFP lub pICH-DsRed) i integrazy (pCH14011) na płytkach agarowych LB zawierających karbenicylinę (100 μg / ml).</li>
	<li>Z pojedynczej kolonii na płytce agarowej LB zaszczepić szczepy GV3101 zawierające wektory geminiwirusowe w 3 ml pożywki YENB (0,75% ekstraktu drożdżowego Bacto, 0,8% bulionu odżywczego, dostosować pH do 7,5 za pomocą NaOH) + kanamycyny (100 μg / ml) w 15 ml probówce do hodowli okrągłodennej, wyhodować płynną kulturę w temperaturze 30 °C w wytrząsarce przez noc z prędkością obrotową 300 obr./min.</li>
	<li>Podobnie, zaszczepij i hoduj szczepy GV3101 zawierające wektory MagnICON w pożywce YENB + karbenicylina (100 μg/ml) w wytrząsarce przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Zmierzyć i zapisać wartości OD600 dla każdej ciekłej kultury za pomocą spektrofotometru i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (V sub) do subhodowli dla nowej kultury o początkowym OD600 wynoszącym 0,025 w 10 ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami. 
	Vsub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD600</li>
	<li>Przenieść Vsub (ml) hodowli przez noc do (10 - Vsub) ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami dla każdego szczepu. Nową kulturę należy uprawiać przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce z prędkością obrotową 250 obr./min, aż wartość OD600 znajdzie się w zakresie 1,7-2,0.</li>
	<li>Zmierzyć i zapisać wartości OD600 dla każdej ciekłej kultury i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (Vinf), którą należy rozcieńczyć w 50 ml buforu infiltracyjnego, aby uzyskać końcowy OD600 0,12 dla każdego szczepu. 
	Vinf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD600</li>
	<li>Przenieść Vinf (ml) każdej kultury do probówki mikrowirówki i odwirować komórki przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforze infiltracyjnym (10 mM MES, pH 5,5; 10 mMMgSO4) przez krótkie wirowanie.</li>
	<li>Wymieszać zawieszone komórki pBYGFP + pREP110 + p19, odwirować komórki w temperaturze 12 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić w sumie 50 ml buforu infiltracyjnego. Ta kombinacja agrobakterii służy do geminiwirusowej ekspresji GFP.</li>
	<li>Podobnie, wymieszaj następujące kombinacje komórek Agrobacteria, odwiruj je i ponownie zawieś w 50 ml buforu infiltracyjnego. Obejmują one (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 dla geminiwirusowej ekspresji DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110 + p19 dla koekspresji geminiwirusa GFP i DsRed, (3) pREp110 + p19 jako negatywna kontrola ekspresji geminiwirusa, (4) pICH-GFP + pICH15879 + pCH14011 dla ekspresji MagnICON GFP, (5) pICH-DsRed + pICH15879 + pCH14011 dla ekspresji MagnICON oraz (6) pICH15879 + pCH14011 jako kontrola negatywna dla ekspresji MagnICON.</li>
</ol>
2.2 Przygotowanie do infiltracji próżniowej
<ol>
	<li>Zaszczepić i wyhodować każdy szczep GV3101 zawierający wektory geminiwirusowe lub wektory MagnICON w 15 ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami w 50 ml autoklawizowanej kolbie i hodować przez noc, jak opisano powyżej dla infiltracji strzykawki.</li>
	<li>Zmierzyć i zapisać wartości OD600 dla każdej ciekłej kultury za pomocą spektrofotometru i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (Vsub) do subhodowli dla nowej kultury o początkowym OD600 wynoszącym 0,025 w 250 ml pożywki YENB z odpowiednimi antybiotykami><.
	Vsub (ml) = (250 ml) x (0,025) / OD600</li>
	<li>Przenieść Vsub (ml) nocnej hodowli do (250 - Vsub) ml pożywki YENB w autoklawizowanej kolbie o pojemności 1 l z odpowiednimi antybiotykami dla każdego szczepu i hodować nową kulturę przez noc, jak opisano powyżej dla infiltracji strzykawki.</li>
	<li>Zmierzyć i zapisać wartości OD600 dla każdej ciekłej kultury i użyć poniższego wzoru do obliczenia niezbędnej objętości (Vinf), którą należy rozcieńczyć w 3 litrach buforu infiltracyjnego, aby uzyskać końcowy OD600 0,12 dla każdego szczepu. 
	Vinf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD600</li>
	<li>Osadzać i ponownie zamieszać Vinf (ml) każdej kultury w buforze infiltracyjnym zgodnie z opisem dla infiltracji strzykawki i wymieszać ponownie zawieszone kultury zgodnie z kombinacjami opisanymi dla infiltracji strzykawki. Ponownie otocz wymieszane komórki agrobakterii i umieść je ponownie w 3 l buforu infiltracyjnego.</li>
</ol>
3. Infiltracja
3.1 Infiltracja strzykawki
<ol>
	<li>Wybierz cztery 6-tygodniowe rośliny N. benthamiana z 5 liśćmi każda. Pierwsze trzy liście, licząc od wierzchołka każdej rośliny, zostaną całkowicie zinfiltrowane jedną z kombinacji szczepów A. tumefaciens w buforze infiltracyjnym. Czwarty liść zostanie naciekany punktowo wszystkimi czterema kombinacjami szczepów do ekspresji geminiwirusa lub wszystkimi trzema kombinacjami do ekspresji MagnICON. Ostatni liść na każdej roślinie zostanie zinfiltrowany kombinacjami kontroli ujemnych.</li>
	<li>Utwórz małe nacięcie za pomocą igły w naskórku na tylnej stronie liścia (ryc. 2A). Uwaga: uważaj, aby nie zadrapać tak mocno, aby przebić liść z obu stron, ponieważ komórki Agrobacteria w mieszaninie infiltracyjnej przejdą przez nakłucie na drugą stronę liścia.</li>
	<li>Chwyć mocno przednią stronę liścia i delikatnie wywierając przeciwny nacisk na nacięcie kciukiem jednej ręki, wstrzyknąć mieszaniny Agrobacterium w buforze infiltracyjnym do nacięcia za pomocą strzykawki bez igły (ryc. 2B). Uwaga: Gdy mieszanina Agrobacterium dostanie się do przestrzeni międzykomórkowej liścia, naciekany obszar zmieni widocznie kolor na ciemnozielony (ryc. 2C).</li>
	<li>Kontynuuj wstrzykiwanie mieszanin Agrobacterium do nacięcia, aż ciemniejsze zielone kółko przestanie się rozszerzać. Utwórz kolejne nacięcie i powtarzaj kroki 3.1.2-3.1.4, aż cały liść zostanie naciekany i cały liść zmieni kolor na ciemnozielony dla pierwszych trzech liści i ostatniego liścia.</li>
	<li>W przypadku czwartego liścia każdej rośliny wszystkie cztery (wektor geminiwirusowy) lub trzy (wektor MagnICON) kombinacje zostaną do niej przeniknięte. Zrób jedno nacięcie dla każdej kombinacji szczepów Agrobacterium i zinfiltruj każde nacięcie jedną kombinacją.</li>
	<li>Po infiltracji przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka między 2-15 dniem po infiltracji (dpi).</li>
</ol>
3.2 Infiltracja próżniowa
<ol>
	<li>Umieścić wannę w eksykatorze próżniowym i przenieść do niej 3 l buforu infiltracyjnego zawierającego szczepy Agrobacterium. Podłączyć eksykator do membranowej pompy próżniowej Vacuubrand (Rysunek 3A).</li>
	<li>Umieść roślinę do góry nogami na płycie eksykatora (Rysunek 3B) i opuść płytkę wraz z rośliną, aż cały system liści i łodyg zostanie zanurzony w buforze infiltracyjnym z płytką spoczywającą na górze wanny. Umieść O-ring eksykatora wzdłuż krawędzi i umieść pokrywę eksykatora na komorze (Rysunek 3C).</li>
	<li>Włącz pompę próżniową i rozpocznij odmierzanie czasu, gdy podciśnienie osiągnie 100 mbar. Powoli otwórz zawór spustowy na eksykatorze po 1 minutach przy ciśnieniu 100 mbar, aby umożliwić przedostanie się agrobakterii do przestrzeni śródmiąższowych zanurzonej tkanki roślinnej. Powtórz ten krok jeszcze jeden raz, aby zapewnić dobrą infiltrację.</li>
	<li>Po infiltracji wyjąć roślinę z eksykatora i ustawić ją z powrotem w pozycji pionowej. Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka w zakresie 2-15 dpi.</li>
</ol>
4. Wykrywanie i fotografowanie białek fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Zaczynając od 2 dpi, przenieś rośliny do ciemnego pomieszczenia i skieruj światło UV na tylną stronę infiltrowanych liści za pomocą ręcznej lampy UV.</li>
	<li>Obserwuj zieloną fluorescencję GFP lub czerwoną fluorescencję DsRed. GFP emituje silniejszy sygnał w przypadku długofalowego światła UV, podczas gdy DsRed jest silniejszy w przypadku krótkofalowego światła UV.</li>
	<li>Rób zdjęcia fluorescencyjnych liści zwykłym aparatem cyfrowym bez lampy błyskowej.</li>
	<li>Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostu po obserwacji lub fotografii.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22Transgenic+Horticultural+Crops%3A+Challenges+and+Opportunities+-+Essays+by+Experts%22">Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts</a>. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).</li>
<li>Chen, Q., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Plant-derived virus-like particles as vaccines.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).</li>
<li>Landry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+development+of+plant-made+virus-like+particle+vaccine+against+avian+H5N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza.</a> PLoS One. 5, e15559(2010).</li>
<li>Lai, H., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocessing+of+plant-derived+virus-like+particles+of+Norwalk+virus+capsid+protein+under+current+Good+Manufacture+Practice+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.</a> Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Pharmaceutical+Proteins+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants.</a> Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+new+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biopharm.+Rev%22%5BJournal%5D)">Turning a new leaf.</a> European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22New+Generation+Vaccines%22">New Generation Vaccines</a>. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).</li>
<li>Lai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+produced+in+plants+efficiently+treats+West+Nile+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).</li>
<li>Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+porcine+prorelaxin+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).</li>
<li>Lico, C., Chen, Q., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.</a> J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).</li>
<li>Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geminiviral+vectors+based+on+bean+yellow+dwarf+virus+for+production+of+vaccine+antigens+and+monoclonal+antibodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vaccin%22%5BJournal%5D)">Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants.</a> Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+mutagenesis%2C+and+oligomerization+of+DsRed%2C+a+red+fluorescent+protein+from+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).</li>
<li>Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li>
<li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).</li>
<li>Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+replicon+system+for+rapid+high-level+production+of+virus-like+particles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).</li>
<li>Santi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+plant+viral+expression+system+generating+orally+immunogenic+Norwalk+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles.</a> Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).</li>
<li>He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+System+for+Rapid+and+Cost-Effective+Production+of+Detection+and+Diagnostic+Reagents+of+West+Nile+Virus+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+rapid+production+of+full-size+monoclonal+antibodies+in+plants+by+a+single-vector+DNA+replicon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).</li>
<li>Kuta, D., Tripathi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-induced+hypersensitive+necrotic+reaction+in+plant+cells%3A+a+resistance+response+against+Agrobacterium-mediated+DNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+immunogenic+Ebola+immune+complex+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonreplicating+subunit+vaccine+protects+mice+against+lethal+Ebola+virus+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).</li>
<li>Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus-like particles as vaccines.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Tech.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Rosnące na całym świecie zapotrzebowanie na farmaceutyki białkowe wymaga nowych platform produkcyjnych, które są solidne, skalowalne, tanie i bezpieczne. Rośliny okazały się jednym z najbardziej obiecujących alternatywnych systemów produkcji białek farmaceutycznych. W ostatnich latach opracowanie zdekonstruowanych wektorów opartych na wirusach umożliwiło przejściową ekspresję białek w roślinach, co znacznie zwiększa szybkość i wydajność roślinnych systemów ekspresyjnych 2,10. Aby jeszcze bardziej zoptymalizowa...

Od lat siedemdziesiątych rośliny są badane jako alternatywa dla hodowli komórek ssaków, owadów i bakterii do komercyjnej produkcji rekombinowanych białek i terapii białkowych 1. Roślinne systemy do ekspresji biofarmaceutyków okazały się obiecujące w ostatnich latach, ponieważ kilka nowatorskich metod leczenia chorób, takich jak choroba Gauchera 2 i ptasia grypa H5N1 3, odniosło sukces w badaniach klinicznych. Rozwój kompetentnych mechanizmów ekspresji białek rekombinowanych w roślinach w ciągu dziesięcioleci, które upłynęły od tych początkowych eksperymentów, stworzył potencjał dla systemów roślinnych do zmiany obecnego paradygmatu produkcji białek z trzech głównych powodów. Po pierwsze, nastąpił znaczny spadek kosztów, ponieważ bioreaktory ssaków, owadów i bakterii wymagają znacznych kosztów rozruchu, drogich pożywek wzrostowych i skomplikowanych procesów oczyszczania 4. Stworzenie stabilnych transgenicznych linii roślinnych pozwala im również wyprzedzić skalowalność innych systemów ekspresji, ponieważ rośliny wykazujące ekspresję białka mogą być uprawiane i zbierane na skalę rolniczą 5. Po drugie, roślinne systemy ekspresji znacznie zmniejszają ryzyko przeniesienia ludzkiego lub zwierzęcego patogenu z gospodarza wykazującego ekspresję białka na człowieka, co świadczy o ich wyższości w zakresie bezpieczeństwa publicznego 6. Wreszcie, rośliny wykorzystują eukariotyczny system endomembranowy, który jest podobny do komórek ssaków, co pozwala na prawidłową potranslacyjną modyfikację białek, w tym glikozylację i składanie białek wielopodjednostkowych 7. Ta zdolność stawia systemy roślinne przed tymi opartymi na systemach prokariotycznych, takich jak bakterie, ponieważ większa liczba farmaceutycznych białek rekombinowanych, w tym przeciwciał monoklonalnych (mAb), ma bardziej skomplikowaną strukturę i wymaga rozległych modyfikacji potranslacyjnych lub składania 8.
Istnieją dwa główne podejścia do wyrażania białek rekombinowanych w roślinach. Pierwszym z nich jest opracowanie stabilnej linii transgenicznej, w której DNA kodujące białko docelowe jest klonowane do kasety ekspresyjnej i wprowadzane do genomu jądrowego lub chloroplastowego. W ten sposób obce DNA staje się dziedziczne przez kolejne pokolenia i pozwala na ogromnie lepszą skalowalność, znacznie przewyższającą inne systemy ekspresji 1. Wprowadzenie egzogennego DNA do genomu jądrowego następuje zwykle poprzez zakażenie tkanki roślinnej przez Agrobacterium tumefaciens lub, rzadziej, przez bombardowanie tkanki mikropociskami 9. Hormony roślinne są następnie wykorzystywane do indukowania różnicowania i wzrostu transgenicznych tkanek roślinnych, takich jak korzenie i liście. Transformacja genomu chloroplastów nie może być osiągnięta za pomocą A. tumefaciens, ale opiera się całkowicie na cząsteczkach złota lub wolframu pokrytych DNA wystrzeliwanym balistycznie do komórek roślinnych. Drugą metodą ekspresji białka rekombinowanego w roślinach jest ekspresja przejściowa 10. W tym scenariuszu wektory pochodzące od wirusa, które zawierają gen będący przedmiotem zainteresowania, są dostarczane przez A. tumefaciens do w pełni rozwiniętych roślin w procesie zwanym agroinfiltracją. Zamiast integrować się z genomem rośliny, dostarczony konstrukt genu zacznie kierować przejściową produkcją pożądanego białka, które można zebrać i wyizolować po krótkim okresie inkubacji. Przejściowa ekspresja genów ma tę zaletę, że zapewnia większą ogólną akumulację białka, a także lepszy czas produkcji białka, ponieważ rośliny będą gotowe do zbiorów około 1-2 tygodnie po agroinfiltracji 11. Jest to znacznie szybsze niż procesy generowania, selekcji i potwierdzania stabilnych linii roślin transgenicznych, które mogą trwać od kilku miesięcy do roku. Jest to jednak również ograniczenie systemu ekspresji przejściowej, ponieważ nie da on genetycznie stabilnych linii roślin, które można wykorzystać do wygenerowania banku nasion do produkcji komercyjnej na dużą skalę. Mimo to opracowano podejścia mające na celu poprawę ekspresji przejściowej na dużą skalę. Tutaj pokazujemy jedną z metod generowania przejściowych roślin Nicotiana benthamiana wykazujących ekspresję białka przy użyciu zdekonstruowanych wektorów wirusowych dostarczanych przez A. tumefaciens.
Opracowywane są dwie główne metody dostarczania A. tumefaciens do tkanek roślinnych: infiltracja na skali laboratoryjnej za pomocą strzykawki i infiltracja na dużą skalę za pomocą komory próżniowej. Oba protokoły zostały opisane tutaj przy użyciu N. benthamiana, która jest blisko spokrewniona z pospolitą rośliną tytoniu, jako roślina żywicielska dla przejściowej ekspresji dwóch białek fluorescencyjnych: białka zielonej fluorescencji (GFP) z meduzy Aequorea victoria i białka czerwonej fluorescencji z Discosoma coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana jest najczęstszą rośliną żywicielską dla białka rekombinowanego, ponieważ jest podatna na transformację genetyczną, może szybko wytwarzać duże ilości biomasy i jest płodnym producentem nasion do produkcji na dużą skalę 14. Kolejną zaletą stosowania N. benthamiana jako gospodarzy do ekspresji białek jest dostępność różnorodnych wektorów ekspresyjnych 2,5. W tym badaniu dwa zdekonstruowane wektory wirusowe, jeden oparty na systemie replikonów RNA wirusa mozaiki tytoniu (TMV) (wektory MagnICON), a drugi pochodzący z systemu replikonów DNA wirusa żółtego karła fasoli (BeYDV) (wektory geminiwirusowe) 4,11,15-18 , są używane do przenoszenia genu GFP i DsRed i dostarczania ich do komórek N. benthamiana za pośrednictwem A. tumefaciens. Trzy konstrukty DNA zostaną wykorzystane do ekspresji GFP lub DsRed za pomocą wektorów MagnICON. Obejmują one moduł 5' (pICH15879) zawierający promotor i inne elementy genetyczne do kierowania ekspresją genu docelowego, moduł 3' zawierający gen będący przedmiotem zainteresowania (pICH-GFP lub pICH-DsRed) oraz moduł integrazy (pICH14011) kodujący enzym, który integruje moduły 5' i 3' razem po ekspresji 8,15. Trzy konstrukty DNA są również potrzebne do ekspresji z wektorami geminiwirusowymi. Oprócz wektorów zawierających replikon genu docelowego ( pBYGFP lub pBYDsRed), do amplifikacji docelowego replikonu 11,14,16 wymagane jest kodowanie wektorowe białka replikacyjnego (pREP110). Ponadto pożądane jest włączenie wektora kodującego supresor wyciszający p19 z wirusa karłowatości pomidora dla ekspresji genów docelowych wysokiego poziomu 11,16.
Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy główne etapy wprowadzania genów białek rekombinowanych do komórek roślinnych poprzez agroinfiltrację, w tym wzrost roślin, przygotowanie kultury A. tumefaciens i infiltracja. Ponieważ każdy krok ma kluczowe znaczenie dla ostatecznego sukcesu tej procedury, poniżej znajduje się szczegółowy opis każdego z nich zarówno dla infiltracji strzykawki, jak i infiltracji próżniowej.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reodczynniki</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> Zobacz odniesienie: Lico i Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> Zobacz odniesienie: Baird i Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector</td><td>Icon Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> Zobacz odniesienie: giritch i Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral</td><td>Vector Author' s Lab</td><td>n/a</td><td>Zobacz odniesienie: Chen and He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Author' s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens szczep gv3101</td><td>Autor' s Lab</td><td>n/a</td><td>Zobacz odniesienie: Lai i Chen 2012</td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin-100, płytki</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamycin-50, płytki</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu hepa hydrat</td><td>Sigma</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Bacto</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Bulion</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES hydrate Buffer</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>70560-51-9</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td></td> <td>221465<a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Jack' s Nawóz</td><td>Hummert International</td><td>25 lipca</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 Pompa próżniowa</td><td>Fisher</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Powietrze próżniowe Zawór regulacyjny</td><td>Fisher</td><td>NC9386590</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Eksykator 12 1/8" z O-ringiem</td><td>Fisher</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3 L Pojemnik</td><td>Rubber-Maid</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn' Miska oszczędnościowa, 10 filiżanek będzie działać</td></tr><tr><td>talerz/półka 230ML</td><td>Fisher</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Peat Pellet</td><td>Hummert International</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>Taca do rozmnażania Kopuła</td><td>hydrofarm</td><td>132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Hydrofarm z tacą propagacyjną</td><td></td><td>138758</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Siewnik ręczny Virbo</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank" >www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>Flora Cart 4 półki</td><td>Hummert International</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 ml Probówki hodowlane z okrągłym dnem</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Kuwety</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><<td>a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Inkubator/Wytrząsarka</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank"> www.eppendorf.com</a></td></tr><tr><td>Model światła ultrafioletowego#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Hodowla komórek ssaków jest główną platformą do komercyjnej produkcji szczepionek ludzkich i białek terapeutycznych. Nie jest jednak w stanie sprostać rosnącemu światowemu zapotrzebowaniu na farmaceutyki ze względu na ograniczoną skalowalność i wysokie koszty. Zakłady okazały się jedną z najbardziej obiecujących alternatywnych platform produkcji farmaceutycznej, które są solidne, skalowalne, tanie i bezpieczne. Niedawny rozwój wektorów opartych na wirusach umożliwił szybką i przejściową ekspresję białek rekombinowanych na wysokim poziomie w roślinach. Aby jeszcze bardziej zoptymalizować użyteczność systemu ekspresji przejściowej, w tym badaniu demonstrujemy prostą, wydajną i skalowalną metodologię wprowadzania docelowego genu zawierającego Agrobacterium do tkanki roślinnej. Nasze wyniki wskazują, że agroinfiltracja zarówno metodą strzykawkową, jak i próżniową doprowadziła do skutecznego wprowadzenia Agrobacterium do liści i solidnej produkcji dwóch białek fluorescencyjnych; GFP oraz DsRed. Ponadto pokazujemy wyjątkowe zalety oferowane przez obie metody. Infiltracja strzykawkowa jest prosta i nie wymaga drogiego sprzętu. Pozwala również na elastyczność w infiltracji całego liścia za pomocą jednego genu docelowego lub wprowadzenia genów wielu celów na jednym liściu. Dzięki temu może być stosowany do ekspresji białek rekombinowanych w skali laboratoryjnej, a także do porównywania różnych białek lub wektorów pod kątem wydajności lub kinetyki ekspresji. Prostota infiltracji strzykawkowej sugeruje również jej przydatność w edukacji szkolnej i studenckiej w zakresie biotechnologii. Natomiast infiltracja próżniowa jest bardziej niezawodna i może być skalowana do komercyjnej produkcji białek farmaceutycznych. Zaletą jest również możliwość agroinfiltracji gatunków roślin, które nie są podatne na infiltrację strzykawkową, takich jak sałata i rzodkiewnik. Ogólnie rzecz biorąc, połączenie agroinfiltracji strzykawkowej i próżniowej zapewnia naukowcom i edukatorom prostą, wydajną i solidną metodologię przejściowej ekspresji białek. Znacznie ułatwi to rozwój białek farmaceutycznych i będzie promować edukację w zakresie nauk ścisłych.

1. Ekspresja białek fluorescencyjnych poprzez infiltrację strzykawką
Aby zademonstrować skuteczność infiltracji tkanek roślinnych za pomocą strzykawki z Agrobacterium, przetestowano ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych – GFP i DsRed – przy użyciu dwóch różnych zrekonstruowanych wektorów wirusowych roślin – geminiwirusowego i MagnICON – w N. benthamiana. W liściach N. benthamiana, które zostały w całości infiltrowane Agrobacteria zawierającymi wektory gemini...

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Ten system eksperymentalny wykorzystuje agroinfiltrację w celu skutecznego dostarczenia konstruktów genowych do liści dla produkcji wysokich poziomów białka rekombinowanego. Najpierw należy hodować rośliny end hamana w kontrolowanym środowisku przez sześć tygodni, do trzech dni przed infiltracją. W dniu infiltracji przygotuj kultury agrobacterium zawierające gen docelowy, który ma zostać wyeksponowany w roślinach.Wprowadź kultury agrobakterii do tkanki roślinnej za pomocą strzykawki lub infiltracji próżniowej. Wyniki, takie jak intensywność zielonej fluorescencji GFP w liściach tytoniu pod wpływem światła UV, wykazują silną ekspresję białek rekombinowanych w roślinach, która dorównuje obecnym systemom ekspresyjnym opartym na ssakach, bakteriach i owadach. Agroinfiltracja jest skuteczną metodą wprowadzania transgenów do komórek roślinnych, co prowadzi do wysokiego poziomu ekspresji białek rekombinowanych.Metoda ta może być stosowana w odniesieniu do szerokiego zakresu gatunków roślin. Co najważniejsze, można ją skalować w celu komercyjnej produkcji białek farmaceutycznych. Dzięki temu metoda ta pozwala na analizę kinetyki i ekspresji GFP oraz może być zastosowana do innych białek, takich jak szczepionki podjednostkowe i rekombinowane przeciwciała monoklonalne, a także w terapiach nowotworów i chorób zakaźnych.Pomyślny przebieg eksperymentu wymaga optymalnych warunków zarówno dla hodowli bakterii, jak i materiału roślinnego. Proces infiltracji ten jest łatwiejszy do powtórzenia po zapoznaniu się z demonstracją wizualną. Rozpocznij od umieszczenia do 60 pelletów torfowych w tacy do propagacji.Dodaj cztery litry wody z kranu i pozostaw pelet torfowy na dwie godziny, aby wchłonął wodę. Następnie umieść po dwa nasiona hamana w każdym peletie torfowym i przykryj tackę przezroczystą plastikową kopułą w celu przeprowadzenia kiełkowania. Umieść nasiona w środowisku o temperaturze 25 °C i wilgotności 84%.Dwa tygodnie po wysiewie zdjąć kopułę i przenieść rośliny do nowej tacy. Następnie dodać dwa litry roztworu nawozu Jack's o stężeniu 1,48 g/l. Kontynuować hodowlę roślin w temperaturze 25 °C.Środowisko o wilgotności 50% co dwa dni. Podawaj dwa litry nawozu Jack's na każdą tacę. W czwartym tygodniu przenieś rośliny w pelletach torfowych do nowej tacy mieszczącej sześć roślin, aby kontynuować wzrost do szóstego tygodnia życia.Wybierz cztery rośliny Nicotiana benthamiana w wieku sześciu tygodni, z pięcioma do sześciu liśćmi każda. Przeznacz trzy liście do pełnej infiltracji szczepami agrobakterii zawierającymi interesujące geny. Jeden liść potraktuj jako kontrolę negatywną, a jeden liść przeznacz do infiltracji punktowej. Za pomocą igły wykonaj niewielkie nacięcie w epidermie na spodniej stronie liścia, dbając o to, aby nie przebić liścia na wylot.Mocno chwyć przednią stronę pierwszego liścia, wywierając jednocześnie delikatny nacisk przeciwstawny na szyjkę. Kciukiem jednej ręki przytrzymaj liść. Za pomocą strzykawki z igłą wstrzyknij mieszaniny agrobakterii w buforze do infiltracji w głąb szyjki.Kontynuuj wstrzykiwanie mieszanin agrobacterium do nacięcia, aż ciemnozielony krąg przestanie się powiększać. Następnie wykonaj kolejne nacięcie i powtarzaj wstrzykiwania, aż cały liść zostanie zinfiltrowany i nabierze ciemnozielonego koloru. Przeprowadź pełną infiltrację trzech pierwszych liści, a w przypadku czwartego liścia każdej rośliny zastosuj infiltrację kombinacjami wektorów składającymi się albo z czterech wektorów wirusowych Gemini, albo z trzech wektorów magcon.Następnie wykonaj jedno nacięcie dla każdej kombinacji szczepów agrobacterium i wprowadź do każdego nacięcia jedną kombinację. Po infiltracji przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka w okresie od 2 do 15 dni. Po infiltracji umieść kuwetę w desykatorze próżniowym i przelej trzy litrami buforu do infiltracji zawierającego szczepy agrobacterium.Następnie podłącz deskryptor do membranowej pompy próżniowej znanej marki. Teraz umieść roślinę odwróconą do góry nogami na płytce deskryptora i opuszczaj płytkę z rośliną, aż cały system liścia i łodygi zostanie zanurzony w buforze infiltracyjnym, a płytka spocznie na górnej krawędzi kuwety. Następnie umieść uszczelkę typu O-ring wzdłuż krawędzi deskryptora.Po nałożeniu pokrywy desykatora na komorę, włącz pompę próżniową i rozpocznij pomiar czasu w momencie, gdy ciśnienie próżni osiągnie 100 millibar. Po wyłączeniu pompy próżniowej, po jednej minucie przy ciśnieniu 100 millibar, powoli otwórz zawór wypuszczający w desykatorze, aby umożliwić wniknięcie bakterii *Agrobacterium* w przestrzenie międzykomórkowe zanurzonej tkanki roślinnej. Powtórz proces infiltracji.Wykonaj inkubację przez jedną godzinę, aby zapewnić dobrą infiltrację. Następnie wyjmij roślinę z urządzenia do wysysania i ustaw ją ponownie w pozycji pionowej. Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka od drugiego do 15. dnia po infiltracji.Aby zademonstrować skuteczność infiltracji tkanki roślinnej agrobakteriami za pomocą strzykawki, przetestowano ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych, GFP i Ds red, przy użyciu dwóch różnych zdekonstruowanych wirusowych wektorów roślinnych: Gemini viral oraz magcon for end. Liście Hamana zostały w całości poddane infiltracji agrobakteriami zawierającymi wektory Gemini viral. Ekspresję GFP zaobserwowano na całej powierzchni liścia pod światłem UV, poczynając już od 2 DPI, a szczyt akumulacji osiągnięto w 4 DPI.W przeciwieństwie do nich, liście infiltrowane wektorem magcon zawierającym kombinacje agrobakterii wykazały fluorescencję GFP dopiero po pięciu DPI, a jej maksymalne nagromadzenie osiągnięto w siódmym DPI. Nie zaobserwowano zielonej fluorescencji w liściach infiltrowanych ujemnymi kontrolnymi mieszaninami agro-bakterii EP one 10 plus P 19, co wskazuje, że fluorescencja była specyficzna dla genu GFP i nie wynikała z autofluorescencji liści. W szczycie nagromadzenia fluorescencja GFP wyrażona za pomocą wektora magcon jest bardziej intensywna niż ta z wektora wirusowego Gemini.Nie zaobserwowano istotnej nekrozy na liściach infiltrowanych konstruktami GFP; gdy oba białka fluorescencyjne były eksponowane na tym samym liściu za pomocą wirusowych wektorów Gemini poprzez infiltrację strzykawkową, wykryto je w oczekiwanych kolorach fluorescencyjnych w miejscu infiltracji. Co ciekawe, ko-infiltracja GFP i DS RED doprowadziła do powstania żółtawej fluorescencji. Zbadano również infiltrację próżniową w celu opracowania skalowalnej metody agroinfiltracji, która mogłaby być wykorzystana do wielkoskalowej produkcji białek rekombinowanych w systemach przejściowej ekspresji roślinnej.Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano fluorescencję GFP we wszystkich liściach rośliny poddanej infiltracji w porównaniu z infiltracją za pomocą strzykawki. Metoda ta jest bardziej skuteczna i pozwala na przeprowadzenie infiltracji każdej rośliny w znacznie krótszym czasie. Po opanowaniu techniki proces ten można zrealizować w ciągu 48 godzin.Większość czasu przeznaczona jest na hodowlę bakterii z rodzaju Agrobacterium, ponieważ właściwy czas infiltracji trwa zaledwie kilka minut. W celu uzyskania optymalnej wydajności agroinfiltracji i ukierunkowanej ekspresji białek należy postępować zgodnie z protokołem. Pamiętaj o kontrolowaniu krytycznych parametrów, w tym warunków wzrostu roślin, stężenia Agrobacterium, ciśnienia próżni oraz czasu trwania procesu w dziedzinie biotechnologii roślin.To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania rozwoju i bioprodukcji nowych białek farmaceutycznych w szerokim zakresie gatunków roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak wykorzystać agroinfiltrację do wprowadzenia docelowych konstruktów genowych do rośliny oraz jak umożliwić systemom przejściowej ekspresji roślinnej produkcję białka rekombinowanego, dorównującego temu uzyskiwanemu z hodowli komórek ssaków, bakterii i owadów.

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczne agroinfiltracja roślin dla wysokiego poziomu przejściowej ekspresji białek rekombinowanych

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Opisujemy tutaj prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP u Nicotiana benthamiana. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie i wizualizację wielu białek, które wykorzystują chromatografię kolumnową. Co więcej, protokół można dostosować do osobistego i wirtualnego laboratorium dydaktycznego w college'u, zapewniając eksplorację opartą na projektach.

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Tutaj prezentujemy pierwszy protokół miejscowej infiltracji próżniowej do badań in vivo genetycznej transformacji dużych roślin. Korzystając z tej metodologii, po raz pierwszy uzyskaliśmy przejściową transformację kakao za pośrednictwem Agrobacterium.

Agroinfiltracja wymuszona próżnią w celu transformacji in planta roślin opornych: kakao jako studium przypadku

Poznaj metodę agroinfiltracji roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie. Technika ta umożliwia skuteczną produkcję białek farmaceutycznych w tkankach roślinnych.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Przeglądaj więcej filmów