Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie
23 lipca 2013
Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.
Ten eksperymentalny system wykorzystuje infiltrację agro do skutecznego dostarczania konstruktów genów do liści w celu produkcji wysokiego poziomu białka rekombinowanego. Po pierwsze, hoduj rośliny hamany w kontrolowanym środowisku przez sześć tygodni, trzy dni przed infiltracją. Przygotować kultury agrobacterium, które zawierają gen docelowy, który ulega ekspresji w roślinach w dniu infiltracji.
Wprowadź kultury agrobacterium do tkanki roślinnej za pomocą strzykawki lub infiltracji próżniowej. Wyniki, takie jak intensywność zielonej fluorescencji GFP w liściach tytoniu w świetle UV, wskazują na silną ekspresję rekombinowanych białek w roślinach, która rywalizuje z obecnymi systemami ekspresji opartymi na bakteriach i owadach u ssaków. Agroinfiltracja jest skutecznym sposobem wprowadzania genów trans do komórek roślinnych, które prowadzą do wysokiego poziomu ekspresji rekombinowanych białek.
Może być stosowany do szerokiej gamy gatunków roślin. Co najważniejsze, można go zwiększyć do komercyjnej produkcji białek farmaceutycznych. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w kinetykę i ekspresję GFP i może być stosowana do innych białek, takich jak szczepionki podjednostkowe, rekombinowane przeciwciała monoklonalne i może być stosowana w leczeniu raka i chorób zakaźnych.
Udany eksperyment wymaga optymalnych warunków zarówno dla hodowli bakterii, jak i materiału roślinnego. Ten proces infiltracji jest łatwiejszy do odtworzenia po wizualnej demonstracji. Zacznij od umieszczenia do 60 granulek torfu na tacy rozmnożeniowej.
Dodaj cztery litry wody z kranu i pozwól granulkom groszku wchłonąć wodę przez dwie godziny. Teraz dodaj dwa nasiona hamany do każdej granulki torfu i przykryj tacę przezroczystą plastikową kopułą do kiełkowania. Umieść nasiona w środowisku o temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 84%.
Dwa tygodnie po wysianiu zdejmij kopułę i przenieś rośliny na nową tacę. Następnie dodaj dwa litry po 1,48 grama na litr. Nawóz Jacka Kontynuuj uprawę roślin w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
50% wilgotności środowiska co dwa dni. Dostarcz dwa litry nawozu jack's na tacę. W czwartym tygodniu przenieś rośliny z granulkami torfu na nową tacę, na której znajduje się sześć roślin do dalszego wzrostu do szóstego tygodnia życia.
Wybierz cztero-, sześciotygodniowe i hamama rośliny z pięcioma do sześciu liściami, z których każdy ma trzy liście, aby całkowicie infiltrować szczepy agrobakterii zawierające interesujące geny. Jeden liść do kontroli ujemnej i jeden liść do infiltracji punktowej. Stwórz małe nacięcie igłą w naskórku na odwrocie liścia, uważając, aby nie przebić liścia z obu stron.
Chwyć mocno przednią stronę pierwszego liścia, jednocześnie delikatnie wywierając przeciwny nacisk na szyję. Kciukiem jednej ręki. Wstrzyknąć mieszaniny agrobacterium w buforze infiltracyjnym w szyję za pomocą strzykawki, igły.
Kontynuuj wstrzykiwanie mieszanin agrobacterium do nacięcia, aż ciemniejsze zielone kółko przestanie się rozszerzać. Następnie utwórz kolejne nacięcie i powtarzaj wstrzyknięcia, aż cały liść zostanie nacieknięty i cały liść zmieni kolor na ciemnozielony. Pełne infiltracje pierwszych trzech liści i ostatniego liścia czwartego liścia każdej rośliny infiltrują kombinacje wektorów wszystkich czterech wektorów wirusowych Gemini lub trzech wektorów magcon.
Zrób również jedno nacięcie dla każdej kombinacji szczepów agrobacterium i naciekaj każde nacięcie jedną kombinacją. Po infiltracji przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka między dwoma a 15 dniami. Po infiltracji umieścić wannę w próżniowym osuszaczu i przenieść do trzech litrów buforu infiltracyjnego zawierającego szczepy Agrobacterium.
Następnie podłącz osuszacz do membranowej pompy próżniowej marki próżniowej. Teraz umieść roślinę do góry nogami na płytce osuszającej i opuść płytkę z rośliną, aż cały system liści i łodyg zostanie zanurzony w buforze infiltracyjnym z płytką spoczywającą na górze wanny. Następnie umieść o-ring osuszający wzdłuż obręczy.
Po założeniu pokrywy osuszającej na komorę włącz pompę próżniową i rozpocznij odmierzanie czasu, gdy próżnia osiągnie 100 milibarów. Po wyłączeniu pompy próżniowej powoli otwórz zawór spustowy na osuszaczu po jednej minucie przy 100 milibarach, aby umożliwić przedostanie się agrobakterii do przestrzeni śródmiąższowych zanurzonej tkanki roślinnej. Powtórz tę infiltrację.
Kroki pierwsze, aby zapewnić dobrą infiltrację. Następnie wyjmij roślinę z wysuszacza i umieść ją z powrotem w pozycji pionowej. Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka między dwoma a 15 dniami po infiltracji.
Aby zademonstrować skuteczność strzykawki, infiltracji agrobacterium do tkanki roślinnej, przetestowaliśmy ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych, GFP i Ds red przez dwa różne zdekonstruowane roślinne wektory wirusowe, Gemini, wirus i magcon for end. Liście Hamana, które były całkowicie przesiąknięte agrobakteriami zawierającymi wektory wirusowe Gemini. Ekspresję GFP obserwowano na całej powierzchni liści w świetle UV, począwszy od 2D PI i osiągała szczytową akumulację przy czterech DPI.
Natomiast liście naciekane wektorem magcon zawierającym kombinacje agrobacterium wykazywały fluorescencję GFP dopiero po pięciu DPI i osiągały maksymalną akumulację przy siedmiu DPI. Nie zaobserwowano zielonej fluorescencji z liści naciekanych negatywnymi mieszaninami agrobakterii kontrolnych EP one 10 plus P 19, co wskazuje, że fluorescencja była specyficzna dla genu GFP i nie była wynikiem fluorescencji tła liści. W szczytowej akumulacji fluorescencja wektora magcon wyrażona do GFP jest bardziej intensywna niż w przypadku wektora wirusowego Gemini.
Nie zaobserwowano większej martwicy na liściach naciekanych konstruktami GFP, gdy oba białka fluorescencyjne ulegały ekspresji na tym samym liściu za pośrednictwem wektorów wirusowych Gemini z infiltracją plamki strzykawki, wykryto je z oczekiwanym kolorem fluorescencyjnym w miejscu, w którym zostały nacieknięte. Co ciekawe, jednoczesna infiltracja GFP i DS RED powodowała żółtawą fluorescencję. Zbadano również infiltrację próżniową w celu opracowania skalowalnej metody agroinfiltracji, która może być wykorzystana do produkcji rekombinowanych białek na dużą skalę za pomocą roślinnych systemów ekspresji stanów nieustalonych.
Zgodnie z oczekiwaniami fluorescencję GFP zaobserwowano dla wszystkich liści infiltrowanej rośliny w porównaniu z infiltracją strzykawkową. Jest bardziej wytrzymały i może osiągnąć infiltrację każdej rośliny w znacznie krótszym czasie. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 48 godzin.
W większości przypadków jest to hodowla agrobakteryjna, ponieważ rzeczywisty czas infiltracji wynosi tylko kilka minut, co zapewnia optymalną wydajność infiltracji agro i ukierunkowaną ekspresję białka. Postępuj zgodnie z protokołem. Pamiętaj o kontrolowaniu krytycznych parametrów, w tym warunków wzrostu roślin, stężenia agrobakterii, podciśnienia i czasu trwania w dziedzinie biotechnologii roślin.
To eksperymentalne podejście może być wykorzystane do zbadania rozwoju i bioprodukcji nowych białek farmaceutycznych w szerokim zakresie gatunków roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wykorzystać infiltrację agro do dostarczania docelowych konstruktów genów do rośliny i umożliwienia roślinnym systemom ekspresji przejściowej wytwarzania rekombinowanego białka, rywalizującego z hodowlami komórek bakteryjnych i owadzich ssaków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia skalowalną metodę produkcji białek farmaceutycznych w roślinach za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Podejście to wykorzystuje agro infiltrację do dostarczania konstrukcji genowych do tkanek roślin, umożliwiając wysokie poziomy ekspresji białek rekombinowanych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia roślin
- Systemy ekspresji białek
- Produkcja farmaceutyczna
Tło
- Obecne systemy ekspresji białek mają ograniczenia w zakresie skalowalności i kosztów.
- Rośliny zapewniają bezpieczną alternatywę dla produkcji białek farmaceutycznych.
- Agrobacterium tumefaciens jest dobrze ugruntowanym narzędziem do transferu genów w roślinach.
- Tymczasowe systemy ekspresji mogą szybko przynosić wysokie poziomy białka.
Cel badania
- Opracowanie prostej i skalowalnej metody ekspresji białek w roślinach.
- Wykazanie skuteczności agro infiltracji w dostarczaniu konstrukcji genowych.
- Porównanie ekspresji w oparciu o rośliny z tradycyjnymi systemami.
Zastosowane metody
- Technika agro infiltracji do dostarczania genów.
- Użycie roślin end hamana hodowanych w kontrolowanym środowisku.
- Przygotowanie kultur Agrobacterium zawierających docelowe geny.
- Ocenie ekspresji białek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.
Główne wyniki
- Wysokie poziomy rekombinowanego białka zostały pomyślnie wyekspresowane w tkankach roślin.
- Obrazowanie fluorescencyjne wykazało silną ekspresję GFP w liściach tytoniu.
- Metoda wykazała zalety w porównaniu z systemami ssaczymi i bakteryjnymi.
- Agro infiltracja okazała się skuteczną metodą wprowadzania genów.
Wnioski
- Badanie potwierdza wykonalność stosowania roślin do produkcji białek na dużą skalę.
- Agro infiltracja jest obiecującą techniką do tymczasowej ekspresji genów.
- To podejście może zwiększyć efektywność produkcji białek farmaceutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Plant-based transient expression systems address scalability and cost limitations of mammalian cell culture for recombinant protein production. Agroinfiltration enables rapid, high-level expression of therapeutic proteins such as subunit vaccines and monoclonal antibodies. This approach supports early-stage target validation and lead identification by providing a scalable, low-cost platform for protein expression and functional screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets through high-level recombinant protein expression in planta.
- Operational Value: Provides a rapid, scalable system for protein production to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Predictive Value: Facilitates comparative assessment of protein variants, vectors, or expression kinetics for lead selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts (e.g., GFP, DsRed) for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Supports multi-target screening on single leaves via syringe infiltration for vector or construct comparison.
- Scalability: Vacuum infiltration enables scale-up for larger leaf areas and species not amenable to syringe methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces recombinant proteins in disease-relevant plant systems for preclinical evaluation.
- Mechanistic De-risking: Allows co-expression of multiple proteins (e.g., GFP and DsRed) to study interactions or fusion constructs.
- Continuity: Bridges discovery to preclinical work by providing scalable protein supply for functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
The agroinfiltration method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical protein supply, enabling rapid iteration and comparative analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via transient expression of gene constructs to assess protein function and localization.
- Screening: Enables reproducible, quantitative protein production for screening campaigns using fluorescence-based readouts.
- Analytics: Fluorescence intensity measurements under UV light provide quantitative data for comparing expression levels across conditions.
- Translational Research: Generates sufficient protein yields for downstream preclinical testing in vaccine or therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein expression across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-level transient expression reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Syringe infiltration offers simplicity and flexibility; vacuum infiltration enables robustness and scalability.
- Strategic Value: Low-cost, scalable production supports better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on protein yield, expression kinetics, and functional output.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth, Agrobacterium handling, and infiltration techniques.
- Needs controlled growth environments, infiltration buffers, and vacuum or syringe equipment.
- Standardization across teams requires consistent plant age, bacterial concentration, and infiltration parameters.
- Adaptation across species (e.g., tobacco, lettuce, Arabidopsis) may require optimization of vacuum pressure and incubation time.
- Practical limitations include species-specific infiltration efficiency and the need for fluorescence detection equipment.
