Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Ten eksperymentalny system wykorzystuje infiltrację agro do skutecznego dostarczania konstruktów genów do liści w celu produkcji wysokiego poziomu białka rekombinowanego. Po pierwsze, hoduj rośliny hamany w kontrolowanym środowisku przez sześć tygodni, trzy dni przed infiltracją. Przygotować kultury agrobacterium, które zawierają gen docelowy, który ulega ekspresji w roślinach w dniu infiltracji.

Wprowadź kultury agrobacterium do tkanki roślinnej za pomocą strzykawki lub infiltracji próżniowej. Wyniki, takie jak intensywność zielonej fluorescencji GFP w liściach tytoniu w świetle UV, wskazują na silną ekspresję rekombinowanych białek w roślinach, która rywalizuje z obecnymi systemami ekspresji opartymi na bakteriach i owadach u ssaków. Agroinfiltracja jest skutecznym sposobem wprowadzania genów trans do komórek roślinnych, które prowadzą do wysokiego poziomu ekspresji rekombinowanych białek.

Może być stosowany do szerokiej gamy gatunków roślin. Co najważniejsze, można go zwiększyć do komercyjnej produkcji białek farmaceutycznych. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w kinetykę i ekspresję GFP i może być stosowana do innych białek, takich jak szczepionki podjednostkowe, rekombinowane przeciwciała monoklonalne i może być stosowana w leczeniu raka i chorób zakaźnych.

Udany eksperyment wymaga optymalnych warunków zarówno dla hodowli bakterii, jak i materiału roślinnego. Ten proces infiltracji jest łatwiejszy do odtworzenia po wizualnej demonstracji. Zacznij od umieszczenia do 60 granulek torfu na tacy rozmnożeniowej.

Dodaj cztery litry wody z kranu i pozwól granulkom groszku wchłonąć wodę przez dwie godziny. Teraz dodaj dwa nasiona hamany do każdej granulki torfu i przykryj tacę przezroczystą plastikową kopułą do kiełkowania. Umieść nasiona w środowisku o temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 84%.

Dwa tygodnie po wysianiu zdejmij kopułę i przenieś rośliny na nową tacę. Następnie dodaj dwa litry po 1,48 grama na litr. Nawóz Jacka Kontynuuj uprawę roślin w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

50% wilgotności środowiska co dwa dni. Dostarcz dwa litry nawozu jack's na tacę. W czwartym tygodniu przenieś rośliny z granulkami torfu na nową tacę, na której znajduje się sześć roślin do dalszego wzrostu do szóstego tygodnia życia.

Wybierz cztero-, sześciotygodniowe i hamama rośliny z pięcioma do sześciu liściami, z których każdy ma trzy liście, aby całkowicie infiltrować szczepy agrobakterii zawierające interesujące geny. Jeden liść do kontroli ujemnej i jeden liść do infiltracji punktowej. Stwórz małe nacięcie igłą w naskórku na odwrocie liścia, uważając, aby nie przebić liścia z obu stron.

Chwyć mocno przednią stronę pierwszego liścia, jednocześnie delikatnie wywierając przeciwny nacisk na szyję. Kciukiem jednej ręki. Wstrzyknąć mieszaniny agrobacterium w buforze infiltracyjnym w szyję za pomocą strzykawki, igły.

Kontynuuj wstrzykiwanie mieszanin agrobacterium do nacięcia, aż ciemniejsze zielone kółko przestanie się rozszerzać. Następnie utwórz kolejne nacięcie i powtarzaj wstrzyknięcia, aż cały liść zostanie nacieknięty i cały liść zmieni kolor na ciemnozielony. Pełne infiltracje pierwszych trzech liści i ostatniego liścia czwartego liścia każdej rośliny infiltrują kombinacje wektorów wszystkich czterech wektorów wirusowych Gemini lub trzech wektorów magcon.

Zrób również jedno nacięcie dla każdej kombinacji szczepów agrobacterium i naciekaj każde nacięcie jedną kombinacją. Po infiltracji przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka między dwoma a 15 dniami. Po infiltracji umieścić wannę w próżniowym osuszaczu i przenieść do trzech litrów buforu infiltracyjnego zawierającego szczepy Agrobacterium.

Następnie podłącz osuszacz do membranowej pompy próżniowej marki próżniowej. Teraz umieść roślinę do góry nogami na płytce osuszającej i opuść płytkę z rośliną, aż cały system liści i łodyg zostanie zanurzony w buforze infiltracyjnym z płytką spoczywającą na górze wanny. Następnie umieść o-ring osuszający wzdłuż obręczy.

Po założeniu pokrywy osuszającej na komorę włącz pompę próżniową i rozpocznij odmierzanie czasu, gdy próżnia osiągnie 100 milibarów. Po wyłączeniu pompy próżniowej powoli otwórz zawór spustowy na osuszaczu po jednej minucie przy 100 milibarach, aby umożliwić przedostanie się agrobakterii do przestrzeni śródmiąższowych zanurzonej tkanki roślinnej. Powtórz tę infiltrację.

Kroki pierwsze, aby zapewnić dobrą infiltrację. Następnie wyjmij roślinę z wysuszacza i umieść ją z powrotem w pozycji pionowej. Przenieś rośliny z powrotem do pomieszczenia wzrostowego i monitoruj ekspresję białka między dwoma a 15 dniami po infiltracji.

Aby zademonstrować skuteczność strzykawki, infiltracji agrobacterium do tkanki roślinnej, przetestowaliśmy ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych, GFP i Ds red przez dwa różne zdekonstruowane roślinne wektory wirusowe, Gemini, wirus i magcon for end. Liście Hamana, które były całkowicie przesiąknięte agrobakteriami zawierającymi wektory wirusowe Gemini. Ekspresję GFP obserwowano na całej powierzchni liści w świetle UV, począwszy od 2D PI i osiągała szczytową akumulację przy czterech DPI.

Natomiast liście naciekane wektorem magcon zawierającym kombinacje agrobacterium wykazywały fluorescencję GFP dopiero po pięciu DPI i osiągały maksymalną akumulację przy siedmiu DPI. Nie zaobserwowano zielonej fluorescencji z liści naciekanych negatywnymi mieszaninami agrobakterii kontrolnych EP one 10 plus P 19, co wskazuje, że fluorescencja była specyficzna dla genu GFP i nie była wynikiem fluorescencji tła liści. W szczytowej akumulacji fluorescencja wektora magcon wyrażona do GFP jest bardziej intensywna niż w przypadku wektora wirusowego Gemini.

Nie zaobserwowano większej martwicy na liściach naciekanych konstruktami GFP, gdy oba białka fluorescencyjne ulegały ekspresji na tym samym liściu za pośrednictwem wektorów wirusowych Gemini z infiltracją plamki strzykawki, wykryto je z oczekiwanym kolorem fluorescencyjnym w miejscu, w którym zostały nacieknięte. Co ciekawe, jednoczesna infiltracja GFP i DS RED powodowała żółtawą fluorescencję. Zbadano również infiltrację próżniową w celu opracowania skalowalnej metody agroinfiltracji, która może być wykorzystana do produkcji rekombinowanych białek na dużą skalę za pomocą roślinnych systemów ekspresji stanów nieustalonych.

Zgodnie z oczekiwaniami fluorescencję GFP zaobserwowano dla wszystkich liści infiltrowanej rośliny w porównaniu z infiltracją strzykawkową. Jest bardziej wytrzymały i może osiągnąć infiltrację każdej rośliny w znacznie krótszym czasie. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 48 godzin.

W większości przypadków jest to hodowla agrobakteryjna, ponieważ rzeczywisty czas infiltracji wynosi tylko kilka minut, co zapewnia optymalną wydajność infiltracji agro i ukierunkowaną ekspresję białka. Postępuj zgodnie z protokołem. Pamiętaj o kontrolowaniu krytycznych parametrów, w tym warunków wzrostu roślin, stężenia agrobakterii, podciśnienia i czasu trwania w dziedzinie biotechnologii roślin.

To eksperymentalne podejście może być wykorzystane do zbadania rozwoju i bioprodukcji nowych białek farmaceutycznych w szerokim zakresie gatunków roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak wykorzystać infiltrację agro do dostarczania docelowych konstruktów genów do rośliny i umożliwienia roślinnym systemom ekspresji przejściowej wytwarzania rekombinowanego białka, rywalizującego z hodowlami komórek bakteryjnych i owadzich ssaków.