Name: RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Poznaj protokół RIBO-seq w bakteriach obejmujący pobieranie próbek, przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie NGS. Ta metoda pozwala precyzyjnie mapować pozycje rybosomów na mRNA w celu badania syntezy białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ALS pragnie podziękować za wsparcie finansowe EMBO Installation Grants IG 3914 oraz POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizowane w ramach programu First TEAM Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego.

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Przygotuj kulturę bakteryjną. Zalecamy objętość hodowli 100 ml na próbkę.</li>
	<li>Przygotuj sprzęt i odczynniki do pobierania próbek: dwie miarki na próbkę, sterylne filtry membranowe 0,45 μm z mieszanymi estrami celulozy (MCE), sterylne probówki 50 ml, ciekły azot, 50 mg/ml chloramfenikolu w etanolu 70% (obj. / obj.) (opcjonalnie). Przebić wieczko probówek o pojemności 50 ml, aby umożliwić odparowanie ciekłego azotu i zapobiec eksplozji zamkniętych probówek. Odkaż czerpaki laboratoryjnym detergentem i 70% etanolem.</li>
	<li>Rozgrzej sprzęt filtrujący i jedną z czerpaków do temperatury wzrostu kultury bakteryjnej. 
	UWAGA: Zalecamy całoszklany aparat filtracyjny z lejkiem, spiekaną podstawą, kolbą do fugowania szlifowanego i zaciskiem sprężynowym Ø 47 mm.</li>
	<li>Przed pobraniem próbki dodać chloramfenikol do kultury bakteryjnej do końcowego stężenia 100 μg/ml i inkubować przez 1 minutę (opcjonalnie).</li>
	<li>Wlej ciekły azot do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i umieść drugą czerpak w probówce, aby ostygła. 
	OSTROŻNOŚĆ! Ciekły azot może spowodować eksplozję zamkniętych pojemników z powodu zmiany ciśnienia po odparowaniu. Aby temu zapobiec, konieczne jest wykonanie kilku otworów w pokrywie probówek o pojemności 50 ml, aby umożliwić odparowanie ciekłego azotu.</li>
	<li>Zbieraj komórki przez filtrację. Przerwij filtrowanie, gdy medium przejdzie przez membranę, ale nie pozwól, aby filtr całkowicie wyschł.</li>
	<li>Zbieraj granulki bakteryjne, szybko zeskrobując komórki z dysku filtra za pomocą podgrzanej czerpaki. Natychmiast umieść całą miarkę z zebranymi komórkami w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej ciekłym azotem. Zebrany pellet powinien być całkowicie pokryty ciekłym azotem.</li>
	<li>Pozwól osadowi dokładnie zamarznąć i usuń zamrożone komórki za pomocą uprzednio schłodzonej drugiej czerpaki. Zamknij przebitą pokrywę i przenieś rurkę do -80°C. PUNKT ZATRZYMANIA 
	UWAGA: Szufelki należy dezynfekować po każdym pobraniu próbki.</li>
</ol>
2. Liza komórek
<ol>
	<li>Przygotować 0,1 M GMP-PNP w 10 mM probówkach reakcyjnych Tris pH 8, DNazy I i 1,5 ml na lizaty i przechowywać je na lodzie. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj bufor do lizy (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-merkaptoetanolu, 5 mM CaCl2 i opcjonalnie 1 mM chloramfenikol). Porcję 500 μl buforu do lizy na próbkę rozlać do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Odkaź moździerz i tłuczek laboratoryjnym detergentem i 70% etanolem, a następnie wysusz. Ostudzić moździerz i tłuczek, wlewając do moździerza ciekły azot.</li>
	<li>Zamrożony granulat przenieść do wstępnie schłodzonego moździerza i zmielić na proszek. Za pomocą szpatułki dodaj około 1 objętość tlenku glinu i kontynuuj mielenie. Utrzymuj moździerz, tłuczek i komórki w chłodzie, wlewając w razie potrzeby ciekły azot, nie pozwól, aby zawartość moździerza się rozmroziła.</li>
	<li>Tuż przed użyciem buforu do lizy dodać GMP-PNP i DNazę I do podwielokrotności buforu do lizy do końcowego stężenia odpowiednio 2 mM i 100 U/ml. Przenieś roztwór do zaprawy z komórkami i tlenkiem glinu i kontynuuj mielenie. Pozwól lizatowi powoli się rozmrozić podczas mielenia i przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieść na lodzie.</li>
	<li>Odwirować lizaty przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do nowych, wstępnie schłodzonych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i przechowywać je na lodzie.</li>
	<li>Zmierz stężenie RNA w każdej próbce za pomocą NanoDrop. Roztwory próbek należy stosować w stosunku 1:10 i rozcieńczenia buforu do lizy w wodzie wolnej od nukleaz w stosunku 1:10 jako próbę ślepą. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że chloramfenikol wykazuje znaczną absorpcję przy 260 nm.</li>
	<li>Podziel każdy lizat na dwie porcje: jedną dla RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) i drugą dla RNA-seq (reszta).</li>
	<li>Oczyść próbki pod kątem sekwencji RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Zalecamy stosowanie zestawu Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (patrz Tabela Materiałów). Zalecamy również dodanie 4,5 objętości etanolu (w porównaniu z objętością próbki) do mieszanki próbki i buforu wiążącego dla śladów rybosomalnych i rozdrobnionego mRNA, w celu zwiększenia skuteczności oczyszczania krótkich fragmentów RNA.</li>
	<li>Próbki przeznaczone do sekwencjonowania RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Procedura sekwencjonowania RNA będzie kontynuowana od kroku 5.</li>
</ol>
3. Trawienie MNazy próbek do sekwencji RIBO
<ol>
	<li>Do 1 mg RNA dodać 3,8 μl 187,5 U/μL MNazy w 10 mM Tris pH 8 i uzupełnić buforem do lizy do całkowitej objętości 500 μL.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 25 °C, 300 obr./min, przez 45 minut w termomikserze.</li>
	<li>Oczyść próbki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania RNA (jak w kroku 2.9).</li>
	<li>Przechowywać próbki do sekwencjonowania RIBO w temperaturze -80 °C (punkt STOP) lub przystąpić do wyboru wielkości.</li>
</ol>
4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) i dobór wielkości próbek do sekwencji RIBO
<ol>
	<li>Przygotuj 15% żel poliakrylamid-TBE z 8 M mocznikiem i umieść go w zbiorniku z buforem TBE. Wstępny bieg przez minimum 10 minut przy stałym napięciu 200 V.</li>
	<li>Wymieszać próbki z buforem do próbek TBE-Mocznik, poddać denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę i natychmiast umieścić je na lodzie.</li>
	<li>Wypłukać mocznik, wstrzykując bufor KZM do studzienek żelowych za pomocą strzykawki. Załaduj próbki, pozostawiając między nimi jedną przestrzeń studzienki, aby oddzielić każdą próbkę i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Jako markery należy użyć oligonukleotydu 29 nt i mieszaniny oligonukleotydów 26 nt i 32 nt. Uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 180 V.</li>
	<li>Przygotować sterylny bufor do inkubacji przez noc (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).</li>
	<li>Po elektroforezie wybarwić żel w kąpieli SYBR Gold-bath przez około 2-3 minuty i spłukać żel wodą bez nukleaz</li>.
	<li>Za pomocą sterylnych igieł lub żyletek należy pobrać fragmenty żelu o objętości od 26 do 32 nt i umieścić fragmenty żelu w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do inkubacji przez noc do każdej probówki reakcyjnej.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 10 °C, 1000 obr./min przez noc w termomieszalniku.</li>
	<li>Następnego dnia wyczyść próbki jak w kroku 2.9. Usuń ślady stóp w 80 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Punkt ZATRZYMANIA. Procedura RIBO-seq będzie kontynuowana od kroku 7.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie bakteryjnego mRNA poprzez zubożenie rRNA z próbek do sekwencjonowania RNA
<ol>
	<li>Usuń rRNA z próbek za pomocą bakteryjnego zestawu do oczyszczania mRNA (np. Invitrogen MICROBExpress). Postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Oczyść próbki jak w kroku 2.9. Eluuj mRNA w 50 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przechowywać próbki do sekwencjonowania RNA w temperaturze -80 °C (punkt STOP) lub kontynuować fragmentację alkaliczną.</li>
</ol>
6. Alkaliczna fragmentacja próbek do sekwencji RNA
<ol>
	<li>Przygotować alkaliczny bufor do hydrolizy (zmieszać 220 μl 0,1 MNaHCO3, 30 μL 0,1 M Na2CO3 i 1 μL 0,5 M EDTA). Zmieszać 1 objętość (50 μl) buforu alkalicznego z 1 objętością (50 μl) próbki i inkubować w temperaturze 95 °C przez 25 minut.</li>
	<li>Dodać 5 μl 3 M NaOAc pH 5,5, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Oczyścić próbki jak w kroku 2.9 i wymyć próbki w 80 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Możliwy punkt STOP: przechowywać próbki sekwencyjnego RNA w temperaturze -80 °C. Zalecamy jednak przejście bezpośrednio do kroku 7, aby uniknąć niepotrzebnego zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
7. Defosforylacja i fosforylacja próbek zarówno dla sekwencji RNA, jak i RIBO
<ol>
	<li>Do każdej próbki dodać 10 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego PNK i 5 μl T4 PNK. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny w celu defosforylacji końców 3'.</li>
	<li>Dodać 3 μl 1 mM ATP i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu fosforylacji końców 5'.</li>
	<li>Oczyść próbki jak w kroku 2.9, wymyj w 30 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Punkt ZATRZYMANIA.</li>
</ol>
8. Przygotowanie biblioteki za pomocą NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set dla Illumina
<ol>
	<li>Przygotuj 100-1000 ng wejściowego RNA (otrzymane fragmenty mRNA i ślady rybosomalne) w 6 μl wody wolnej od nukleaz i dodaj 1 μl adaptera 3' SR. Inkubować zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Dodać 10 μl 3' buforu reakcyjnego do ligacji (2X) i 3 μl mieszanki enzymów ligacyjnych 3' i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny, zamiast 1 godziny w temperaturze 25 °C, jak określa protokół producenta.</li>
	<li>Hybrydyzować Reverse Transcription Primer zgodnie z protokołem producenta ze zmodyfikowanym programem: 5 minut w temperaturze 75 °C, 30 minut w temperaturze 37 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podłącz adapter 5' SR. Postępować zgodnie z protokołem producenta z jedną zmianą: inkubację należy przeprowadzać w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny, zamiast 1 godziny w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Możliwy punkt STOP: inkubować próbki zawierające zsyntetyzowane cDNA w temperaturze 70 °C przez 15 minut w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Zalecamy jednak przejście bezpośrednio do kolejnych kroków, aby uniknąć niepotrzebnego zamrażania i rozmrażania próbek.</li>
	<li>Przechowuj połowę każdej biblioteki cDNA w temperaturze -80 °C jako kopię zapasową.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację PCR zgodnie z protokołem producenta. Użyj połowy mieszaniny reakcyjnej. Uzyskane biblioteki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Punkt STOP.</li>
</ol>
9. Wybór rozmiaru bibliotek cDNA za pomocą PAGE
<ol>
	<li>Przygotować 6% żel poliakrylamidowo-TBE i umieścić go w zbiorniku z buforem TBE. Wstępny bieg przez minimum 10 minut przy stałym napięciu 200 V.</li>
	<li>Wymieszaj próbki z Gel Loading Dye, Blue (6X) i załaduj je na żel. Użyj Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest jako drabiny. Na początku uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 120 V, aby umożliwić DNA wejście do żelu, a następnie zmień napięcie na 180 V.</li>
	<li>Po zakończeniu elektroforezy należy zabarwić żel w kąpieli SYBR Gold-bath przez około 2-3 minuty i spłukać żel wodą bez nukleazy.</li>
	<li>Fragmenty żelu akcyzowego zawierające biblioteki. Dla próbek sekwencyjnych RNA należy wycisnąć akcyzę między 135-180 nt, a dla sekwencji RIBO między 135-170 nt. Użyj sterylnej igły lub żyletki i umieść wycięte fragmenty żelu w oddzielnych probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Pamiętaj, aby wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami. 
	UWAGA: Adaptery i kod kreskowy z zestawu NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set dla Illumina mają łącznie 119 nt, co określa dolną granicę wycinania.</li>
	<li>Do każdego wyciętego fragmentu żelu dodać 100 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Inkubować fragmenty żelu w temperaturze 10 °C, 450 obr./min przez noc w termomikserze.</li>
	<li>Oczyść i skoncentruj biblioteki cDNA za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia DNA zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Zalecamy stosowanie zestawu Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Przechowywać oczyszczone biblioteki cDNA w temperaturze -80 °C. Punkt STOP.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowym wyzwaniem technicznym związanym z profilowaniem rybosomów jest potrzeba szybkiego zahamowania translacji w celu uchwycenia migawki rybosomów na mRNA w określonym stanie fizjologicznym. Aby to osiągnąć, powszechnie stosuje się inhibitory translacji, szybkie zbiory i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Stosowanie antybiotyków jest opcjonalne, ponieważ mogą one powodować artefakty. Chloramfenikol jest powszechnie stosowanym lekiem do zatrzymywania wydłużających się rybosomów w bakteryjnym RIBO-seq. Nie zapob...

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) została opracowana w laboratorium Jonathana Weissmana na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco1. W porównaniu do innych metod stosowanych do badania ekspresji genów na poziomie translacyjnym, RIBO-seq skupia się na każdym rybosomie związanym z mRNA i dostarcza informacji o jego lokalizacji oraz względnej liczbie rybosomów na transkrypcie. Umożliwia ona monitorowanie procesu syntezy białek in vivo i może zapewnić rozdzielczość oraz dokładność na poziomie pojedynczego kodonu, co pozwala na pomiar gęstości rybosomów zarówno na poszczególnych cząsteczkach mRNA, jak i w obrębie całego transkryptomu w komórce. Podstawą techniki RIBO-seq jest fakt, że podczas translacji rybosom wiąże cząsteczkę mRNA, chroniąc tym samym zakryty fragment transkryptu przed trawieniem przez rybonukleazę. Po dodaniu rybonukleazy niechronione mRNA ulega trawieniu, a fragmenty otoczone przez rybosomy – zazwyczaj o długości ~28-30 nt – pozostają nienaruszone. Fragmenty te, nazywane odciskami rybosomalnymi (RF), mogą być następnie izolowane, sekwencjonowane i mapowane na transkrypty, z których pochodzą, co pozwala na wykrycie dokładnej pozycji rybosomów. W rzeczywistości zdolność rybosomów do ochrony fragmentów mRNA była wykorzystywana od lat 60. XX wieku do badania wiązania rybosomalnego i miejsc inicjacji translacji (TIS)2,3,4. Jednak dzięki postępom w technologii głębokiego sekwencjonowania, RIBO-seq stał się złotym standardem monitorowania translacji5, który dzięki angażowaniu rybosomów może dostarczyć informacji o syntezie białek w skali całego genomu6. Profilowanie rybosomów wypełniło lukę technologiczną, która istniała pomiędzy ilościowym określaniem transkryptomu a proteomu6.
Aby przeprowadzić profilowanie rybosomów, należy uzyskać lizat komórkowy organizmu, który rósł w badanych warunkach. Zaburzenie tych warunków podczas zbierania i lizy komórek może dostarczyć niewiarygodnych danych. Aby temu zapobiec, powszechnie stosuje się inhibitory translacji, szybkie zbieranie oraz błyskawiczne mrożenie w ciekłym azocie. Komórki można lizować poprzez rozcieranie kriogeniczne w homogenizatorze mechanicznym, takim jak młyn mieszalnikowy7,8 lub homogenizator kulkowy (bead beater)9, a także poprzez tryturację za pomocą pipety10 lub igły11. Bufor do lizy można dodać bezpośrednio przed lub krótko po sproszkowaniu komórek. W naszym protokole używamy ciekłego azotu do schłodzenia moździerza i tłuczka, a także tlenku glinu jako łagodniejszej metody rozbijania bakteryjnej ściany komórkowej, co zapobiega fragmentacji RNA często spotykanej przy stosowaniu metod takich jak sonikacja. Po sproszkowaniu dodajemy lodowaty bufor do lizy do schłodzonej zawartości moździerza. Wybór odpowiedniego buforu do lizy jest istotny dla uzyskania najlepszej rozdzielczości odcisków rybosomowych (ribosomal footprints). Ponieważ siła jonowa wpływa zarówno na rozmiar RF, jak i na precyzję ramki odczytu, obecnie zaleca się stosowanie buforów do lizy o niskiej sile jonowej i niskiej pojemności buforowej, nawet jeśli wydaje się, że skład buforu nie wpływa na zajętość rybosomów na mRNA11,12. Ważnymi składnikami buforu do lizy są jony magnezu, których obecność zapobiega dysocjacji podjednostek rybosomowych i hamuje spontaniczne zmiany konformacyjne w rybosomach bakteryjnych11,13. Jony wapnia również odgrywają istotną rolę i są niezbędne dla aktywności nukleazy mikrokokkowej (MNase) stosowanej w metodzie profilowania rybosomów bakteryjnych14. Dodatek guanozyno-5′-[β,γ-imido]trifosforanu (GMP-PNP), niehydrolizowalnego analogu GTP, wraz z chloramfenikolem hamuje translację podczas lizy15.
Po uzyskaniu lizatu zostaje on sklarowany poprzez wirowanie i podzielony na dwie porcje, z których każda jest przeznaczona do RIBO-seq oraz wysokoprzepustowego sekwencjonowania całkowitego mRNA (RNA-seq), ponieważ są one przeprowadzane jednocześnie (Rycina 1). RNA-seq stanowi punkt odniesienia, który umożliwia porównanie danych z obu metod – RIBO-seq i RNA-seq – podczas analizy danych. Badany translatom jest definiowany poprzez normalizację odcisków rybosomalnych (ribosomal footprints) do obfitości mRNA16. Dane z RNA-seq mogą również pomóc w identyfikacji artefaktów klonowania lub sekwencjonowania17.
<img alt="Schemat profilowania rybosomów: trawienie kwasów nukleinowych, oczyszczanie mRNA, proces fragmentacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematy przygotowania próbek mRNA do RIBO-seq i RNA-seq. W przypadku przygotowania biblioteki do RIBO-seq RNA poddaje się trawieniu za pomocą MNase (A), a następnie dokonuje selekcji frakcji RF o długości ~28-30 nt (B); w przypadku RNA-seq RNA jest izolowane (C), usuwa się z niego rRNA (D), a otrzymane mRNA jest losowo fragmentowane na fragmenty o różnej długości (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wstępne etapy procedury przygotowania próbek do RIBO-seq i RNA-seq nieco się od siebie różnią (Rysunek 1). W przypadku profilowania rybosomalnego lizat musi zostać poddany trawieniu specyficzną endonukleazą w celu degradacji cząsteczek mRNA, które nie są chronione przez rybosomy. W standardowych protokołach uzyskane monosomy odzyskuje się za pomocą ultrawirowania na poduszce sacharozowej lub ultrawirowania w gradiencie sacharozy8,14. W niniejszym artykule wykazujemy, że etap ten nie jest konieczny do wyizolowania RF wymaganych do RIBO-seq u bakterii, podobnie jak w przypadku komórek eukariotycznych18, a wystarczająca jest selekcja fragmentów mRNA o odpowiedniej długości z żelu poliakrylamidowego.
W przypadku RNA-seq mRNA uzyskuje się poprzez usunięcie rRNA z całkowitego RNA – cząsteczki rRNA hybrydyzują z biotynylowanymi sondami oligonukleotydowymi, które wiążą się z kuleczkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną. Kompleksy rRNA-oligonukleotyd-kuleczka są następnie usuwane z próbki za pomocą magnesu, co prowadzi do uzyskania próbki pozbawionej rRNA19,20. Oczyszczone cząsteczki mRNA są następnie losowo fragmentowane poprzez hydrolizę alkaliczną. Uzyskane fragmenty mRNA, jak i odciski rybosomalne (ribosomal footprints), są konwertowane na biblioteki cDNA i przygotowywane do głębokiego sekwencjonowania (Rycina 2). Proces ten obejmuje naprawę końców niezbędną po hydrolizie alkalicznej (dla mRNA) i trawieniu enzymatycznym (dla RF): defosforylację końców 3' i następującą po niej fosforylację końców 5'. Kolejnymi krokami są ligacja adapterów oraz odwrotna transkrypcja w celu stworzenia insertów cDNA ograniczonych sekwencjami wymaganymi do sekwencjonowania następnej generacji (NGS) z wykorzystaniem platformy Illumina. Ostatnią fazą przygotowania biblioteki jest reakcja PCR, w której konstrukty są amplifikowane i znakowane specyficznymi dla próbki kodami kreskowymi (barcodes), co umożliwia multipleksowanie i sekwencjonowanie różnych próbek na jednym kanale. Przed sekwencjonowaniem jakość i ilość bibliotek ocenia się za pomocą wysokoczułej elektroforezy DNA na chipie. Biblioteki cDNA o odpowiednich parametrach mogą być następnie łączone i sekwencjonowane. Sekwencjonowanie można przeprowadzić na różnych platformach Illumina, takich jak MiSeq, NextSeq lub HighSeq, w zależności od liczby bibliotek, wymaganej długości odczytu i głębokości sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu przeprowadza się analizę bioinformatyczną.
<img alt="Proces sekwencjonowania RNA, schemat izolacji mRNA, fosforylacja, ligacja, transkrypcja, PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Przygotowanie biblioteki. Przygotowanie biblioteki obejmuje naprawę końców, ligację adapterów, odwrotną transkrypcję oraz amplifikację z kodowaniem kreskowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Profilowanie rybosomów to uniwersalna metoda, którą można łatwo modyfikować i dostosowywać do stawianych pytań naukowych. Pierwotnie była ona stosowana u drożdży1, lecz wkrótce potem zastosowano ją w komórkach bakteryjnych21, a także w organizmach modelowych eukariotycznych, w tym u myszy10, danio pręgowanego22, muszki owocowej23 oraz Arabidopsis thaliana24. Wykorzystano ją również do badania różnych typów rybosomów: cytoplazmatycznych, mitochondrialnych25,26 i chloroplastowych27,28. U eukariotów metoda RIBO-seq jest powszechnie adaptowana i udoskonalana w celu zbadania konkretnych aspektów translacji, w tym inicjacji10,11,29,30,31,32, elongacji1,10,11,31,33, zatrzymywania się rybosomów (stalling)33 oraz zmian konformacyjnych33. Większość modyfikacji wiąże się z zastosowaniem różnych inhibitorów translacji. W przypadku bakterii analogiczne badania były jednak trudne do przeprowadzenia ze względu na niedobór inhibitorów o wymaganym mechanizmie działania34. Najczęściej stosowanym inhibitorem translacji u bakterii jest chloramfenikol (CAM), który wiąże się z centrum peptydylotransferazy (PTC) i zapobiega prawidłowemu ustawieniu aminoacylo-tRNA w miejscu A. W konsekwencji CAM zapobiega tworzeniu wiązania peptydowego, co prowadzi do zatrzymania elongujących rybosomów35. Innymi przykładami inhibitorów translacji u bakterii są tetracyklina (TET)36, retapamulina (RET)34 oraz Onc11237, które były wykorzystywane do badania miejsc inicjacji translacji. TET, która zapobiega dostarczaniu tRNA do rybosomu poprzez bezpośrednie nakładanie się na pętlę łodygi antykodonu tRNA w miejscu A, była pierwotnie stosowana w celu weryfikacji wyników uzyskanych po traktowaniu CAM, ponieważ oba te antybiotyki hamują elongację translacji38. Stwierdzono, że TET wykrywa pierwotne TIS, jednak nie była w stanie ujawnić wewnętrznych TIS36. RET wiąże się w PTC rybosomu bakteryjnego i zapobiega tworzeniu pierwszego wiązania peptydowego, interferując z aminoacylo-tRNA elongacyjną w miejscu A. Zastosowanie RET skutkuje zatrzymaniem rybosomów zarówno w pierwotnych, jak i wewnętrznych TIS34. Onc112, peptyd przeciwdrobnoustrojowy bogaty w prolinę, wiąże się w kanale wyjściowym i blokuje wiązanie aminoacylo-tRNA w rybosomalnym miejscu A. W rezultacie Onc112 zapobiega przejściu kompleksów inicjacyjnych w fazę elongacji37.
Główne informacje dostarczane przez profilowanie rybosomów to gęstość rybosomów oraz ich pozycja na mRNA. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do badania różnicowej ekspresji genów na poziomie translacji w różnych warunkach wzrostu1,6, pomiaru wydajności translacji1,38,39 oraz wykrywania zdarzeń regulacji translacji, takich jak pauza rybosomalna10. RIBO-seq pozwala również na odkrywanie translacji adnotowanych ncRNA, pseudogenów oraz nieadnotowanych krótkich ramek odczytu (ORF), co prowadzi do identyfikacji nowych i/lub bardzo krótkich genów kodujących białka10,12,22,30,37. W takich przypadkach RIBO-seq może służyć do doprecyzowania i ulepszenia adnotacji genomu. Dzięki wysokiej czułości w identyfikacji tłumaczonych ORF oraz naturze ilościowej, profilowanie rybosomów może również służyć jako substytut wyznaczania proteomu lub wsparcie dla badań proteomicznych31,34,39. Poprzez mapowanie TIS, profilowanie rybosomów ujawnia izoformy znanych białek z wydłużonym lub uciętym N-końcem10,32. RIBO-seq został również zaadaptowany do badania kotranslacyjnego fałdowania białek14,21,24. Metoda ta umożliwia pomiar tempa elongacji1,10,39 lub prędkości dekodowania poszczególnych kodonów6 i pomaga w opracowywaniu ilościowych modeli translacji17. Metoda profilowania rybosomów pozwala również na uzyskanie wglądu w mechanizmy pauzy rybosomalnej u bakterii7,15,17, przesunięć ramki odczytu40, odczytu przez kodon stop21, defektów terminacji/recyklingu41,42 oraz zmian konformacji rybosomów33 u eukariotów. RIBO-seq został także dostosowany do badania wpływu specyficznych czynników trans-działających na translację, takich jak miRNA6 oraz białka wiążące RNA u eukariotów16,43. Należy jednak pamiętać, że projekt eksperymentalny oraz uzyskana rozdzielczość RIBO-seq determinują ilość informacji, jaką można wyodrębnić z wynikowych danych sekwencjonowania12.

<table><tbody><tr><td>10X TBE (proszek)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9864</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol, 99%, czysty</td><td>Acros Organics</td><td>125472500</td><td></td></tr><tr><td>5'-trifosforan adenozyny (ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek glinu kalcynowany czysty rocznie</td><td>Chempur</td><td>114560600</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>MP Biomedicals</td><td>190321</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Koncentrator -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I rekombinowana, wolna od rnazy</td><td></td><td></td> sól disodowa Roche 4716728001 <td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/P140/48</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy Absolut 99,8%&nbsp; Pure-P.A.-Basic</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A.</td><td>BA6480111</td><td></td></tr><tr><td>Aparat filtracyjny</td><td>VWR Collection</td><td>511-0265</td><td>całoszklany aparat filtracyjny, z lejkiem, spiekaną podstawą, nasadką, 47 mm i Oslash; zacisk sprężynowy i kolba do szlifowania</td></tr><tr><td>Żel 40 (19:1)</td><td>Rotiphorese</td><td>3030.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, niebieski, 6X</td><td>New England Biolabs</td><td>E6138G</td><td></td></tr><tr><td>Guanozyna 5&prime;-[&beta;,&gamma;-imido]trifosforan sól trisodowa</td><td>hydrat Sigma-Aldrich</td><td>G0635-25MG</td><td></td></tr><tr><td>labZAP</td><td>A& A Biotechnology</td><td>040-500</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat octanu magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>MCE Membrane fiter</td><td>Technologia Alfatec M47MCE45GWS</td><td></td><td>wielkość porów: 0,45um</td></tr><tr><td>MICROBExpress Bakteryjne oczyszczanie mRNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7300S</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu Bezwodny czysty PA</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>. <td>744330113</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>E7323A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Koncentrator -25</td><td>Zymo Research</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu czysty p.a.</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland S.A</td>. <td>810530115</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Barwnik żelowy kwasu nukleinowego</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowej</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek TBE-mocznika (2x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan, ultraczysty, 99,9%</td><td>AlfaAesar</td><td>J65594</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, 98%</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik G.R.</td><td>lach:ner</td><td>40096-AP0</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

ribo-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania ngs

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) jest obecnie najbardziej efektywnym narzędziem do badania procesu syntezy białek in vivo. Zaletą tej metody, w porównaniu z innymi podejściami, jest jej zdolność do monitorowania translacji poprzez precyzyjne mapowanie pozycji i liczby rybosomów na transkryptie mRNA.
W tym artykule opisujemy kolejne etapy pobierania próbek i przygotowania do metody RIBO-seq u bakterii, podkreślając szczegóły istotne dla planowania i przeprowadzenia eksperymentu.
Ponieważ sekwencja RIBO opiera się na nienaruszonych rybosomach i pokrewnych mRNA, kluczowym krokiem jest szybkie zahamowanie translacji i odpowiedni rozpad komórek. Dlatego sugerujemy filtrację i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie w celu pobrania komórek z opcjonalną obróbką wstępną chloramfenikolem w celu zatrzymania translacji u bakterii. Do rozpadu proponujemy mielenie zamrożonych komórek moździerzem i tłuczkiem w obecności tlenku glinu, aby mechanicznie rozbić ścianę komórkową. W tym protokole nie jest wymagana poduszka sacharozowa ani ultrawirowanie w gradiencie sacharozy do oczyszczania monosomu. Zamiast tego stosuje się separację mRNA za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a następnie wycięcie śladu rybosomalnego (pasmo 28-30 nt), które daje zadowalające wyniki. To znacznie upraszcza metodę, a także skraca czas i zmniejsza wymagania sprzętowe dotyczące zabiegu. Do przygotowania biblioteki zalecamy użycie dostępnego na rynku małego zestawu RNA do sekwencjonowania Illumina firmy New England Biolabs, zgodnie z wytycznymi producenta z pewnym stopniem optymalizacji.
Powstałe biblioteki cDNA prezentują odpowiednią ilość i jakość wymaganą do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z opisanym protokołem daje w wyniku od 2 do 10 mln unikalnie zmapowanych odczytów na próbkę, co zapewnia wystarczającą ilość danych do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest szybki i stosunkowo łatwy i można go wykonać przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Przedstawione tutaj przykładowe wyniki uzyskano w badaniu nad regulacją translacji w sporulujących komórkach typu WT Bacillus subtilis. Hodowle nocne rozcieńczono do OD600 równego 0.1 w 100 mL pożywki bogatej i inkubowano w 37 °C przy intensywnym wstrząsaniu, aż OD600 osiągnęło wartość 0.5-0.6. Następnie pożywkę bogatą zastąpiono pożywką minimalną, aby indukować proces sporulacji, a inkubację kontynuowano do czterech godzin. Komórki zbierano co godzinę, zaczynając od T0 – momentu indukcji s...

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Technika profilowania rybosomów, zwana również RIBO-seq, jest obecnie najskuteczniejszym narzędziem do badania procesu syntezy białek in vivo. Zaletą tej metody jest jej zdolność do monitorowania translacji poprzez precyzyjne mapowanie pozycji i liczby rybosomów. RIBO-seq opiera się na fakcie, że rybosom, wiążąc się z cząsteczką mRNA, chroni zakopany fragment transkryptu podczas trawienia rybonukleazą.Uzyskane fragmenty, zwane śladami rybosomalnymi, można sekwencjonować i mapować na transkrypt, z którego pochodzą, co skutkuje określeniem dokładnego położenia rybosomów. Równolegle z sekwencją RIBO przeprowadzane jest wysokoprzepustowe sekwencjonowanie całkowitego mRNA, aby zapewnić punkt odniesienia i umożliwić porównanie danych zarówno z sekwencji RIBO, jak i sekwencji RNA podczas analizy danych. Przed pobraniem komórek można opcjonalnie dodać chloramfenikol do kultury bakteryjnej, do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr, aby zahamować translację.Inkubuj kulturę z antybiotykiem przez jedną minutę. Ten krok jest ważny, jeśli zbiór trwa dłużej niż zwykle, ponieważ zahamowanie translacji pozwala wydłużyć czas pobierania próbki. Próbki należy pobrać za pomocą wstępnie ogrzanego systemu filtracji.Możesz wprowadzić potrząsanie, aby naśladować warunki wzrostu. Przerwij filtrowanie, gdy wszystkie media przejdą przez membranę, ale nie pozwól, aby filtr całkowicie wyschł. Zbieraj granulki bakteryjne, szybko zeskrobując komórki z dysku filtra za pomocą wstępnie podgrzanej, zdezynfekowanej czerpaki.Natychmiast umieść całą czerpak z zebranymi komórkami w 50-mililitrowej probówce wypełnionej ciekłym azotem. Zebrany pellet powinien być całkowicie pokryty ciekłym azotem. Pozwól granulce dokładnie zamarznąć i usuń zamrożone komórki za pomocą wcześniej schłodzonej czerpaki.Zamknij pokrywę i upewnij się, że jest przebita. Jest to ważne, ponieważ ciekły azot może spowodować eksplozję zamkniętych pojemników z powodu zmiany ciśnienia po odparowaniu. Przygotuj GMPP, wymaz DNA i świeże probówki Eppendorfa przeznaczone dla lizozy.W razie potrzeby przygotować bufor do lizy z dodatkiem chloramfenikolu. Przydziel 500 mikrolitrów buforu do lizy na próbkę do oddzielnych probówek Eppendorfa i umieść je na lodzie. Odkazić moździerz i tłuczek laboratoryjnym środkiem dezynfekującym i 70% etanolem.Ostudzić moździerz i tłuczek, wlewając do moździerza ciekły azot. Zamrożony granulat bakteryjny przenieść do wstępnie schłodzonego moździerza i zmielić na proszek. Dodaj około jednej objętości tlenku glinu i kontynuuj mielenie.Utrzymuj moździerz, tłuczek i komórki w chłodzie, wlewając w razie potrzeby ciekły azot, aby nie dopuścić do rozmrożenia zawartości moździerza. Tuż przed użyciem dodać GMPPNP i wymaz DNA do podwielokrotności buforu do lizy. Przenieś roztwór do zaprawy i kontynuuj mielenie.Pozwól lizazie powoli się rozmrażać podczas mielenia. Gdy lizaza całkowicie się rozmrozi, przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej rurki Eppendorfa i wróć do lodu. Odwirować lizazę w temperaturze 20 0000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieść supernatanty do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek Eppendorfa i umieścić je na lodzie. Zmierz stężenie RNA w każdej rozcieńczonej próbce za pomocą NanoDrop. Podziel każdy lizat na dwie porcje, 0,5 do 1 miligrama RNA dla sekwencji RIBO, a resztę dla sekwencji RNA.Do jednego miligrama RNA dodaj 3,8 mikrolitra MNazy w Tris pH 8 i uzupełnij buforem do lizy do całkowitej objętości 500 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza, 300 rund na minutę, przez 45 minut. Po zakończeniu inkubacji wyczyść próbki dostępnym w handlu zestawem do czyszczenia RNA.Przygotuj 15% poliakryloamidowy żel TBE z ośmioma molowymi mocznikami i umieść go w zbiorniku z buforem TBE. Uruchom wstępnie przez co najmniej 10 minut przy stałym napięciu 200 woltów. Wymieszać próbki z buforem do próbek TBE-Mocznik.Denaturuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez minutę i natychmiast umieść je na lodzie. Wypłukać mocznik, wstrzykując bufor KZM do studzienek żelowych za pomocą strzykawki. Załaduj próbki, pozostawiając między nimi jedną przestrzeń studzienki, aby oddzielić każdą próbkę i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.Użyj 29 oligonukleotydów o długości nukleotydów oraz mieszanki oligonukleotydów o długości 26 i 32 nukleotydów jako markerów. Uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 180 woltów. Przygotować sterylny bufor do inkubacji przez noc.Po zakończeniu elektroforezy zabarwić żel preparatem SYBR Gold. Wyciąć fragmenty żelu od 26 do 32 nukleotydów za pomocą sterylnej igły lub żyletki, a następnie umieścić fragmenty żelu w oddzielnych probówkach Eppendorfa. Wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami.Dodać 200 mikrolitrów buforu do inkubacji przez noc do każdego Eppendorfa i inkubować próbki w temperaturze 10 stopni Celsjusza, 1000 rund na minutę, przez noc. Następnego dnia wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA i wymyj je w 18 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Uzyskane odciski rybosomów są gotowe do opracowania bibliotecznego.Wykonaj zubożenie rybosomalnego RNA dla próbek do sekwencjonowania RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Następnie wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA. Przeprowadź hydrolizę alkaliczną w następujący sposób; przygotować alkaliczny bufor do hydrolizy, dodać jedną objętość buforu do jednej objętości próbki i inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 25 minut.Dodać pięć mikrolitrów 3-molowego octanu sodu o pH 5,5 do każdej próbki, aby zatrzymać reakcję. Oczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA i wymyj je w 18 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Otrzymany losowo rozdrobniony RNA jest gotowy do przygotowania bibliotecznego.Do każdej próbki dodać 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu reakcyjnego i pięć mikrolitrów kinazy polinukleotydowej T4. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez półtorej godziny. Po tym czasie dodać trzy mikrolitry jednego milimolowego ATP i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA. Przygotowanie biblioteki należy wykonać przy użyciu dostępnego na rynku zestawu, zgodnie z protokołem podanym tutaj. Wykonaj PAGE przy użyciu 6% żelu poliakrylamidowego.Żel zabarwić preparatem SYBR Gold. Fragmenty żelu akcyzowego zawierające biblioteki. W przypadku próbek sekwencyjnych RNA biblioteka wynosi od 135 do 180 nukleotydów, a w przypadku RIBO-seq od 135 do 170 nukleotydów.Użyj sterylnych igieł lub żyletek i umieść wycięte fragmenty żelu w oddzielnych probówkach Eppendorf. Pamiętaj, aby wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami. Dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdego wyciętego fragmentu żelu.I inkubuj je w temperaturze 10 stopni Celsjusza, 450 rund na minutę, przez noc. Następnego dnia wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia DNA. Uzyskane biblioteki są gotowe do kontroli jakościowej i ilościowej z wysoką czułością, elektroforezy DNA na chipie, a następnie do sekwencjonowania nowej generacji.Uzyskane w ten sposób biblioteki cDNA prezentują odpowiednią ilość i jakość wymaganą do sekwencjonowania nowej generacji, co potwierdza elektroforeza DNA na chipie o wysokiej czułości. Pasma i piki reprezentujące biblioteki sekwencyjne RIBO są węższe i lepiej zdefiniowane, w porównaniu z tymi, które reprezentują biblioteki sekwencyjne RNA. Zgodnie z wbudowaną elektroforezą, biblioteki mają oczekiwaną soczewkę.Dodatkowe piki bliższe 200 parom zasad obecne w bibliotekach RIBO-seq mogą wskazywać na hibernujące rybosomy, nie do końca strawione ślady rybosomalne lub artefakty, na przykład rRNA, i mogą zostać odrzucone podczas analizy bioinformatycznej, gdy dane uzyskane z sekwencjonowania są przycinane, a tRNA filtrowane. Średnia ilość cDNA generowana podczas przygotowywania biblioteki wynosi 32 nanogramy, co zapewnia wystarczającą ilość materiału wymaganego do sekwencjonowania nowej generacji. Po kontroli jakości za pomocą elektroforezy w układzie scalonym, biblioteki zostały pobrane do sekwencjonowania pojedynczych i 50 par zasad na platformie NextSeq 500 firmy Illumina.Przycinanie adapterów i niskiej jakości sekwencje skutkowały 25 do 47 milionami odczytów na próbkę w przypadku próbek sekwencyjnych RNA i od 25 do 50 milionów odczytów na próbkę w przypadku próbek sekwencyjnych RIBO. Uzyskane dane zostały sprawdzone pod kątem kontroli jakości za pomocą FastQC. Zarówno próbki RNA-seq jak i RIBO-seq prezentowały się bardzo dobrej jakości.Mapowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z opisanym protokołem dało od 2,4 do 9,6 miliona unikalnie zmapowanych odczytów na próbkę dla próbek sekwencyjnych RNA i od 2,3 do 10,4 miliona unikalnie zmapowanych odczytów dla próbek sekwencyjnych RIBO. Dane RIBO-seq wykazują potrójną okresowość i wysoki, wąski pik, odpowiadający rybosomom inicjującym i charakterystyczny dla śladów rybosomalnych, czego nie obserwuje się w danych sekwencyjnych RNA. Co więcej, wykres przedstawiający profile średniego pokrycia śladów rybosomalnych i fragmentów mRNA w sekwencjach kodujących ujawnia wyższy odsetek odczytów zmapowanych do CDS w zestawie danych RIBO-seq, zgodnie z oczekiwaniami.Wizualizacja zmapowanych śladów rybosomalnych wykazała bardzo podobne wzorce w porównaniu z wynikami uzyskanymi z tego samego eksperymentu przeprowadzonego zgodnie ze standardową procedurą RIBO-seq, która obejmuje odzyskiwanie monosomu przez ultrawirowanie w gradionym poziomie sacharozy. Nasz protokół został wykorzystany do zbadania regulacji translacji w różnych warunkach wzrostu, ale może być zastosowany do badania innych aspektów translacji, takich jak wykrywanie miejsc inicjacji translacji i nowych genów kodujących białka. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z naszymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej.Przedstawiony przez nas protokół jest szybki, łatwy i opłacalny, a do tego można go wykonać przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

ribo-seq-bacteria-sample-collection-library-preparation-protocol-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Protokół zubożenia rybosomalnego RNA (rRNA) został opracowany w celu wzbogacenia informacyjnego RNA (mRNA) dla sekwencyjnego RNA metatranskryptomu jelita komara. Z komara i jego mikroorganizmów jelitowych stworzono sondy rRNA specyficzne dla próbki, które użyto do usunięcia rRNA poprzez odejmowanie. Działanie protokołu może skutkować usunięciem około 90-99% rRNA.

Zubożenie rybosomalnego RNA dla metagenomicznego RNA-seq jelit komarów

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Ten protokół zapewnia łatwy do naśladowania przepływ pracy do przeprowadzenia oczyszczania poli(A) RNA, konwersji wodorosiarczynu i przygotowania biblioteki przy użyciu standardowego sprzętu dla interesującej próbki biologicznej.

Wzbogacenie biblioteki mRNA i mRNA wodorosiarczynowego do sekwencjonowania nowej generacji

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Poznaj protokół RIBO-seq w bakteriach obejmujący pobieranie próbek, przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie NGS. Ta metoda pozwala precyzyjnie mapować pozycje rybosomów na mRNA w celu badania syntezy białek.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Przeglądaj więcej filmów