RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Technika profilowania rybosomów, zwana również RIBO-seq, jest obecnie najskuteczniejszym narzędziem do badania procesu syntezy białek in vivo. Zaletą tej metody jest jej zdolność do monitorowania translacji poprzez precyzyjne mapowanie pozycji i liczby rybosomów. RIBO-seq opiera się na fakcie, że rybosom, wiążąc się z cząsteczką mRNA, chroni zakopany fragment transkryptu podczas trawienia rybonukleazą.

Uzyskane fragmenty, zwane śladami rybosomalnymi, można sekwencjonować i mapować na transkrypt, z którego pochodzą, co skutkuje określeniem dokładnego położenia rybosomów. Równolegle z sekwencją RIBO przeprowadzane jest wysokoprzepustowe sekwencjonowanie całkowitego mRNA, aby zapewnić punkt odniesienia i umożliwić porównanie danych zarówno z sekwencji RIBO, jak i sekwencji RNA podczas analizy danych. Przed pobraniem komórek można opcjonalnie dodać chloramfenikol do kultury bakteryjnej, do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr, aby zahamować translację.

Inkubuj kulturę z antybiotykiem przez jedną minutę. Ten krok jest ważny, jeśli zbiór trwa dłużej niż zwykle, ponieważ zahamowanie translacji pozwala wydłużyć czas pobierania próbki. Próbki należy pobrać za pomocą wstępnie ogrzanego systemu filtracji.

Możesz wprowadzić potrząsanie, aby naśladować warunki wzrostu. Przerwij filtrowanie, gdy wszystkie media przejdą przez membranę, ale nie pozwól, aby filtr całkowicie wyschł. Zbieraj granulki bakteryjne, szybko zeskrobując komórki z dysku filtra za pomocą wstępnie podgrzanej, zdezynfekowanej czerpaki.

Natychmiast umieść całą czerpak z zebranymi komórkami w 50-mililitrowej probówce wypełnionej ciekłym azotem. Zebrany pellet powinien być całkowicie pokryty ciekłym azotem. Pozwól granulce dokładnie zamarznąć i usuń zamrożone komórki za pomocą wcześniej schłodzonej czerpaki.

Zamknij pokrywę i upewnij się, że jest przebita. Jest to ważne, ponieważ ciekły azot może spowodować eksplozję zamkniętych pojemników z powodu zmiany ciśnienia po odparowaniu. Przygotuj GMPP, wymaz DNA i świeże probówki Eppendorfa przeznaczone dla lizozy.

W razie potrzeby przygotować bufor do lizy z dodatkiem chloramfenikolu. Przydziel 500 mikrolitrów buforu do lizy na próbkę do oddzielnych probówek Eppendorfa i umieść je na lodzie. Odkazić moździerz i tłuczek laboratoryjnym środkiem dezynfekującym i 70% etanolem.

Ostudzić moździerz i tłuczek, wlewając do moździerza ciekły azot. Zamrożony granulat bakteryjny przenieść do wstępnie schłodzonego moździerza i zmielić na proszek. Dodaj około jednej objętości tlenku glinu i kontynuuj mielenie.

Utrzymuj moździerz, tłuczek i komórki w chłodzie, wlewając w razie potrzeby ciekły azot, aby nie dopuścić do rozmrożenia zawartości moździerza. Tuż przed użyciem dodać GMPPNP i wymaz DNA do podwielokrotności buforu do lizy. Przenieś roztwór do zaprawy i kontynuuj mielenie.

Pozwól lizazie powoli się rozmrażać podczas mielenia. Gdy lizaza całkowicie się rozmrozi, przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej rurki Eppendorfa i wróć do lodu. Odwirować lizazę w temperaturze 20 0000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieść supernatanty do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek Eppendorfa i umieścić je na lodzie. Zmierz stężenie RNA w każdej rozcieńczonej próbce za pomocą NanoDrop. Podziel każdy lizat na dwie porcje, 0,5 do 1 miligrama RNA dla sekwencji RIBO, a resztę dla sekwencji RNA.

Do jednego miligrama RNA dodaj 3,8 mikrolitra MNazy w Tris pH 8 i uzupełnij buforem do lizy do całkowitej objętości 500 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza, 300 rund na minutę, przez 45 minut. Po zakończeniu inkubacji wyczyść próbki dostępnym w handlu zestawem do czyszczenia RNA.

Przygotuj 15% poliakryloamidowy żel TBE z ośmioma molowymi mocznikami i umieść go w zbiorniku z buforem TBE. Uruchom wstępnie przez co najmniej 10 minut przy stałym napięciu 200 woltów. Wymieszać próbki z buforem do próbek TBE-Mocznik.

Denaturuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez minutę i natychmiast umieść je na lodzie. Wypłukać mocznik, wstrzykując bufor KZM do studzienek żelowych za pomocą strzykawki. Załaduj próbki, pozostawiając między nimi jedną przestrzeń studzienki, aby oddzielić każdą próbkę i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.

Użyj 29 oligonukleotydów o długości nukleotydów oraz mieszanki oligonukleotydów o długości 26 i 32 nukleotydów jako markerów. Uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 180 woltów. Przygotować sterylny bufor do inkubacji przez noc.

Po zakończeniu elektroforezy zabarwić żel preparatem SYBR Gold. Wyciąć fragmenty żelu od 26 do 32 nukleotydów za pomocą sterylnej igły lub żyletki, a następnie umieścić fragmenty żelu w oddzielnych probówkach Eppendorfa. Wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami.

Dodać 200 mikrolitrów buforu do inkubacji przez noc do każdego Eppendorfa i inkubować próbki w temperaturze 10 stopni Celsjusza, 1000 rund na minutę, przez noc. Następnego dnia wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA i wymyj je w 18 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Uzyskane odciski rybosomów są gotowe do opracowania bibliotecznego.

Wykonaj zubożenie rybosomalnego RNA dla próbek do sekwencjonowania RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Następnie wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA. Przeprowadź hydrolizę alkaliczną w następujący sposób; przygotować alkaliczny bufor do hydrolizy, dodać jedną objętość buforu do jednej objętości próbki i inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 25 minut.

Dodać pięć mikrolitrów 3-molowego octanu sodu o pH 5,5 do każdej próbki, aby zatrzymać reakcję. Oczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA i wymyj je w 18 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Otrzymany losowo rozdrobniony RNA jest gotowy do przygotowania bibliotecznego.

Do każdej próbki dodać 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu reakcyjnego i pięć mikrolitrów kinazy polinukleotydowej T4. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez półtorej godziny. Po tym czasie dodać trzy mikrolitry jednego milimolowego ATP i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia RNA. Przygotowanie biblioteki należy wykonać przy użyciu dostępnego na rynku zestawu, zgodnie z protokołem podanym tutaj. Wykonaj PAGE przy użyciu 6% żelu poliakrylamidowego.

Żel zabarwić preparatem SYBR Gold. Fragmenty żelu akcyzowego zawierające biblioteki. W przypadku próbek sekwencyjnych RNA biblioteka wynosi od 135 do 180 nukleotydów, a w przypadku RIBO-seq od 135 do 170 nukleotydów.

Użyj sterylnych igieł lub żyletek i umieść wycięte fragmenty żelu w oddzielnych probówkach Eppendorf. Pamiętaj, aby wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami. Dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdego wyciętego fragmentu żelu.

I inkubuj je w temperaturze 10 stopni Celsjusza, 450 rund na minutę, przez noc. Następnego dnia wyczyść próbki za pomocą zestawu do czyszczenia DNA. Uzyskane biblioteki są gotowe do kontroli jakościowej i ilościowej z wysoką czułością, elektroforezy DNA na chipie, a następnie do sekwencjonowania nowej generacji.

Uzyskane w ten sposób biblioteki cDNA prezentują odpowiednią ilość i jakość wymaganą do sekwencjonowania nowej generacji, co potwierdza elektroforeza DNA na chipie o wysokiej czułości. Pasma i piki reprezentujące biblioteki sekwencyjne RIBO są węższe i lepiej zdefiniowane, w porównaniu z tymi, które reprezentują biblioteki sekwencyjne RNA. Zgodnie z wbudowaną elektroforezą, biblioteki mają oczekiwaną soczewkę.

Dodatkowe piki bliższe 200 parom zasad obecne w bibliotekach RIBO-seq mogą wskazywać na hibernujące rybosomy, nie do końca strawione ślady rybosomalne lub artefakty, na przykład rRNA, i mogą zostać odrzucone podczas analizy bioinformatycznej, gdy dane uzyskane z sekwencjonowania są przycinane, a tRNA filtrowane. Średnia ilość cDNA generowana podczas przygotowywania biblioteki wynosi 32 nanogramy, co zapewnia wystarczającą ilość materiału wymaganego do sekwencjonowania nowej generacji. Po kontroli jakości za pomocą elektroforezy w układzie scalonym, biblioteki zostały pobrane do sekwencjonowania pojedynczych i 50 par zasad na platformie NextSeq 500 firmy Illumina.

Przycinanie adapterów i niskiej jakości sekwencje skutkowały 25 do 47 milionami odczytów na próbkę w przypadku próbek sekwencyjnych RNA i od 25 do 50 milionów odczytów na próbkę w przypadku próbek sekwencyjnych RIBO. Uzyskane dane zostały sprawdzone pod kątem kontroli jakości za pomocą FastQC. Zarówno próbki RNA-seq jak i RIBO-seq prezentowały się bardzo dobrej jakości.

Mapowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z opisanym protokołem dało od 2,4 do 9,6 miliona unikalnie zmapowanych odczytów na próbkę dla próbek sekwencyjnych RNA i od 2,3 do 10,4 miliona unikalnie zmapowanych odczytów dla próbek sekwencyjnych RIBO. Dane RIBO-seq wykazują potrójną okresowość i wysoki, wąski pik, odpowiadający rybosomom inicjującym i charakterystyczny dla śladów rybosomalnych, czego nie obserwuje się w danych sekwencyjnych RNA. Co więcej, wykres przedstawiający profile średniego pokrycia śladów rybosomalnych i fragmentów mRNA w sekwencjach kodujących ujawnia wyższy odsetek odczytów zmapowanych do CDS w zestawie danych RIBO-seq, zgodnie z oczekiwaniami.

Wizualizacja zmapowanych śladów rybosomalnych wykazała bardzo podobne wzorce w porównaniu z wynikami uzyskanymi z tego samego eksperymentu przeprowadzonego zgodnie ze standardową procedurą RIBO-seq, która obejmuje odzyskiwanie monosomu przez ultrawirowanie w gradionym poziomie sacharozy. Nasz protokół został wykorzystany do zbadania regulacji translacji w różnych warunkach wzrostu, ale może być zastosowany do badania innych aspektów translacji, takich jak wykrywanie miejsc inicjacji translacji i nowych genów kodujących białka. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z naszymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej.

Przedstawiony przez nas protokół jest szybki, łatwy i opłacalny, a do tego można go wykonać przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.