Name: Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących w żywych komórkach przy użyciu fotocrosslinkingu UV i spektrometrii mas. Technika ta nie wymaga puryfikacji kompleksów białkowo-RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.B. był wspierany przez Searle Scholars Program, W.W. Smith Foundation (C1404) i March of Dimes Foundation (1-FY-15- 344). B.A.G dziękuje za wsparcie ze strony grantów NIH R01GM110174 i NIH R01AI118891, a także grantów DOD BC123187P1. R.W.-T. był wspierany przez grant szkoleniowy NIH T32GM008216.

1. Kultura i ekspansja mESC
UWAGA: Embrionalne komórki macierzyste myszy są łatwe do hodowli i mogą być szybko rozszerzone do dużej liczby wymaganej przez eksperymenty biochemiczne dzięki ich szybkiemu czasowi cyklu. Zdrowe mESC podwajają się co 12 godzin.
<ol>
	<li>Rozwiń mESC do żądanej liczby na zżelowanych płytkach w pożywce mESC (patrz poniżej) w inkubatorze do hodowli tkankowych utrzymywanym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności >95%. 
	UWAGA: Należy przygotować wystarczającą ilość płytek na 3 - 5 powtórzeń biologicznych dla próbki +4SU i kontroli -4SU. Jedna 10-centymetrowa płytka (>tj. 5-10 milionów komórek) jest więcej niż wystarczająca dla każdej kontrpróby biologicznej.</li>
	<li>Pożywka dla mESC składa się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 0,5x penicyliny/streptomycyny, 1x aminokwasów endogennych, 100 μM beta-merkaptoetanolu, 1000 U/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 3 μM CHIR99021, 1 μM PD0325901.</li>
	<li>Przed pasażowaniem mESC przygotuj żądaną liczbę płytek o średnicy 10 cm.
	<ol>
		<li>Dodać 4 ml 0,1% żelatyny do wody, upewniając się, że cała powierzchnia płytki jest pokryta; inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT); usunąć roztwór żelatyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki pasażowe, gdy osiągną ~10 milionów komórek na płytkę, zwykle ~48 godzin po inokulacji. 
	UWAGA: Ponieważ mESC rosną w gęstych koloniach, nigdy nie należy dopuścić do osiągnięcia 100% zbieżności, jak obserwowano w przypadku linii komórkowych rosnących w monowarstwach (np. Komórki HEK293 lub 3T3). Płytka mESC powinna być przepuszczana, gdy ~50% zlewa się i zdecydowanie zanim pożywka zmieni kolor na żółty.
	<ol>
		<li>Aby odłączyć komórki, umyj płytki gęstymi kulturami mESC raz w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 2 mM EDTA, a następnie dodaj 0,05% trypsyny rozpuszczonej w DMEM i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na 5 minut (37 °C, 5% CO2 i >95% wilgotności).</li>
		<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i ponownie zawiesić komórki o równej objętości DMEM, kilkakrotnie energicznie pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i upewnij się, że komórki tworzą zawiesinę jednokomórkową (tj. bez skupisk), a następnie odwiruj mieszaninę komórek 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 - 2 ml DMEM.</li>
		<li>Zaszczepić komórki o gęstości 10 000 komórek/cm2 w pożywce mESC (tj. ~800 000 komórek na 10-centymetrową płytkę) przy użyciu płytek pokrytych żelatyną przygotowanych w kroku 1.3.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Usieciowanie oddziaływań białko-RNA w żywych komórkach
UWAGA: Sieciowanie RNA-białko odbywa się za pośrednictwem fotoaktywowanego analogu rybonukleozydu 4-tiourydyny (4SU). 4SU ma dłuższe maksimum absorbancji niż endogenne nukleotydy i może być włączone tylko do RNA; dlatego UVB o średniej długości fali może być używane do selektywnego sieciowania RNA z białkami25,26. Traktowanie UVB komórek traktowanych 4SU prowadzi do kowalencyjnych wiązań krzyżowych między RNA zawierającym 4SU a aminokwasami, z zgłoszoną preferencją dla Tyr, Trp, Met, Lys i Cys27.
<ol>
	<li>Rozwiń mESC do wymaganej liczby 10-centymetrowych płytek, jak opisano w kroku 1. 
	UWAGA: Należy przygotować wystarczającą ilość płytek na 3 - 5 powtórzeń biologicznych dla próbki +4SU i kontroli -4SU. Jedna 10-centymetrowa płytka (tj. 5 - 10 milionów komórek) wystarcza na każdą kontrpróbę biologiczną.</li>
	<li>Zanim płytki osiągną zlewność, dodaj 4SU bezpośrednio do podłoża do końcowego stężenia 500 μM. Pozostaw szalki kontrolne -4SU niepoddane obróbce.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij płytkami, aby równomiernie rozprowadzić 4SU w całym podłożu. Umieść je z powrotem w tym samym inkubatorze do hodowli tkankowych na 2 godziny (37 °C, 5% CO2 i >95% wilgotności).</li>
	<li>Przenieś talerze do wiadra na lód i wyrzuć podłoże.</li>
	<li>Delikatnie opłucz płytkę 5 ml lodowatego PBS. 
	UWAGA: Delikatnie spłucz, w przeciwnym razie komórki mogą się oderwać.</li>
	<li>Dodać 2 ml lodowatego PBS i umieścić płytki bez pokrywek w urządzeniu sieciującym wyposażonym w żarówki emitujące promieniowanie UVB (312 nm). Napromieniować płytki z nastawą energii 1 J/cm2, 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby plastikowe pokrywki zostały usunięte, ponieważ mogą one chronić ogniwa przed światłem UV i zapobiegać sieciowaniu.</li>
	<li>Zbierz komórki za pomocą podnośników komórkowych i przenieś do lodowatego PBS w stożkowych probówkach. Wirować przy 2 000 x g przez 5 minut, 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml lodowatego PBS z 2 mM EDTA i 0,2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Spodziewaj się 5 - 10 i 10 - 20 milionów komórek z płyt 10 cm i 15 cm.</li>
	<li>Wirować przy 2.000 x g przez 5 min, 4 °C. 
	UWAGA: Granulowane ogniwa można natychmiast użyć w kroku 3 lub można je błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.</li>
</ol>
3. Izolacja jąder
UWAGA: Jądra są izolowane w celu usunięcia białek cytoplazmatycznych i zwiększenia pokrycia białek jądrowych. Ten etap można zastąpić innymi formami frakcjonowania komórkowego w celu zbadania RBP w różnych przedziałach komórkowych.
<ol>
	<li>Przygotuj lodowaty bufor A (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 °C, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl). Do ekstrakcji należy użyć co najmniej 2,5 ml na 10 milionów komórek (zgodnie z obliczeniami w kroku 2.9). 
	UWAGA: Zapasy buforu A (np. butelka o pojemności 500 ml) można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 6 miesięcy.
	<ol>
		<li>Przed użyciem dodaj 0,5 mM ditiotreitolu (DTT) i 0,2 mM PMSF do żądanej ilości (2,5 ml na 10 milionów komórek) lodowatego buforu A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki za pomocą 2 ml buforu A na 10 milionów komórek. Wirować z prędkością 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, dodać bufor A uzupełniony 0,2% niejonowego, niedenaturującego detergentu, takiego jak oktylofenoksy-polietylenoksyetanol (patrz tabela materiałów), 500 μl na 10 milionów komórek. Obracać przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować przy 2.500 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant; osad składa się z nienaruszonych jąder pozbawionych cytoplazmy. 
	UWAGA: Jądra mogą być natychmiast użyte do kroku 4 lub zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.</li>
</ol>
4. Liza jąder
UWAGA: Usieciowane jądra są lizowane w buforze zgodnym ze spektrometrią mas w celu uwolnienia białek i kompleksów białko-RNA.
<ol>
	<li>Dodać bufor do lizy (9 M mocznika, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 24 °C), 200 μL na 10 milionów komórek. Sonikuj do ścinania chromatyny za pomocą sondy 1/8" przy ustawieniu amplitudy 50% przez 5 - 10 s.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut i zebrać 175 μl supernatantu, aby uniknąć osadu. 
	UWAGA: 100 μl zostanie użyte do kolejnych kroków RBR-ID, a pozostałe 75 μl lizatu można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania i/lub analizy western blot.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda lub podobnej techniki28. Rozcieńczyć stężenie białka w różnych próbkach do 1 mg/ml lub najniższe stężenie próbki, stosując odpowiednie ilości buforu do lizy. 
	UWAGA: Z jąder 10 milionów mESC należy spodziewać się 100 - 200 μg białka.</li>
</ol>
5. Trawienie trypsyny
UWAGA: Białka są trawione w celu wytworzenia peptydów odpowiednich do analizy metodą spektrometrii mas (MS) od dołu do góry.
<ol>
	<li>Dodać roztwór DTT do lizatu jądrowego (5 mM końcowy); inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać jodoacetamid ze świeżego wywaru (14 mM końcowy); inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Rozcieńczyć lizat 5-krotną objętością 50 mM NH4HCO3</li>
	<li>Dodać trypsynę (μg białka : μg trypsyny = 200 : 1); inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
</ol>
6. Odsalanie peptydów
<ol>
	<li>Przygotuj jedną niestandardową końcówkę stage na próbkę.
	<ol>
		<li>6.1.1. Umieścić krążek z materiałem C18 do ekstrakcji do fazy stałej na dnie końcówki pipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Dodać 50 μl żywicy oligo R3 z odwróconymi fazami na dysk C18. Umieść końcówkę stage w adapterze do wirowania, a końcówkę umieszczenia z adapterem w probówce do mikrofuge o pojemności 1.5 ml.</li>
		<li>Dodaj 100 μl 100% acetonitrylu do końcówek do prania. Wirować przy 1000 x g przez 1 minutę w celu usunięcia rozpuszczalnika.</li>
		<li>Zrównoważyć z 50 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA). Wirować przy 1000 x g przez 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 100% kwas mrówkowy do strawionej próbki białka, aby obniżyć pH do 2 - 3, 
	UWAGA: Powinno to wymagać ~5 μL na 1 ml rozcieńczonej próbki peptydu, ale należy zmierzyć pH i w razie potrzeby dodać więcej kwasu mrówkowego.</li>
	<li>Załaduj próbkę na specjalnie wykonaną końcówkę stolika, odwiruj przy 1000 x g przez 1 minutę, aż cała próbka przejdzie przez końcówkę.</li>
	<li>Przemyć związane peptydy 50 μl 0,1% TFA. Wirować przy 1000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Peptydy elutyczne eluować przez dodanie 50 μl buforu elucyjnego (75% acetonitrylu, 0,025% TFA) do końcówki stopnia i odwirować przy 1000 x g przez 1 minutę, aby wypchnąć bufor elucyjny z końcówki.</li>
	<li>Wysuszyć próbkę za pomocą wirówki próżniowej o ciśnieniu 150 x g i ciśnieniu 1–3 kPa przez 1 godz. 
	UWAGA: Suszone peptydy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.</li>
</ol>
7. Usunięcie usieciowanego RNA
UWAGA: Potraktuj peptydy nukleazą, aby usunąć usieciowane RNA.
<ol>
	<li>Zawiesić osad w 50 μl 2x buforze nukleazy (100 mM NH4HCO3, 4 mM MgCl2).</li>
	<li>Zmierzyć stężenie peptydu za pomocą absorbancji przy 280 nm, przyjmując 1 mg/ml peptydów dla A280 1, 
	UWAGA: Oczekiwane stężenie to 1 mg/ml.</li>
	<li>Dostosuj wszystkie próbki do 1 mg/ml lub do najniższego stężenia przy użyciu 2x buforu nukleazy.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową składającą się z 50 μlH2O+ 1 μl nukleazy o wysokiej czystości (≥250 U) (patrz tabela materiałów) na próbkę.</li>
	<li>Pobrać 50 μl próbki peptydu i dodać 50 μl głównej mieszaninyH2O+ nukleazy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przystąpić do wykonywania spektrometrii mas. 
	UWAGA: Peptydy są teraz gotowe do spektrometrii mas. Mogą być one analizowane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.</li>
</ol>
8. Nano chromatografia cieczowa, spektrometria mas i przetwarzanie surowych danych
UWAGA: Ponieważ sieciowanie 4SU zmienia masę peptydu, ich jony nie liczą się do intensywności nieusieciowanego peptydu podczas LC-MS/MS, która wydaje się być zmniejszona przez sieciowanie. Stopień i konsekwencja tego spadku odzwierciedla stopień usieciowania białka-RNA dla każdego peptydu24.
<ol>
	<li>Przygotować HPLC w następujący sposób: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie o czystości HPLC (bufor A); 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu klasy HPLC (bufor B).</li>
	<li>Jeśli dostępna jest nano-HPLC, należy podłączyć nanokolumnę o następujących specyfikacjach: średnica wewnętrzna 75 μm; wypełnione cząstkami C18-AQ; długość 20 - 25 cm. 
	UWAGA: Jeśli dostępna HPLC działa przy wyższych natężeniach przepływu, należy użyć kolumny o odpowiednim rozmiarze dla wskazanego natężenia przepływu. Chromatografia o wyższym przepływie zmniejsza czułość.</li>
	<li>Zaprogramować metodę HPLC w następujący sposób: natężenie przepływu 250 - 300 nL/min; gradient od 2 do 28% bufora B w 120 min, od 28 do 80% B przez następne 5 min i izokratyczne 80% B przez 10 min. 
	UWAGA: Jeśli HPLC nie ma automatycznego równoważenia kolumny przed załadowaniem próbki, uruchom program od 10 minut przy 0% B przed załadowaniem próbki.</li>
	<li>Zaprogramuj metodę akwizycji MS tak, aby wykonywała akwizycję zależną od danych (DDA) jako standardowe eksperymenty proteomiczne typu shotgun. Cykl pracy przyrządu powinien przeplatać pełne skany MS z tandemowymi skanami MS (lub MS/MS) najbardziej intensywnych sygnałów. Użyj optymalnych ustawień dla proteomiki MS runs. 
	UWAGA: Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy użyć przyrządów, które mogą wykonać co najmniej pełny skan MS w trybie wysokiej rozdzielczości (np. orbitrap, time-of-flight). Aby uzyskać dokładną ocenę ilościową, upewnij się, że odstępy między pełnymi skanami MS nie są dłuższe niż 3 s. Dłuższe cykle pracy mogą uniemożliwić dokładne zdefiniowanie ekstrahowanych chromatogramów jonowych.</li>
	<li>Załadować 1 - 2 μg próbki do kolumny HPLC i uruchomić metodę HPLC-MS/MS zgodnie z programem. Dla każdej kontrpróby biologicznej należy wykonać co najmniej dwie niezależne serie i traktować je jako kontrpróby techniczne.</li>
	<li>Po MS zaimportuj surowe pliki do pakietu oprogramowania proteomicznego w celu identyfikacji widm MS/MS i kwantyfikacji peptydów za pomocą ekstrahowanej chromatografii jonowej. Zalecamy pakiety oprogramowania, które mogą wykonywać chromatograficzne wyrównanie wielu serii MS (patrz Tabela materiałów)29,30.</li>
	<li>Jeśli opcja jest dostępna w pakiecie oprogramowania, włącz opcję "Dopasuj między przebiegami" przed rozpoczęciem przetwarzania danych.</li>
	<li>Po zakończeniu analizy wyeksportuj listę peptydów wraz z wartościami ilościowymi.</li>
</ol>

<ol><li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li>
<li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li>
<li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+RNA+biology+to+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li>
<li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127(2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212(2016).</li>
<li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+helix+stabilizes+the+3%27+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly%28A%29+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li>
<li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637(2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li>
<li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript%2C+Wrap53%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li>
<li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+U1+snRNP%2C+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle%2C+reveals+the+mechanism+of+5%27+splice+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy szczegółowy protokół eksperymentalny do przeprowadzenia RBR-ID w mESC oraz, z odpowiednimi modyfikacjami, w dowolnej komórce, która może włączyć 4SU do RNA. Inne typy komórek mogą wymagać optymalizacji podejścia w celu zapewnienia wystarczającego stosunku sygnału do szumu. Ponadto, podczas gdy opisany w niniejszym dokumencie protokół koncentruje się na badaniu jądrowych RBP, technologia RBR-ID powinna być łatwo dostosowana do różnych przedziałów komórkowych, takich jak cytozol lub określone organelle, poprzez z...

Celem metody RBR-ID jest identyfikacja nowych białek wiążących RNA (RBP) i mapowanie ich regionów wiążących RNA (RBR) z rozdzielczością na poziomie peptydów, aby ułatwić projektowanie mutantów wiążących RNA oraz badanie biologicznych i biochemicznych funkcji interakcji białko-RNA.
RNA jest unikalne wśród biomolekuł, ponieważ może zarówno działać jako posłaniec przenoszący informację genetyczną, jak i składać się w złożone trójwymiarowe struktury o funkcjach biochemicznych bardziej zbliżonych do białek1,2. Coraz więcej dowodów sugeruje, że niekodujące RNA (ncRNA) odgrywają ważną rolę w różnych szlakach regulacyjnych i epigenetycznych genów3,4,5 i, zazwyczaj, te funkcje regulacyjne są pośredniczone w połączeniu z białkami, które oddziałują specyficznie z danym RNA. Szczególnie istotne jest to, że niedawno zidentyfikowano zestaw oddziałujących białek dla intensywnie badanego długiego ncRNA (lncRNA) Xist, dostarczając cennych informacji na temat tego, w jaki sposób lncRNA pośredniczy w inaktywacji chromosomu X w komórkach żeńskich6,7,8. Warto zauważyć, że kilka z tych białek oddziałujących z Xist nie zawiera żadnych kanonicznych domen wiążących RNA9, a zatem ich aktywność wiązania RNA nie mogła być przewidziana in silico na podstawie samej ich pierwotnej sekwencji. Biorąc pod uwagę, że tysiące lncRNA ulega ekspresji w dowolnej komórce10, rozsądne jest założenie, że wiele z nich może działać poprzez interakcje z jeszcze nieodkrytymi białkami wiążącymi RNA (RBP). Eksperymentalna strategia mająca na celu zidentyfikowanie tych nowych RBP znacznie ułatwiłaby zatem zadanie analizy biologicznej funkcji ncRNA.
Poprzednie próby empirycznej identyfikacji RBP opierały się na selekcji poliA+RNA sprzężonej ze spektrometrią mas (MS)11,12,13,14,15. Chociaż eksperymenty te dodały wiele białek do listy przypuszczalnych RBP, z założenia mogły wykryć tylko białka związane z poliadenylowanymi transkryptami. Jednak większość małych RNA i wiele lncRNA nie jest poliadenylowanych. 16,17 i ich oddziałujące białka prawdopodobnie zostałyby pominięte w tych eksperymentach. W niedawnym badaniu zastosowano uczenie maszynowe do baz danych interaktomii białko-białko w celu zidentyfikowania białek, które współoczyszczają się z wieloma znanymi RBP i wykazano, że ci powtarzający się partnerzy RBP byli bardziej skłonni do posiadania aktywności wiążącej RNA18. Jednak podejście to opiera się na eksploracji istniejących dużych baz danych interakcji i może zidentyfikować tylko białka, które mogą być współoczyszczane w warunkach niedenaturujących ze znanymi RBP, wykluczając w ten sposób z analizy białka nierozpuszczalne, osadzone w błonie i rzadkie.
Identyfikacja białka jako RBP w dobrej wierze często nie dostarcza automatycznie informacji o biologicznej i/lub biochemicznej funkcji interakcji białko-RNA. Aby rozwiązać ten problem, zazwyczaj pożądane jest zidentyfikowanie domeny białkowej i reszt aminokwasowych zaangażowanych w interakcję, tak aby można było zaprojektować specyficzne mutanty do testowania funkcji wiązania RNA w kontekście każdej nowej klasy RBP19,20. Poprzednie wysiłki naszej grupy i innych osób wykorzystywały rekombinowane fragmenty białek i mutanty delecji do identyfikacji regionów wiążących RNA (RBR)19,20,21,22; Takie podejścia są jednak pracochłonne i niekompatybilne z analizami wysokoprzepustowymi. Niedawno w badaniu opisano eksperymentalną strategię mapowania aktywności wiązania RNA w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu spektrometrii mas23; jednak podejście to opierało się na podwójnej selekcji RNA poliA+, a zatem niosło ze sobą te same ograniczenia, co opisane powyżej podejścia do identyfikacji RBP.
Opracowaliśmy technikę, zwaną identyfikacją regionu wiążącego RNA (RBR-ID), która wykorzystuje fotosieciowanie białka-RNA i ilościową spektrometrię mas do identyfikacji białek i regionów białkowych oddziałujących z RNA w żywych komórkach bez zakładania statusu poliadenylacji RNA, włączając w ten sposób RBP związane z poliA- RNAs24. Co więcej, metoda ta opiera się wyłącznie na sieciowaniu i nie ma wymagań dotyczących rozpuszczalności ani dostępności białek, a zatem nadaje się do mapowania aktywności wiązania RNA w błonach (np. otoczce jądrowej) lub słabo rozpuszczalnych przedziałach (np. matrycy jądrowej). Opisujemy etapy eksperymentalne do wykonania RBR-ID dla jąder mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC), ale z niewielkimi modyfikacjami protokół ten powinien być odpowiedni dla różnych typów komórek, pod warunkiem, że mogą one skutecznie włączać 4SU z pożywki hodowlanej.

<table><tbody><tr><td>KnockOut</td><td>DMEM Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, pochodzenie amerykańskie</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100&razy;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Czynnik hamujący białaczkę (LIF)</td><td>EMD Milipor ESG1106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny, 2% w wodzie</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-tiourydyna</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM zapas w wodzie</td></tr><tr><td>Spektrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Komercyjna forma detergentu oktylo-fenoksy-polietylenowo-etanolowego</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, klasa sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore dysk ekstrakcyjny do fazy stałej</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 Żywica odwrócona fazowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>Nukleaza o wysokiej czystości</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Model 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>wycofany</td><td>zaktualizowany o FB505110</td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>Materiał uszczelniający do kolumny HPLC</td></tr><tr><td>Kapilara do nanokolumn (75 &mikro; m)</td> <td>Oprogramowanie Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Instytut Biochemii</td><td></td> im. Maxa Plancka <td>Może wykonywać chromatograficzne wyrównanie wielu przebiegów MS</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących rna w oparciu o spektrometrię mas

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Niekodujące RNA odgrywają ważną rolę w wielu procesach jądrowych, w tym w regulacji ekspresji genów, strukturze chromatyny i naprawie DNA. W większości przypadków w działaniu niekodujących RNA pośredniczą białka, których funkcje są z kolei regulowane przez te interakcje z niekodującymi RNA. W związku z tym donoszono, że rosnąca liczba białek zaangażowanych w funkcje jądrowe wiąże RNA, a w kilku przypadkach regiony wiążące RNA tych białek zostały zmapowane, często za pomocą pracochłonnych metod opartych na kandydatach.
Tutaj raportujemy szczegółowy protokół do przeprowadzenia wysokoprzepustowej, bezstronnej identyfikacji białek wiążących RNA i ich regionów wiążących RNA. Metodologia opiera się na włączeniu fotoreaktywnego analogu urydyny do komórkowego RNA, a następnie sieciowaniu białka-RNA za pośrednictwem promieniowania UV oraz analizach spektrometrii mas w celu ujawnienia peptydów usieciowanych RNA w proteomie. Chociaż opisujemy procedurę dla embrionalnych komórek macierzystych myszy, protokół powinien być łatwo dostosowany do różnych hodowanych komórek.

Rysunek 1 przedstawia schemat analizy RBR-ID. Ze względu na stosunkowo niską wydajność sieciowania w tej technice, bardzo ważne jest uwzględnienie zarówno poziomu ubytku, jak i spójności obserwowanego efektu (wartość P-) pomiędzy powtórzeniami biologicznymi. Rysunek 2 przedstawia wykres wulkaniczny wyników RBR-ID. Peptydy nakładające się na domenę motywu rozpoznającego RNA (RRM) wykazują wysoce spójny poziom ubytku. Dome...

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja białek wiążących RNA w żywych komórkach oraz mapowanie ich regionów wiązania RNA przy użyciu fotousieciowania indukowanego promieniowaniem UV, a następnie spektrometrii mas. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny epigenetyki, takie jak to, które regulatory epigenetyczne wiążą się z RNA oraz jakie regiony białkowe są niezbędne do tych oddziaływań. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona oczyszczania kompleksów białko-RNA, a w związku z tym potrzebna jest niewielka ilość materiału i możliwe jest zidentyfikowanie białek związanych z każdym rodzajem RNA.Przedstawiona metoda koncentruje się na białkach jądrowych, ponieważ stanowią one przedmiot naszych zainteresowań naukowych, jednak przy niewielkich modyfikacjach etapów frakcjonowania można by ją wykorzystać do badania RNA oraz białek wiążących w innych przedziałach jądrowych. Po hodowli i namnożeniu mysich ESC zgodnie z protokołem tekstowym, namnożone komórki przenieś na wymaganą liczbę płytek 10 centymetrów. Przed osiągnięciem przez komórki pełnej konfluencji, dodaj cztery SU bezpośrednio do pożywki do stężenia końcowego 500 micro molar.Pozostaw kontrolne szalki z 4sU bez obróbki. Delikatnie wstrząśnij płytki, aby homogenicznie rozprowadzić 4sU w całym medium, a następnie przenieś płytki z powrotem do tego samego inkubatora do hodowli tkanek na dwie godziny. Efektywność wbudowywania 4sU różni się w zależności od typu komórek, dlatego może być konieczna optymalizacja jego stężenia i czasu inkubacji, aby zapewnić efektywne sieciowanie i zminimalizować toksyczność.Następnie przenieś płytki do pojemnika z lodem i odlej pożywkę. Potem użyj 5 milliliters lodowatego PBS, aby delikatnie wypłukać płytki. Dodaj 2 milliliters lodowatego PBS i umieść płytki bez przykrywek w urządzeniu do sieciowania wyposażonym w żarówki emitujące promieniowanie UV-B.Naświetlaj płytki przy ustawieniu energii na poziomie 1 Joule per square centimeter. Efektywne sieciowanie UV jest kluczowe. Zalecamy stosowanie światła UV-B, ale można również użyć UV-A.W każdym przypadku ilość zastosowanej energii UV powinna zostać zoptymalizowana, co można monitorować za pomocą metod PAR-CLIP lub ChIRP. Do zebrania komórek i przeniesienia ich do probówek stożkowych z lodowatym PBS należy użyć scraperów komórkowych. Następnie komórki należy wirować przy 2000 ×g i 4 °C przez pięć minut.Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach lodowatego PBS z 2 millimolar EDTA i 0,2 millimolar PMSF. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Przewidywana liczba komórek to od pięciu do dziesięciu oraz od dziesięciu do dwudziestu milionów dla płytek o średnicy odpowiednio 10 centymetrów i 15 centymetrów.Następnie odwiruj komórki przy 2000 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Aby wyizolować jądra z komórek, przygotuj lodowaty bufor A zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed użyciem dodaj 0,5 mM DTT oraz 0,2 mM PMSF do odpowiedniej ilości buforu A. Dodaj 2 mL zimnego buforu do komórek w celu ich przemycia, a następnie odwiruj komórki przy 2500 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut.Odlać supernatant i dodać bufor A uzupełniony o 0,2% niejonowego, niedenaturującego detergentu, a następnie rotować próbkę w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po wirowaniu komórek z prędkością 2500 ×g przez pięć minut, usunąć supernatant. Osad składa się z nienaruszonych jąder komórkowych pozbawionych cytoplazmy.Aby zlizować jądra komórkowe, należy dodać do probówki 200 µL buforu lizującego. Próbkę należy poddać sonikacji za pomocą głowicy o średnicy 1/8 cala w celu ścinania chromatyny, przy ustawieniu amplitudy na 50% przez okres od pięciu do dziesięciu sekund. Próbkę należy wirować z prędkością 12000 ×g przez pięć minut, a następnie zebrać jedynie 175 µL supernatantu, aby uniknąć pobrania osadu.Następnie należy zmierzyć stężenie białka za pomocą metody Bradforda lub podobnej techniki. Potem, używając buforu do lizy, należy rozcieńczyć białko w poszczególnych próbkach do stężenia 1 mg/ml lub do najniższego stężenia występującego w próbkach. Do lizatu jądrowego należy dodać roztwór DTT o stężeniu 5 mM i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie należy dodać 14 mM jodacetamidu ze świeżego roztworu treściwego i inkubować lizat w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Rozcieńczyć lizat pięciokrotną objętością 50 mM wodorowęglanu amonu, a następnie dodać trypsynę. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez noc.Aby przygotować jedną specjalistyczną końcówkę etapową na próbkę, należy umieścić dysk materiału do ekstrakcji do fazy stałej C18 w dolnej części końcówki pipety o pojemności 200 µL. Na wierzch dysku C18 należy dodać 50 µL żywicy odwrotnej fazy Oligo R3, następnie umieścić końcówkę etapową w adapterze do wirowania, a adapter w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Do końcówek należy dodać 100 µL 100% acetonitrylu w celu ich przemycia.Następnie wiruj końcówki z prędkością 1000 ×g przez jedną minutę, aby usunąć rozpuszczalnik. Równoważ końcówki, używając 50 µL 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA). Następnie ponownie je wiruj.Dodaj 100% kwasu mrówkowego do próbki trawionego białka, aby obniżyć pH do poziomu od 2 do 3. Następnie nałóż próbkę na wykonaną na zamówienie końcówkę do oczyszczania (stage tip) i wiruj próbkę z prędkością 1000 ×g przez jedną minutę, aż cała próbka przejdzie przez końcówkę. Przemyj związane peptydy 50 µL 0,1% TFA.Następnie, po wirowaniu próbki przy 1000 ×g przez jedną minutę, eluuj peptydy, dodając 50 µL buforu elucyjnego do końcówki etapu i wirując przy 1000 ×g przez jedną minutę, aby wymusić wypłukanie buforu elucyjnego z końcówki. Aby wysuszyć próbkę, użyj wirówki próżniowej ustawionej na 150 ×g i od 1 do 3 kPa przez jedną godzinę. W celu usunięcia sieciowanego RNA z próbki, ponownie zawieś osad w 50 µL 2x buforu nukleazowego.Zmierz stężenie peptydów przy 280 nanometrach, przyjmując, że 1 miligram na mililitr peptydów odpowiada wartości A280 równym 1. Użyj 2x buforu nukleazowego, aby dostosować wszystkie próbki do stężenia jednego miligrama na mililitr lub do najniższego stężenia, a następnie przygotuj mieszaninę główną (master mix) składającą się z 50 mikrolitrów wody oraz 1 mikrolitra nukleazy o wysokiej czystości na próbkę. Połącz 50 mikrolitrów próbki peptydowej z 50 mikrolitrami mieszaniny głównej wody z nukleazą.Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Na koniec przeprowadź nanocieczową chromatografię, spektrometrię mas oraz przetwarzanie danych zgodnie z protokołem tekstowym. Rysunek przedstawia wykres wulkaniczny (volcano plot) wyniku RBR id z mysich ESCs.Peptydy nakładające się z domeną motywu rozpoznawania RNA są zaznaczone na niebiesko i wykazują wysoce spójne poziomy deplekcji. Peptyd wiążący RNA z białka HNRNPC został wyróżniony na czerwono. Przedstawiona tutaj mapa ciepła obrazuje wyniki RBR id, które zostały obliczone jako szacunkowe prawdopodobieństwo wiązania RNA przez dany region białka.Wynik został wyświetlony na powierzchni podjednostki spliceosomalnej U1-70k. Intensywny czerwony kolor w pobliżu miejsca kontaktu z RNA, określonego na podstawie struktury krystalicznej, wskazuje na prawidłową identyfikację oddziaływania białka z RNA. Na tej rycinie TET2 przedstawiono jako nowe białko wiążące RNA (RBP), a aktywność wiązania RNA przypisano do regionu C-końcowego poprzez wykreślenie wyniku RBR id wzdłuż sekwencji pierwotnej białka.Wreszcie, wymóg ten w odniesieniu do nowej RBR można zweryfikować, przeprowadzając PAR-CLIP z użyciem sekwencji typu dzikiego i porównując sygnał z sygnałem mutanta pozbawionego przewidywanej RBR. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu siedmiu do ośmiu godzin w ciągu dwóch dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Przed sieciowaniem komórki można stymulować różnymi zabiegami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób rozpoczyna się różnicowanie lub w jaki sposób cykl komórkowy reguluje oddziaływania białek z RNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat sposobu generowania ekstraktów zawierających sieciowane kompleksy białkowo-RNA w celu identyfikacji miejsc oddziaływań białko-RNA za pomocą spektrometrii mas.

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

W tym filmie opisujemy systematyczną ewolucję ligandów metodą wykładniczego wzbogacania (SELEX) w celu identyfikacji specyficznych sekwencji wiążących RNA dla docelowego białka. Białko jest inkubowane z dużą pulą randomizowanych sekwencji RNA, a sekwencje RNA wiążące białka są izolowane, amplifikowane PCR i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania ich miejsc wiązania białek.

Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Poznaj metodę identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących w żywych komórkach przy użyciu fotocrosslinkingu UV i spektrometrii mas. Technika ta nie wymaga puryfikacji kompleksów białkowo-RNA.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Przeglądaj więcej filmów