Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja białek wiążących RNA w żywych komórkach i mapowanie ich regionów wiążących RNA za pomocą sieciowania fotograficznego za pośrednictwem promieniowania UV, a następnie spektrometrii mas. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak to, które regulatory epigenetyczne są związane z RNA i jakie regiony białka są wymagane do interakcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wiąże się ona z oczyszczaniem kompleksów białkowych RNA, a zatem wymaga niewielkiej ilości materiału i identyfikuje białka związane z dowolnym typem RNA.

Jak przedstawiono, metoda ta koncentruje się na białkach jądrowych, ponieważ jest to nasze zainteresowanie naukowe, ale z niewielkimi modyfikacjami w etapach frakcjonowania, może być wykorzystana do badania RNA i białek wiążących w innych przedziałach stu-nu-larnych. Po wyhodowaniu i rozprężeniu mysich ESC zgodnie z protokołem tekstowym, rozwiń komórki do wymaganej liczby 10-centymetrowych płytek. Zanim płytki osiągną zbieżność, dodaj cztery SU bezpośrednio do pożywki do końcowego stężenia 500 mikro molowych.

Pozostaw naczynia kontrolne 4sU niepoddane obróbce. Delikatnie potrząśnij płytkami, aby równomiernie rozprowadzić 4sU w pożywce, a następnie umieść płytki z powrotem w tym samym inkubatorze do hodowli tkankowych na dwie godziny. Skuteczność inkorporacji 4sU różni się w zależności od typu komórek, dlatego może być konieczne zoptymalizowanie jej stężenia i czasu inkubacji, aby zapewnić skuteczne sieciowanie i zminimalizować toksyczność.

Następnie przenieś talerze do wiaderka na lód i wyrzuć podłoże. Następnie użyj 5 mililitrów lodowatego PBS, aby delikatnie spłukać płytki. Dodaj 2 mililitry lodowatego PBS i umieść płytki bez pokrywek w sieciowniku wyposażonym w żarówki emitujące promieniowanie UV-B.

Napromieniować płytki z energią ustawioną na 1 dżul na centymetr kwadratowy. Skuteczne sieciowanie UV ma kluczowe znaczenie. Zalecamy stosowanie światła UV-B, ale można również zastosować UV-A.

W każdym przypadku ilość wykorzystywanej energii UV powinna być zoptymalizowana i może być monitorowana przez PAR-CLIP lub ChIRP. Użyj podnośników komórkowych, aby zebrać komórki i przenieść je do lodowatego PBS w stożkowych rurkach. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 2000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórek w pięciu mililitrach lodowatego PBS z 2 milimolowym EDTA i 0,2 milimolowym PMSF. Za pomocą hemocytometru policz komórki. Spodziewaj się od pięciu do dziesięciu i dziesięciu do dwudziestu milionów komórek z płytek o średnicy odpowiednio 10 i 15 centymetrów.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 2000 razy g i 4 stopnie Celsjusza przez pięć minut. Aby wyizolować jądra od komórek, należy przygotować lodowaty bufor A zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed użyciem dodaj 0,5 milimola DTT i 0,2 milimola PMSF do żądanej ilości buforu A. Dodaj 2 mililitry zimnego buforu do komórek, aby je umyć, a następnie obracaj komórki w temperaturze 2500 razy g i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i dodać bufor A uzupełniony 0,2 procentem niejonowego, niedenaturującego detergentu, a następnie obracać próbkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po obracaniu komórek pod ciśnieniem 2500 razy g przez pięć minut, usunąć supernatant. Osad składa się z nienaruszonych jąder pozbawionych cytoplazmy.

Aby zlizować jądra, dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy do probówki. Użyj sondy 1/8 cala do sonikacji próbki, aby ścinać chromatynę przy ustawieniu amplitudy 50 procent przez pięć do dziesięciu sekund. Wiruj próbkę pod ciśnieniem 12000 razy g przez pięć minut i zbierz tylko 175 mikrolitrów supernatantu, aby uniknąć osadu.

Następnie zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda lub podobnej techniki. Następnie użyj buforu do lizy, aby rozcieńczyć białko w różnych próbkach do 1 miligrama na mililitr lub najniższego stężenia próbki. Dodać 5-milimolowy roztwór DTT do lizatu jądrowego i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie dodaj 14 milimolowy jodoacetamid ze świeżego wywaru i inkubuj lizat w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Rozcieńczyć lizat pięciokrotnie większą objętością 50-milimolowego wodorowęglanu amonu, a następnie dodać trypsynę. Próbkę inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Aby przygotować jedną niestandardową końcówkę do pomiaru na próbkę, umieść krążek z materiałem C18 do ekstrakcji do fazy stałej na dnie końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Dodaj 50 mikrolitrów żywicy Oligo R3 z odwróconymi fazami na wierzch dysku C18, a następnie umieść końcówkę stolika w adapterze do wirowania i umieść adapter w 1,5-mililitrowej probówce do mikrofugi. Dodaj 100 mikrolitrów 100-procentowego acetonitrylu do końcówek, aby je umyć.

Następnie odwiruj końcówki w temperaturze 1000 razy g przez jedną minutę, aby usunąć rozpuszczalnik. Zrównoważ końcówki 50 mikrolitrami 0,1 procenta kwasu trifluorooctowego lub TFA. Następnie ponownie je zakręć.

Dodaj 100 procent kwasu mrówkowego do strawionej próbki białka, aby obniżyć pH do 2 do 3. Następnie załaduj próbkę na specjalnie wykonaną końcówkę stolika i odwiruj próbkę z prędkością 1000 razy g przez jedną minutę, aż cała próbka przejdzie przez końcówkę. Umyj związane peptydy 50 mikrolitrami 0,1 procent TFA.

Następnie, po wirowaniu próbki pod ciśnieniem 1000 razy g przez jedną minutę, wymyj peptydy, dodając 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do końcówki stopnia i odwiruj przy 1000 razy g przez jedną minutę, aby wypchnąć bufor elucyjny z końcówki. Aby wysuszyć próbkę, należy użyć wirówki próżniowej ustawionej na 150 razy g i 1 do 3 kilopaskali na jedną godzinę. Aby usunąć usieciowany RNA z próbki, ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach buforu 2x nukleazy.

Zmierz stężenie peptydu na poziomie 280 nanometrów, przyjmując 1 miligram na mililitr peptydów dla i A280 1. Użyj 2x bufor nukleazy, aby dostosować wszystkie próbki do jednego miligrama na mililitr lub do najniższego stężenia, a następnie przygotuj główną mieszankę 50 mikrolitrów wody plus 1 mikrolitr nukleazy o wysokiej czystości na próbkę. Połącz 50 mikrolitrów próbki peptydu z 50 mikrolitrami wody i głównej mieszanki nukleazy.

Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Na koniec przeprowadź chromatografię nanocieczową, spektrometrię mas i przetwarzanie danych zgodnie z protokołem tekstowym. Na rysunku przedstawiono wykres wulkanu przedstawiający wynik identyfikatora RBR z mysich ESC.

Peptydy, które nałożyły się na domenę motywu rozpoznającego RNA, są zaznaczone na niebiesko i wykazują bardzo spójne poziomy wyczerpania. Peptyd wiążący RNA z HNRNPC jest podświetlony na czerwono. Pokazano tutaj mapę cieplną wyników identyfikatora RBR, które są obliczane jako oszacowanie prawdopodobieństwa wiązania RNA w regionie białka.

Wynik rzutowany jest na powierzchnię podjednostki spliceosomalnej U1-70k. Jaskrawoczerwony kolor w pobliżu kontaktu RNA, określony przez strukturę krystaliczną, wskazuje na prawidłową identyfikację oddziaływania białka RNA. Na tym rysunku TET2 jest przedstawiony jako nowy RBP, a aktywność wiązania RNA jest mapowana do regionu końcowego C poprzez wykreślenie wyniku identyfikatora RBR wzdłuż pierwotnej sekwencji białka.

Wreszcie, zapotrzebowanie na ten nowy RBR można zweryfikować, wykonując PAR-CLIP przy użyciu sekwencji typu dzikiego i porównując sygnał z sygnałem mutanta pozbawionego przewidywanego RBR. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu do ośmiu godzin w ciągu dwóch dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Przed sieciowaniem komórki mogą być stymulowane różnymi zabiegami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak początek różnicowania lub jak cykl komórkowy reguluje interakcje białek RNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować dodatki zawierające usieciowane kompleksy białkowe RNA, aby zidentyfikować miejsca interakcji białkowego RNA za pomocą spektrometrii mas.