Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Ten protokół opisuje ekstrakcję lotnych związków organicznych z próbki biologicznej za pomocą metody ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżniowo, chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu szyny Entech Sample Preparation Rail, oraz analizę danych. Opisano również hodowlę próbek biologicznych i sondowanie izotopów stabilnych.

Protokół ten pozwala nam łatwo skoncentrować i zidentyfikować lotne metabolity i aktywnie wytwarzane substancje lotne z organizmów mikrobiologicznych w różnych próbkach biologicznych. WAZ jest bardziej przyjazną dla użytkownika metodą koncentracji substancji lotnych o niskiej obfitości. Wszystko, czego potrzebujesz, to próbka w warunkach zbliżonych do próżni i pozwól fizyce zrobić resztę.

Dostęp do analizy lotnej próbek klinicznych ma ważne implikacje dla odkrywania biomarkerów metabolicznych w wielu różnych stanach chorobowych. Na przykład patogen napędzający infekcję lub powodzenie terapii przeciwbakteryjnej można wykryć za pomocą lotnej analizy próbek śliny, plwociny lub oddechu. Aby przygotować próbki kału, dodaj jeden mililitr wody dejonizowanej do 100 miligramów kału w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej i wiruj przez trzy minuty.

Próbki należy przechowywać na lodzie, gdy nie są używane. Dodaj 485 mililitrów pożywki BHI z 20-milimolową glukozą 13C lub BHI z 30% deuterem do 15 mikrolitrów mieszaniny kału i wody, upewniając się, że końcowa objętość próbki wynosi 500 mikrolitrów. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach technicznych.

Aby przygotować próbki ścieków, dodaj 500 mikrolitrów ścieków do 500 mikrolitrów pożywki BHI z 13C glukozą lub 30% deuterem, aby uzyskać całkowitą objętość jednego mililitra. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach i przechowywać je na lodzie. Aby przygotować próbki śliny, dodaj 50 mikrolitrów śliny do 500 mikrolitrów pożywki BHI z 13C glukozą lub 30% deuterem, aby uzyskać całkowitą objętość 550 mikrolitrów.

Przygotować próbki w trzech egzemplarzach i przechowywać je na lodzie. Aby przygotować próbki plwociny, dodaj 15 mikrolitrów plwociny do fiolki. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach i przechowywać je na lodzie.

Umieść puste fiolki VOA na zimnej płycie i umieść zimną płytkę na lodzie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Włącz 5600 SPEU i ustaw go na żądaną temperaturę. Oznacz 20-mililitrowe fiolki VOA zgodnie z próbkami, powtórzeniami i identyfikatorami HSP za pomocą wodoodpornego markera, który jest odporny na wodę w przypadku, gdy na zewnątrz fiolki tworzy się kondensacja podczas przebywania na lodzie.

Wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego odkręć białą nakrętkę fiolki, szybko pipetuj próbkę do fiolki i załóż wkładkę pokrywki, czarną nakrętkę i HSP. Umieścić fiolkę zawierającą próbkę i HSP z powrotem na zimnej płytce. Po przygotowaniu wszystkich próbek w szklanych fiolkach włącz pompę próżniową, umieść fiolki w próżni i usuń źródło próżni.

Dokładnie sprawdź ciśnienie po umieszczeniu wszystkich próbek pod próżnią za pomocą manometru. Jeśli fiolka przecieka, należy upewnić się, że nakrętka jest mocno dokręcona i że białe pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym HSP i wkładki wieczka są prawidłowo założone. Umieścić fiolki w SPEU dla optymalnego czasu i temperatury z mieszaniem przy 200 obr./min.

Ekstrahuj kultury przez jedną godzinę w temperaturze 70 stopni Celsjusza i ekstrahuj eksperymenty sondowania stabilnych izotypów z próbkami kału, ścieków, śliny i plwociny przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść zimną płytę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do użycia po zakończeniu okresu ekstrakcji. Po zakończeniu ekstrakcji umieścić próbki na zimnej płytce na 15 minut, aby wyciągnąć parę wodną z HSP i przestrzeni nad fiolką, a następnie przenieść HSP do rękawów.

Skonfiguruj sekwencję próbek w oprogramowaniu Entech. Otwórz program i wybierz 5800 i Sekwencja w opcjach po prawej stronie menu rozwijanego Instrument. Zapisz tabelę sekwencji, wybierz pozycję Uruchom po lewej stronie, a następnie Rozpocznij od pustego w desorberze, jeśli puste HSP nie jest desorberem.

Należy pamiętać, że WWO będą obsługiwane przez SPR dla każdej próbki w sekwencji. Pozwól SPR się rozgrzać. Zezwól SPR na automatyczne uruchamianie wszystkich próbek.

Sekwencja po stronie GC-MS automatycznie zapisze dane w osobnych plikach. Dodaj wartość szczytową do metody przetwarzania, wybierając opcję Kalibruj, a następnie Edytuj związek, nazwę i wstaw związek w obszarze Zewnętrzny związek wzorcowy. Dodaj nazwę związków, czas retencji i jon docelowy sygnału ilościowego.

Dodaj trzy największe piki, które zawierają związki z prawdopodobieństwem większym niż 75%, upewniając się, że wyrównanie każdego jonu identyfikującego związek leży w środku piku. Zapisz go, wybierając przycisk OK, a następnie Metoda i Zapisz. Po skonfigurowaniu metody procesu przejdź do opcji Quantitate and Calculate, a następnie View and QEDIT Quant Result, aby określić ilościowo dane.

W tym przypadku po ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią nastąpiła desorpcja termiczna na GC-MS w celu zbadania profili lotnych mono- i kokultur bakteryjnych oraz identyfikacji aktywnie wytwarzanych substancji lotnych za pomocą sondowania stabilnych izotopów z ludzkiego kału, śliny, ścieków i próbek plwociny. Mono- i kohodowle składały się z gatunków bakterii Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii. Wykryto 43 lotne cząsteczki z opisanymi cząsteczkami z monokultur i kokultur w 24- i 48-godzinnych punktach czasowych.

Stwierdzono większą inkorporację 13C do w pełni znakowanych cząsteczek lotnych w porównaniu z deuterem. 13C włączono do 2-butanonu, 3-hydroksy, 2, 3-butanodionu, diacetylu, kwasu octowego i fenolu we wszystkich próbkach kału, ścieków i śliny. Aceton, kwas butanowy i kwas propanowy wykryto jako oznaczone w ślinie i ściekach.

natomiast trisiarczek dimetylu i disiarczek dimetylu wzbogacono zarówno w próbkach kału, jak i śliny. Lotne 1-propanol, 2-butanon, benzofenon, etanol i octan metylotiolu wzbogacono tylko w ściekach, a 2,3-pentanodion w ślinie. Deuter został włączony do lotnych kwasu octowego, benzaldehydu, trisiarczku 4-metylodimetylu i fenolu z próbek śliny lub ścieków.

Kwas octowy, trisiarczek dimetylu, aceton i 2-metylo propanol występowały w większej liczbie w próbkach plwociny hodowlanej niż w próbkach plwociny niehodowlanej. Permutacyjną wieloczynnikową analizę wariantów, PERMANOVA, przeprowadzono na macierzy odległości Braya-Curtisa lotnych obfitości z próbek plwociny mukowiscydozy. Odkryliśmy, że osoba, która oddała próbkę, wyjaśnia 51% zmienności w plwocinie hodowlanej znakowanej 13C i 33% zmienności w plwocinie niehodowlanej.

W tym artykule przedstawiono sukces znakowania stabilnych izotopów glukozą 13C w lotnych próbkach plwociny z hodowlanych próbek plwociny pobranych od siedmiu osób z mukowiscydozą. Substancje lotne, które mają wyższą inkorporację 13C dla większości próbek, są pokazane w panelu 5A, te z niższym procentem włączenia 13C w większości próbek plwociny znajdują się w panelu 5B, a cząsteczki o niższej konwersji 13C w mniejszości próbek plwociny są pokazane w panelu 5C. Zawsze należy dokładnie sprawdzić ciśnienie w fiolce po około minucie.

Zepsuta próżnia pokonuje czułość i szybkość metody WAZY. Zgodnie z tą procedurą, jeśli przeprowadzono sondowanie stabilnych izotopów, DNA można wyekstrahować z pozostałego materiału w celu zidentyfikowania organizmów lub gatunków drobnoustrojów, które mogły przyczynić się do produkcji lotnych cząsteczek. Metoda ta jest również przydatna w wykrywaniu substancji lotnych z dowolnego rodzaju próbki bez sondowania izotopowego.

Dzięki zaletom czułości i małej objętości próbki, wiele zastosowań może skorzystać z tej techniki.