Name: Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę VASE do analizy lotnych związków organicznych z próbek mikrobiologicznych związanych z człowiekiem. Technika ta umożliwia wykrywanie metabolitów bakteryjnych w kale, ślinie i plwocinie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Heather Maughan i Lindzie M. Kalikin za staranną redakcję tego rękopisu. Prace te były wspierane przez NIH NHLBI (grant 5R01HL136647-04).

1. Uwagi dotyczące analizy Headspace Sorbent Pen (HSP) i próbki
UWAGA: HSP zawierający sorbent Tenax TA został wybrany do wychwytywania szerokiego zakresu substancji lotnych. Tenax ma mniejsze powinowactwo do wody w porównaniu z innymi sorbentami, co umożliwia zatrzymywanie większej ilości LZO z próbek o wyższej wilgotności. Tenax ma również niski poziom zanieczyszczeń i może być kondycjonowany do ponownego użycia. Wyboru sorbentu dokonano również z uwzględnieniem kolumny zainstalowanej w GC-MS (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przeprowadzić kontrole ujemne poprzez ekstrakcję pożywek lub ślepych prób w takich samych warunkach, jak przy ekstrakcji próbki.</li>
	<li>Przeanalizować ślepą próbę HSP (wcześniej potwierdzono, że jest czysta i wolna od znaczącego tła) na GC-MS przed analizą wyekstrahowanych próbek. Uruchomić ślepe próby między typami próbek (np. trzy kontrpróby monokultury bakterii, ślepa próba, trzy kontrpróby kohodowli bakterii, ślepa próba itp.).</li>
	<li>Ogranicz używanie pachnących środków higieny osobistej lub spożywanie śmierdzących pokarmów przed ekstrakcją i analizą próbki. Najlepiej przygotować próbki w okapie bezpieczeństwa biologicznego, który nie był czyszczony alkoholem lub innymi lotnymi środkami czyszczącymi przez co najmniej 30 minut. Włącz przepływ powietrza w kapturze bezpieczeństwa biologicznego na 30-60 minut przed przygotowaniem próbki.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać na lodzie, aby ograniczyć uwalnianie substancji lotnych podczas przygotowywania próbki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mono- i kokultur
<ol>
	<li>W kapturze bezpieczeństwa biologicznego zaszczepić kultury A. baumannii, S. aureus i P. aeruginosa w pożywkach wzrostowych Todda Hewitta. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem 200 obr./min.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji należy przeprowadzić postępowanie z kulturą w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Rozcieńczyć każdą kulturę do gęstości optycznej 0,05 przy 500 nm.</li>
	<li>Wymieszać kokultury w równych częściach i odpipetować 200 μl pożywki kontrolnej, mono- lub kokultury do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny. Przygotować drugą płytkę do 48-godzinnej inkubacji.</li>
	<li>Pod koniec okresu inkubacji przygotować próbki do ekstrakcji w sekcji 4. Pipetować płynne kultury do probówek mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C, aby w razie potrzeby ekstrahować je później.</li>
</ol>
3. Sondowanie stabilnych izotopów w przygotowaniu próbek biologicznych
UWAGA: Próbki kału i śliny zostały pobrane od anonimowych dawców za zgodą University of California Irvine Institutional Review Board (HS# 2017-3867). Ścieki pochodziły z San Diego w Kalifornii. Próbki plwociny pobrano od osób z mukowiscydozą w ramach większego badania zatwierdzonego przez University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).
<ol>
	<li>Wszystkie próbki biologiczne należy przygotować w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Aby przygotować próbki kału, dodaj 1 ml wody dejonizowanej do 100 mg kału w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj przez 3 minuty. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.
		<ol>
			<li>Do 15 μl mieszaniny kału i wody dodaj 485 μl pożywki Brain Heart Infusion (BHI) z 20 mM 13C glukozy lub BHI z 30% deuterem (D2O). Upewnij się, że końcowa objętość próbki wynosi 500 μl. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach technicznych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby przygotować próbki ścieków, należy dodać 500 μl ścieków do 500 μL BHI z 20 mM 13C glukozy lub BHI z 30% D2O, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.</li>
		<li>Aby przygotować próbki śliny, dodać 50 μl śliny do 500 μl BHI z 20 mM 13C glukozy lub BHI z 30% D2O, aby uzyskać całkowitą objętość 550 μL. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.</li>
		<li>Aby przygotować próbki plwociny w celu porównania substancji lotnych obecnych w próbce przed i po hodowli, należy przeprowadzić pierwszą ekstrakcję za pomocą 15 μl plwociny. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany. Przejść do sekcji 4 w celu ekstrakcji próbki i ekstrahować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C z mieszaniem 200 obr./min.</li>
		<li>Po zakończeniu pierwszej ekstrakcji niehodowlanych próbek plwociny należy zachować fiolki z plwociną. Dodać 500 μl BHI z 20 mM 13C glukozy do fiolek z plwociną z 3.5.1. Umieść na lodzie, gdy nie jest używany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejść do sekcji 4 w celu ekstrakcji próbki.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Umieść puste fiolki po analizie lotnych substancji organicznych (VOA) (20 ml) na zimnej płytce i umieść zimną płytkę na lodzie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Włącz urządzenie do ekstrakcji wstrzykiwacza sorbentu 5600 (SPEU) i ustaw żądaną temperaturę zgodnie z wymaganiami dla każdej metody. 
	UWAGA: W przypadku eksperymentów z sondowaniem izotopów stabilnych w temperaturze 37 °C osiągnięcie wartości zadanej może zająć do 15 minut. W przypadku eksperymentów z monokulturą i kokulturą w temperaturze 70 °C osiągnięcie wartości zadanej może zająć do 60 minut.</li>
	<li>Zebrać czyste WWO, które są równe liczbie przygotowanych próbek, w tym WWO dla pożywek lub kontroli próbek.</li>
	<li>W razie potrzeby oznacz fiolki VOA o pojemności 20 ml zgodnie z próbkami, powtórzeniami i identyfikatorami HSP. Użyj markera, który jest odporny na wodę, w przypadku gdy na zewnątrz fiolki tworzy się kondensacja podczas przebywania na lodzie.</li>
	<li>Wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego odkręć białą nakrętkę na fiolce, szybko odpipetuj próbkę do fiolki i załóż czarną nakrętkę, wkładkę pokrywki i HSP. 
	UWAGA: Próbki nie powinny mieć kontaktu z HSP, a objętość próbki będzie zależeć od typu próbki.</li>
	<li>Umieścić fiolkę zawierającą próbkę i HSP z powrotem na zimnej płytce.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.5 i 4.6 dla każdej próbki. Wykonaj te czynności dla każdej próbki, a nie dla wszystkich naraz, aby zapobiec podgrzaniu próbki, a tym samym przedwczesnemu uwalnianiu substancji lotnych.</li>
	<li>Po przygotowaniu wszystkich próbek w szklanych fiolkach należy wykonać następujące czynności na zewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego na stole. Włączyć pompę próżniową, umieścić fiolki pod ciśnieniem do 30 mmHg i usunąć źródło podciśnienia. 
	UWAGA: Fiolki nie muszą znajdować się na zimnej tacy po zakończeniu aplikacji próżniowej.</li>
	<li>Dokładnie sprawdź ciśnienie po umieszczeniu wszystkich próbek pod próżnią za pomocą manometru. Jeśli fiolka jest nieszczelna, należy upewnić się, że nakrętka jest mocno dokręcona i że białe pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym HSP i wkładki wieczka są prawidłowo założone. 
	UWAGA: Uszkodzone uszczelnienie może spowodować zmniejszenie wykrywalności substancji lotnych w porównaniu z fiolką pod próżnią.</li>
	<li>Umieścić fiolki w SPEU na optymalny czas i temperaturę z mieszaniem przy 200 obr./min. Ekstrahować kultury przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C. Ekstrahować eksperymenty sondowania stabilnymi izotopami z próbkami kału, ścieków, śliny i plwociny przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić zimną płytę w temperaturze -80 °C do użycia po zakończeniu okresu ekstrakcji.</li>
	<li>Po zakończeniu ekstrakcji umieścić próbki na zimnej płytce na 15 minut, aby wyciągnąć parę wodną z HSP i przestrzeni nad fiolką.</li>
	<li>Przenieś WWO do rękawów. 
	UWAGA: Eksperyment można tutaj przerwać na okres do ~1 tygodnia w temperaturze pokojowej przed utratą bardziej lotnych związków z HSP.</li>
</ol>
5. Analiza próbek na chromatografii gazowej - spektrometr masowy (GC-MS)
<ol>
	<li>Użyj następujących ustawień GC-MS (patrz tabela materiałów): 35 °C z 5 minutami zatrzymania, 10 °C/min z krokiem do 170 °C i krokiem 15 °C/min do 230 °C ze stosunkiem podziału 20:1 i całkowitym czasem pracy 38 minut.</li>
	<li>Ustawić metodę desorpcji w następujący sposób: 2 min, podgrzewanie w temperaturze 70 °C; desorpcja w 2 minutach w temperaturze 260 °C; wypalanie w temperaturze 34 min w temperaturze 260 °C i po wypieku w temperaturze 2 min w temperaturze 70 °C.</li>
	<li>Ustaw sekwencję próbek i rozpocznij przebieg zgodnie z oprzyrządowaniem.
	<ol>
		<li>Aby skonfigurować sekwencję w oprogramowaniu Entech, otwórz program. W opcjach po prawej stronie menu rozwijanego instrumentu wybierz 5800 | Sekwencja.</li>
		<li>Obserwuj tabelę sekwencji w oprogramowaniu Entech podobną do tej w oprogramowaniu GC-MS. Nazwij kolumnę Identyfikator próbki zgodnie z bieżącym numerem date_vial. Należy pamiętać, że nazwa jest analogiczna do nazwy w tabeli sekwencji GC-MS, a metoda 5800 określa szybkość narastania temperatury, czasy utrzymywania itp. (otwiera menu, w którym można wybrać metodę wygenerowaną w kroku 5.2).</li>
		<li>Należy pamiętać, że kolumny Tray (Taca) i Position (Pozycja) określają, dokąd uda się szyna przygotowania próbki (SPR), aby odebrać HSP.
		<ol>
			<li>Zwróć uwagę na dwie tace z 30 plamkami każda po lewej stronie, ułożone jako sześć kolumn po pięć punktów każda. Pozycja tacy, która jest najbardziej wysunięta na lewo i najbliżej użytkownika (przód), to pozycja 1, podczas gdy skrajna prawa, najbardziej oddalona to pozycja 30.</li>
			<li>Zwróć uwagę, że te tace to HSP A lub B, gdzie HSP B to taca bliżej SPR (najbardziej wewnętrzna taca), a bezpośrednio za HSP B znajduje się HSP Blank. Umieść wyekstrahowane próbki na tacach i odpowiednio wybierz miejsce w sekwencji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisz tabelę sekwencji, wybierz opcję Uruchom po lewej stronie, a następnie Rozpocznij od pustej wartości w desorberze, jeśli puste HSP znajduje się w desorberze (oznaczone przez HSP oznaczone żółtą etykietą).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy pamiętać, że WWO będą obsługiwane przez SPR dla każdej próbki w sekwencji. Pozwól SPR się rozgrzać, a u góry ekranu pojawi się komunikat potwierdzający, czy puste miejsce znajduje się w desorberze. Kliknij Pomiń, aby potwierdzić, że pióro tam jest. Zezwól SPR na automatyczne uruchamianie wszystkich próbek, a sekwencja po stronie GC-MS automatycznie zapisze dane w oddzielnych plikach.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Dane filtrów jakościowych w oprogramowaniu GC-MS (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przejrzyj każdy pik na chromatogramie i dodaj adnotacje do pików, które pasują do biblioteki National Institute of Standards & Technology (NIST) (lub z inną dostępną biblioteką).</li>
		<li>Dodać adnotowane piki chromatogramu do metody przetwarzania. Ustaw kryteria wyboru pików tak, aby obejmowały związki o prawdopodobieństwie większym niż 75%, i upewnij się, że wyrównanie każdego jonu identyfikującego związek leży w środku piku.
		<ol>
			<li>Aby dodać szczyt do metody przetwarzania, wybierz opcję Kalibruj | Edycja złożona | Nazwa | wstaw związek w obszarze Zewnętrzny związek wzorcowy. Dodaj nazwę związku, czas retencji, Quant Signal Target Ion. Dodaj trzy największe szczyty. Aby zapisać, wybierz OK | Metoda | Zapisz.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po skonfigurowaniu metody procesu przejdź do opcji Quantitate | Obliczanie i wyświetlanie | Wynik ilościowy QEdit.</li>
		<li>Sprawdź każdy związek, aby upewnić się, że piki są zgodne z oczekiwanymi czasami retencji i znajdują się powyżej szumu tła.</li>
		<li>Po zakończeniu QEdit wybierz opcję Exit (Wyjdź | Tak, aby zapisać QEdits i powrócić do głównego chromatogramu. Wyeksportuj integracje obszaru, otwierając plik po lewej stronie. Wybierz opcję Kwantyfikuj | Wygeneruj raport.</li>
		<li>Aby wyeksportować pliki do użycia w DExSI, wybierz Plik | Eksport danych do formatu AIA | Utwórz nowy katalog i wybierz lokalizację dla pliku lub Użyj istniejącego katalogu.</li>
		<li>Obserwuj, jak otwiera się nowe okno, w którym można wybrać pliki do eksportu. Przenieś pliki na prawą stronę okna i kliknij Proces. Poczekaj od kilku sekund do kilku minut w zależności od liczby konwertowanych plików.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skoryguj obfitość izotopów w DExSI zgodnie z instrukcjami dla oprogramowania DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) i przeprowadź analizę za pomocą ulubionego oprogramowania lub programu (np. R). Skrypty używane do generowania liczb znajdują się pod adresem <a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/joannlp/VOC_SIP&source=gmail&ust=1646398895210000&usg=AOvVaw18Jx-lKhdf3eNanCnF4OhQ" href="https://github.com/joannlp/VOC_SIP" target="_ blank">https://github.com/joannlp/VOC_SIP</a>.</li>
</ol>

<ol><li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li>
<li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li>
<li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li>
<li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179(2015).</li>
<li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li>
<li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li>
<li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li>
<li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87(2012).</li>
<li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584(2014).</li>
<li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+%27rule-in%27+Pseudomonas+aeruginosa+and+%27rule-out%27+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826(2018).</li>
<li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412(2015).</li>
<li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways%3A+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151(2018).</li>
<li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li>
<li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365(2018).</li>
<li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li>
<li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+%26+Bioanalytical+Techniques%22%5BJournal%5D)">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184(2014).</li>
<li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li>
<li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+volatile+analysis%3A+optimization+of+HS%2FSPME+coupled+to+GC%2FMS%2FFID%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li>
<li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li>
<li>Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuum-assisted+sorbent+extraction%3A+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390(2020).</li>
<li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Environment+Research%22%5BJournal%5D)">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li>
<li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+vacuum%3A+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li>
<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12(2015).</li>
<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060(2018).</li>
<li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li>
</ol>

V. L. V i S. J. B. D. byli byłymi pracownikami Entech Instruments Inc., a K. W. jest członkiem Entech's University Program. J. P., J. K. i C. I. R. nie mają żadnych konfliktów interesów, o których mogliby się oświadczyć.

Aby zidentyfikować produkcję lotną w kulturach in vitro i próbkach związanych z człowiekiem, przeprowadzono analizę lotnych mono- i kokultur P. aeruginosa, S. aureus i A. baumanii oraz sondowanie stabilnych izotopów różnych próbek biologicznych. W analizie dla monokultur i kokultur substancje lotne wykryto poprzez przeprowadzenie krótkiej ekstrakcji przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C. Lotna analiza mono- i kokultur pozwoliła na zbadanie związków wytwarzanych zarówno przez poszczególne gatunki...

Lotne związki organiczne (LZO) są bardzo obiecujące w wykrywaniu i identyfikacji bakterii, ponieważ są emitowane przez wszystkie organizmy, a różne mikroorganizmy mają unikalne sygnatury LZO. Cząsteczki lotne zostały wykorzystane jako nieinwazyjny pomiar do wykrywania różnych infekcji dróg oddechowych, w tym przewlekłej obturacyjnej choroby płuc1, gruźlicy2 w moczu3, oraz zapalenia płuc związanego z respiratorem4, oprócz odróżniania osób z mukowiscydozą (CF) od zdrowych osób z grupą kontrolną5,6. Sygnatury lotne zostały nawet wykorzystane do rozróżnienia specyficznych infekcji patogennych w mukowiscydozie (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa8,9 i S. aureus vs. P. aeruginosa10). Jednak ze względu na złożoność takich próbek biologicznych często trudno jest określić źródło określonych LZO.
Jedną ze strategii oddzielania profili lotnych od wielu infekujących mikroorganizmów jest przeprowadzenie analizy przestrzeni nad mikroorganizmami zarówno w monokulturze, jak i w kokulturze11. Analiza przestrzeni nad powierzchnią bada anality emitowane do "przestrzeni nad głową" nad próbką, a nie te osadzone w samej próbce. Metabolity drobnoustrojów są często charakteryzowane w monokulturach ze względu na trudności w określeniu pochodzenia metabolitów drobnoustrojów w złożonych próbkach klinicznych. Poprzez profilowanie substancji lotnych z monokultur bakteryjnych, rodzaje substancji lotnych wytwarzanych przez drobnoustroje in vitro mogą stanowić podstawę jego lotnego repertuaru. Łączenie kultur bakteryjnych, np. tworzenie kokultur i profilowanie wytwarzanych lotnych cząsteczek, może ujawnić interakcje lub wzajemne karmienie między bakteriami12.
Inną strategią identyfikacji mikrobiologicznego pochodzenia lotnych cząsteczek jest dostarczenie źródła składników odżywczych, które jest oznaczone stabilnym izotopem. Izotopy stabilne to naturalnie występujące, nieradioaktywne formy atomów o różnej liczbie neutronów. W strategii, która jest stosowana od wczesnych lat 30. XX wieku do śledzenia aktywnego metabolizmu u zwierząt13, mikroorganizm żywi się oznakowanym źródłem składników odżywczych i włącza stabilny izotop do swoich szlaków metabolicznych. Ostatnio stabilny izotop w postaci ciężkiej wody (D2O) został użyty do identyfikacji metabolicznie aktywnego S. aureus w klinicznej próbce plwociny CF14. W innym przykładzie, 13glukozy znakowanej C wykorzystano do zademonstrowania krzyżowego podawania metabolitów między klinicznymi izolatami mukowiscydozy P. aeruginosa i Rothia mucilaginosa12 .
Wraz z rozwojem technik spektrometrii mas, metody wykrywania lotnych sygnałów przeniosły się z obserwacji jakościowych na bardziej ilościowe pomiary. Dzięki zastosowaniu chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) przetwarzanie próbek biologicznych stało się dostępne dla większości warunków laboratoryjnych lub klinicznych. Wiele metod badania lotnych cząsteczek zostało wykorzystanych do profilowania próbek, takich jak żywność, kultury bakterii i inne próbki biologiczne oraz powietrze i woda w celu wykrycia zanieczyszczeń. Jednak kilka popularnych metod pobierania próbek lotnych o wysokiej przepustowości wymaga rozpuszczalnika i nie jest przeprowadzanych z korzyściami zapewnianymi przez ekstrakcję próżniową. Ponadto do analizy często wymagane są większe objętości lub ilości (większe niż 0,5 ml) pobranych materiałów15,16,17,18,19, chociaż jest to specyficzne dla podłoża i wymaga optymalizacji dla każdego typu próbki i metody.
Tutaj ekstrakcja sorbentu wspomagana próżnią (VASE), a następnie desorpcja termiczna na GC-MS została wykorzystana do zbadania lotnych profili mono- i kokultur bakteryjnych oraz identyfikacji aktywnie wytwarzanych substancji lotnych za pomocą sondowania stabilnych izotopów z ludzkich kału, śliny, ścieków i próbek plwociny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Przy ograniczonej ilości próbek, LZO wyekstrahowano już z 15 μl plwociny. Eksperymenty z sondowaniem izotopów na próbkach ludzkich wymagały dodania stabilnego źródła izotopów, takiego jak glukoza 13C, i pożywki w celu kultywowania wzrostu społeczności drobnoustrojów. Aktywna produkcja substancji lotnych została zidentyfikowana jako cięższa cząsteczka przez GC-MS. Ekstrakcja cząsteczek lotnych w próżni statycznej umożliwiła wykrycie cząsteczek lotnych ze zwiększoną czułością20,21,22.

<table><tbody><tr><td>13C glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374-1G</td><td></td></tr><tr><td>2-Stg Pompa membranowa</td><td>Entech Instruments</td><td>01-10-20030</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki VOA 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>5719110</td><td></td></tr><tr><td>24 mm Czarne nakrętki z otworem, bez przegrody</td><td>Entech Instruments</td><td>01-39-76044B</td><td>utrzymuje wkładkę wieczka na miejscu na fiolce</td></tr><tr><td>24-milimetrowa wkładka na fiolkę do wstrzykiwaczy sorbentowych</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-L024S</td><td>umożliwia wstrzykiwaczom wykonanie uszczelnienia próżniowego na górze fiolki</td></tr><tr><td>5600 Jednostka do ekstrakcji pióra sorbentowego (SPEU)</td><td>Entech Instruments</td><td>5600-SPES</td><td>5600 Jednostka do ekstrakcji pióra sorbentowego -120 VAC</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki testowe</td><td>Genesee</td><td>25-224</td><td></td></tr><tr><td>Infuzja mózgu i serca (BHI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>ChemStation Stofware</td><td>Kolumna Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-624</td><td>Agilent</td><td>122-1364E</td><td>60 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm, grubość warstwy 1,40 mikrona, w GC-MS</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Dexsi</td><td>Dexsi (open source)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (7890A GC i 5975C obojętny XL MSD z detektorem trójosiowym)</td><td>Agilent</td><td></td><td>7890A GC i 5975C obojętny XL MSD z trzema osiami detektor</td></tr><tr><td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-B01</td><td>Elementy do uruchamiania ekstrakcji headspace zawarte w zestawie</td></tr><tr><td>Długopis sorbentowy Headspace (HSP) - blank</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-0</td><td></td></tr><tr><td>Długopis sorbentowy Headspace (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-T3560</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (2 mL)</td><td>VWR</td><td>53550-792</td><td></td></tr><tr><td>O-ringi</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-OR-L024</td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie próbki Rail</td><td>Entech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kondycjoner termiczny w piórze sorbentowym</td><td>Entech Instruments</td><td>3801-SPTC</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt (TH) media</td><td>Sigma</td><td>T1438-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Lotne związki organiczne (LZO) z próbek biologicznych mają nieznane pochodzenie. LZO mogą pochodzić od gospodarza lub różnych organizmów z jego społeczności mikrobiologicznej. Aby rozwikłać temat pochodzenia mikrobiologicznych LZO, przeprowadzono analizę lotnej przestrzeni nad powierzchnią mono- i kokultur bakteryjnych Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii, a także sondowanie stabilnych izotopów w próbkach biologicznych kału, śliny, ścieków i plwociny. Mono- i kokultury wykorzystano do identyfikacji produkcji substancji lotnych z poszczególnych gatunków bakterii lub w połączeniu z sondowaniem stabilnych izotopów w celu zidentyfikowania aktywnego metabolizmu drobnoustrojów w próbkach biologicznych.
Ekstrakcja sorbentu wspomagana próżnią (VASE) została zastosowana do ekstrakcji LZO. VASE to łatwa w użyciu, komercjalizowana, bezrozpuszczalnikowa metoda ekstrakcji przestrzeni nad powierzchnią dla związków półlotnych i lotnych. Brak rozpuszczalników i warunki zbliżone do próżni stosowane podczas ekstrakcji sprawiają, że opracowanie metody jest stosunkowo łatwe i szybkie w porównaniu z innymi opcjami ekstrakcji, takimi jak tert-butylacja i mikroekstrakcja do fazy stałej. Opisany tutaj przepływ pracy został wykorzystany do identyfikacji określonych niestabilnych sygnatur z monokultur i kokultur. Co więcej, analiza sondowania stabilnymi izotopami próbek biologicznych związanych z ludźmi pozwoliła zidentyfikować LZO, które były produkowane powszechnie lub unikalnie. W artykule przedstawiono ogólny przebieg pracy i rozważania eksperymentalne dotyczące VASE w połączeniu z sondowaniem stabilnych izotopów żywych kultur drobnoustrojów.

Monokultury i kokultury S. aureus, P. aeruginosa oraz A. baumannii 
Monokultury i kokultury składały się z gatunków bakteryjnych S. aureus, P. aeruginosa oraz A. baumannii. Są to powszechne patogeny oportunistyczne występujące w ranach u ludzi i infekcjach przewlekłych. Aby zidentyfikować lotne cząsteczki obecne w monokulturach i kokulturach, przeprowadzono krótką, 1-godzin...

Ten protokół opisuje ekstrakcję lotnych związków organicznych z próbki biologicznej za pomocą metody ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżniowo, chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu szyny Entech Sample Preparation Rail, oraz analizę danych. Opisano również hodowlę próbek biologicznych i sondowanie izotopów stabilnych.

Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Protokół ten pozwala nam łatwo skoncentrować i zidentyfikować lotne metabolity i aktywnie wytwarzane substancje lotne z organizmów mikrobiologicznych w różnych próbkach biologicznych. WAZ jest bardziej przyjazną dla użytkownika metodą koncentracji substancji lotnych o niskiej obfitości. Wszystko, czego potrzebujesz, to próbka w warunkach zbliżonych do próżni i pozwól fizyce zrobić resztę.Dostęp do analizy lotnej próbek klinicznych ma ważne implikacje dla odkrywania biomarkerów metabolicznych w wielu różnych stanach chorobowych. Na przykład patogen napędzający infekcję lub powodzenie terapii przeciwbakteryjnej można wykryć za pomocą lotnej analizy próbek śliny, plwociny lub oddechu. Aby przygotować próbki kału, dodaj jeden mililitr wody dejonizowanej do 100 miligramów kału w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej i wiruj przez trzy minuty.Próbki należy przechowywać na lodzie, gdy nie są używane. Dodaj 485 mililitrów pożywki BHI z 20-milimolową glukozą 13C lub BHI z 30% deuterem do 15 mikrolitrów mieszaniny kału i wody, upewniając się, że końcowa objętość próbki wynosi 500 mikrolitrów. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach technicznych.Aby przygotować próbki ścieków, dodaj 500 mikrolitrów ścieków do 500 mikrolitrów pożywki BHI z 13C glukozą lub 30% deuterem, aby uzyskać całkowitą objętość jednego mililitra. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach i przechowywać je na lodzie. Aby przygotować próbki śliny, dodaj 50 mikrolitrów śliny do 500 mikrolitrów pożywki BHI z 13C glukozą lub 30% deuterem, aby uzyskać całkowitą objętość 550 mikrolitrów.Przygotować próbki w trzech egzemplarzach i przechowywać je na lodzie. Aby przygotować próbki plwociny, dodaj 15 mikrolitrów plwociny do fiolki. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach i przechowywać je na lodzie.Umieść puste fiolki VOA na zimnej płycie i umieść zimną płytkę na lodzie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Włącz 5600 SPEU i ustaw go na żądaną temperaturę. Oznacz 20-mililitrowe fiolki VOA zgodnie z próbkami, powtórzeniami i identyfikatorami HSP za pomocą wodoodpornego markera, który jest odporny na wodę w przypadku, gdy na zewnątrz fiolki tworzy się kondensacja podczas przebywania na lodzie.Wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego odkręć białą nakrętkę fiolki, szybko pipetuj próbkę do fiolki i załóż wkładkę pokrywki, czarną nakrętkę i HSP. Umieścić fiolkę zawierającą próbkę i HSP z powrotem na zimnej płytce. Po przygotowaniu wszystkich próbek w szklanych fiolkach włącz pompę próżniową, umieść fiolki w próżni i usuń źródło próżni.Dokładnie sprawdź ciśnienie po umieszczeniu wszystkich próbek pod próżnią za pomocą manometru. Jeśli fiolka przecieka, należy upewnić się, że nakrętka jest mocno dokręcona i że białe pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym HSP i wkładki wieczka są prawidłowo założone. Umieścić fiolki w SPEU dla optymalnego czasu i temperatury z mieszaniem przy 200 obr./min.Ekstrahuj kultury przez jedną godzinę w temperaturze 70 stopni Celsjusza i ekstrahuj eksperymenty sondowania stabilnych izotypów z próbkami kału, ścieków, śliny i plwociny przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść zimną płytę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do użycia po zakończeniu okresu ekstrakcji. Po zakończeniu ekstrakcji umieścić próbki na zimnej płytce na 15 minut, aby wyciągnąć parę wodną z HSP i przestrzeni nad fiolką, a następnie przenieść HSP do rękawów.Skonfiguruj sekwencję próbek w oprogramowaniu Entech. Otwórz program i wybierz 5800 i Sekwencja w opcjach po prawej stronie menu rozwijanego Instrument. Zapisz tabelę sekwencji, wybierz pozycję Uruchom po lewej stronie, a następnie Rozpocznij od pustego w desorberze, jeśli puste HSP nie jest desorberem.Należy pamiętać, że WWO będą obsługiwane przez SPR dla każdej próbki w sekwencji. Pozwól SPR się rozgrzać. Zezwól SPR na automatyczne uruchamianie wszystkich próbek.Sekwencja po stronie GC-MS automatycznie zapisze dane w osobnych plikach. Dodaj wartość szczytową do metody przetwarzania, wybierając opcję Kalibruj, a następnie Edytuj związek, nazwę i wstaw związek w obszarze Zewnętrzny związek wzorcowy. Dodaj nazwę związków, czas retencji i jon docelowy sygnału ilościowego.Dodaj trzy największe piki, które zawierają związki z prawdopodobieństwem większym niż 75%, upewniając się, że wyrównanie każdego jonu identyfikującego związek leży w środku piku. Zapisz go, wybierając przycisk OK, a następnie Metoda i Zapisz. Po skonfigurowaniu metody procesu przejdź do opcji Quantitate and Calculate, a następnie View and QEDIT Quant Result, aby określić ilościowo dane.W tym przypadku po ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią nastąpiła desorpcja termiczna na GC-MS w celu zbadania profili lotnych mono- i kokultur bakteryjnych oraz identyfikacji aktywnie wytwarzanych substancji lotnych za pomocą sondowania stabilnych izotopów z ludzkiego kału, śliny, ścieków i próbek plwociny. Mono- i kohodowle składały się z gatunków bakterii Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii. Wykryto 43 lotne cząsteczki z opisanymi cząsteczkami z monokultur i kokultur w 24- i 48-godzinnych punktach czasowych.Stwierdzono większą inkorporację 13C do w pełni znakowanych cząsteczek lotnych w porównaniu z deuterem. 13C włączono do 2-butanonu, 3-hydroksy, 2, 3-butanodionu, diacetylu, kwasu octowego i fenolu we wszystkich próbkach kału, ścieków i śliny. Aceton, kwas butanowy i kwas propanowy wykryto jako oznaczone w ślinie i ściekach.natomiast trisiarczek dimetylu i disiarczek dimetylu wzbogacono zarówno w próbkach kału, jak i śliny. Lotne 1-propanol, 2-butanon, benzofenon, etanol i octan metylotiolu wzbogacono tylko w ściekach, a 2,3-pentanodion w ślinie. Deuter został włączony do lotnych kwasu octowego, benzaldehydu, trisiarczku 4-metylodimetylu i fenolu z próbek śliny lub ścieków.Kwas octowy, trisiarczek dimetylu, aceton i 2-metylo propanol występowały w większej liczbie w próbkach plwociny hodowlanej niż w próbkach plwociny niehodowlanej. Permutacyjną wieloczynnikową analizę wariantów, PERMANOVA, przeprowadzono na macierzy odległości Braya-Curtisa lotnych obfitości z próbek plwociny mukowiscydozy. Odkryliśmy, że osoba, która oddała próbkę, wyjaśnia 51% zmienności w plwocinie hodowlanej znakowanej 13C i 33% zmienności w plwocinie niehodowlanej.W tym artykule przedstawiono sukces znakowania stabilnych izotopów glukozą 13C w lotnych próbkach plwociny z hodowlanych próbek plwociny pobranych od siedmiu osób z mukowiscydozą. Substancje lotne, które mają wyższą inkorporację 13C dla większości próbek, są pokazane w panelu 5A, te z niższym procentem włączenia 13C w większości próbek plwociny znajdują się w panelu 5B, a cząsteczki o niższej konwersji 13C w mniejszości próbek plwociny są pokazane w panelu 5C. Zawsze należy dokładnie sprawdzić ciśnienie w fiolce po około minucie.Zepsuta próżnia pokonuje czułość i szybkość metody WAZY. Zgodnie z tą procedurą, jeśli przeprowadzono sondowanie stabilnych izotopów, DNA można wyekstrahować z pozostałego materiału w celu zidentyfikowania organizmów lub gatunków drobnoustrojów, które mogły przyczynić się do produkcji lotnych cząsteczek. Metoda ta jest również przydatna w wykrywaniu substancji lotnych z dowolnego rodzaju próbki bez sondowania izotopowego.Dzięki zaletom czułości i małej objętości próbki, wiele zastosowań może skorzystać z tej techniki.

capturing-actively-produced-microbial-volatile-organic-compounds-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Wtórna spektrometria mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (SESI-MS) umożliwia detekcję lotnych związków organicznych (LZO) bez konieczności wstępnego przygotowania próbek. Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące szybkiej (w ciągu kilku minut) charakteryzacji bakteryjnych LZO przy użyciu SESI-MS.

Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)

Czas reakcji transferu protonów w locie Spektrometria mas umożliwia bardzo czułą, szybką i nieinwazyjną analizę lotnych związków organicznych. Aby pokazać jej potencjał, podajemy trzy przykłady: fermentację mlekową jogurtu (monitorowanie bioprocesów on-line), różne genotypy jabłek (badania przesiewowe na dużą skalę) oraz przestrzeń zanosową po wypiciu kawy (analiza przestrzeni nosowej).

PTR-ToF-MS w połączeniu ze zautomatyzowanym systemem pobierania próbek i dostosowaną analizą danych do badań żywności: monitorowanie bioprocesów, badania przesiewowe i analiza przestrzeni nosowej

Wprowadzamy VacuSIP, prostą, nieinwazyjną i niezawodną metodę czystego i dokładnego punktowego pobierania próbek wody. System został opracowany i oceniony pod kątem jednoczesnego zbierania wody wdychanej i wydychanej przez dozowniki zawiesiny bentosowej in situ, w celu czystego pomiaru usuwania i wydalania cząstek stałych i rozpuszczonych związków.

VacuSIP, ulepszona metoda InEx do pomiaru in situ cząstek stałych i rozpuszczonych związków przetwarzanych przez aktywne podajniki zawiesiny

Ekstrakcja gazowana to nowa technika laboratoryjna do analizy związków lotnych i półlotnych. Gaz nośny rozpuszcza się w ciekłej próbce poprzez zastosowanie nadciśnienia i wymieszanie próbki. Komora na próbkę jest następnie dekompresowana. Gatunki analitów są uwalniane do fazy gazowej w wyniku musowania.

Ekstrakcja gazowana lotnych związków organicznych w połączeniu z ciśnieniem atmosferycznym Jonizacja chemiczna Kwadrupolowa spektrometria mas

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Tutaj prezentujemy protokół zbierania substancji lotnych o zapachu kwiatowym z kwitnących kwiatów, przy użyciu nieniszczącej procedury pobierania próbek.

Szybkie zbieranie lotnych substancji zapachowych o kwiatowych zapachach przy użyciu techniki zbierania lotnych substancji w przestrzeni nad powierzchnią do pobierania próbek desorpcji termicznej GC-MS

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. W szczególności stosujemy mikroekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z chromatografią gazową ze spektrometrią mas do analizy lotnych składników zapachów zwierzęcych i oznaczeń zapachowych.

Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

Całkowita waporyzacja Mikroekstrakcja w fazie stałej (TV-SPME) całkowicie odparowuje płynną próbkę, podczas gdy anality są sorbowane na włókno SPME. Pozwala to na podział analitu tylko na parę rozpuszczalnika i powłokę z włókna SPME.

Chromatografia gazowa-spektrometria mas w połączeniu z całkowitą odparowywaniem Mikroekstrakcja do fazy stałej jako narzędzie kryminalistyczne

Platforma mikroekstrakcji gazowej w fazie stałej jest tutaj opisana do szybkiej, niezawodnej i półautomatycznej identyfikacji i kwantyfikacji substancji lotnych w dojrzałych owocach czarnej porzeczki. Technika ta może być wykorzystana do poszerzenia wiedzy na temat aromatu owoców oraz do selekcji odmian o wzmocnionym smaku do celów hodowlanych.

Profilowanie związków lotnych w owocach czarnej porzeczki przy użyciu mikroekstrakcji w fazie stałej w przestrzeni nad powierzchnią sprzężoną z chromatografią gazową i spektrometrią mas

Ten protokół przedstawia w pełni zautomatyzowany przepływ pracy do ekstrakcji geosminy i 2-metyloizoborneolu z wody i bogatych w lipidy tkanek ryb. Metoda pozwala na wczesne wykrycie tych cząsteczek, zanim osiągną one progi zapachowe. Przedstawiono reprezentatywne dane z otoczenia akwakultury.

Ekstrakcja i wykrywanie geosminy i 2-metyloizoborneolu w wodzie i rybach przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i GC-MS

Poznaj metodę VASE do analizy lotnych związków organicznych z próbek mikrobiologicznych związanych z człowiekiem. Technika ta umożliwia wykrywanie metabolitów bakteryjnych w kale, ślinie i plwocinie.

Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią (Wideo) | JoVE Journal

Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Przeglądaj więcej filmów