Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

W danych przedstawionych w tym badaniu pokazują dramatyczny wpływ jednostronnej niedrożności moczowodu na czynność nerek, stan zapalny i zwłóknienie. Pomaga nam zrozumieć patofizjologiczne mechanizmy jednostronnej niedrożności moczowodów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania interakcji komórka-komórka, zdarzeń subkomórkowych oraz dynamicznego kojarzenia struktury i funkcji w funkcjonującej nerce.

Demonstracja procedury moczowodu zostanie wykonana przez dr Silvię Campos-Bilderback, która jest chirurgiem w naszym laboratorium. Na początek znieczul szczura, a następnie wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej i zlokalizuj lewą nerkę, aby oddzielić ją od otaczających narządów otrzewnej. Po zlokalizowaniu szypułki nerkowej, obejmującej tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód, należy oddzielić moczowód, nie uszkadzając delikatnej struktury.

Użyj kleszczy, aby zapętlić i zawiązać szew 3-0 wokół moczowodu, a następnie zawiąż węzeł kilka milimetrów po obu stronach pierwszego węzła, aby zapewnić całkowitą niedrożność. Po związaniu moczowodu należy ostrożnie zamknąć kolejne warstwy mięśniowe, a następnie całkowicie zamknąć brzuch. Zamknij zewnętrzną skórę zszywkami chirurgicznymi.

W celu przygotowania chirurgicznego umieść znieczulonego szczura z linią dostępu żylnego na stałe po stronie z ogolonym lewym bokiem skierowanym do góry płasko i prosto na stole. Upewnij się, że przednie łapy szczura stykają się ze sobą, tak jak powinny stykać się tylne łapy. Po ustawieniu szczura należy dotknąć lewego boku tuż pod żebrami, aby wyczuć nerkę i określić naturalną pozycję w jamie brzusznej, a następnie narysuj linię za pomocą trwałego markera wzdłuż ogolonego obszaru, przecinając środek nerki na pół w orientacji od nosa do ogona.

Użyj pary ząbkowanych kleszczy, aby chwycić i podnieść skórę do góry i ścisnąć linię markera permanentnego parą hemostatów, aby zmiażdżyć leżące poniżej naczynia krwionośne i zapobiec krwawieniu. Powtórz procedurę dla cienkiej zewnętrznej warstwy mięśni, aby zminimalizować krwawienie. Aby wykonać ostatnie nacięcie cienkiej wewnętrznej warstwy mięśni brzucha, należy dotknąć nerki, aby oszacować rozmiar i położenie, a następnie podnieść wewnętrzną warstwę mięśni za pomocą kleszczy, a następnie zmiażdżyć linię, która przecina skórę nad nerką hemostatami, co stanowi około 1/3 szacowanej wielkości nerki.

Utrzymując chwyt warstwy mięśniowej za pomocą kleszczy, wykonaj ostatnie nacięcie. Następnie użyj kleszczy w każdej ręce, aby chwycić i przytrzymać tłuszcz nerkowy w dolnym biegunie nerki techniką ręka nad ręką działającą w dół. Trzymając mocno tłuszcz jedną ręką, pociągnij tłuszcz i bardzo delikatnie przeciśnij nerkę przez nacięcie.

Jeśli nerka nie przejdzie, łatwo poszerz nacięcie. W celu zidentyfikowania białych krwinek lub WBC osadzonych w pętlach kapilarnych, należy podać Hoechst 33342 barwnik jądrowy w dawce 8 mikrogramów na kilogram masy ciała szczura przez linię dostępu żylnego na stałe. Pod mikroskopem umieść odsłoniętą nerkę na krawędzi naczynia z lekkim obrotem, tak aby brzuszna strona nerki stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym, a strona grzbietowa była skierowana od krawędzi.

Aby jeszcze bardziej zminimalizować ruch, zapakuj dwie sterylne gaziki 2 na 2 zwilżone solą fizjologiczną do grzbietowej strony nerki, wzmacniając kontakt brzusznej strony nerki z krawędzią. Po umieszczeniu próbki spójrz przez okular mikroskopu w oświetleniu epifluorescencyjnym za pomocą dwuprzebiegowej kostki rodaminy FITC. Jeśli zostanie wykryty ruch w pozycji próbki, dokonaj drobnych korekt, regulując gazę, upewniając się, że nie wpycha się pod nerkę.

Przewróć szczura lekko, aby klatka piersiowa była dalej od naczynia. Zeskanuj powierzchnię nerki za pomocą oświetlenia epifluorescencyjnego i zaznacz pozycje kłębuszków nerkowych za pomocą oprogramowania powiązanego z zmotoryzowanym sterownikiem stopnia. Dla każdego kanału koloru w oświetleniu 2-fotonowym należy wykonać płytką objętość 3D górnej części każdego zaznaczonego kłębuszka nerkowego, który posłuży jako obraz tła.

W opcji wyświetlania oprogramowania do obrazowania użyj pseudo palety kolorów, aby zobrazować słabe intensywności fluorescencji tła pętli naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych. Używając powierzchownego naczynia krwionośnego jako punktu centralnego, powoli wlewaj fluorescencyjną albuminę surowicy Texas Red RAP lub TRRSA, obserwując wzrost i spadek fluorescencji spowodowany dystrybucją ogólnoustrojową, aż intensywność w naczyniach okołokanalikowych i pętlach naczyń włosowatych znajdzie się tuż poniżej nasycenia. Po 10 minutach uzyskaj objętości 3D dla wszystkich oznaczonych i zobrazowanych kłębuszków nerkowych w odstępach 1 mikrometra.

Znajdź odpowiednie naczynie, pętlę kapilarną lub naczynie okołorurkowe, a następnie obróć obraz za pomocą funkcji Obróć, ponieważ funkcja skanowania linii w oprogramowaniu do akwizycji obrazu wymaga, aby naczynie było prostopadłe. Gdy naczynie zostanie obrócone i położy się płasko, wybierz funkcję XT w menu Akwizycja i ustaw ją tak, aby skanowała 4 000 linii. Umieścić linię w poprzek badanego naczynia z płaszczyzną ogniskową na maksymalnej średnicy segmentu.

Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy kolorowy obraz kompozytowy i wybierz kartę Zrób migawkę, aby wygenerować obraz referencyjny obszaru, w którym wykonano skanowanie linii. Natychmiast kliknij przycisk Start, aby przechwycić skan linii statku. Później zaimportuj skany linii do oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby określić natężenie przepływu RBC.

W menu rozwijanym Miara otwórz okno dialogowe Pokaż statystyki regionu i wybierz narzędzie Rysowanie pojedynczej linii, aby narysować linię odpowiadającą nachyleniu cieni RBC. Po zanotowaniu szerokości i wysokości linii użyj równania, aby obliczyć prędkość, a następnie uzyskaj średnią z pięciu obliczeń, aby podać prędkość dla każdego skanowania linii. Wyśrodkuj kłębuszek nerkowy w polu obrazowania i weź zestaw danych 3D, zaczynając od powierzchni kłębuszków nerkowych, a kończąc na 30 do 35 mikrometrach.

Użyj kroku o rozmiarze 1 mikrometra w kierunku Z. Zidentyfikuj WBC, porównując niebieski kanał Hoechsta z kanałem albuminy Texas Red, szukając wykluczenia czerwonego barwnika w pętli kapilarnej i odpowiadającego mu barwienia jądrowego. Jeśli WBC wydają się statyczne w trzech sekcjach optycznych, zdefiniuj komórki jako przylegające, a następnie podaj wartości jako występowanie na 10 przekrojów optycznych od góry kłębuszków nerkowych, pobrane w odstępach 1 mikrometra.

Liczba kłębuszków nerkowych na pole u szczurów monachijskich, Wistar, Fromter lub MWF była zwiększona w 5-tygodniowej grupie UUO niż u szczurów nieleczonych. Szczury Sprague-Dawley lub szczury SD przeszły od braku kłębuszków nerkowych do 2,02 na pole po pięciu tygodniach jednostronnej niedrożności moczowodu. Obserwowano trójwymiarowe zrekonstruowane obrazy, aby zobaczyć powierzchnię nerki.

5-tygodniowa jednostronna niedrożność cewki moczowej u szczurów SD nie spowodowała obszarów przypominających normalny nabłonek kanalików, jak obserwowano u MWF, nieleczonych i częściowo u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF. W badaniu dynamiki naczyń nerkowych przepływ krwi przez nerki był znacznie zmniejszony w 5-tygodniowych grupach UUO, MWF i SD w porównaniu z nieleczonymi szczurami. Prędkość RBC w pętlach naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych była znacznie zmniejszona u 5-tygodniowych szczurów UUO, MWF i SD w porównaniu z nieleczonymi szczurami MWF.

Dodatkowo, nieleczone szczury MWF miały mniej WBC na 10 odcinków optycznych od góry, podczas gdy liczba wzrosła u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF i 5-tygodniowych UUO SD. Przy jednostronnej niedrożności moczanów obserwowano wzrost przepuszczalności albumin. Nagromadzenie albuminy w przestrzeni Bowmana było intensywne po jednostronnej niedrożności mocznika.

Endocytoza segmentu S1 duże ilości albuminy, co obserwuje się w warunkach fizjologicznych u nieleczonych szczurów MWF. Takiego samego wychwytu nie można było zaobserwować u szczurów MWF lub SD po 5 tygodniach jednostronnej niedrożności układu moczowego. W połączeniu z tą techniką można zastosować wiele różnych metod, takich jak powtarzanie obrazowania w celu zbadania procesu w czasie, utrwalenie określonego obszaru do obrazowania, a następnie wykorzystanie utrwalonej tkanki do przeprowadzenia mikroskopii o wyższej rozdzielczości.

Technika ta jest uważana za przełomową technologię. Dzięki temu badacze mogą odpowiedzieć na wiele nowych pytań. W ten sposób dostarczono nowych spostrzeżeń i uzyskano dane zmieniające paradygmat.