Name: Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do ilościowej oceny wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na dynamikę kłębuszkową u szczurów Munich Wistar Fromter. Ta zaawansowana technika pozwala na obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grants RO1DK091623 i P30DK079312 (dla B.A.M.). Dziękujemy personelowi Genomics Core Facility of the Research Technology Support Facility (RTSF) na Uniwersytecie Stanowym Michigan za przeprowadzenie analizy nanostrun.

<ol><li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Indiana+O%27Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li>
<li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney%3A+a+micropuncture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li>
<li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex%3A+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li>
<li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+rat+homologue+of+podocin%3A+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+JASN%22%5BJournal%5D)">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li>
<li>Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+nephrons+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499(2013).</li>
<li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction%3A+a+new+look+at+an+old+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li>
<li>Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li>
<li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li>
<li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330(2016).</li>
<li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li>
<li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die%3A+Is+there+any+cell+death+in+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li>
<li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Electrolyte+%26+Blood+Pressure+E+%26+BP%22%5BJournal%5D)">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972(2016).</li>
<li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li>
<li>Mühlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378(2010).</li>
<li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin%3A+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+Dialysis%2C+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li>
<li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2%2FM%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052(2013).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3A+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+bottom+and+using+it%3A+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674(2014).</li>
<li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus%3A+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li>
<li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li>
<li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

W badaniach nad fizjologią kłębuszków nerkowych zastosowano wiele różnych podejść, w szczególności zastosowanie mikronakłucia, perfuzji izolowanych kłębuszków nerkowych i mikroskopii. Dostępność kłębuszków powierzchniowych u monachijskich szczurów Wistar, szczepów Fromter i Simonsen, pozwoliła na dynamiczne badania in vivo . Jedną z ważnych uwag dla badaczy stosujących tę technologię jest konieczność ustawienia parametrów akwizycji w celu utrzymania spójnych obrazów między badaniami, tak aby autofluorescencja w tkance pozostała spójna. Wykorzystanie dwuprzebiegowej kostki epifluorescencji fluoresceiny/rodaminy i dostosowanie ustawień wzmocnienia do kanałów emisji zielonej i czerwonej w celu naśladowania na ekranie komputera tego, co jest widziane przez okulary, zapewni spójną sygnaturę kolorów w autofluorescencji nawet między różnymi systemami mikroskopowymi.
Szczep Fromter był szeroko stosowany, ponieważ ma zmniejszoną całkowitą liczbę kłębuszków nerkowych, ~ 75% normalnie, a samce spontanicznie rozwijają nadciśnienie w wieku około 12 tygodni, z postępującym białkomoczem i następnie ogniskowym stwardnieniem kłębuszków nerkowych, ostatecznie umierając z powodu niewydolności nerek12. Wykorzystanie tych szczurów i dodanie mikroskopii 2-fotonowej o zmniejszonej fototoksyczności, zwiększonej głębokości penetracji i możliwości jednoczesnego oglądania wielu sond fluorescencyjnychutorowało drogę do nowych odkryć 1,4,5. Wraz z rozwojem sprzętu komputerowego i oprogramowania, dane ilościowe są obecnie standardem we wszystkich laboratoriach 2-fotonowych. Opracowano wiele technik ilościowych i zastosowano je do kanalików kłębuszkowych, kanalików proksymalnych, procesów naczyniowych i śródmiąższowych w warunkach fizjologicznych i chorobowych 1,4,5,27,28,29,30.
Urządzenia do wytwarzania myszy transgenicznych nadały nowy wymiar badaniom nad fizjologią i patologią nerek i było tylko kwestią czasu, aż zostanie to połączone z mikroskopią 2-fotonową, aby jeszcze bardziej nakreślić znaczenie określonych produktów genowych w strukturze i funkcji nerek. Jednak kłębuszki mysie, z wyjątkiem bardzo młodych myszy, znajdują się ponad 100 μm od powierzchni nerki9. Mikroskopię dwufotonową najlepiej przeprowadza się na głębokości od 20 do 50 μm w rozdzielczości, a intensywność fluorescencji szybko spada z powodu rozpraszania emitowanego światła i absorpcji w wyniku interakcji z hemoglobiną. W związku z tym konieczne było wywołanie kłębuszków nerkowych. Powszechnie stosowanym podejściem jest model przedłużonej jednostronnej obturacji przez 12 tygodni. Ponieważ modele te nie pozwalają na określenie linii bazowej, oddzielenie skutków UUO od badanego procesu nie jest możliwe.
Korzystając ze szczurów MWF, można porównać wyjściową funkcję kłębuszków nerkowych z następującą po UUO. Wiadomo, że ten model UUO wywołuje stan zapalny i szybkie tempo zwłóknienia i był używany do badania PChN i zwłóknienia 10,11,12. Zgodnie z oczekiwaniami nastąpił wzrost liczby kłębuszków nerkowych zarówno u szczurów MWF, jak i SD. Co więcej, wyniki ilościowe uzyskane po UUO dla szczurów MWF i SD były bardzo porównywalne. Odnotowane tutaj zmniejszenie przepływu krwi zostało wcześniej zgłoszone, porównując dane mikroskopowe po UUO z danymi z mikronakłucia3. Wiadomo było również, że histologia kanalików i śródmiąższu jest znacznie zmieniona, a PT są w większości niefunkcjonalne, jak opisano tutaj, z brakiem endocytozy albuminowej. Badania na rycinie 2 i rycinie 3 wykazują dramatyczne zmniejszenie natężenia przepływu krwinek czerwonych w naczyniach włosowatych kłębuszkowych i okołokanalikowych oraz zwiększoną adhezję WBC. Zmniejszenie przepływu jest prawdopodobnie spowodowane zablokowaniem naczyń włosowatych przez adhezję WBC i formacje rouleaux.
Aby dokładniej ocenić stan zapalny, określiliśmy ilościowo przepuszczalność albumin i wykazaliśmy, że wzrasta ona dziesięciokrotnie. Ponadto izolowane kłębuszki wykazały, że ekspresja mRNA wzrosła w przypadku wielu genów, o których wcześniej wiadomo, że są zwiększone w zapaleniu nerek w różnych stanach chorobowychnerek 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Wzrost gęstości powierzchni kłębuszków nerkowych i przepuszczalności albumin był postępujący, jak wykazano w 12-tygodniowych danych UUO. Obecne dane są pierwszymi, które bezpośrednio pokazują, że kłębuszki ulegają znacznym uszkodzeniom strukturalnym, stanom zapalnym i zmianom molekularnym w modelu UUO. Wyniki są zgodne z wcześniejszym badaniem całej tkanki nerkowej, w którym analizowano biopsje nerek owiec po UUO, stwierdzając, że wiele markerów stanu zapalnego jest podwyższonychdo 19. Obecne wyniki wskazują, że w kłębuszkach nerkowych występuje wyraźny stan zapalny, wcześniej znany tylko z tkanki korowej.
Obecne dane różnią się od wcześniejszych badań na myszach, w których nie stwierdzono zmian w ekspresji cząsteczek adhezyjnych, osadzaniu się dopełniacza i infiltracji neutrofili między 12-tygodniowymi kłębuszkami nerkowymi a normalnymi31. Ponadto laboratorium Hickeya wykorzystało 12-tygodniowy model UUO do zbadania reakcji immunologicznych w kłębuszkach nerkowych myszy. Nie znaleźli różnic w nacieku neutrofili między czterotygodniowymi kłębuszkami mysi a kłębuszkami poturacyjnymi32,33. Te późniejsze badania przeprowadzono po tym, jak miednica niedrożnej nerki została odtworzona z moczu. Nie zrobiliśmy tego, ponieważ chcieliśmy określić wpływ UUO na funkcję kłębuszków nerkowych, tak jak to byłoby in vivo, bez sztucznego usuwania płynu powodującego niedrożność. Wreszcie, zastosowanie UUO u myszy jest zastępowane obrazowaniem kłębuszków nerkowych na głębokości większej niż 100 μm pod powierzchnią. Chociaż jest to możliwe, istnieje kompromis między rozdzielczością a intensywnością, przy czym obie te wartości ulegają znacznemu zmniejszeniu po przekroczeniu 50 μm34.
Przedstawione wyniki nie są zaskakujące, jeśli zestawi się dane z istniejącej literatury na temat zmian histologicznych, powstawania kłębuszków jajowych, stanów zapalnych, zwłóknień, hemodynamiki 10,11,12. Przedstawione dane, w tym adhezja WBC, formacje rouleaux, molekularne markery zapalenia kłębuszków nerkowych i zwiększona przepuszczalność albumin, dodatkowo wskazują na rozległy stan zapalny, który trwa w tym modelu UUO nawet po pięciu tygodniach, a także po dwunastu tygodniach. Oczywiste jest, że przewlekłe UUO nie jest stanem fizjologicznym, a użycie UUO do indukowania kłębuszków nerkowych na powierzchni stanowi model urazu. Szczury MWF, które mają kłębuszki powierzchniowe w warunkach fizjologicznych, mogą być badane podłużnie w miarę wystąpienia urazu. Możliwe jest generowanie transgenicznych szczurów, a wielu badaczy tworzy je za pomocą bioczujników, aby zadawać konkretne pytania. W szczególności Medical College of Wisconsin ma obecnie kolonię szczurów MWF i stworzył transgeniczne szczury w celu badania procesów kłębuszkowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Te szczury MWF oferują doskonałą okazję do badania procesów kłębuszkowych u normalnych, chorych i genetycznie zmienionych szczurów.

Zrozumienie procesów zachodzących w kłębuszkach nerkowych, zwłaszcza biologii podocytów, było celem od ponad 50 lat. Monachijskie szczury Wistar z kłębuszkami powierzchniowymi odegrały kluczową rolę w tych badaniach, w tym w badaniach mikronakłuć, aby zrozumieć wiele aspektów procesów fizjologicznych i patologicznych1,2,3. Wykorzystanie mikroskopii do śródetapowego badania składników kłębuszków nerkowych było ograniczone ze względu na efekty fototoksyczności do czasu pojawienia się mikroskopii 2-fotonowej, która zminimalizowała tę toksyczną ekspozycję i zwiększyła głębokość penetracji1,2. Wraz z szybkim postępem w sprzęcie komputerowym i oprogramowaniu, pozwoliło to na trójwymiarowe (3D) i czterowymiarowe (czasowe) badania przez wiele godzin w jednym ustawieniu1,4,5.
Kwantyfikacja przepływu krwi w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych, zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na leki, przepuszczalność i wpływ ładunku na przepuszczalność i stan zapalny to tylko niektóre z procesów kłębuszkowych, które zostały zbadane. Ponadto można zidentyfikować segment S1 kanalika proksymalnego, a różnice w zachowaniu nabłonka rurkowego S1 i S2 można określić ilościowo1,4. Badania na myszach, zwłaszcza przy powszechnej dostępności urządzeń transgenicznych u myszy, doprowadziły do szybkiego postępu w zrozumieniu biologii molekularnej procesów chorobowych kłębuszków nerkowych. Poszczególne białka są odpowiedzialne za dysfunkcję kłębuszków nerkowych w badaniach nokautujących, zwłaszcza w odniesieniu do białkomoczu6,7,8. Jednak wykorzystanie modeli mysich do badań obrazowania kłębuszków nerkowych było ograniczone, ponieważ kłębuszki nerkowe znajdują się ponad 100 μm poniżej powierzchni w licznych badanych szczepach9.
To skłoniło badaczy do opracowania i wykorzystania modeli mysich, co zaowocowało powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi, które mogą być badane. Najczęściej spotykanym modelem jest użycie kompletnego UUO10,11,12. Pod koniec przedłużonego okresu UUO w nerkach myszy występują liczne kłębuszki nerkowe, które mogą być i były badane13,14. W tych badaniach na myszach nie przeprowadzono badań wyjściowych ani kontrolnych w celu określenia wpływu przedłużonego UUO na biologię kłębuszków nerkowych. Ponieważ jest to poważny i długotrwały model urazu powodujący szybkie zwłóknienie i zniszczenie kory mózgowej10,11,12, postawiliśmy hipotezę, że będzie to miało wpływ na procesy i funkcje kłębuszków nerkowych. Aby odpowiedzieć na to pytanie, do badania parametrów kontrolnych/wyjściowych wykorzystano szczury Munich Wistar Fromter (MWF) z kłębuszkami powierzchniowymi, a wyniki wyjściowe porównano z badaniami kłębuszkowymi na szczurach MWF po pięciu tygodniach UUO. Badaliśmy również szczury Sprague Dawley (SD), które nie mają kłębuszków powierzchniowych po UUO. Wyniki wskazują, że 5 tygodni UUO u szczurów MWF i SD rzeczywiście zwiększa liczbę kłębuszków nerkowych. Były to jednak nieprawidłowe kłębuszki nerkowe z wyraźnymi zmianami w przepływie krwi w kłębuszkach nerkowych, stanie zapalnym oraz przepuszczalności i wielkości makrocząsteczek.

<table><tbody><tr><td>70 &mikro; m sterylny sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>#421751</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m sterylne sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>#421752</td><td></td></tr><tr><td>CA Mikronożyczki Model 1C300</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>Kat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna poduszka grzewcza</td><td>Sunbeam</td><td>Kroger</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze manipulacyjne</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Nauki Kat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne Kelly (proste)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>Kot#72930</td><td></td></tr><tr><td>Leica Dive SP-8 Wielofotonowy mikroskop odwrócony</td><td>Leica Microsystems</td><td>Uwaga: Wersja 7.1r1</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee laser tytanowo-szafirowy</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Nożyczki preparacyjne</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Nauki Kat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów metamorficznych</td><td>Dynamika molekularna</td><td>Nr kat.# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td>2007 wersja</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Zestaw do oznaczania RNA</td><td>Invitrogen/ThermoFisher</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz podzbiornika Reptitherm</td><td>Zoomed</td><td>Amazon</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (kolumny spinowe)</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RPE</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td></td></tr><tr><td>Taśma autoklawu Strate-Line</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRI</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia nakrywkowe Willco-dish Bottoms (50 mm/40 mm szkiełko nakrywkowe)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Zastosowanie nowatorskich metod mikroskopowych do odpowiednich modeli chorób zwierzęcych w celu zbadania dynamicznej fizjologii nerek pozostaje wyzwaniem. Szczury z kłębuszkami powierzchniowymi dają wyjątkową okazję do zbadania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych za pomocą przyżyciowej mikroskopii 2-fotonowej. Kwantyfikacja przepływu krwi w kapilarkach kłębuszkowych oraz zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na leki, przepuszczalność i stan zapalny to tylko niektóre z procesów, które można badać. Ponadto transgeniczne szczury, tj. podocyty znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i innymi metodami biomarkerów molekularnych, zapewniają zwiększoną rozdzielczość do bezpośredniego monitorowania i ilościowego określania interakcji białko-białko oraz skutków określonych zmian molekularnych.
U myszy, które nie mają kłębuszków powierzchniowych po czterech tygodniach, jednostronna niedrożność moczowodu (UUO) przez kilka tygodni była stosowana do wywoływania kłębuszków nerkowych. Ponieważ ten model indukcji nie pozwala na badania wyjściowe, określiliśmy ilościowo wpływ UUO na procesy kłębuszkowe w modelu UUO u szczurów Monachium Wistar Frömter (MWF), które mają kłębuszki powierzchniowe w warunkach fizjologicznych. Model UUO przez pięć tygodni lub dłużej powodował znaczące zmiany w morfologii nerek, mikrokrążeniu okołokanalikowym i kłębuszkowym, a także w strukturze i funkcji nabłonka kanalików. Przepływ kłębuszkowych i okołokanalikowych krwinek czerwonych (RBC) uległ znacznemu zmniejszeniu (p < 0,01), prawdopodobnie z powodu znacznego wzrostu przylegania białych krwinek (WBC) w naczyniach włosowatych kłębuszków nerkowych i okołokanalikowych. Współczynnik przesiewania kłębuszkowego albuminy wzrósł z 0,015 ± 0,002 u nietraktowanych MWF do 0,045 ± 0,05 u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF. Dwanaście tygodni UUO spowodowało dalszy wzrost powierzchniowej gęstości kłębuszków nerkowych i współczynnika przesiewania kłębuszków nerkowych (GSC) dla albuminy. Albumina fluorescencyjna przefiltrowana przez kłębuszki nerkowe nie została ponownie wchłonięta przez kanaliki proksymalne. Dane te sugerują, że stosowanie UUO do indukcji kłębuszków nerkowych ogranicza zdolność do badania i interpretowania normalnych procesów kłębuszkowych i zmian chorobowych.

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

W danych przedstawionych w tym badaniu pokazują dramatyczny wpływ jednostronnej niedrożności moczowodu na czynność nerek, stan zapalny i zwłóknienie. Pomaga nam zrozumieć patofizjologiczne mechanizmy jednostronnej niedrożności moczowodów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania interakcji komórka-komórka, zdarzeń subkomórkowych oraz dynamicznego kojarzenia struktury i funkcji w funkcjonującej nerce.Demonstracja procedury moczowodu zostanie wykonana przez dr Silvię Campos-Bilderback, która jest chirurgiem w naszym laboratorium. Na początek znieczul szczura, a następnie wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej i zlokalizuj lewą nerkę, aby oddzielić ją od otaczających narządów otrzewnej. Po zlokalizowaniu szypułki nerkowej, obejmującej tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód, należy oddzielić moczowód, nie uszkadzając delikatnej struktury.Użyj kleszczy, aby zapętlić i zawiązać szew 3-0 wokół moczowodu, a następnie zawiąż węzeł kilka milimetrów po obu stronach pierwszego węzła, aby zapewnić całkowitą niedrożność. Po związaniu moczowodu należy ostrożnie zamknąć kolejne warstwy mięśniowe, a następnie całkowicie zamknąć brzuch. Zamknij zewnętrzną skórę zszywkami chirurgicznymi.W celu przygotowania chirurgicznego umieść znieczulonego szczura z linią dostępu żylnego na stałe po stronie z ogolonym lewym bokiem skierowanym do góry płasko i prosto na stole. Upewnij się, że przednie łapy szczura stykają się ze sobą, tak jak powinny stykać się tylne łapy. Po ustawieniu szczura należy dotknąć lewego boku tuż pod żebrami, aby wyczuć nerkę i określić naturalną pozycję w jamie brzusznej, a następnie narysuj linię za pomocą trwałego markera wzdłuż ogolonego obszaru, przecinając środek nerki na pół w orientacji od nosa do ogona.Użyj pary ząbkowanych kleszczy, aby chwycić i podnieść skórę do góry i ścisnąć linię markera permanentnego parą hemostatów, aby zmiażdżyć leżące poniżej naczynia krwionośne i zapobiec krwawieniu. Powtórz procedurę dla cienkiej zewnętrznej warstwy mięśni, aby zminimalizować krwawienie. Aby wykonać ostatnie nacięcie cienkiej wewnętrznej warstwy mięśni brzucha, należy dotknąć nerki, aby oszacować rozmiar i położenie, a następnie podnieść wewnętrzną warstwę mięśni za pomocą kleszczy, a następnie zmiażdżyć linię, która przecina skórę nad nerką hemostatami, co stanowi około 1/3 szacowanej wielkości nerki.Utrzymując chwyt warstwy mięśniowej za pomocą kleszczy, wykonaj ostatnie nacięcie. Następnie użyj kleszczy w każdej ręce, aby chwycić i przytrzymać tłuszcz nerkowy w dolnym biegunie nerki techniką ręka nad ręką działającą w dół. Trzymając mocno tłuszcz jedną ręką, pociągnij tłuszcz i bardzo delikatnie przeciśnij nerkę przez nacięcie.Jeśli nerka nie przejdzie, łatwo poszerz nacięcie. W celu zidentyfikowania białych krwinek lub WBC osadzonych w pętlach kapilarnych, należy podać Hoechst 33342 barwnik jądrowy w dawce 8 mikrogramów na kilogram masy ciała szczura przez linię dostępu żylnego na stałe. Pod mikroskopem umieść odsłoniętą nerkę na krawędzi naczynia z lekkim obrotem, tak aby brzuszna strona nerki stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym, a strona grzbietowa była skierowana od krawędzi.Aby jeszcze bardziej zminimalizować ruch, zapakuj dwie sterylne gaziki 2 na 2 zwilżone solą fizjologiczną do grzbietowej strony nerki, wzmacniając kontakt brzusznej strony nerki z krawędzią. Po umieszczeniu próbki spójrz przez okular mikroskopu w oświetleniu epifluorescencyjnym za pomocą dwuprzebiegowej kostki rodaminy FITC. Jeśli zostanie wykryty ruch w pozycji próbki, dokonaj drobnych korekt, regulując gazę, upewniając się, że nie wpycha się pod nerkę.Przewróć szczura lekko, aby klatka piersiowa była dalej od naczynia. Zeskanuj powierzchnię nerki za pomocą oświetlenia epifluorescencyjnego i zaznacz pozycje kłębuszków nerkowych za pomocą oprogramowania powiązanego z zmotoryzowanym sterownikiem stopnia. Dla każdego kanału koloru w oświetleniu 2-fotonowym należy wykonać płytką objętość 3D górnej części każdego zaznaczonego kłębuszka nerkowego, który posłuży jako obraz tła.W opcji wyświetlania oprogramowania do obrazowania użyj pseudo palety kolorów, aby zobrazować słabe intensywności fluorescencji tła pętli naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych. Używając powierzchownego naczynia krwionośnego jako punktu centralnego, powoli wlewaj fluorescencyjną albuminę surowicy Texas Red RAP lub TRRSA, obserwując wzrost i spadek fluorescencji spowodowany dystrybucją ogólnoustrojową, aż intensywność w naczyniach okołokanalikowych i pętlach naczyń włosowatych znajdzie się tuż poniżej nasycenia. Po 10 minutach uzyskaj objętości 3D dla wszystkich oznaczonych i zobrazowanych kłębuszków nerkowych w odstępach 1 mikrometra.Znajdź odpowiednie naczynie, pętlę kapilarną lub naczynie okołorurkowe, a następnie obróć obraz za pomocą funkcji Obróć, ponieważ funkcja skanowania linii w oprogramowaniu do akwizycji obrazu wymaga, aby naczynie było prostopadłe. Gdy naczynie zostanie obrócone i położy się płasko, wybierz funkcję XT w menu Akwizycja i ustaw ją tak, aby skanowała 4 000 linii. Umieścić linię w poprzek badanego naczynia z płaszczyzną ogniskową na maksymalnej średnicy segmentu.Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy kolorowy obraz kompozytowy i wybierz kartę Zrób migawkę, aby wygenerować obraz referencyjny obszaru, w którym wykonano skanowanie linii. Natychmiast kliknij przycisk Start, aby przechwycić skan linii statku. Później zaimportuj skany linii do oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby określić natężenie przepływu RBC.W menu rozwijanym Miara otwórz okno dialogowe Pokaż statystyki regionu i wybierz narzędzie Rysowanie pojedynczej linii, aby narysować linię odpowiadającą nachyleniu cieni RBC. Po zanotowaniu szerokości i wysokości linii użyj równania, aby obliczyć prędkość, a następnie uzyskaj średnią z pięciu obliczeń, aby podać prędkość dla każdego skanowania linii. Wyśrodkuj kłębuszek nerkowy w polu obrazowania i weź zestaw danych 3D, zaczynając od powierzchni kłębuszków nerkowych, a kończąc na 30 do 35 mikrometrach.Użyj kroku o rozmiarze 1 mikrometra w kierunku Z. Zidentyfikuj WBC, porównując niebieski kanał Hoechsta z kanałem albuminy Texas Red, szukając wykluczenia czerwonego barwnika w pętli kapilarnej i odpowiadającego mu barwienia jądrowego. Jeśli WBC wydają się statyczne w trzech sekcjach optycznych, zdefiniuj komórki jako przylegające, a następnie podaj wartości jako występowanie na 10 przekrojów optycznych od góry kłębuszków nerkowych, pobrane w odstępach 1 mikrometra.Liczba kłębuszków nerkowych na pole u szczurów monachijskich, Wistar, Fromter lub MWF była zwiększona w 5-tygodniowej grupie UUO niż u szczurów nieleczonych. Szczury Sprague-Dawley lub szczury SD przeszły od braku kłębuszków nerkowych do 2,02 na pole po pięciu tygodniach jednostronnej niedrożności moczowodu. Obserwowano trójwymiarowe zrekonstruowane obrazy, aby zobaczyć powierzchnię nerki.5-tygodniowa jednostronna niedrożność cewki moczowej u szczurów SD nie spowodowała obszarów przypominających normalny nabłonek kanalików, jak obserwowano u MWF, nieleczonych i częściowo u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF. W badaniu dynamiki naczyń nerkowych przepływ krwi przez nerki był znacznie zmniejszony w 5-tygodniowych grupach UUO, MWF i SD w porównaniu z nieleczonymi szczurami. Prędkość RBC w pętlach naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych była znacznie zmniejszona u 5-tygodniowych szczurów UUO, MWF i SD w porównaniu z nieleczonymi szczurami MWF.Dodatkowo, nieleczone szczury MWF miały mniej WBC na 10 odcinków optycznych od góry, podczas gdy liczba wzrosła u 5-tygodniowych szczurów UUO MWF i 5-tygodniowych UUO SD. Przy jednostronnej niedrożności moczanów obserwowano wzrost przepuszczalności albumin. Nagromadzenie albuminy w przestrzeni Bowmana było intensywne po jednostronnej niedrożności mocznika.Endocytoza segmentu S1 duże ilości albuminy, co obserwuje się w warunkach fizjologicznych u nieleczonych szczurów MWF. Takiego samego wychwytu nie można było zaobserwować u szczurów MWF lub SD po 5 tygodniach jednostronnej niedrożności układu moczowego. W połączeniu z tą techniką można zastosować wiele różnych metod, takich jak powtarzanie obrazowania w celu zbadania procesu w czasie, utrwalenie określonego obszaru do obrazowania, a następnie wykorzystanie utrwalonej tkanki do przeprowadzenia mikroskopii o wyższej rozdzielczości.Technika ta jest uważana za przełomową technologię. Dzięki temu badacze mogą odpowiedzieć na wiele nowych pytań. W ten sposób dostarczono nowych spostrzeżeń i uzyskano dane zmieniające paradygmat.

using-2-photon-microscopy-to-quantify-effects-chronic-unilateral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje procedurę generowania modelu myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu. Zabieg polega na przecięciu jednego z moczowodów myszy w celu utrudnienia przepływu moczu.

Mysi model jednostronnej niedrożności moczowodu: zabieg chirurgiczny mający na celu zablokowanie przepływu moczu z nerki w modelach mysich

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Mysi model nieodwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) jest prezentowany razem z modelem odwracalnego UUO, w którym niedrożność moczowodu jest łagodzona przez zespolenie przerwanego moczowodu z pęcherzem moczowym. Modele te umożliwiają badanie stanu zapalnego i bliznowacenia nerek, a także przebudowy tkanek.

Mysi model nieodwracalnej i odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Prezentujemy użycie mikroskopii 2-fotonowej do umieszczenia mikropipety w przestrzeni moczowej Bowmana u myszy, łącząc 2 podstawowe techniki fizjologii nerek. Zastosowanie mikroskopii 2-fotonowej pozwala przezwyciężyć krytyczne ograniczenia konwencjonalnej mikroskopii w badaniach fizjologii nerek z mikronakłuciem.

Mikronakłucie przestrzeni Bowmana u myszy ułatwione przez mikroskopię 2-fotonową

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

Obecny protokół opisuje krok po kroku, powtarzalny model jednostronnej niedrożności moczowodu.

Niedojrzały mysi model odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu

Ten protokół opisuje metodę wywoływania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) u myszy w celu zbadania postępu zwłóknienia tkanek w nefropatii obturacyjnej. Obejmuje zabiegi chirurgiczne, opiekę pooperacyjną i metody oceny zwłóknienia.

Model jednostronnej niedrożności moczowodu do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek

Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe instrukcje, które umożliwią badaczom wykonanie odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu u myszy przy użyciu ustandaryzowanego modelu, który umożliwia analizę długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużonej niedrożności moczowodu.

Mysi model do oceny długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużającej się jednostronnej niedrożności moczowodu

Poznaj zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do ilościowej oceny wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na dynamikę kłębuszkową u szczurów Munich Wistar Fromter. Ta zaawansowana technika pozwala na obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Przeglądaj więcej filmów