Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Ogólnym celem tej procedury jest pomyślna wizualizacja jednostki filtracyjnej nefronu i ilościowe określenie filtracji makrocząsteczek fluorescencyjnych przez barierę filtracyjną do przestrzeni moczowej in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie stolika mikroskopowego dla żywego zwierzęcia. Następnie nerka jest odsłaniana, a szczur jest umieszczany na scenie.

Następnie identyfikowane i mapowane są poszczególne kłębuszki nerkowe oraz pozyskiwane są obrazy 3D tła. Na koniec podawana jest albumina fluorescencyjna. Pobierane są objętości 3D poszczególnych kłębuszków nerkowych i określa się ilościowo przepuszczalność.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują współczynnik filtracji makrocząsteczek przez kłębuszki nerkowe w nerkach dzięki zastosowaniu mikroskopii dwufotonowej umieszczonej wewnątrz fiolki. Główną zaletą mikroskopii dwufotonowej jest to, że pozwala ona na jednoczesną kwantyfikację zarówno filtracji kłębuszkowej, jak i proksymalnej reabsorpcji kanalików i transcytozy u zwierzęcia. Jednocześnie implikacje tej techniki wykraczają poza mechanistyczne i obejmują diagnostykę i terapię, ponieważ znaczenie zrozumienia zarówno roli filtracji kłębuszkowej, jak i kanalików proksymalnych.

Reabsorpcja albuminy ma kluczowe znaczenie dla określenia ukierunkowania terapii. Po znieczuleniu szczura należy wprowadzić linię dostępu żylnego na stałe przez żyłę szyjną lub udową i ogolić lewy bok od momentu tuż poniżej klatki piersiowej do tuż nad lewym udem. Jest to operacja, która nie daje szans na przeżycie.

Połóż szczura płasko na prawym boku, tak aby lewa ogolona strona była skierowana do góry. Upewnij się, że leży płasko na ławce, a jego postawa jest wydłużona i nie jest przykucnięta, z przednimi łapami stykającymi się ze sobą i tylnymi łapami dotykającymi się bardzo delikatnie. Wykonaj badanie palpacyjne, aby wyczuć nerkę, aby określić, gdzie naturalnie leży w przestrzeni zaotrzewnowej, i użyj sharpie, aby narysować linię prostą równoległą do ciała za pomocą pary kleszczy do zębów.

Podnieś skórę i użyj pary hemostatów, aby uszczypnąć skórę wzdłuż narysowanej linii, aby zmiażdżyć tkankę i zapobiec krwawieniu za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przeciąć wzdłuż nacięcia. Użyj tej samej procedury do cięcia zewnętrznej warstwy mięśni, która jest cienka w razie potrzeby.

Użyj hemostatów, aby zapobiec krwawieniu z powodu nacięcia do wewnętrznej warstwy mięśni, co odsłoni otrzewną. Ponownie zbadaj palpacyjnie nerkę, aby oszacować wielkość. Ściśnij linię nacięcia mniejszą niż nerka, upewniając się, że nacięcie znajduje się tuż nad nerką.

Najlepiej, aby to nacięcie było zbyt małe i w razie potrzeby powiększało. Zlokalizuj nerkę i użyj kleszczy, aby chwycić otaczający tłuszcz, pracując w kierunku dolnego bieguna nerki w sposób ręka nad ręką. Po osiągnięciu dolnego bieguna nerki delikatnie przeciągnij nerkę przez nacięcie, jednocześnie bardzo delikatnie ściskając poniżej nerki, aby ją zewnętrznić.

Jeśli nacięcie jest zbyt małe, zmiażdż warstwę mięśniową i przetnij, aby ją poszerzyć. Powtórz procedurę, aby zewnętrzizować nerkę po uzewnętrznieniu nerki szczura i umieszczeniu szczura na stoliku mikroskopu w celu obrazowania. Jeśli twój mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowany stolik zdolny do oznaczania lokalizacji za pomocą dwuprzebiegowego pręta fluoresceinowego, filtra dominowego i obiektywu o małej mocy, znajdź i wyśrodkuj poszczególne kłębuszki nerkowe, które będą wyglądać jak puste okrągłe struktury otoczone kanalikami proksymalnymi.

Posiadanie naturalnej żółto-pomarańczowej autofluorescencji oznaczającej każde miejsce, przełącz wieżyczkę na obiektyw zanurzenia w wodzie o większej mocy i zbierz zestawy danych 3D dla każdej kłębuszków nerkowych. Upewnij się, że pętle kapilarne i przestrzeń Bowmana są wyraźnie widoczne. Użycie pseudo palety kolorów pomoże zobrazować te struktury.

Następnie, koncentrując się na powierzchownym naczyniu krwionośnym, powoli wlewaj albuminę fluorescencyjną, upewniając się, że jest czas na ogólnoustrojową dystrybucję cząsteczek o niskim współczynniku kłębuszkowego lub GSC, konieczne jest maksymalizowanie wartości intensywności w osoczu, ale nie osiąganie poziomów, które nasycą fotodetektory w mikroskopie. Zwiększa to wykrywalność przefiltrowanych cząsteczek Po odczekaniu około 10 minut, aby umożliwić usunięcie potencjalnych fragmentów o małej masie cząsteczkowej, uzyskaj objętości 3D w odstępach jednego mikrona, które zostaną wykorzystane do obliczenia albumin za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów metamorficznych. Załaduj zestawy danych 3D wraz z obrazami tła dla każdego kłębuszka nerkowego w woluminie zawierającym albuminę fluorescencyjną.

Zlokalizuj powierzchowną pętlę kapilarną z wystarczającą ilością pustej przestrzeni między jej zdefiniowanymi marginesami a krawędzią kapsuły Bowmana. W woluminie w tle. Zlokalizuj tę samą płaszczyznę ogniskową, która powinna zawierać wszystkie wizualne wskazówki albuminy zawierającej obraz.

Wybierz obszar w interesującej Cię pętli kapilarnej i zanotuj średni odczyt intensywności. Następnie wybierz region w przestrzeni Bowmana i zanotuj średni odczyt intensywności. Zostaną one wykorzystane jako wartości tła do oceny ilościowej.

Wybierz podobny region w przestrzeni Bowmana na obrazie zawierającym album. Zrób to dla co najmniej dwóch innych regionów, aby uzyskać wartość średniej intensywności w przestrzeni Bowmana. Wybierz pętlę kapilarną o najjaśniejszym natężeniu plazmy i narysuj wokół niej obszar.

Następnie, korzystając z funkcji progowej, podświetl jasne wartości w krążącym osoczu, unikając ciemnych smug, które krążą w czerwonych krwinkach. Zwróć uwagę na średnie wartości intensywności wybranej przestrzeni plazmowej. Ważne jest, aby preferencyjnie wybierać jasne obszary osocza, ponieważ czynniki we krwi będą służyć jedynie do niedoszacowania poziomów fluorescencji osocza.

Wprowadź wartości do arkusza kalkulacyjnego Excel, aby obliczyć GSC, gdzie GSC jest równe różnicy surowej przestrzeni Bowmana. Intensywność minus intensywność tła Intensywność przestrzeni Bowmana podzielona przez różnicę intensywności surowej pętli kapilarnej minus intensywność pętli kapilarnej tła. Wychwyt przefiltrowanej albuminy fluorescencyjnej występuje głównie we wczesnym segmencie kanalików proksymalnych.

S, ten panel pokazuje przekrój kłębuszka nerkowego i segment S jeden pobrany od monachijskiego szczura suflera Wistar, około 20 minut po infuzji początkowego czerwonego bolusa RSA z Teksasu. Otwarcie przestrzeni Bowmana i gwałtowne pobieranie albuminy w kolorze czerwonym jest pokazane w segmencie S one. Ten panel pokazuje płytką projekcję 3D o grubości 20 mikronów tego samego zestawu danych, a tutaj pokazano projekcję niższej mocy wykonaną około 60 minut po infuzji.

Obrazy te pokazują, że mikroskopia intravital może pozwolić na wizualizację losu podawanego materiału po filtracji, potwierdzając w pewnym stopniu obserwowany współczynnik filtracji pokazany tutaj to obrazy wykonane z powierzchni kłębuszków nerkowych. Ten panel jest obrazem tła, a ten obraz został zrobiony około 12 minut po infuzji albuminy surowicy szczura Texas Red. Te dwa panele są narysowane w pseudokolorze.

Trzy małe obszary zainteresowania narysowane w przestrzeni Bowmana są używane do obliczenia średniej intensywności albuminy fluorescencyjnej, która przekroczyła barierę filtracji. Średnie wartości intensywności dla poszczególnych regionów zostały podane w wyróżnionym obszarze w oknie dialogowym Pokaż statystykę regionu. Wartość GSC dla albuminy wynosząca 0,0111 uzyskana dla tego pojedynczego kłębuszka nerkowego mieści się w zakresie występowania u tego szczepu monachijskich szczurów gwiaździstych w stanie karmienia.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza ilościowa i jakościowa, na innych strukturach nerkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ostateczny transport makrocząsteczki po filtracji do przestrzeni moczowej po jej rozwoju. Technika ta pozwoliła naukowcom zajmującym się fizjologią nerek na zbadanie dynamicznych procesów fizjologicznych i patofizjologicznych, nie tylko jednorazowo, ale podłużnie. Z czasem tak się stało.