Name: Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium. Technika umożliwia badanie funkcji nerek in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Silvii B Campos-Bilderback i George'owi J. Rhodesowi za przeprowadzenie zabiegów chirurgicznych obejmujących założenie linii dostępu żylnego. Chcieliby również podziękować Sarze E. Wean za utrzymanie kolonii Monachium-Wistar składającej się zarówno ze szczepów Simonsen, jak i Frömter. Praca ta została wsparta przez fundusze udzielone Indiana Center for Biological Microscopy oraz granty National Institutes of Health P30-DK079312 i 5RO1-DK091623 przyznane Bruce'owi A. Molitorisowi.

1. Koniugacja albuminy surowicy szczura z chlorkiem sulfonylu sulfo-rodaminy 101 (Texas Red)
<ol>
	<li>Rozpuścić 100 mg albuminy surowicy szczurzej (RSA) w 6,667 ml 100 mM wodorowęglanu sodu o pH 9,0; końcowe stężenie 15 mg/ml w 50 ml probówce stożkowej.</li>
	<li>Umieścić roztwór w bezku z lodem/wodą i schłodzić do temperatury od 0 do 4 °C.</li>
	<li>Dodać 200 μl wysokiej jakości bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) do fiolki zawierającej 10 mg chlorku sulfonylowego Texas Red (TRSC); mieszać w wortexie z prędkością średnią przez 15 s.</li>
	<li>Wymieszać roztwór RSA w wortexie z prędkością średnią i dodać rozpuszczony TRSC.</li>
	<li>Owinąć probówkę stożkową 50 ml folią (można użyć Parafilmu, aby zapewnić szczelne zamknięcie), umieścić poziomo w wiaderku z samym lodem i ustawić na wytrząsarku w celu powolnego mieszania roztworu (należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza); kontynuować reakcję w temperaturze od 0 do 4 °C przez 1 h.</li>
	<li>Przygotować 5 L 0,9% roztworu soli fizjologicznej i nawilżyć komorę dializacyjną o odcięciu masy cząsteczkowej (MWCO) 50 kDa, która może być: a) membraną dializacyjną z klipsami, b) rurką dializacyjną w urządzeniu typu float-a-lyzer lub c) kasetą slide-a-lyzer (wszystkie są odpowiednie do usuwania nieprzyłączonego TRSC).</li>
	<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną do komory dializacyjnej i umieścić w 5 L pojemniku z 0,9% roztworem soli fizjologicznej; dializować przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
	<li>Wymieniać 5 L roztworu dializacyjnego rano i późnym popołudniem, aż inkubacja nocna nie spowoduje już niemal żadnej zmiany barwy (zazwyczaj zajmuje to około 48 h przy co najmniej 4 wymianach). Dodatkowo, ponieważ MWCO 50 kDa jest bardzo zbliżone do masy cząsteczkowej RSA (66 kDa), możliwe jest, że roztwór nigdy nie stanie się całkowicie przejrzysty; zależy to od rozkładu wielkości porów membrany; 60 h i 5 wymian jest czasem w zupełności wystarczającym.</li>
	<li>Zmierzyć objętość i podzielić początkową masę 100 mg przez objętość, aby uzyskać przybliżone stężenie TR-RSA; zazwyczaj stężenia mieszczą się w zakresie 10-13 mg/ml. Końcowy stosunek barwnika do albuminy powinien wynosić około 4:1, czyli 1 fluorofor na 15 000 Daltonów masy cząsteczkowej białka. Przechowywać w temperaturze 4 °C; NIGDY NIE ZAMRAŻAĆ roztworu TR-RSA, ponieważ powstała w wyniku mrożenia fragmentacja może zmienić wartości przepuszczalności.</li>
</ol>
2. Przygotowanie stolika mikroskopu odwróconego do obrazowania/ Ustawienia mikroskopu
<ol>
	<li>Umieść ~ 4-7 kawałków taśmy autoklawowej (o długości około ¾") idealnie ułożonych jeden na drugim wewnątrz naczynia 50 mm z dnem z okładki szkiełka (coverslip bottom dish). Powinny one zostać umieszczone bliżej jednej z krawędzi, tak aby krawędź taśmy stykała się z krawędzią zakrzywienia nerki, ale nie blokowała drogi światła obiektywu (Ryciny 1A i 1B); w przypadku większych szczurów wymagana będzie większa odległość między taśmą a krawędzią naczynia.</li>
	<li>Umieść 2 podkładki Repti-therm obok stolika, wzdłuż naczynia 50 mm (Rycina 1A). Na stoliku rozłóż ogrzewający koc z płaszczem wodnym.</li>
	<li>Maksymalizuj wydajność podczas gromadzenia obrazów, upewniając się, że rewolwer obiektywów posiada obiektyw 10x powietrzny lub 20x (powietrzny lub imersyjny wodny) oraz obiektyw imersyjny wodny o większym powiększeniu do gromadzenia obrazów do analizy ilościowej.</li>
	<li>Podczas obrazowania najwydajniejszym sposobem dodawania wody do obiektywów jest ich obrócenie na bok i dodanie wody za pomocą strzykawki 1 cc z długim odcinkiem rurki PE-200, która może sięgnąć góry obiektywów.</li>
	<li>Ustaw intensywność wzbudzenia lasera 10W na ~15-20%, korzystając z filtrów neutralnych w oprogramowaniu. Detektory niedeskynowane fosforku galu i arsenu ustawiono na 750 w celu gromadzenia emisji zielonej oraz na 625 w celu gromadzenia emisji czerwonej. Emisje niebieskie (takie jak barwnik jądrowy Hoechst 33342) są gromadzone za pomocą standardowego niedeskynowanego detektora wieloalkalicznego z ustawieniem między 750-800.</li>
	<li>Aby zapewnić właściwe gromadzenie słabych emisji w przestrzeni Bowmana, upewnij się, że dolne granice detektorów są ustawione tak, aby nie wykluczać tych wartości. Wizualne znaczniki ostrzegawcze wskażą, czy ustawienie czułości jest zbyt niskie i czy wartości te są przypisane do intensywności równej zero.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę 1 cc ilością ~ 5-8 mg fluorescencyjnego roztworu albuminy rozcieńczonego w 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, aby uzyskać całkowitą objętość 1 cc.</li>
</ol>
3. Odsłanianie nerki u szczura Munich Wistar do obrazowania dwufotonowego in vivo
<ol>
	<li>Zacznij od szczura poddanego znieczuleniu z użyciem Pentobarbitalu (roztwór 50 mg/ml, 120 μl/100 g masy ciała), Inactinu (roztwór 130 mg/ml, 120 μl/100 g masy ciała) lub Izofluranu (indukcja 5%, utrzymanie od 1,5 do 2,5%), z wprowadzonym stałym dostępem żylnym (do żyły szyjnej lub udowej) oraz z ogolonym lewym bokiem od obszaru tuż poniżej klatki piersiowej do obszaru tuż nad lewym udem.</li>
	<li>Umieść szczura płasko na prawym boku, tak aby lewa, ogolona strona była skierowana do góry; upewnij się, że zwierzę leży płasko na stole, z wyprostowanym ciałem, a nie w pozycji skulonej, z przednimi łapami dotykającymi się nawzajem i tylnymi łapami dotykającymi się nawzajem (Rysunek 2A).</li>
	<li>Bardzo delikatnie przeprowadź palpację, aby zlokalizować nerkę i określić jej naturalne położenie w przestrzeni zaotzewnowej, a następnie narysuj markerem Sharpie linię prostą równoległą do ciała (od klatki piersiowej do uda) (Rysunek 2A).</li>
	<li>Chwyć skórę pęsetą z ząbkami i zaciśnij skórę wzdłuż narysowanej linii za pomocą kleszczyków hemostatycznych, aby zmiażdżyć tkankę i zapobiec krwawieniu. Przetnij tkankę wzdłuż nacięcia, używając nożyczek chirurgicznych. Zmiażdżenie zewnętrznej warstwy skóry i warstw mięśni przed nacięciem znacznie ograniczy, a zazwyczaj całkowicie wyeliminuje krwawienie.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla zewnętrznej, cienkiej warstwy mięśni.</li>
	<li>W przypadku nacięcia wewnętrznej warstwy mięśni, które odsłoni otrzewną, ponownie przeprowadź palpację nerki, aby oszacować jej rozmiar. Zaciśnij linię nacięcia mniejszą niż nerka, upewniając się, że nacięcie znajduje się dokładnie nad nerką. Najlepiej jest wykonać zbyt małe nacięcie i powiększyć je w razie potrzeby. Jeśli nacięcie będzie zbyt duże, konieczne będzie nałożenie szwów. To ostatnie nacięcie jest krytyczne; przesunięcie go w dowolnym kierunku wpłynie na stabilność na stole operacyjnym i wywoła albo artefakty ruchowe wynikające z oddychania (najlepszy scenariusz), albo doprowadzi do rozciągnięcia szypuły nerkowej i niekorzystnego zmniejszenia perfuzji nerkowej (najgorszy scenariusz).</li>
	<li>Zlokalizuj nerkę (jak pokazano na Rysunku 2B) i chwyć otaczający ją tłuszcz pęsetą, przesuwając się w kierunku bieguna dolnego nerki metodą „ręka nad ręką”.</li>
	<li>Po dotarciu do bieguna dolnego nerki, delikatnie wyciągnij nerkę przez nacięcie, bardzo lekko uciskając poniżej niej, aby ją zewnętrznić. Jeśli nacięcie jest zbyt małe, zmiażdż warstwę mięśniową i przetnij ją, aby poszerzyć otwór; powtórz procedurę zewnętrznienia nerki.</li>
</ol>
4. Umieszczanie szczura Munich Wistar na stole do obrazowania
<ol>
	<li>Umieść nerkę w pobliżu krawędzi naczynia z szkiełkiem nakrywowym, lekko obracając ją w stronę grzbietową (plecy) szczura, tak aby strona brzuszna nerki stykała się z dnem naczynia (Rysunek 1A). Do naczynia dodaj podgrzany, sterylny 0,9% roztwór soli fizjologicznej.</li>
	<li>Obserwując przez obiektyw 10x lub 20x, sprawdź, czy występuje ruch. Jeśli ruch zostanie wykryty, lekko obróć szczura, tak aby klatka piersiowa znajdowała się dalej od dna naczynia; upewnij się, że nerka znajduje się jak najbliżej krawędzi naczynia, nie naciągając przy tym szypuły nerkowej (Rysunek 1B).</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie obrazów w celu ilościowego określenia przepuszczalności nerek dla albuminy
<ol>
	<li>Obliczanie przepuszczalności kłębka (współczynnik przesiewania kłębkowego; GSC) dla dowolnej makrocząsteczki wymaga wykonania referencyjnych obrazów tła poszczególnych kłębków przed infuzją cząsteczki fluorescencyjnej. Jeśli mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowany stół umożliwiający zaznaczanie lokalizacji, należy zlokalizować i wycentrować poszczególne kłębki za pomocą obiektywu o mniejszym powiększeniu, a następnie zaznaczyć każdą lokalizację. Do tej procedury idealny jest filtr epifluorescencyjny dual-pass dla fluoresceiny/rhodaminy, choć zadziała każdy z filtrów emisyjnych (kontrast fazowy lub inne niefluorescencyjne źródła oświetlenia nie będą skuteczne). Kłębki będą widoczne jako puste okrągłe struktury otoczone kanalikami proksymalnymi, które wykazują naturalną żółto-pomarańczową autofluorescencję przy obserwacji przez filtr dual-pass.</li>
	<li>Jeśli mikroskop nie posiada zmotoryzowanego stołu, należy przeskanować nerkę w rastrze za pomocą obiektywu o niskim powiększeniu i sporządzić wstępną mapę rozmieszczenia poszczególnych kłębków, opierając się na naturalnych punktach orientacyjnych, takich jak duże powierzchowne naczynia krwionośne znajdujące się nad torebką nerki lub skupiska tłuszczu.</li>
	<li>Należy przełączyć rewolwer na obiektyw imersyjny (wodny) o większym powiększeniu i zebrać zestawy danych 3D dla każdego kłębka, upewniając się, że pętle kapilarne i przestrzeń Bowmana są wyraźnie widoczne. Użycie palety pseudokolorów (czegokolwiek innego niż czerń i biel) ułatwi wizualizację tych struktur.</li>
	<li>Skupiając się na powierzchownym naczyniu krwionośnym, należy powoli infundować fluorescencyjną albuminę, zapewniając odpowiedni czas na rozprzestrzenienie systemowe. W przypadku cząsteczek o niskim GSC niezbędne jest zmaksymalizowanie wartości intensywności w osoczu, ale bez osiągania poziomów, które nasyciłyby fotodetektory w mikroskopie. Zwiększa to wykrywalność przefiltrowanych cząsteczek. Uwaga: zazwyczaj występuje 5-7 sekundowe opóźnienie między momentem wprowadzenia fluorescencyjnej albuminy a momentem jej pojawienia się na ekranie (przy pozyskiwaniu pełnych klatek z częstotliwością ~ 1 klatka/sekundę).</li>
	<li>Należy odczekać około 10 min, aby umożliwić usunięcie potencjalnych fragmentów o niskiej masie cząsteczkowej przed pozyskaniem wolumenów 3D w interwałach 1 μm, które zostaną wykorzystane do obliczenia GSC albuminy. Typowo szczepy Simonsen szczurów Munich Wistar mają znacznie mniej kłębków powierzchniowych, dlatego obrazowane i ilościowane są wszystkie, które można zwizualizować. Szczep Frömter posiada znacznie większą ich liczbę, dlatego ograniczamy liczbę ilościowanych kłębków do ~10.</li>
	<li>Na koniec badania szczur zostaje poddany eutanazji poprzez przedawkowanie środka znieczulającego użytego w badaniu. W celu zapewnienia eutanazji wykonuje się obustronną pneumotorakomię.</li>
</ol>
6. Obliczanie GSC dla fluorescencyjnej albuminy z objętości 3D
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów Metamorph należy wczytać trójwymiarowe zestawy danych dla każdego kłębka nerkowego, zarówno zestaw tła, jak i zestaw uzyskany po infuzji fluorescencyjnej albuminy.</li>
	<li>W woluminie zawierającym fluorescencyjną albuminę należy zlokalizować powierzchowną pętlę kapilarną z wystarczającą przestrzenią między jej określonymi krawędziami a brzegiem torebki Bowmana.</li>
	<li>W woluminie tła należy zlokalizować tę samą płaszczyznę ogniskową, która powinna zawierać wszystkie punkty orientacyjne widoczne na obrazie z albuminą. Należy wybrać obszar w obrębie interesującej pętli kapilarnej i zapisać średnią wartość intensywności. Następnie należy wybrać obszar w obrębie przestrzeni Bowmana i zapisać średnią wartość intensywności. Wartości te zostaną wykorzystane jako wartości tła.</li>
	<li>W celu ilościowego oznaczenia należy wybrać analogiczny obszar w przestrzeni Bowmana na obrazie zawierającym albuminę. Należy powtórzyć tę czynność dla co najmniej dwóch innych obszarów, aby wyznaczyć średnią wartość intensywności w przestrzeni Bowmana.</li>
	<li>Należy wybrać pętlę kapilarną o najwyższej intensywności plazmy i obrysować wokół niej obszar. Następnie, korzystając z funkcji progowania, należy zaznaczyć jasne wartości w obrębie krążącej plazmy, unikając ciemnych smug, które stanowią krążące erytrocyty. Należy zapisać średnie wartości intensywności zaznaczonej przestrzeni plazmy. Ważne jest, aby preferencyjnie wybierać jasne obszary plazmy, ponieważ składniki krwi mogłyby doprowadzić do niedoszacowania poziomów fluorescencji plazmy.</li>
	<li>W arkuszu Microsoft Excel należy wprowadzić wartości w celu obliczenia GSC, gdzie:</li>
</ol>
<img alt="Równanie stanu równowagi statycznej, wzór GSC; schemat analizy natężenia w układzie spektroskopowym." fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">

<ol><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3B+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504(2007).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489(2009).</li>
<li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447(2012).</li>
<li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601(1992).</li>
<li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides%2C+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat%3A+Effects+of+molecular+size+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237(2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tutaj kroki reprezentują to, co uważamy za te, które zapewnią spójne i dokładne wartości przepuszczalności, ponieważ pozwalają ominąć następujące pułapki:
<ol>
 <li>Rozpraszanie: Zastosowanie fluoroforów emitujących czerwień pozwala na bardziej efektywne zbieranie światła, ponieważ fotony o dłuższych falach są mniej podatne na rozpraszanie. Użycie fluoroforów emitujących kolor zielony lub niebieski wprowadzi większą zmienność GSC ze względu na zwiększoną zmienność wartości intensywności z pętli kapil...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop konfokalny/wielofotonowy Olympus Floview 1000</td><td>Olympus America</td><td></td><td>Filtry do detektorów: Niebieski 430/100, Zielony 525/50, Czerwony 605/90</td></tr><tr><td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Regulowane długości fal wzbudzenia: ~750-1150 nm</td></tr><tr><td>Fotodetektory fosforku arsenku galu</td><td>Hamamatsu Corp</td><td></td><td>Uwaga: Dostępne są konfiguracje montowane z przodu lub z boku.</td></tr><tr><td>Metamorph Oprogramowanie do przetwarzania obrazów</td><td>Dynamika molekularna</td><td></td><td>Uwaga: Wersja 6.1r1</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td></td><td>2007</td></tr><tr><td>wersja Obsługa kleszczy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>Nr kat. # 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparowania Mayo</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>Nr kat. # 72962</td><td></td></tr><tr><td>CA Mikronożyczki Model 1C300</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>Kat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne Kelly (proste)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Koc z kurtką wodną + poduszka grzewcza</td><td>Gaymar</td><td></td><td>T / Pump PN 11184-000 Koc-66N111CC</td></tr><tr><td>Repti-Therm Podgrzewacz pod zbiornikiem</td><td>ZooMed</td><td></td><td>RH-4</td></tr><tr><td>Texas Red Sulfonyl</td><td>Chloride Invitrogen/Sondy molekularne</td><td>Cat# T-353</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy szczurzej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A-6272</td><td></td></tr><tr><td>Wysokiej jakości bezwodny DMF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# 270547</td><td></td></tr><tr><td>Taśma autoklawowa Strate-Line</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish Szkiełko nakrywkowe z dnem (50 mm/40 mm szkiełko nakrywkowe)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów wistar w monachium

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Choroby nerek polegające na utracie w moczu dużych niezbędnych makrocząsteczek, takich jak albumina surowicy, od dawna uważane są za spowodowane zmianami w barierze przepuszczalności składającej się z podocytów, komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i błony podstawnej, które działają zgodnie. Dane z naszego laboratorium przy użyciu przyżyciowej mikroskopii 2-fotonowej ujawniły bardziej przepuszczalną barierę filtracyjną kłębuszków nerkowych (GFB) niż wcześniej sądzono w warunkach fizjologicznych, z odzyskiwaniem przefiltrowanej albuminy zachodzącej we wczesnej podgrupie komórek zwanej komórkami kanalików proksymalnych (PTC)1,2,3.
Poprzednie techniki używane do badania filtracji nerkowej i ustalania charakterystyki bariery filtracyjnej obejmowały mikronakłuwanie światła tych wczesnych segmentów rurkowych z próbkowaniem zawartości płynu i analizą4. Badania te wykazały, że stężenie albuminy w płynie luminalnym praktycznie nie istnieje; odpowiadające ściśle temu, co jest zwykle wykrywane w moczu. Jednak charakterystyka polimerów dekstranu o określonych rozmiarach za pomocą tej techniki ujawniła, że te o wielkości podobnej do albuminy surowicy miały wyższe poziomy w świetle kanalików i moczu; Sugerowanie zwiększonej przepuszczalności5.
To szczegółowy zarys techniki używanej do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określania przepuszczalności albuminy fluorescencyjnej kłębuszków nerkowych in vivo. Metoda ta pozwala na wykrycie przefiltrowanej albuminy przez barierę filtracyjną do przestrzeni Bowmana (początkowa komora filtracji moczu); a także umożliwia ilościowe określenie reabsorpcji albuminy przez kanaliki proksymalne i wizualizację późniejszej transcytozy albuminowej6. Brak albuminy fluorescencyjnej wzdłuż późniejszych segmentów kanalików w drodze do pęcherza moczowego podkreśla skuteczność szlaku pobierania we wcześniejszych segmentach kanalików proksymalnych. Ponadto, gdy technika ta została zastosowana do określenia przepuszczalności dekstransu o wielkości podobnej do albuminy, podano praktycznie identyczne wartości przepuszczalności2. Obserwacje te bezpośrednio potwierdzają potrzebę rozszerzenia zainteresowania wielu białkomoczowych chorób nerek na uwzględnione zmiany w regeneracji komórek kanalików proksymalnych.

Rysunek 3 przedstawia przykład obrazu wykonanego z powierzchniowego kłębka nerkowego szczura rasy Munich Wistar Frömter oraz kroki podjęte w celu oznaczenia przepuszczalności fluorescencyjnej albuminy. Wartość GSC dla albuminy wynosząca 0,0111, wyznaczona dla tego konkretnego kłębka, mieści się w zakresie obserwowanym u tej linii szczurów Munich Wistar w stanie sytości3. Stabilność widoczna na tych obrazach wynika z uważnego zaplanowania i wykonania instrukcji przedstawionych na Rysunk...

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomyślna wizualizacja jednostki filtracyjnej nefronu i ilościowe określenie filtracji makrocząsteczek fluorescencyjnych przez barierę filtracyjną do przestrzeni moczowej in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie stolika mikroskopowego dla żywego zwierzęcia. Następnie nerka jest odsłaniana, a szczur jest umieszczany na scenie.Następnie identyfikowane i mapowane są poszczególne kłębuszki nerkowe oraz pozyskiwane są obrazy 3D tła. Na koniec podawana jest albumina fluorescencyjna. Pobierane są objętości 3D poszczególnych kłębuszków nerkowych i określa się ilościowo przepuszczalność.Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują współczynnik filtracji makrocząsteczek przez kłębuszki nerkowe w nerkach dzięki zastosowaniu mikroskopii dwufotonowej umieszczonej wewnątrz fiolki. Główną zaletą mikroskopii dwufotonowej jest to, że pozwala ona na jednoczesną kwantyfikację zarówno filtracji kłębuszkowej, jak i proksymalnej reabsorpcji kanalików i transcytozy u zwierzęcia. Jednocześnie implikacje tej techniki wykraczają poza mechanistyczne i obejmują diagnostykę i terapię, ponieważ znaczenie zrozumienia zarówno roli filtracji kłębuszkowej, jak i kanalików proksymalnych.Reabsorpcja albuminy ma kluczowe znaczenie dla określenia ukierunkowania terapii. Po znieczuleniu szczura należy wprowadzić linię dostępu żylnego na stałe przez żyłę szyjną lub udową i ogolić lewy bok od momentu tuż poniżej klatki piersiowej do tuż nad lewym udem. Jest to operacja, która nie daje szans na przeżycie.Połóż szczura płasko na prawym boku, tak aby lewa ogolona strona była skierowana do góry. Upewnij się, że leży płasko na ławce, a jego postawa jest wydłużona i nie jest przykucnięta, z przednimi łapami stykającymi się ze sobą i tylnymi łapami dotykającymi się bardzo delikatnie. Wykonaj badanie palpacyjne, aby wyczuć nerkę, aby określić, gdzie naturalnie leży w przestrzeni zaotrzewnowej, i użyj sharpie, aby narysować linię prostą równoległą do ciała za pomocą pary kleszczy do zębów.Podnieś skórę i użyj pary hemostatów, aby uszczypnąć skórę wzdłuż narysowanej linii, aby zmiażdżyć tkankę i zapobiec krwawieniu za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przeciąć wzdłuż nacięcia. Użyj tej samej procedury do cięcia zewnętrznej warstwy mięśni, która jest cienka w razie potrzeby.Użyj hemostatów, aby zapobiec krwawieniu z powodu nacięcia do wewnętrznej warstwy mięśni, co odsłoni otrzewną. Ponownie zbadaj palpacyjnie nerkę, aby oszacować wielkość. Ściśnij linię nacięcia mniejszą niż nerka, upewniając się, że nacięcie znajduje się tuż nad nerką.Najlepiej, aby to nacięcie było zbyt małe i w razie potrzeby powiększało. Zlokalizuj nerkę i użyj kleszczy, aby chwycić otaczający tłuszcz, pracując w kierunku dolnego bieguna nerki w sposób ręka nad ręką. Po osiągnięciu dolnego bieguna nerki delikatnie przeciągnij nerkę przez nacięcie, jednocześnie bardzo delikatnie ściskając poniżej nerki, aby ją zewnętrznić.Jeśli nacięcie jest zbyt małe, zmiażdż warstwę mięśniową i przetnij, aby ją poszerzyć. Powtórz procedurę, aby zewnętrzizować nerkę po uzewnętrznieniu nerki szczura i umieszczeniu szczura na stoliku mikroskopu w celu obrazowania. Jeśli twój mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowany stolik zdolny do oznaczania lokalizacji za pomocą dwuprzebiegowego pręta fluoresceinowego, filtra dominowego i obiektywu o małej mocy, znajdź i wyśrodkuj poszczególne kłębuszki nerkowe, które będą wyglądać jak puste okrągłe struktury otoczone kanalikami proksymalnymi.Posiadanie naturalnej żółto-pomarańczowej autofluorescencji oznaczającej każde miejsce, przełącz wieżyczkę na obiektyw zanurzenia w wodzie o większej mocy i zbierz zestawy danych 3D dla każdej kłębuszków nerkowych. Upewnij się, że pętle kapilarne i przestrzeń Bowmana są wyraźnie widoczne. Użycie pseudo palety kolorów pomoże zobrazować te struktury.Następnie, koncentrując się na powierzchownym naczyniu krwionośnym, powoli wlewaj albuminę fluorescencyjną, upewniając się, że jest czas na ogólnoustrojową dystrybucję cząsteczek o niskim współczynniku kłębuszkowego lub GSC, konieczne jest maksymalizowanie wartości intensywności w osoczu, ale nie osiąganie poziomów, które nasycą fotodetektory w mikroskopie. Zwiększa to wykrywalność przefiltrowanych cząsteczek Po odczekaniu około 10 minut, aby umożliwić usunięcie potencjalnych fragmentów o małej masie cząsteczkowej, uzyskaj objętości 3D w odstępach jednego mikrona, które zostaną wykorzystane do obliczenia albumin za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów metamorficznych. Załaduj zestawy danych 3D wraz z obrazami tła dla każdego kłębuszka nerkowego w woluminie zawierającym albuminę fluorescencyjną.Zlokalizuj powierzchowną pętlę kapilarną z wystarczającą ilością pustej przestrzeni między jej zdefiniowanymi marginesami a krawędzią kapsuły Bowmana. W woluminie w tle. Zlokalizuj tę samą płaszczyznę ogniskową, która powinna zawierać wszystkie wizualne wskazówki albuminy zawierającej obraz.Wybierz obszar w interesującej Cię pętli kapilarnej i zanotuj średni odczyt intensywności. Następnie wybierz region w przestrzeni Bowmana i zanotuj średni odczyt intensywności. Zostaną one wykorzystane jako wartości tła do oceny ilościowej.Wybierz podobny region w przestrzeni Bowmana na obrazie zawierającym album. Zrób to dla co najmniej dwóch innych regionów, aby uzyskać wartość średniej intensywności w przestrzeni Bowmana. Wybierz pętlę kapilarną o najjaśniejszym natężeniu plazmy i narysuj wokół niej obszar.Następnie, korzystając z funkcji progowej, podświetl jasne wartości w krążącym osoczu, unikając ciemnych smug, które krążą w czerwonych krwinkach. Zwróć uwagę na średnie wartości intensywności wybranej przestrzeni plazmowej. Ważne jest, aby preferencyjnie wybierać jasne obszary osocza, ponieważ czynniki we krwi będą służyć jedynie do niedoszacowania poziomów fluorescencji osocza.Wprowadź wartości do arkusza kalkulacyjnego Excel, aby obliczyć GSC, gdzie GSC jest równe różnicy surowej przestrzeni Bowmana. Intensywność minus intensywność tła Intensywność przestrzeni Bowmana podzielona przez różnicę intensywności surowej pętli kapilarnej minus intensywność pętli kapilarnej tła. Wychwyt przefiltrowanej albuminy fluorescencyjnej występuje głównie we wczesnym segmencie kanalików proksymalnych.S, ten panel pokazuje przekrój kłębuszka nerkowego i segment S jeden pobrany od monachijskiego szczura suflera Wistar, około 20 minut po infuzji początkowego czerwonego bolusa RSA z Teksasu. Otwarcie przestrzeni Bowmana i gwałtowne pobieranie albuminy w kolorze czerwonym jest pokazane w segmencie S one. Ten panel pokazuje płytką projekcję 3D o grubości 20 mikronów tego samego zestawu danych, a tutaj pokazano projekcję niższej mocy wykonaną około 60 minut po infuzji.Obrazy te pokazują, że mikroskopia intravital może pozwolić na wizualizację losu podawanego materiału po filtracji, potwierdzając w pewnym stopniu obserwowany współczynnik filtracji pokazany tutaj to obrazy wykonane z powierzchni kłębuszków nerkowych. Ten panel jest obrazem tła, a ten obraz został zrobiony około 12 minut po infuzji albuminy surowicy szczura Texas Red. Te dwa panele są narysowane w pseudokolorze.Trzy małe obszary zainteresowania narysowane w przestrzeni Bowmana są używane do obliczenia średniej intensywności albuminy fluorescencyjnej, która przekroczyła barierę filtracji. Średnie wartości intensywności dla poszczególnych regionów zostały podane w wyróżnionym obszarze w oknie dialogowym Pokaż statystykę regionu. Wartość GSC dla albuminy wynosząca 0,0111 uzyskana dla tego pojedynczego kłębuszka nerkowego mieści się w zakresie występowania u tego szczepu monachijskich szczurów gwiaździstych w stanie karmienia.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza ilościowa i jakościowa, na innych strukturach nerkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ostateczny transport makrocząsteczki po filtracji do przestrzeni moczowej po jej rozwoju. Technika ta pozwoliła naukowcom zajmującym się fizjologią nerek na zbadanie dynamicznych procesów fizjologicznych i patofizjologicznych, nie tylko jednorazowo, ale podłużnie. Z czasem tak się stało.

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Określanie przepuszczalności kłębuszków nerkowych dla fluorescencyjnych makrocząsteczek za pomocą mikroskopii dwufotonowej u szczurów Wistar z Monachium

Ten film prezentuje aspirację płynu z mysich kłębuszków nerkowych przy użyciu techniki mikronakłuwania za pośrednictwem dwóch fotonów. Technika ta zapewnia dostęp do kłębuszków nerkowych żywej myszy, a tym samym pomaga uzyskać wgląd w fizjologię nerek.

Aspiracja płynu z kłębuszków nerkowych myszy: metoda odsysania płynu kłębuszkowego od myszy za pomocą mikronakłucia za pośrednictwem dwóch fotonów

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem oceny funkcji nerek. Tutaj opisujemy metodę wysokoprzepustową, która umożliwia określenie GFR u przytomnych myszy za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia bolusa, oznaczenie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-inuliny w osoczu i obliczenie GFR za pomocą dwufazowego modelu rozpadu wykładniczego.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Prezentujemy użycie mikroskopii 2-fotonowej do umieszczenia mikropipety w przestrzeni moczowej Bowmana u myszy, łącząc 2 podstawowe techniki fizjologii nerek. Zastosowanie mikroskopii 2-fotonowej pozwala przezwyciężyć krytyczne ograniczenia konwencjonalnej mikroskopii w badaniach fizjologii nerek z mikronakłuciem.

Mikronakłucie przestrzeni Bowmana u myszy ułatwione przez mikroskopię 2-fotonową

Tutaj opisujemy protokół pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) u świadomych, swobodnie poruszających się myszy za pomocą transdermalnego monitora GFR.

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą bardzo czułego, nieradioaktywnego znacznika. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu.

Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Poznaj metodę kwantyfikacji przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium. Technika umożliwia badanie funkcji nerek in vivo.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Przeglądaj więcej filmów