Wizualizacja rozwoju blizn za pomocą testu SCAD - test bliznowacenia skóry ex-situ

Stosowane wcześniej modele in vitro lub ex vivo pozbawione są składników komórek skóry właściwej i złożoności tkanki skórnej. Ten test SCAD ex situ pokonuje ustalone ograniczenie i umożliwia badanie rozwoju blizn poza rannym zwierzęciem. Test SCAD umożliwia wizualizację migracji fibroblastów i powstawania blizn w mikrośrodowiskach skóry.

Umożliwia to korzystanie z bibliotek przesiewowych aktywatorów lub inhibitorów w celu zrozumienia mechanistycznych podstaw powstawania blizn. Wysokoprzepustowe testy przesiewowe płaskich bibliotek wykorzystujące model SCAD w zrozumieniu podstawowego procesu i przebiegu cząsteczki zaangażowanej w gojenie się ran. Test SCAD jest łatwy do wykonania przy użyciu eksplantatów skóry.

Aby uzyskać jednolitą bliznę, zaleca się wybór skóry po porodzie w dniu zero lub w dniu pierwszym. Po poświęceniu nowonarodzonego szczeniaka po urodzeniu zera lub pierwszego dnia, użyj sterylnego skalpela chirurgicznego, aby ostrożnie wyciąć skórę grzbietową o wymiarach 1,5 na 1,5 centymetra o pełnej grubości aż do warstwy mięśni szkieletowych. Peeluj skórę za pomocą sterylnych, zakrzywionych kleszczy, upewniając się, że powierzchowna powięź jest nienaruszona z leżącym poniżej mięśniem panniculus carnosus.

Umyj wyciętą tkankę 50 do 100 mililitrami zimnego podłoża DMEM F-12 w celu usunięcia zanieczyszczającej krwi. Następnie umyj tkankę zrównoważonym roztworem soli Hanksa, aby utrzymać żywotność tkanek i komórek. Ułóż skórę do góry nogami z powierzchowną powięzią na górze na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej podłoże DMEM F-12.

Następnie, za pomocą jednorazowego dwumilimetrowego stempla biopsyjnego, wytnij okrągłe kawałki skóry o pełnej grubości, aby wytworzyć strupki tkane, upewniając się, że powięź powierzchowna jest nienaruszona z leżącym pod nią mięśniem panniculus carnosus aż do naskórka. Dodaj 200 mikrolitrów świeżej kompletnej pożywki DMEM F-12 bez czerwieni fenolowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś i całkowicie zanurz pojedynczą tkankę pokrytą strupami do góry nogami do dołków 96-dołkowej płytki.

Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych utrzymywanego w standardowych warunkach. W drugim i czwartym dniu hodowli usuń pożywkę, pozostawiając 10 mikrolitrów w studzience i dodaj świeżą, wstępnie podgrzaną kompletną pożywkę DMEM F-12 wraz ze związkami poddanymi działaniu substancji, aby utrzymać ciągłe warunki żywotności komórek i tkanek. Aby zobrazować SCAD na żywo, przygotuj 30 mililitrów 2 do 3% niskotopliwego roztworu agarozy w PBS w szklanej butelce, podgrzewając w kuchence mikrofalowej.

Po ugotowaniu natychmiast przenieś butelkę i ostudź płynny roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie przenieś tkankę SCAD z powięzią lub blizną skierowaną do góry na środek 35-milimetrowej naczynia. Następnie osadź SCAD w temperaturze pokojowej, powoli wlewając płynną agarozę o temperaturze 40 stopni Celsjusza na tkankę za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów.

Agaroza polimeryzuje w ciągu dwóch minut. Po polimeryzacji dodać dwa mililitry wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki DMEM F-12. Następnie, używając mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego wyposażonego w odpowiednie systemy inkubacji opisane w manuskrypcie, uzyskaj zdjęcia poklatkowe od dnia zerowego do dnia pierwszego.

W przypadku pobierania tkanek należy umyć tkanki w odpowiednich punktach czasowych, zastępując pożywkę sterylnym PBS. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś każdy SCAD do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów 2% paraformaldehydu, aby utrwalić tkanki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia należy trzykrotnie przemyć tkanki PBS przed przystąpieniem do dwu- lub trójwymiarowego barwienia immunofluorescencyjnego, jak opisano w rękopisie tekstu.

Reprezentatywne obrazy SCAD w pełnym jasnym polu są pokazane tutaj. Barwienie trichromowe pionowych skrawków tkanek Massona ujawnia sygnatury bliznowacenia tkanek, skurczu tkanek i akumulacji macierzy zewnątrzkomórkowej w rdzeniu blizny w dniu zero i piątym. Pokazano barwienie immunofluorescencyjne SCAD w dniach zero i pięć.

Od blizny we wczesnym i późnym stadium, zakorzeniony fibroblast dodatni jest pokazany na zielono, a zakorzeniony fibroblast ujemny na czerwono. W przypadku obrazowania trójwymiarowego tkanki zanurzono w roztworze agarozy i pokryto PBSGT. Reprezentatywne obrazy pokazują wyjątkową lokalizację białka N-kadheryny w miejscu blizny SCAD w piątym dniu.

Trójwymiarowy zestaw do obrazowania poklatkowego wyposażony w komorę inkubacyjną wyświetlał wczesne zdarzenia progresji rojów fibroblastów w ciągu pierwszych 12 godzin lub wczesnych etapów rozwoju blizny. Przedstawiono tutaj graficzne przedstawienie śledzonych trajektorii komórkowych poszczególnych fibroblastów w poszczególnych komórkach w trakcie rozwoju blizny. Bardzo ważne jest, aby umieścić tkankę SCAD do góry nogami wewnątrz płytki studzienki, tak aby powięź była skierowana do góry.

Niezastosowanie się do tego skutkowałoby nieuniknionymi zmianami we wzorcach migracji. Procedura ta pozwala na zbadanie warstw skóry właściwej do zabiegów lub hodowli przy użyciu modulatorów chemicznych, przeciwciał neutralizujących lub metod wirusowych. Pomaga to w ocenie patologicznych reakcji zwłóknieniowych w różnych środowiskach medycznych.

Wykazaliśmy ekspresję koneksyny-43 i N-kadheryny jako kluczowych cząsteczek biorących udział w mobilizacji powięzi po zranieniu. Metodologia SCAD pozwala na identyfikację nowych strategii terapeutycznych mających na celu ograniczenie bliznowacenia i zwłóknienia.