Name: Wizualizacja rozwoju blizn za pomocą testu SCAD - test bliznowacenia skóry ex-situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę SCAD do wizualizacji rozwoju blizn i migracji fibroblastów w mikrośrodowisku skóry. Model ten umożliwia badanie mechanizmów gojenia ran oraz identyfikację nowych strategii terapeutycznych przeciwko bliznowaceniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim współautorom Jiang et al. 2020 za wkład w rozwój metodologii SCAD13. Dziękujemy dr. Steffenowi Dietzelowi i centralnemu ośrodkowi bioobrazowania na Uniwersytecie Ludwiga-Maximilansa za dostęp do systemu Multiphoton. Projekt Y.R. był wspierany przez Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), Europejski Komitet ds. Badań Naukowych Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) oraz Fundację LEO (LF-OC-21-000835).

Model przedstawiony poniżej zawiera szczegółowy opis generacji testu SCAD krok po kroku, jak pokrótce opisano w Jiang et al., 202013. Przygotowanie próbek SCAD przeprowadzono po złożeniu zwierząt w ofierze zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi i wytycznymi rządu Górnej Bawarii. Zwierzęta były trzymane w ośrodku dla zwierząt w Centrum Helmholtza w Monachium. W pomieszczeniach utrzymywano optymalną wilgotność i stałą temperaturę z 12 godzinnym cyklem świetlnym. Zwierzęta były zaopatrywane w pokarm i wodę ad libitum.
1. Przygotowanie tkanek SCAD
<ol>
	<li>Uśmiercaj nowonarodzone szczenięta w dniu poporodowym 0 lub dniu 1 (P0 lub P1).</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć skórę grzbietu grzbietu o wymiarach co najmniej 1,5 cm x 1,5 cm pełnej grubości aż do warstwy mięśni szkieletowych za pomocą sterylnego skalpela chirurgicznego.</li>
	<li>Peeluj skórę za pomocą sterylnych, zakrzywionych kleszczy, upewniając się, że powierzchowna powięź jest nienaruszona z leżącym poniżej mięśniem panniculus carnosus.</li>
	<li>Umyj wyciętą tkankę 50-100 ml zimnego podłoża DMEM/F-12 w celu usunięcia zanieczyszczającej krwi.</li>
	<li>Umyj raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS), aby utrzymać żywotność tkanek i komórek.</li>
	<li>Umieść skórę do góry nogami (powięź powierzchowna na górze) na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę DMEM/F12.</li>
	<li>Za pomocą jednorazowego dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm należy wyciąć okrągłe kawałki skóry o pełnej grubości, upewniając się, że powięź powierzchowna jest nienaruszona z leżącym pod nią mięśniem panniculus carnosus, aż do naskórka, aby wytworzyć tkanki SCAD.</li>
	<li>Przygotuj i napełnij 200 μL kompletnego podłoża DMEM/F12 (bez czerwieni fenolowej) - pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM aminokwasy endogenne i 1x Penicylina/streptomycyna do pojedynczych dołków 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przenieś i całkowicie zanurz pojedynczą tkankę SCAD do góry nogami (powięź skierowana do góry) do dołków 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych utrzymywanego w standardowych warunkach (37 °C, 21% (v/v) tlenu, 5% (v/v) C02 i 95% wilgotności).</li>
</ol>
2. SCAD - Hodowla tkankowa
<ol>
	<li>Hodowla SCAD w inkubatorze przez okres do 5 dni.</li>
	<li>W 2. i 4. dniu hodowli zastąp pożywkę 200 μl świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM/F12, aby zapewnić ciągłe warunki żywotności komórek i tkanek. Wymieniaj związki do uzdatniania podczas każdej zmiany podłoża. 
	UWAGA: Upewnij się, że w studzience pozostało 10 μl pożywki, aby chusteczki nie przywierały do studzienek.</li>
	<li>Przygotuj SCAD do następujących eksperymentów: obrazowanie na żywo (sekcja 3) oraz pobieranie tkanek i barwienie immunofluorescencyjne 2D/3D (sekcja 4).</li>
</ol>
3. Obrazowanie SCAD na żywo
<ol>
	<li>Przygotuj co najmniej 30 ml niskotopliwego roztworu agarozy o stężeniu 2%-3% (w/v) w PBS w szklanej butelce, podgrzewając go w kuchence mikrofalowej do wrzenia.</li>
	<li>Natychmiast przenieść butelkę i schłodzić płynny roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Przenieś tkankę SCAD z powięzią/blizną skierowaną do góry na środek szalki o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Osadź SCAD w temperaturze pokojowej (RT), powoli przenosząc ciekłą agarozę o temperaturze 40 °C na szalkę o średnicy 35 mm za pomocą pipety Pasteura. Agaroza polimeryzuje w ciągu 2 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM/F12 (bez wskaźnika czerwieni fenolowej).</li>
	<li>Pozyskiwanie zdjęć poklatkowych SCAD dnia 0 do 48 godzin za pomocą mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego wyposażonego w odpowiedni system inkubacji ustawiony na 37 °C, 21% (v/v) tlenu, 5% (v/v) C02 i wilgotność 95%.</li>
</ol>
4. Pobieranie tkanek i barwienie immunofluorescencyjne 2D/3D
<ol>
	<li>Umyj chusteczki w odpowiednich punktach czasowych, zastępując pożywkę sterylnym PBS.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przenieś poszczególne SCAD do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl 2% paraformaldehydu, aby utrwalić tkanki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj tkanki trzykrotnie PBS i przystąp do barwienia immunofluorescencyjnego 2D/3D.</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne 3D
	<ol>
		<li>Przepuszczalność tkanek przez inkubację w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl PBS uzupełnionego 0,2% żelatyny, 0,5% Triton-X100 i 0,01% tiomersalu (PBSGT) w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.</li>
		<li>Przygotować odpowiednią ilość przeciwciał pierwszorzędowych zgodnie z instrukcjami producenta i inkubować tkanki SCAD w 150 μl roztworu PBSGT przez 24 godziny w temperaturze RT. 
		UWAGA: Jeśli producent nie poda optymalnego stężenia przeciwciał dla fluorescencji immunologicznej, należy wcześniej przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał na tkankach kontrolnych przy użyciu różnych stężeń (np. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).</li>
		<li>Delikatnie przemyć SCAD trzy razy PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe.</li>
		<li>Inkubować tkankę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor w 1:1000 w PBS przez noc w RT.</li>
		<li>Delikatnie myj tkankę przez 30 minut w PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.</li>
		<li>Przenieść tkankę na naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w celu obrazowania konfokalnego lub wielofotonowego. 
		UWAGA: W przypadku korzystania z obiektywów zanurzonych w wodzie, należy osadzić SCAD w agarozie o niskiej temperaturze topnienia 2%, aby unieruchomić tkankę i zapobiec dryfowaniu podczas akwizycji obrazu</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne 2D
	<ol>
		<li>Przenieś tkankę do krioformy i delikatnie wypełnij ją związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby całkowicie zanurzyć tkankę.</li>
		<li>Delikatnie wyreguluj orientację tkanki, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza, aby uzyskać przekrój lub przekrój pionowy.</li>
		<li>Umieść formę na suchym lodzie na 20-30 minut i inkubuj blok w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
		<li>Ustawić temperaturę ostrza na -25 °C, a temperaturę bloku próbki na -17 °C. Przygotować kriosekcję 6 μm za pomocą kriostatu, przenieść skrawki na szkiełko adhezyjne i przechowywać szkiełka w zamrażarce o temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka trzykrotnie w PBS i inkubować szkiełka w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w/v w PBST (PBS uzupełniony 0,05% Tween) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego do 150 μl PGST i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C 
		UWAGA: Jeżeli producent nie poda optymalnego stężenia przeciwciał dla fluorescencji immunologicznej, należy wcześniej przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał na odcinkach kontrolnych przy użyciu różnych stężeń (np. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).</li>
		<li>Delikatnie przemyj skrawki trzykrotnie PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe.</li>
		<li>Inkubować tkankę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor w skali 1:1000 w PBS przez noc w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Delikatnie myj tkankę przez 5 minut w PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego zawierającego DAPI i wysusz szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Longaker, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skin+wounds+in+the+fetal+environment+heal+with+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation.</a> Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).</li>
<li>desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+wound+healing%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and wound healing: an update.</a> Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).</li>
<li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).</li>
<li>Tripathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+scars+and+keloids%3A+a+review+and+current+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities.</a> Biomedical Dermatology. 4, 11(2020).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--Aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li>
<li>Correa-Gallegos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+repair+of+deep+wounds+by+mobilized+fascia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patch repair of deep wounds by mobilized fascia.</a> Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).</li>
<li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wounds+and+its+burden%3A+An+updated+compendium+of+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), 2151(2015).</li>
<li>Leavitt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prrx1+fibroblasts+represent+a+pro-fibrotic+lineage+in+the+mouse+ventral+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis.</a> Cell Reports. 33 (6), 108356(2020).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparisons+of+the+morphology%2C+migration%2C+cell+adhesions%2C+and+actin+cytoskeleton+of+fibroblasts+in+four+different+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).</li>
<li>Jiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+triggers+fascia+fibroblast+collective+cell+migration+to+drive+scar+formation+through+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin.</a> Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+gap+junction+drives+fascia+mobilization+and+repair+of+deep+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+wound+healing%3A+an+emphasis+on+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%3A+Official+Journal+of+International+Society+for+Bioengineering+and+the+Skin+%28ISBS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Digital+Imaging+of+Skin+%28ISDIS%29+%5Band%5D+International+Society+for+Skin+Imaging+%28ISSI%29%22%5BJournal%5D)">Models of wound healing: an emphasis on clinical studies.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+Animal+models+of+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: Animal models of wound healing).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Opracowano już kilka modeli, aby zrozumieć powstawanie blizn po urazie. Chociaż poczyniono w tym zakresie wiele postępów, rzeczywiste mechanizmy nadal nie są jasne. W przeciwieństwie do poprzedniej techniki, model SCAD obejmuje wszystkie typy komórek i warstwy skóry, zachowując w ten sposób złożoność natywnej skóry18,19. Metodologia ta jest w stanie wygenerować podstawowe zestawy danych, które są ważne w zrozumieniu mechanizmów molekularnych napędzających powstaw...

Gojenie ran to proces przywracania uszkodzonych ran. Urazy tkanek u bezkręgowców skutkują częściową lub całkowitą regeneracją. W przeciwieństwie do tego, ssaki reagują na głębokie obrażenia bliznowaceniem, procesem dostosowanym do szybkiego uszczelniania ran za pomocą gęstych zatyczek włókien matrycy, które minimalizują naruszony obszar i jednocześnie trwale deformują uszkodzone miejsce1,2,3. Duże oparzenia skóry lub głęboko otwarte rany u ssaków skutkują patologicznymi fenotypami, takimi jak blizny przerostowe lub keloidowe4,5. Te wybujałe blizny stanowią ogromne obciążenie dla klinicznych i globalnych systemów opieki zdrowotnej. W samych Stanach Zjednoczonych leczenie blizn kosztuje około 10 miliardów dolarów rocznie6,7. W związku z tym konieczne jest opracowanie odpowiednich metodologii, aby lepiej zrozumieć podstawowe procesy i mechanizmy związane z powstawaniem blizn.
W ostatnich latach szeroki zakres badań na myszach ujawnił niejednorodne populacje fibroblastów o różnych potencjach funkcjonalnych w oparciu o ich pochodzenie w określonych miejscach skóry8,9,10. W skórze pleców Rinkevich i in., 2015, zidentyfikowali, że specyficzna populacja fibroblastów z wczesną embrionalną ekspresją Engrailed-1 (En1), określaną jako EPF (Engrailed dodatni fibroblast) przyczynia się do bliznowacenia skóry po zranieniu. I odwrotnie, inna linia fibroblastów bez historii ekspresji Engrailed, Engrailed negative fibroblast (ENF), nie przyczynia się do powstawania blizn8. Mapowanie losów tych linii En1 przy użyciu transgenicznych linii myszy sterowanych przez Cre skrzyżowanych z fluorescencyjnymi liniami reporterowymi myszy, takimi jak R26mTmG (En1Cre xR26 mTmG), umożliwia wizualizację populacji EPF i ENF.
Badanie migracji fibroblastów in vivo przez kilka dni jest ograniczone ograniczeniami etycznymi i technicznymi. Co więcej, badania przesiewowe biblioteki przeciwciał złożonych, wirusowych i neutralizujących w celu modulacji szlaków zaangażowanych w bliznowacenie są technicznie trudne. Poprzednio używane modele in vitro lub ex vivo nie mają możliwości wizualizacji migracji fibroblastów i powstawania blizn w prawdziwych mikrośrodowiskach skóry, jednorodności w rozwoju blizny, a także złożoności tkanek, które emulują środowiska skóry in vivo11,12. Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, opracowaliśmy test bliznowacenia ex vivo o nazwie SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Ten prosty test można przeprowadzić, wycinając 2 mm skóry o pełnej grubości zawierającej naskórek, skórę właściwą i podskórne obszary powięzi i hodując je w pożywce DMSO uzupełnionej surowicą przez okres do 5 dni. Blizny wygenerowane za pomocą SCAD niezawodnie odtwarzają transkryptomiczne i proteomiczne cechy charakterystyczne blizn in vivo. Ponadto SCAD wygenerowane z odpowiednich linii myszy transgenicznych (np. myszy En1) skrzyżowanych z fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych umożliwiają wizualizację dynamiki migracji fibroblastów i rozwoju blizn w niespotykanej dotąd rozdzielczości. Co więcej, model ten można łatwo dostosować do dowolnych zastosowań o wysokiej przepustowości (np. biblioteki związków, biblioteki przeciwciał lub badań przesiewowych wirusów)13,14. W tym artykule opisujemy zoptymalizowany protokół do generowania SCAD i późniejszych aplikacji przetwarzania w celu zbadania dynamiki komórkowej i macierzy w rozwoju blizn.

<table><tbody><tr><td>10% Tween 20, Niejonowy detergent</td><td>Biorad Laboratories</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, fract zimnego etanolu</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowej-500 mL</td><td>LIFE Technologies</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Cryostar NX70 Cryostat</td><td>Thermo Preparaty</td> adhezyjne Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Epredia SuperFrost Plus Fisher</td><td>scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Szkiełka adhezyjne</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, atestowana przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej-500 ml</td><td>LIFE Technologies</td><td>&nbsp; </td><td></td>10500064</tr><tr><td>Fluoromount-G z technologiami DAPI</td><td>Life 00</td><td>4959 52</td><td>Medium montażowe z DAPI</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione z drobnymi punktami z prowadnicąstal nierdzewna (pęseta)Długość 125 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12381369</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement-100 ml</td><td>LIFE Technologies</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej-500 ml</td><td>LIFE Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi System inkubacji gazów do CO2 i O2</td><td>Ibidi</td><td>11922</td><td></td></tr><tr><td>System grzewczy Ibidi</td><td></td><td>10915</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Leica SP8 - wzbudzenie wielofotonowe 680&ndash; 1300 nm</td><td>Leica</td><td></td><td>Wyposażony w obiektyw do zanurzania w wodzie 25x (HC IRAPO L 25x/1.00&thinsp; W) w połączeniu z przestrajalnym laserem (Spectra-Physics, InSight DS&thinsp;+&thinsp; Pojedyncze)</td></tr> <tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>LIFE Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agaroza, 25 g Biozym</td><td>/ Lonza</td><td>859081</td><td></td></tr><tr><td>OCT Matryca do zatapiania</td><td>Carlroth</td><td>6478.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% w/v AQ. 10 x10 mL</td><td>VWR International</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Stiefel Biopsy-Punch 2 mm</td><td>Stiefel</td><td>270130</td><td></td></tr><tr><td>Proste ostre/Ostre nożyczki preparacyjne 11,4 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15654444</td><td></td></tr><tr><td>Tiomersal Bioxtra, 97%&ndash; Mikroskop pionowy 101%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8784-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axioimager M2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja rozwoju blizn za pomocą testu scad - test bliznowacenia skóry ex-situ

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

Globalną reakcją ssaków na uszczelnianie głębokich ran tkankowych jest tworzenie blizn i kurczenie się tkanek, w których pośredniczą wyspecjalizowane fibroblasty powięzi. Pomimo klinicznego znaczenia powstawania blizn i upośledzonego gojenia się ran, nasza wiedza na temat dynamiki fibroblastów powięzi w gojeniu się ran jest pobieżna ze względu na brak odpowiednich testów, które umożliwiają bezpośrednią wizualizację choreografii i dynamiki fibroblastów w złożonych środowiskach, takich jak rany skóry. W artykule przedstawiono protokół generowania blizn skórnych ex-situ za pomocą SCAD lub "SCar-like tissue in A Dish", które naśladują złożone środowisko ran skóry. W tym teście skóra o pełnej grubości 2 mm jest wycinana i hodowana do góry nogami w pożywce przez 5 dni, podczas których blizny i przykurcze skóry rozwijają się równomiernie. Ta metodologia, w połączeniu z transgenicznymi modelami myszy specyficznymi dla linii fibroblastów, umożliwia wizualizację poszczególnych linii fibroblastów w całym procesie gojenia się ran. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pomaga naukowcom w zrozumieniu podstawowych procesów i mechanizmów gojenia się ran, bezpośrednio badając wpływ modulatorów na wyniki gojenia się ran.

Generowanie SCADs można podzielić na trzy kluczowe etapy: pobranie skóry grzbietu od myszy P0-P1, wykonanie pełnowarstwowych biopsji wycinkowych oraz późniejszą hodowlę poszczególnych SCADs do 5 dni w płytkach 96-dołkowych. Jako odczyt, badanie to można dalej zastosować do analizy przestrzennych i czasowych aspektów bliznowacenia. Analiza przestrzenna wykorzystuje 2D i 3D immunoznakowanie tkanek w celu zbadania lokalizacji przestrzennej komponentów komórkowych i macierzy w rozwijającej się tkance bliznowatej. Badania spa...

Ten protokół opisuje wytwarzanie eksplantatu skórno-powięziowego, określanego jako "SCar like tissue in A Dish" lub SCAD. Model ten pozwala na niespotykaną dotąd wizualizację pojedynczych fibroblastów podczas tworzenia blizn.

Wizualizacja rozwoju blizn za pomocą testu SCAD - test bliznowacenia skóry ex-situ

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Stosowane wcześniej modele in vitro lub ex vivo pozbawione są składników komórek skóry właściwej i złożoności tkanki skórnej. Ten test SCAD ex situ pokonuje ustalone ograniczenie i umożliwia badanie rozwoju blizn poza rannym zwierzęciem. Test SCAD umożliwia wizualizację migracji fibroblastów i powstawania blizn w mikrośrodowiskach skóry.Umożliwia to korzystanie z bibliotek przesiewowych aktywatorów lub inhibitorów w celu zrozumienia mechanistycznych podstaw powstawania blizn. Wysokoprzepustowe testy przesiewowe płaskich bibliotek wykorzystujące model SCAD w zrozumieniu podstawowego procesu i przebiegu cząsteczki zaangażowanej w gojenie się ran. Test SCAD jest łatwy do wykonania przy użyciu eksplantatów skóry.Aby uzyskać jednolitą bliznę, zaleca się wybór skóry po porodzie w dniu zero lub w dniu pierwszym. Po poświęceniu nowonarodzonego szczeniaka po urodzeniu zera lub pierwszego dnia, użyj sterylnego skalpela chirurgicznego, aby ostrożnie wyciąć skórę grzbietową o wymiarach 1,5 na 1,5 centymetra o pełnej grubości aż do warstwy mięśni szkieletowych. Peeluj skórę za pomocą sterylnych, zakrzywionych kleszczy, upewniając się, że powierzchowna powięź jest nienaruszona z leżącym poniżej mięśniem panniculus carnosus.Umyj wyciętą tkankę 50 do 100 mililitrami zimnego podłoża DMEM F-12 w celu usunięcia zanieczyszczającej krwi. Następnie umyj tkankę zrównoważonym roztworem soli Hanksa, aby utrzymać żywotność tkanek i komórek. Ułóż skórę do góry nogami z powierzchowną powięzią na górze na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej podłoże DMEM F-12.Następnie, za pomocą jednorazowego dwumilimetrowego stempla biopsyjnego, wytnij okrągłe kawałki skóry o pełnej grubości, aby wytworzyć strupki tkane, upewniając się, że powięź powierzchowna jest nienaruszona z leżącym pod nią mięśniem panniculus carnosus aż do naskórka. Dodaj 200 mikrolitrów świeżej kompletnej pożywki DMEM F-12 bez czerwieni fenolowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś i całkowicie zanurz pojedynczą tkankę pokrytą strupami do góry nogami do dołków 96-dołkowej płytki.Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych utrzymywanego w standardowych warunkach. W drugim i czwartym dniu hodowli usuń pożywkę, pozostawiając 10 mikrolitrów w studzience i dodaj świeżą, wstępnie podgrzaną kompletną pożywkę DMEM F-12 wraz ze związkami poddanymi działaniu substancji, aby utrzymać ciągłe warunki żywotności komórek i tkanek. Aby zobrazować SCAD na żywo, przygotuj 30 mililitrów 2 do 3% niskotopliwego roztworu agarozy w PBS w szklanej butelce, podgrzewając w kuchence mikrofalowej.Po ugotowaniu natychmiast przenieś butelkę i ostudź płynny roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie przenieś tkankę SCAD z powięzią lub blizną skierowaną do góry na środek 35-milimetrowej naczynia. Następnie osadź SCAD w temperaturze pokojowej, powoli wlewając płynną agarozę o temperaturze 40 stopni Celsjusza na tkankę za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów.Agaroza polimeryzuje w ciągu dwóch minut. Po polimeryzacji dodać dwa mililitry wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki DMEM F-12. Następnie, używając mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego wyposażonego w odpowiednie systemy inkubacji opisane w manuskrypcie, uzyskaj zdjęcia poklatkowe od dnia zerowego do dnia pierwszego.W przypadku pobierania tkanek należy umyć tkanki w odpowiednich punktach czasowych, zastępując pożywkę sterylnym PBS. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś każdy SCAD do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów 2% paraformaldehydu, aby utrwalić tkanki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia należy trzykrotnie przemyć tkanki PBS przed przystąpieniem do dwu- lub trójwymiarowego barwienia immunofluorescencyjnego, jak opisano w rękopisie tekstu.Reprezentatywne obrazy SCAD w pełnym jasnym polu są pokazane tutaj. Barwienie trichromowe pionowych skrawków tkanek Massona ujawnia sygnatury bliznowacenia tkanek, skurczu tkanek i akumulacji macierzy zewnątrzkomórkowej w rdzeniu blizny w dniu zero i piątym. Pokazano barwienie immunofluorescencyjne SCAD w dniach zero i pięć.Od blizny we wczesnym i późnym stadium, zakorzeniony fibroblast dodatni jest pokazany na zielono, a zakorzeniony fibroblast ujemny na czerwono. W przypadku obrazowania trójwymiarowego tkanki zanurzono w roztworze agarozy i pokryto PBSGT. Reprezentatywne obrazy pokazują wyjątkową lokalizację białka N-kadheryny w miejscu blizny SCAD w piątym dniu.Trójwymiarowy zestaw do obrazowania poklatkowego wyposażony w komorę inkubacyjną wyświetlał wczesne zdarzenia progresji rojów fibroblastów w ciągu pierwszych 12 godzin lub wczesnych etapów rozwoju blizny. Przedstawiono tutaj graficzne przedstawienie śledzonych trajektorii komórkowych poszczególnych fibroblastów w poszczególnych komórkach w trakcie rozwoju blizny. Bardzo ważne jest, aby umieścić tkankę SCAD do góry nogami wewnątrz płytki studzienki, tak aby powięź była skierowana do góry.Niezastosowanie się do tego skutkowałoby nieuniknionymi zmianami we wzorcach migracji. Procedura ta pozwala na zbadanie warstw skóry właściwej do zabiegów lub hodowli przy użyciu modulatorów chemicznych, przeciwciał neutralizujących lub metod wirusowych. Pomaga to w ocenie patologicznych reakcji zwłóknieniowych w różnych środowiskach medycznych.Wykazaliśmy ekspresję koneksyny-43 i N-kadheryny jako kluczowych cząsteczek biorących udział w mobilizacji powięzi po zranieniu. Metodologia SCAD pozwala na identyfikację nowych strategii terapeutycznych mających na celu ograniczenie bliznowacenia i zwłóknienia.

visualizing-scar-development-using-scad-assay-an-ex-situ-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Podczas rozwoju ssaków, rany skóry na wczesnym etapie ciąży goją się bez blizny. Tutaj szczegółowo opisujemy wiarygodny i powtarzalny model gojenia się ran bez blizn płodu w grzbietu skóry zarodków myszy E16.5 (bez blizn) i E18.5 (bliznowaciejących).

Model skóry płodu myszy z gojeniem ran bez blizn

To badanie skupia się na modelu gojenia ran in vitro (test zadrapań) jako mechanizmie określającym, jak zanieczyszczenia środowiskowe, takie jak arsen, wpływają na migrację komórek. Wyniki pokazują, że ten test in vitro dostarcza szybkich i wczesnych wskazówek dotyczących zmian w migracji komórkowej przed eksperymentami in vivo.

In vitro Test zarysowania w celu wykazania wpływu arsenu na migrację komórek skóry

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje użycie makromolekularnego stłoczenia do stworzenia in vitro modelu ludzkiej przerostowej tkanki bliznowatej, która przypomina warunki in vivo. Uprawiane w zatłoczonym środowisku makromolekularnym fibroblasty ludzkiej skóry wykazują fenotypy, biochemię, fizjologię i cechy funkcjonalne przypominające tkankę bliznowatą.

Model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego

Opisana jest spójna metodologia obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowego oznaczania związków farmaceutycznych w skórze. W artykule opisano przygotowanie tkanki skórnej (ludzkiej i mysiej) i miejscowe stosowanie preparatów, akwizycję obrazu w celu ilościowego określenia czasoprzestrzennych profili stężeń oraz wstępną analizę farmakokinetyczną w celu oceny miejscowego dostarczania leków.

Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Ten protokół wyjaśni, jak ustanowić model myszy z bliznami przerostowymi, który zwiększa sygnalizację mechanotransdukcji, aby symulować blizny podobne do ludzkich. Metoda ta polega na zwiększeniu napięcia mechanicznego w poprzek gojącego się nacięcia u myszy i użyciu specjalistycznego urządzenia do stworzenia powtarzalnej, nadmiernej tkanki bliznowatej do szczegółowych analiz histologicznych i bioinformatycznych.

Mysi model napędzanych mechanotransdukcją, podobnych do ludzkich blizn przerostowych

To badanie przedstawia metodę korelacyjnego obrazowania leków w tkankach miękkich za pomocą nieliniowej spektroskopii optycznej i obrazowania spektrometrii mas. Połączenie obrazowania skóry w wysokiej rozdzielczości z czułym wykrywaniem leków stanowi cenne podejście do badania dystrybucji leków w skórze, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania doskonałych produktów do stosowania miejscowego.

Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich

Przedstawiamy tutaj półautomatyczny protokół identyfikacji i ilościowej identyfikacji i ilościowej identyfikacji komórek odpornościowych i nieimmunologicznych w przekrojach skóry za pomocą SCAnED, darmowego makro opartego na ImageJ do segmentacji skóry.

SCAnED – otwartoźródłowe makro do segmentacji skóry do półautomatycznego wykrywania komórek i jąder w przegrodach skóry naskórnej i skórnej

Poznaj metodę SCAD do wizualizacji rozwoju blizn i migracji fibroblastów w mikrośrodowisku skóry. Model ten umożliwia badanie mechanizmów gojenia ran oraz identyfikację nowych strategii terapeutycznych przeciwko bliznowaceniu.

Wizualizacja rozwoju blizn za pomocą testu SCAD - test bliznowacenia skóry ex-situ

Przeglądaj więcej filmów