Optyczne pułapkowanie nanocząstek plazmonicznych do charakterystyki spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo in situ
23 czerwca 2022
Obecny protokół opisuje wygodne podejście do integracji optycznego pułapkowania i powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (SERS) do manipulowania plazmonicznymi nanocząstkami w celu czułego wykrywania molekularnego. Bez środków agregujących, laser pułapkujący gromadzi plazmoniczne nanocząstki w celu wzmocnienia sygnałów SERS docelowych analitów do pomiarów spektroskopowych in situ.
Protokół ten zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad zespołem nanocząstek aktywnych SERS przy braku czynników agregujących w celu uzyskania czułego wykrywania docelowych analitów. Główną zaletą naszej metody jest to, że do wytworzenia zespołu aktywnych nanocząstek SERS nie są używane żadne środki agregujące, dzięki czemu nadaje się ona do analizy wrażliwych biomolekuł w warunkach fizjologicznych. Jest to obiecująca platforma do wykrywania cząsteczek analitów, takich jak biomarker choroby, w roztworach i w warunkach fizjologicznych w układzie mikroprzepływowym.
Stosując tę metodę po raz pierwszy, badacz może być zmuszony do precyzyjnego dostrojenia mocy lasera pułapkowego, czasu napromieniowania i stężenia nanocząstek srebra, aby osiągnąć najlepszą wydajność. Aby rozpocząć, skieruj wiązkę laserową o długości 532 nm do elastycznego portu mikroskopu pęsety optycznej. Ustaw wiązkę lasera o długości 532 nm w stereoskopowych dwuwarstwowych ścieżkach optycznego mikroskopu pęsetowego z 750-nanometrowym zwierciadłem dichroicznym o długości 750 nanometrów, aby połączyć je z oryginalnymi wiązkami laserowymi pułapkującymi, aby ustawić ostrość na komorze próbki.
Zebrać światło rozproszone wstecznie z komory próbki za pomocą 750-nanometrowego zwierciadła dichroicznego długiego przepustu i przekierować je do spektrometru zawierającego chłodzoną ciekłym azotem kamerę ze sprzężeniem ładunku. Umieść filtr wycinający o długości 532 nm przed szczeliną wejściową spektrometru przed akwizycją widmową. Wyczyść szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe wodą i etanolem.
Przymocuj taśmę ramową do szklanego szkiełka, aby stworzyć komorę. Dodaj kilka kropli roztworu DSNB z nanocząsteczkami srebra do ramki. Umieść szkiełko nakrywkowe na taśmie ramy i uszczelnij je.
Dodaj ciekły azot do pojemnika kamery urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym chłodzonym ciekłym azotem, aż temperatura osiągnie minus 120 stopni Celsjusza. Zablokuj ścieżkę wiązki sondy Ramana za pomocą magnetycznego ekranu bezpieczeństwa lasera, a następnie włącz laser źródła wzbudzenia Ramana o długości 532 nanometrów. Zamocuj komorę na próbkę roztworem nanocząstek srebra DSNB na uchwycie komory.
Dodaj wodę do obiektywu zanurzonego w wodzie, a następnie umieść uchwyt komory natychmiast na mikrostage nad obiektywem. Upuść olejek immersyjny na szkiełko nakrywkowe i ustaw skraplacz zanurzony w oleju, aby uwidocznić cząstki na kamerze mikroskopu. Wyreguluj położenie Z obiektywu, obracając pokrętło mikroskopu, aż wiązka sondy Ramana o długości 532 nanometrów zostanie skupiona na dolnej szklanej powierzchni komory, pokazując białą plamę na kamerze mikroskopu.
Dostosuj pozycje X i Y mikrostolika, aby przesunąć komorę i umieścić centralny obszar komory w białym punkcie. Otwórz oprogramowanie sterujące pęsetą optyczną i użyj dołączonego joysticka, aby przesunąć laser pułapkujący o długości 1,064 nanometra tak, aby nałożył się na białą plamkę. Następnie dostrój pokrętło mikroskopu, aby przesunąć pozycję Z obiektywu w górę.
Włącz laser pułapkowy o długości fali 1,064 nanometra, aby przyciągnąć nanocząstki srebra do komory próbki i utworzyć plazmoniczny zespół nanocząstek srebra. W razie potrzeby zmniejsz wiązkę lasera pułapkowego, aby uniknąć przegrzania lub tworzenia się pęcherzyków. Dostosuj położenie mikrostolika próbki, aby umieścić ciemną plamkę zespołu plazmonicznych nanocząstek srebra pod ogniskiem wiązki sondy Ramana o długości 532 nm w celu pomiarów spektroskopowych.
Umieść filtry o neutralnej gęstości przed 532-nanometrowym wyjściem lasera Ramana, aby dostosować moc do 10 megawatów. Wprowadź czas akwizycji w panelu ustawień w oprogramowaniu widma i kliknij przycisk Pobierz, aby rozpocząć akwizycję widma. Bez lasera pułapkującego rozproszone nanocząstki srebra w komorze próbki wygenerowały czarne widmo.
Zwiększenie mocy i wydłużenie czasu naświetlania lasera pułapkującego może przyciągnąć więcej nanocząstek srebra i wygenerować ciemną plamę. Ponieważ rozproszone nanocząstki srebra znajdowały się pod wpływem ruchów Browna, połączenia międzycząsteczkowe były duże i niestabilne. Ogólna intensywność DSNB w plazmonicznym zespole nanocząstek srebra była wyższa niż w przypadku rozproszonej nanocząstki srebra.
Biorąc pod uwagę intensywność charakterystycznego piku na odwrocie 1,444 centymetra, plazmoniczny zespół nanocząstek srebra może zapewnić około 50-krotne wzmocnienie wzmocnionego powierzchniowo sygnału spektroskopii Ramana DSNB w porównaniu z rozproszonymi nanocząstkami srebra. Natężenia charakterystycznych pików DSNB na odwróconych 1, 152, 1, 444 i 1 579 centymetrów w tych 20 powierzchniowo wzmocnionych widmach Ramana zostały wykreślone jako histogramy ze względnymi odchyleniami standardowymi wynoszącymi odpowiednio 6,88, 6,59 i 5,48%. Najważniejszą rzeczą w tej procedurze jest zlokalizowanie pozycji 532-nanometrowego lasera sondy Ramana i nałożenie go na 1,064-nanometrowy laser pułapkowy.
Technika ta toruje naukowcom drogę do wykrywania cząsteczek analitu z kontrolą przestrzenną i czasową w warunkach fizjologicznych w celu przeprowadzenia przyszłych analiz in vivo.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę integrowania pułapkowania optycznego ze spektroskopią Ramana wzmocnioną powierzchniowo (SERS) w celu manipulowania plazmonicznymi nanocząsteczkami dla czułej detekcji molekularnej. Podejście to umożliwia pomiary spektroskopowe in situ bez użycia czynników agregujących, co wzmacnia sygnały SERS docelowych analitów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Chemia analityczna
Wstęp
- Pułapkowanie optyczne oraz SERS są potężnymi technikami detekcji molekularnej.
- Tradycyjne metody często wymagają zastosowania środków agregujących, które mogą zakłócać czułą analizę biomolekuł.
- Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście, które eliminuje konieczność stosowania takich środków.
- Metoda ta jest odpowiednia do warunków fizjologicznych, co czyni ją przydatną w detekcji biomarkerów.
Cel badania
- Opracowanie protokołu montażu nanocząsteczek aktywnych w SERS bez użycia czynników agregujących.
- Zwiększenie czułości detekcji molekularnej w środowiskach fizjologicznych.
- Stworzenie platformy do przyszłych analiz biomolekuł in vivo.
Zastosowane metody
- Integracja pułapkowania optycznego z SERS w celu manipulacji nanocząsteczkami.
- Zastosowanie lasera o długości fali 532 nm do wzbudzenia oraz lasera pułapkującego o długości fali 1 064 nm.
- Dostosowanie mocy lasera i czasu naświetlania w celu optymalizacji procesu agregacji nanocząsteczek.
- Akwizycja widm przy użyciu kamery CCD chłodzonej ciekłym azotem.
Główne wyniki
- Złożone plazmoniczne nanocząstki srebra wykazały 50-krotny wzrost sygnału SERS w porównaniu z rozproszonymi nanocząstkami.
- Charakterystyczne piki analitów były stale wykrywane z wysoką intensywnością.
- Względne odchylenia standardowe pików były niskie, co wskazuje na wiarygodność pomiarów.
- Metoda ta umożliwia precyzyjną kontrolę nad przestrzennymi i czasowymi aspektami agregacji nanocząstek.
Wnioski
- Technika ta stanowi znaczący postęp w detekcji biomolekuł w warunkach fizjologicznych.
- Brak czynników agregujących zwiększa wiarygodność wyników.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować analizy biomarkerów chorób in vivo.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Platformy SERS zintegrowane z pułapkami optycznymi odpowiadają na krytyczną potrzebę powtarzalnego i ultrasensytywnego wykrywania molekularnego w środowiskach istotnych fizjologicznie, bez użycia chemicznych czynników agregujących. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w odkrywaniu biomarkerów we wczesnym stadium oraz wspiera solidne procesy analityczne w badaniu układów istotnych dla chorób. Przestrzenna i czasowa kontrola nad montażem nanocząstek w tej metodzie umożliwia wiarygodne analizy przy niskim poziomie perturbacji, co jest niezbędne dla rurociągów badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę celów biomolekularnych w roztworze w warunkach fizjologicznych.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez wyeliminowanie wpływu czynników agregujących na detekcję molekularną.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dzięki powtarzalnemu i ilościowemu wzmocnieniu sygnału SERS.
- Zwiększa pewność predykcyjną w procesie wczesnej identyfikacji i segregacji biomarkerów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, wolną od agregacji platformę do przygotowania zespołów aktywnych w technice SERS w systemach mikroprzepływowych lub wodnych.
- Zapewnia wysoką powtarzalność i wyniki ilościowe z niskim względnym odchyleniem standardowym pomiędzy pomiarami.
- Umożliwia skalowalny rozwój analiz w celu czułego screeningu związków lub biomarkerów.
- Umożliwia niezawodną ocenę cząsteczek analitu w stężeniach poniżej poziomu nanomolarnego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z analizą układów istotnych dla przebiegu choroby, umożliwiając detekcję in situ w środowiskach fizjologicznych.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez minimalizację zaburzeń próbki.
- Zmniejsza ryzyko podejmowanych decyzji dotyczących dalszego rozwoju badań, dostarczając solidnych i powtarzalnych danych dotyczących charakterystyki molekularnej.
- Wspiera przyszłe przepływy pracy w zakresie analizy biomarkerów in vivo.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta metoda pułapkowania optycznego z SERS integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz przepływy pracy nad biomarkerami translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wykrywanie analitów w oparciu o hipotezy oraz wyjaśnianie szlaków w środowiskach zbliżonych do naturalnych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki SERS w celu oceny gotowości testów i ewaluacji związków.
- Analityka: Zapewnia solidne pomiary widmowe i wyniki statystyczne do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie biomarkerów i zachowanie ciągłości w modelach przedklinicznych przy minimalnych zakłóceniach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, wolną od agregacji zdolność analityczną dla zróżnicowanych potrzeb detekcji molekularnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i walidację celu poprzez umożliwienie czułej, powtarzalnej detekcji bez artefaktów agregacji.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje tworzenie i pomiar struktur aktywnych w SERS w celu uzyskania skalowalnych, powtarzalnych procesów pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka analitycznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących biomarkerów i celów terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie pułapkowania optycznego, aparatury SERS oraz analizy widmowej.
- Wymaga dostępu do mikroskopów z optycznymi pęsetami dwulaserowymi oraz spektrometrów CCD chłodzonych ciekłym azotem.
- Wymaga standaryzacji parametrów wyrównania laserów, mocy oraz akwizycji danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych systemów nanocząstek powlekanych analitami oraz platform mikroprzepływowych.
- Wydajność może zależeć od precyzyjnego nakładania się przestrzennego oraz kontroli środowiskowej, zgodnie z opisem w protokole.
