Name: Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj pomiary SERS pojedynczych cząsteczek wykorzystujące nanoanteny origami DNA. Ta metoda umożliwia wykrywanie biomolekuł z wysoką czułością i śledzenie reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC; grant konsolidacyjny nr 772752).

1. Zespół widelca DNA origami
<ol>
	<li>Samodzielnie złóż strukturę origami DNA w jednym garnku. Najpierw dodaj 2,5 nM okrągłej nici rusztowania M13mp18 (7,249 nukleotydów, patrz tabela materiałów) i 100 nM 201 krótkich oligonukleotydów (tabela 1) w 1x TAE (tris[hydroksymetylo]aminometan [tris], kwas octowy, kwas etylenodiaminowy octowy [EDTA]) uzupełniony 15 mM buforem MgCl2. Następnie dostosuj całkowitą objętość do 100 μl za pomocą ultraczystej wody.</li>
	<li>Następnie wyżarzać roztwór za pomocą gradientu temperatury w termocyklerze, najpierw przez szybkie podgrzanie do 80 °C, następnie przez schłodzenie z 80 °C do 20 °C przy 1 °C/12 min, następnie z 20 °C do 16 °C przy 1 °C/6 min, a następnie przez szybkie schłodzenie z 16 °C do 8 °C.</li>
	<li>Użyj filtrów Amicon 100 kDa z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) (patrz tabela materiałów), aby oczyścić mieszaninę z nadmiaru zszywek.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu origami DNA do filtrów Amicon, a także 400 μl ultraczystej wody, a następnie odwirować przy 6 000 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Wyrzuć filtrat, wyjmując filtr i obracając rurkę, aby usunąć wypłukanie ze zlewu, a następnie dodaj 400 μl ultraczystej wody do filtra i ponownie odwiruj. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
		<li>Aby zebrać oczyszczony roztwór nanostruktury, odwróć filtr do góry nogami w nowej probówce i odwiruj (1 000 x g, 2 min, RT) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Roztwór ten można przechowywać w lodówce w temperaturze 8 °C do 2 tygodni. 
		UWAGA: Do etapu oczyszczania filtra Amicon należy użyć 1x buforu TAE lub 1x TAE uzupełnionego buforem 15 mM MgCl2 zamiast ultraczystej wody, ponieważ woda zmniejsza stabilność i obniża stężenie uzyskanych widelców origami DNA. W przypadku pomiaru pojedynczej cząsteczki barwnika, mieszaninę nici zszywkowej DNA zastępuje się zmodyfikowaną mieszaniną nici zawierającą barwnik TAMRA na końcu 5'. To zmodyfikowane pasmo znajduje się w środku mostka nanowidelcowego (tabela 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Powłoka z nanocząsteczek złota (AuNP)
UWAGA: Zmodyfikowana wersja protokołu Liu et al.<sup="xref">23 została użyta do pokrycia AuNPs, a proces powlekania polegał na zamrożeniu roztworu AuNP-DNA.
<ol>
	<li>Odwirować (3 500 x g, 5 min, RT) 400 μl roztworu AuNP o średnicy 60 nm (otrzymanego w handlu; patrz tabela materiałów) i za pomocą pipety usunąć supernatant. Następnie rozpuść granulkę w 25 μl ultraczystej wody. Końcowe stężenie AuNPs wynosi ~0,3 nM.</li>
	<li>Dodać 1 μl 100 mM roztworu tris-(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) do 4 μl DNA modyfikowanego tiolem (100 μM dostarczonego przez producenta; patrz tabela materiałów) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji dodać mieszaninę 5 μl do stężonego roztworu AuNP (etap 2.1), wirować przez 5 s i zamrażać przez co najmniej 2 godziny w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Po rozmrożeniu w temperaturze pokojowej należy odwirować mieszaninę (3 500 x g, 5 min, RT) w celu usunięcia nadmiernie dodanego DNA powlekającego. Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie rozpuścić osad w 10 μl wody. 
	UWAGA: Na nanowidelcu znajdują się dwie nitki powłoki dla każdego z AuNP (Tabela 2). Kroki są takie same, z wyjątkiem sekwencji nici powlekającej DNA. Po pokryciu cząstki są bardzo stabilne; Mogą pozostać w takim stanie, w jakim są, przez wiele miesięcy w lodówce, a nawet można je zamrozić. W przypadku w pełni powlekanych AuNPs, powlekające nici DNA mają wewnętrzny barwnik TAMRA.</li>
</ol>
3. Montaż DONA
<ol>
	<li>Dodać powlekany roztwór AuNP do roztworu nanowidelców o stosunku molowym o stężeniu 1,5:1.</li>
	<li>Dodać MgCl2 do końcowego stężenia 4 mM za pomocą 50 mM roztworu podstawowego MgCl2. Dostosuj końcową objętość do 20 μl za pomocą ultraczystej wody.</li>
	<li>Hybrydyzuj DONA za pomocą gradientu temperatury w termocyklerze. Najpierw szybko podgrzać do 40 °C, następnie schłodzić z 40 °C do 20 °C w temperaturze 1 °C/10 min, a następnie szybko schłodzić z 20 °C do 8 °C.</li>
</ol>
4. Elektroforeza żelowa
UWAGA: Niezwiązane nanocząstki w roztworze DONA są usuwane przez elektroforezę w żelu agarozowym.
<ol>
	<li>Przygotuj 1% żel agarozowy. W tym celu rozpuść 0,8 g agarozy w 80 ml 1x TAE uzupełnionego 5 mM MgCl2.</li>
	<li>Dodać 2,25 μl buforu ładującego (30% glicerolu, 13 mM MgCl2; patrz Tabela Materiałów) do 18 μl roztworu DONA, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 mM MgCl2 z 4 mM w kroku 3.2. Bufor załadowczy zapewnia również, że próbka pozostaje w kieszeni żelu.</li>
	<li>Uruchom żel na 60 minut przy napięciu 70 V w lodowatej kąpieli wodnej. Bieżący bufor to 1x TAE uzupełniony o 5 mM MgCl2.</li>
	<li>Wytnij interesującą nas opaskę i umieść ją na szkiełku mikroskopowym owiniętym folią parafinową z tworzywa sztucznego, a następnie wyciśnij roztwór za pomocą drugiego szkiełka mikroskopowego owiniętego folią parafinową z tworzywa sztucznego. Za pomocą pipety zebrać wyciśnięty płyn do probówki o pojemności 500 μl.</li>
</ol>
5. Kolokalizacja pomiarów AFM i Ramana
<ol>
	<li>Plazmę poddaje się obróbce chipa krzemowego (patrz tabela materiałów) przez 10 minut, a następnie inkubuje 10 μl oczyszczonego roztworu DONA plus 10 μl 100 mM MgCl2 na chipie przez 3 godziny. Następnie umyj frytki dwa razy mieszaniną 1:1 (objętościowo) etanolu i wody i wysusz sprężonym powietrzem. Następnie przyklej chip do dysku magnetycznego i włóż go do instrumentu w celu obrazowania. 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem pomiarów pozycja lasera wzbudzenia Ramana jest dostosowywana tak, aby znajdowała się na górze końcówki sondy AFM. W niniejszej pracy zastosowano mikroskop ramanowski HORIBA LabRAM HR Evolution sprzężony z HORIBA Omegascope AFM. Urządzenie jest sterowane za pomocą oprogramowania LabSpec i AIST.</li>
	<li>Do pomiaru AFM należy użyć trybu stukania (tryb AC) z ACCESS-NC-A (częstotliwość rezonansowa: 300 kHz; stała sprężystości: 45 N/m) tips24. Tryb AC automatycznie steruje wszystkimi parametrami z wyjątkiem częstotliwości skanowania, która jest ustawiona na 1 Hz. 
	UWAGA: Po obrazowaniu AFM końcówka AFM jest wycofywana, aby nie znajdowała się na drodze lasera Ramana. Odbywa się to za pomocą funkcji makra "Probe away", zaprogramowanej w systemie. W ten sposób dla dowolnie wybranego punktu na obrazie AFM laser będzie w tej samej pozycji bez przesunięcia w stosunku do AFM.</li>
	<li>Wybierz żądaną długość fali lasera, moc i czas akumulacji dla pomiarów Ramana, ponieważ wszystkie te parametry zależą od mierzonej próbki.
	<ol>
		<li>Do pomiaru AuNP w pełni pokrytego TAMRA można użyć wymienionych parametrów: laser 633 nm, moc 100 μW i czas integracji 1 s.</li>
		<li>Użyj wymienionych parametrów dla pojedynczego pomiaru TAMRA: laser 633 nm, moc 400 μW i czas integracji 4 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po dostosowaniu parametrów umieść kursor na żądanym DONA na obrazie AFM; robi to funkcja "przesuń kursor" w oprogramowaniu. Następnie rozpocznij pomiar Ramana. 
	UWAGA: Istnieją różne tryby pozyskiwania widm: pomiar jednopunktowy - jednowymiarowe mapowanie czasu - gdzie pojedynczy punkt jest mierzony w czasie25; oraz dwuwymiarowe mapowanie obszaru XY, w którym zmotoryzowany stopień jest przesuwany pod laserem w celu uzyskania widm z tablicy punktów w siatce XY26.</li>
</ol>

Single-Molecule SERS Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

<ol><li>Heck, C., Kanehira, Y., Kneipp, J., Bald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placement+of+single+proteins+within+the+SERS+hot+spots+of+self-assembled+silver+nanolenses%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Placement of single proteins within the SERS hot spots of self-assembled silver nanolenses.</a> Angewandte Chemie. 57 (25), 7444-7447 (2018).</li>
<li>Dey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">DNA origami.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 13(2021).</li>
<li>Tasciotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+cancer+therapy+with+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Smart cancer therapy with DNA origami.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 234-235 (2018).</li>
<li>Ijäs, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+interaction+between+doxorubicin+and+DNA+origami+nanostructures+for+customizable+chemotherapeutic+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Unraveling the interaction between doxorubicin and DNA origami nanostructures for customizable chemotherapeutic drug release.</a> Nucleic Acids Research. 49 (6), 3048-3062 (2021).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami-enabled+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">DNA origami-enabled biosensors.</a> Sensors. 20 (23), 6899(2020).</li>
<li>Kabusure, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+characterization+of+DNA+origami-shaped+silver+nanoparticles+created+through+biotemplated+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Optical characterization of DNA origami-shaped silver nanoparticles created through biotemplated lithography.</a> Nanoscale. 14 (27), 9648-9654 (2022).</li>
<li>Kershner, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placement+and+orientation+of+individual+DNA+shapes+on+lithographically+patterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces.</a> Nature Nanotechnology. 4 (9), 557-561 (2009).</li>
<li>Dutta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+states+and+spin+crossover+of+hemin+studied+by+DNA+origami+enabled+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Molecular states and spin crossover of hemin studied by DNA origami enabled single-molecule surface-enhanced Raman scattering.</a> Nanoscale. 14 (44), 16467-16478 (2022).</li>
<li>Langer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface-enhanced Raman scattering.</a> ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).</li>
<li>Jones, R. R., Hooper, D. C., Zhang, L., Wolverson, D., Valev, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+techniques%3A+fundamentals+and+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Raman techniques: fundamentals and frontiers.</a> Nanoscale Research Letters. 14 (1), 231(2019).</li>
<li>Blackie, E. J., Le Ru, E. C., Etchegoin, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+surface-enhanced+Raman+spectroscopy+of+nonresonant+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Single-molecule surface-enhanced Raman spectroscopy of nonresonant molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14466-14472 (2009).</li>
<li>Sepúlveda, B., Angelomé, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzán, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSPR-based+nanobiosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">LSPR-based nanobiosensors.</a> Nano Today. 4 (3), 244-251 (2009).</li>
<li>Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optical+properties+of+metal+nanoparticles%3A+The+influence+of+size%2C+shape%2C+and+dielectric+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).</li>
<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+of+gold+nanorods+at+short+distances+and+in+different+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
<li>Niu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami-based+nanoprinting+for+the+assembly+of+plasmonic+nanostructures+with+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">DNA origami-based nanoprinting for the assembly of plasmonic nanostructures with single-molecule surface-enhanced Raman scattering.</a> Angewandte Chemie. 60 (21), 11695-11701 (2021).</li>
<li>Fang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantizing+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering+with+DNA+origami+metamolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantizing single-molecule surface-enhanced Raman scattering with DNA origami metamolecules.</a> Science Advances. 5 (9), (2019).</li>
<li>Zhan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+directed+assembly+of+gold+bowtie+nanoantennas+for+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">DNA origami directed assembly of gold bowtie nanoantennas for single-molecule surface-enhanced Raman scattering.</a> Angewandte Chemie. 57 (11), 2846-2850 (2018).</li>
<li>Choi, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering+as+a+probe+of+single-molecule+surface+reactions%3A+promises+and+current+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule surface-enhanced Raman scattering as a probe of single-molecule surface reactions: promises and current challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 52 (11), 3008-3017 (2019).</li>
<li>Liu, N., Liedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-assembled+advanced+plasmonic+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA-assembled advanced plasmonic architectures.</a> Chemical Reviews. 118 (6), 3032-3053 (2018).</li>
<li>Acuna, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+enhancement+at+docking+sites+of+DNA-directed+self-assembled+nanoantennas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence enhancement at docking sites of DNA-directed self-assembled nanoantennas.</a> Science. 338 (6106), 506-510 (2012).</li>
<li>Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+nanophotonics+and+plasmonics+at+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">DNA origami nanophotonics and plasmonics at interfaces.</a> Langmuir. 34 (49), 14911-14920 (2018).</li>
<li>Tapio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+DNA+origami-based+plasmonic+nanoantenna+for+label-free+single-molecule+surface-enhanced+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A versatile DNA origami-based plasmonic nanoantenna for label-free single-molecule surface-enhanced Raman spectroscopy.</a> ACS Nano. 15 (4), 7065-7077 (2021).</li>
<li>Liu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing-driven+DNA+adsorption+on+gold+nanoparticles%3A+tolerating+extremely+low+salt+concentration+but+requiring+high+DNA+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Freezing-driven DNA adsorption on gold nanoparticles: tolerating extremely low salt concentration but requiring high DNA concentration.</a> Langmuir. 35 (19), 6476-6482 (2019).</li>
<li>Aliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%2C+tapping+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">AFM, tapping mode.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 99(2012).</li>
<li>Recording Raman spectral images and profiles. Horiba Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.horiba.com/int/scientific/technologies/raman-imaging-and-spcetroscopy/recording-spectral-images-and=profiles/">https://www.horiba.com/int/scientific/technologies/raman-imaging-and-spcetroscopy/recording-spectral-images-and=profiles/</a> (2023).</li>
<li>Raman Images Explained. Renishaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.renishaw.com/en/raman-images-explained-25810">https://www.renishaw.com/en/raman-images-explained-25810</a> (2023).</li>
<li>Kogikoski, S., Tapio, K., von Zander, R. E., Saalfrank, P., Bald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+enhancement+of+nanoparticle+dimers+self-assembled+using+DNA+origami+nanotriangles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Raman enhancement of nanoparticle dimers self-assembled using DNA origami nanotriangles.</a> Molecules. 26 (6), 1684(2021).</li>
<li>Heck, C., Kanehira, Y., Kneipp, J., Bald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+carbon+generation+as+a+photocatalytic+reaction+on+DNA-assembled+gold+and+silver+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Amorphous carbon generation as a photocatalytic reaction on DNA-assembled gold and silver nanostructures.</a> Molecules. 24 (12), 2324(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

SM SERS to potężne narzędzie, które pozwala naukowcom badać zachowanie i interakcje poszczególnych cząsteczek w próbce1. Taka technika pozwala na analizę układów na niespotykanym dotąd poziomie czułości, dostarczając nowych informacji na temat podstawowego zachowania pojedynczych cząsteczek oraz rozkładu właściwości chemicznych lub fizycznych w zespole cząsteczek, a także pomaga zidentyfikować odpowiednie produkty pośrednie w procesach chemicznych. Jednak umieszczenie pojedynczej cząsteczki w gorącym punkcie, przy jednoczesnym upewnieniu się, że gorący punkt ma wystarczające wzmocnienie powierzchni, może byćdość trudne. Opisane DONA w tym protokole mogą precyzyjnie umieścić pojedynczą cząsteczkę w gorącym punkcie między dwiema nanocząstkami złota, zapewniając jednocześnie osiągnięcie 10-11-krotnego zwiększenia powierzchni.
Przerwa między nanocząstkami ma kluczowe znaczenie dla montażu DONA, aby osiągnąć wymagane wzmocnienie powierzchni dla badań SM SERS. DONA są zoptymalizowane pod kątem sferycznych nanocząstek o rozmiarach od 60 do 80 nm. Co więcej, jakość nanocząstek może znacząco wpłynąć na hybrydyzację nanocząstek z widelcami origami DNA; Gdy nanocząstki używane na etapie powlekania są starsze niż 6 miesięcy, efektywność hybrydyzacji zaczyna spadać.
Innym krytycznym aspektem protokołu jest to, że kroki, które wymagają dokładnego stosunku między komponentami, muszą być dokładnie wykonane, w przeciwnym razie DONA nie zostaną prawidłowo utworzone. Widelec origami DNA jest niezwykle wrażliwy na protokół narastania temperatury, a zmiany wpływają na integralność struktury lub zapobiegają tworzeniu się widelców.
Wytwarzanie węgla amorficznego jest istotnym problemem podczas pomiarów SER, ponieważ jego piki zwykle mieszczą się w tym samym zakresie, co obszar odcisków palców dla wielu cząsteczek (1200-1700 cm-1). Chociaż formacja ta nie jest jeszcze w pełni poznana, zwykle wiąże się z dużą mocą lasera lub długim czasem integracji28. Na wszelki wypadek należy stosować najniższą moc lasera i możliwie najkrótszy czas integracji. Nie jest to jednak łatwe do osiągnięcia, ponieważ należy osiągnąć równowagę między uzyskaniem pożądanego sygnału SERS a uniknięciem wytwarzania amorficznego węgla.
DONA są bardzo wszechstronne jako system SM pod względem różnych typów i kształtów nanocząstek, które mogą być użyte, takich jak srebrne kule, złote kwiaty lub gwiazdy. Dodatkowo, badaną cząsteczkę można łatwo zastąpić, zmieniając tylko nić DNA w środku mostu, bez żadnych zmian w procedurze. Przejście na białka takie jak cytochrom C można przeprowadzić poprzez umieszczenie w mostku nici wychwytującej DNA zmodyfikowanej pirydyną, która związałaby cytochrom C i zapewniłaby, że znajduje się on w gorącym miejscu dla pomiarów SM SERS22. Przekłada się to również na elastyczny wybór lasera do naświetlania, potencjalnie przy użyciu lasera, który daje maksymalne wzmocnienie.
Podsumowując, metoda ta jest niezawodna w łączeniu struktur DONA i wykorzystywaniu ich do pomiarów spektroskopii Ramana wzmocnionych powierzchniowo pojedynczych cząsteczek.

Origami DNA to technika nanotechnologiczna, która polega na składaniu nici DNA w określone kształty i wzory. Możliwość tworzenia struktur z precyzyjną kontrolą w nanoskali jest jedną z kluczowych zalet DNA origami1. Możliwość manipulowania materią na tak małą skalę może zrewolucjonizować szeroki zakres dziedzin, w tym medycynę, elektronikę i materiałoznawstwo2. Na przykład struktury origami DNA zostały wykorzystane do dostarczania leków bezpośrednio do komórek nowotworowych3,4, twórz nanoskalowe czujniki do wykrywania chorób5,6, i twórz skomplikowane wzory na powierzchniach materiałów6,7. Co więcej, możliwość wykorzystania origami DNA do tworzenia złożonych struktur w nanoskali stworzyła nowe możliwości badania podstawowych procesów biologicznych w nanoscale8.
Powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana (SERS) to solidna technika analityczna, która wykrywa i identyfikuje cząsteczki o ekstremalnie niskich stężeniach9. Opiera się na efekcie Ramana, który jest zmianą długości fali rozproszonego światła10. SERS wymaga plazmonicznego podłoża metalowego, aby wzmocnić sygnał Ramana zaadsorbowanych na nim cząsteczek. Wzmocnienie to może być do 1011 razy większe niż sygnał uzyskany z tej samej cząsteczki mierzony konwencjonalną spektroskopią Ramana, co sprawia, że SERS jest bardzo czułą metodą analizy śladowych ilości substancji11.
Wzmocnienie sygnału Ramana nanocząstek wynika głównie ze wzmocnienia elektromagnetycznego opartego na wzbudzeniu zlokalizowanego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR)12. W tym zjawisku elektrony w nanocząstce metalu oscylują kolektywnie wokół powierzchni nanocząstki metalu podczas padania światła. Powoduje to powstanie fali stojącej elektronów znanej jako plazmon powierzchniowy, która może rezonować z padającym światłem. LSPR znacznie wzmacnia pole elektryczne w pobliżu powierzchni cząstki, a absorpcja optyczna cząstki jest maksymalna przy częstotliwości rezonansowej plazmonu. Energia plazmonu powierzchniowego zależy od kształtu i wielkości nanocząstki metalu, a także od właściwości otaczającego ją ośrodka13. Większe wzmocnienie można osiągnąć za pomocą sprzężeń plazmonicznych, na przykład gdy dwie nanocząstki znajdują się blisko siebie w odległości około 2,5 razy większej niż długość średnicy lub mniej14. Bliskość powoduje, że LSPR obu nanocząstek oddziałuje ze sobą, zwiększając pole elektryczne w przerwie między cząstkami o kilka rzędów wielkości, znacznie przewyższając wzmocnienie pojedynczej nanocząstki15,16,17. Wielkość wzmocnienia jest odwrotnie proporcjonalna do odległości między nanocząstkami; wraz ze zmniejszaniem się odległości pojawia się punkt krytyczny, w którym wzmocnienie jest wystarczające do wykrycia pojedynczych cząsteczek (SM)18.
Origami DNA reprezentuje kluczową technologię, która może efektywnie rozmieszczać plazmoniczne nanocząstki w celu wykorzystania i optymalizacji sprzężenia plazmonicznego19. Jednocześnie interesujące cząsteczki można umieścić dokładnie w miejscu, w którym detekcja optyczna jest najbardziej efektywna. Zostało to zademonstrowane za pomocą nanoanten plazmonicznych opartych na origami DNA do wykrywania fluorescencji20. W przeciwieństwie do detekcji etykiet fluorescencyjnych, SERS zapewnia możliwość wykrycia bezpośredniego chemicznego odcisku palca cząsteczki, co sprawia, że jednocząsteczkowy SERS jest bardzo atrakcyjny do wykrywania, a także monitorowania reakcji chemicznych i badań mechanistycznych. Origami DNA może być również używane jako maska do wytwarzania plazmonicznych nanostruktur o dobrze zdefiniowanych kształtach21, chociaż możliwość precyzyjnego umieszczania docelowych cząsteczek w gorącym punkcie jest wtedy tracona.
Korzystając z kolokalizowanej mikroskopii sił atomowych (AFM) i pomiarów Ramana, możemy uzyskać widma Ramana z pojedynczej nanoanteny DNA origami (DONA) i potencjalnie pojedynczej cząsteczki, jeśli umieścimy ją w pozycji o najwyższym wzmocnieniu sygnału. DONA składa się z widelca origami DNA i dwóch precyzyjnie rozmieszczonych nanocząstek, w pełni pokrytych DNA komplementarnym do wydłużonych nici zszywek dołączonych do origami DNA. Po hybrydyzacji DNA nanocząstki są wiązane z widelcem origami DNA z przerwą 1,2-2,0 nm między powierzchniami nanocząstek22. Takie połączenie tworzy gorący punkt pomiędzy nanocząstkami o wzmocnieniu sygnału do 1011-krotnym, zgodnie z obliczeniami z symulacji w dziedzinie czasu skończonej różnicy (FDTD)22, umożliwiając w ten sposób pomiary SM SERS. Jednak objętość najwyższego wzmocnienia jest niewielka (w zakresie 1-10nm3), w związku z czym cząsteczki docelowe muszą być precyzyjnie umieszczone w tym gorącym punkcie. Widelec origami DNA umożliwia umieszczenie pojedynczej cząsteczki między dwiema nanocząstkami za pomocą mostka widelca DNA i odpowiedniej chemii sprzęgającej. Niemniej jednak, obserwacja takich SM w widmach Ramana jest bardzo trudna22. Alternatywnie, nanocząstki mogą być w pełni pokryte cząsteczką docelową, taką jak barwnik TAMRA, aby umożliwić pojedyncze pomiary DONA o wyższej intensywności SERS21. W tym przypadku TAMRA jest kowalencyjnie przyłączona do nici powlekającej DNA (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).

<table><tbody><tr><td>Filtry 100 kDa MWCO Amicon, 0,5 ml</td><td>Merck</td><td>UFC5100BK</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor TAE (0,4 M Tris, 0,2 M kwas octowy, 0,01 M EDTA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>60 nm goldspheres, gołe (cytrynian)</td><td>NanoComposix</td><td>AUCN60</td><td></td></tr><tr><td>ACCESS-NC-A Sondy AFM</td><td>SCHÄFER-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza w proszku</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Nici powlekające DNA AuNP Nici powlekające</td> DNA <td>AuNP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(TAMRA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Fresco 17</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HORIBA OmegaScope z LabRAM HR evolution</td><td>HORIBA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Nić mostkowa DNA Nanofork (TAMRA)</td><td>Nici</td> zszywkowe DNA Metabion <td></td><td></td></tr><tr><td>Nanofork</td><td>SIGMA Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ParafilmM</td><td>Carl Roth</td><td>CNP8.1</td><td></td></tr><tr><td>Primus 25 Thermocycler</td><td>Peqlab/VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wafel</td><td>krzemowy Siegert</td><td>wafel BW14076</td><td></td></tr><tr><td>Rusztowanie jednoniciowe DNA, typ p7249 (M13mp18)</td><td>Tilibit nanosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCEP solution</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary rozpraszania ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego dna

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana (SERS) ma zdolność wykrywania pojedynczych cząsteczek, dla których wymagane jest wysokie wzmocnienie pola. Jednocząsteczkowa (SM) SERS jest w stanie dostarczyć specyficznych dla cząsteczki informacji spektroskopowych o poszczególnych cząsteczkach, a zatem dostarcza bardziej szczegółowych informacji chemicznych niż inne techniki wykrywania SM. Jednocześnie istnieje potencjał do rozwikłania informacji z pomiarów SM, które pozostają ukryte w pomiarach ramanowskich materiałów sypkich. Protokół ten przedstawia pomiary SM SERS przy użyciu nanoanteny DNA origami (DONA) w połączeniu z mikroskopią sił atomowych (AFM) i spektroskopią Ramana. Struktura widelca DNA origami i dwie nanocząstki złota są łączone w celu utworzenia DONA, z przerwą 1,2-2,0 nm między nimi. Pozwala to na nawet 10-krotne wzmocnienie sygnału SERS, umożliwiając pomiary pojedynczych cząsteczek. Protokół dodatkowo demonstruje umieszczenie pojedynczej cząsteczki analitu w gorącym punkcie SERS, proces obrazowania AFM, a następnie nałożenie obrazowania Ramana w celu zmierzenia analitu w pojedynczym DONA.

Zgodnie z protokołem należy upewnić się, że origami DNA w kształcie widelca zostało prawidłowo złożone; preferowaną metodą badania struktury widelców jest obrazowanie AFM. Oczekuje się, że większość widelców będzie miała zwartą strukturę, bez przerwanego ramienia. Z kolei mostek między ramionami jest trudny do obrazowania ze względu na niewielką średnicę i wysoką elastyczność; wymaga on również bardzo ostrej końcówki AFM (Rysunek 2).
Zmiana koloru roztworu na każdym etapie procesu powlekania AuNP wskazuje na prawidłowy przebieg reakcji. Początkowo, w przypadku samych AuNP, kolor jest intensywnie czerwony, jednak po dodaniu DNA zmienia się on na ciemnoczerwony z fioletowym odcieniem. Zamrażanie zmienia kolor na fioletowy, a po rozmrożeniu powraca on do intensywnej czerwieni (Rycina 3A). Rycina 3B przedstawia widma absorbancji niepowlekanych AuNP oraz AuNP powlekanych DNA.
Następnie, w krokach składania DONA, kolor pozostaje głęboko czerwony przez cały proces. Podczas oczyszczania w żelu agarozowym, powyżej prążka wolnych AuNP (najszybszego prążka w próbce) pojawia się prążek dimerów. Prążek ten odpowiada DONA i zostaje następnie wycięty i wyciśnięty w celu wyekstrahowania próbki (Rycina 4).
Na koniec, w celu pomiarów kolokalizacji, wykonuje się obrazowanie próbki za pomocą AFM w poszukiwaniu DONA (Rysunek 5). Następnie zbiera się widma Ramana dla pojedynczych DONA i porównuje je, aby upewnić się, że uzyskane widma pochodzą od cząsteczek TAMRA (Rysunek 6).
<img alt="Schemat montażu nanostruktury; obejmuje nanocząsteczki złota, połączenia molekularne; zaznaczone wymiary." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie widelca z origami DNA oraz w pełni zmontowanego DONA. (A) Wymiary widelca z origami DNA z mostkiem o długości 90 nukleotydów. (B) Schematyczny widok z boku zmontowanego DONA, z dwiema AuNP i widelcem z origami DNA pomiędzy nimi. (C) Schematyczny widok z góry zmontowanego DONA przedstawiający pozycję rozmieszczenia SM na środku mostka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii sił atomowych, rozkład nanocząsteczek, skala wysokości 0,5-3,47 nm, skala nanometryczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obraz AFM widełek z origami DNA po montażu. Widełki są dobrze uformowane, a w niektórych z nich widoczny jest mostek. Widełki mają wysokość od 1,5-2 nm. Pasek skali = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Stabilność nanocząsteczek złota (AuNP); widma absorpcyjne; probówki z roztworami AuNP niepowleczonych i powleczonych; wykres." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zmiana barwy i widma absorbancji AuNP. (A) Probówki prezentujące barwę roztworu AuNP na różnych etapach. (1) Ciemnoczerwony kolor roztworu niepowleczonych AuNP. (2) Ciemnopurpurowoczerwony kolor po dodaniu DNA powlekającego do AuNP. (3) Purpurowy kolor po zamrożeniu mieszaniny DNA-AuNP. (4) Powrót do ciemnoczerwonego koloru po rozmrożeniu mieszaniny. (B) Widma absorbancji AuNP o rozmiarze 60 nm, pokazujące przesunięcie piku absorbancji od AuNP niepowleczonych (probówka 1) do AuNP powleczonych DNA (probówka 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy w żelu przedstawiający rozdzielanie AuNP; widoczne prążki dimerów i wolnych nanocząstek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Żel agarozowy roztworu DONA. W obu ścieżkach znajduje się ta sama próbka; wyraźnie widoczne są zarówno prążek dimeru (DONA), jak i prążek wolnych AuNP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy topografii AFM przedstawiają nanostruktury; w tym analizę powiększoną z wykresem profilu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Obraz AFM struktur DONA. (A) Obraz przedstawia wiele struktur DONA; ten obraz AFM został wykorzystany do pomiarów kolokalizacji. (B) Powiększony obraz zakreślonej struktury DONA oraz pionowy przekrój DONA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres spektroskopii Ramanowskiej dla SM TAMRA oraz TAMRA AuNP; analiza intensywności względem przesunięcia Ramanowskiego (cm⁻¹)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Widma SERS DONA wyposażonych w całkowicie pokryte TAMRA AuNP oraz w pojedynczą cząsteczkę TAMRA. Pionowe linie siatki wskazują główne piki TAMRA. Główne piki TAMRA są widoczne w całkowicie pokrytych TAMRA AuNP. Mimo że stosunek sygnału do szumu dla widm SM TAMRA jest niższy, główne piki są możliwe do zidentyfikowania: 1,360 cm-1: rozciąganie C-C; 1,509 cm-1: rozciąganie C=C; 1,536 cm-1: rozciąganie C=C; 1,654 cm-1: rozciąganie C=O. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig06large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Tabela 1: Lista nici staplowych dla widelca z origami DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310_Table%201_Nanofork%20staple%20%20strands%20list.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Lista zmodyfikowanych nici DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310_Table%202_DNA%20modified%20%20strands.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół demonstruje pomiary jednocząsteczkowego wzmocnionego powierzchniowo rozpraszania Ramana (SERS) za pomocą nanoanteny DNA origami (DONA) w połączeniu z kolokalizowaną mikroskopią sił atomowych (AFM) i pomiarami Ramana.

Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...

Nasze badania mają na celu opracowanie nowych narzędzi do wykrywania pojedynczych cząsteczek za pomocą powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana (SERS). Jest to jedyna technika, która zapewnia chemiczny odcisk palca cząsteczki i jest wystarczająco czuła, aby wykryć pojedyncze cząsteczki. W ten sposób można uzyskać szczegółowe informacje mechanistyczne na temat reakcji chemicznych.Nanostruktury DNA origami zostały wykorzystane do precyzyjnego pozycjonowania zarówno nanocząstek plazmonicznych, jak i cząsteczek docelowych. Jest to konieczne, ponieważ zwiększone rozpraszanie Ramana pochodzi z małej objętości nanometrycznej między nanocząstkami, które nazywamy gorącymi punktami. A teraz stworzyliśmy nową nano antenę plazmonicznego DNA origami właśnie w tym celu.Głównym wyzwaniem jest umieszczenie docelowych cząsteczek w takich gorących punktach między dwiema nanocząstkami i zebranie danych ramanowskich z dokładnie jednej struktury nanoanteny. Aby zebrać duże ilości danych i skutecznie skorelować mikroskopię sił atomowych ze spektroskopią Ramana, należy wykonać zabieg. Nano anteny plazmonicznego DNA origami pozwalają na powtarzalną produkcję dużej liczby plazmonicznych dimerów, w których cząsteczka docelowa jest precyzyjnie umieszczona pomiędzy nanocząstkami w gorącym punkcie.Dzięki korelacji danych AFM i ramanowskich możemy teraz upewnić się, że wykryta jest tylko jedna cząsteczka. Teraz możemy śledzić pojedyncze cząsteczki, takie jak cząsteczki barwnika lub białka w czasie rzeczywistym, ich zachowanie w gorących punktach i ich reakcje na zmiany chemiczne w środowisku. Na przykład niedawno monitorowano zmianę stanu spinowego pojedynczych cząsteczek henian.W przyszłości zamierzamy monitorować reakcje chemiczne na pojedynczym poziomie molekularnym i badać ich mechanizmy reakcji. Ponadto możemy wykorzystać tę technologię do wykrywania biomolekuł istotnych z medycznego punktu widzenia z bardzo wysoką czułością. Aby samodzielnie złożyć strukturę origami DNA w jednym doniczce, zacznij od przygotowania mieszaniny 2,5 nanomolowców okrągłej nici rusztowania M13, MP18 i 100 nanomolowców 201 krótkich zszywek nukleotydowych wielokątów w buforze TAE, uzupełnionych 15-milimolowym chlorkiem magnezu.Następnie dostosuj całkowitą objętość roztworu do 100 mikrolitrów za pomocą ultraczystej wody. Roztwór należy umieścić w termocyklerze za pomocą gradientu temperatury. Zacznij od szybkiego podgrzania do 80 stopni Celsjusza i postępuj zgodnie z wyświetlanym programem gradientu temperatury krok po kroku.Aby oczyścić mieszaninę z nadmiaru zszywek, dodaj 100 mikrolitrów roztworu origami DNA do filtra amanowego o masie cząsteczkowej 100 kilodaltonów, a następnie dodaj 400 mikrolitrów ultraczystej wody. Następnie odwirować w temperaturze 6 000 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu wyjmij filtr i odwróć rurkę, aby wyrzucić filtrat, dodaj 400 mikrolitrów ultraczystej wody do filtra i odwiruj, jak pokazano wcześniej.Aby zebrać oczyszczony roztwór nanostruktury, odwróć filtr do góry nogami w nowej probówce i odwiruj przy 1000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej zgodnie z instrukcjami producenta. Prawidłowy montaż widelca DNA origami został zapewniony za pomocą mikroskopii sił atomowych lub obrazowania AFM. Zgodnie z oczekiwaniami większość widelców była solidna i nie miała złamanych ramion.Jednak most między ramionami był trudny do zobrazowania ze względu na jego małą średnicę i dużą elastyczność. Aby pokryć nanocząstki złota DNA, weź 400 mikrolitrów komercyjnie uzyskanego roztworu nanocząstek złota i odwiruj go w temperaturze 3 500 G i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie rozpuścić osad w 25 mikrolitrach ultraczystej wody.Następnie dodaj cztery mikrolitry komercyjnie uzyskanego 100-mikromolowego DNA zmodyfikowanego tiolem. Dodaj jeden mikrolitr 100-milimolowego roztworu TCEP. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji dodać pięć mikrolitrów mieszaniny do wcześniej stężonego roztworu nanocząstek złota. Wiruj powstałą mieszaninę przez pięć sekund i zamrażaj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu zamrożonej mieszaniny w temperaturze pokojowej, odwirować ją w temperaturze 3,500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar dodanej powłoki DNA.Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie rozpuścić osad w 10 mikrolitrach wody. Zmieniający się kolor roztworu na każdym kroku wskazywał na prawidłowe pokrycie nanocząstki złota. Głęboki czerwony kolor nanocząstek złota zmienił się w ciemnopurpurowo-czerwony, gdy tylko dodano DNA.Zamrożenie zmieniło kolor na fioletowy, a rozmrożenie przywróciło go do głębokiej czerwieni. Widma absorbancji nanocząstek złota pokrytych DNA o długości 60 nanometrów wykazały przesunięcie piku absorpcji w porównaniu z nanocząstkami nagiego złota. Aby złożyć nano anteny DNA origami lub DONA, użyj nanocząstek złota pokrytych DNA i już zmontowanych widelców origami DNA.Dodaj roztwór nano widelca do powlekanego roztworu nanocząstek złota, utrzymując końcowy stosunek stężenia molowego 1,5 do jednego. Do mieszaniny dodać chlorek magnezu z 50-milimolowego roztworu podstawowego, aby osiągnąć końcowe stężenie chlorku magnezu wynoszące cztery milimolowe. Dostosuj końcową objętość do 20 mikrolitrów za pomocą ultraczystej wody.Hybrydyzuj DONA za pomocą gradientu temperatury w termocyklerze. Zaczynając od szybkiego podgrzania do 40 stopni Celsjusza, postępuj zgodnie z wyświetlanym programem gradientu temperatury krok po kroku. W celu oczyszczenia DONA przygotuj 1% żel agaros, rozpuszczając 0,8 grama agarosu w 80 mililitrach TAE uzupełnionym pięciomilimolowym chlorkiem magnezu.Dodać 2,25 mikrolitra buforu ładującego zawierającego 30% glicerolu i 13 milimolowy chlorek magnezu do 18 mikrolitrów roztworu DONA. Uruchom żel na 60 minut przy napięciu 70 V w lodowatej kąpieli wodnej. Wytnij interesującą Cię opaskę i umieść ją na szkiełku mikroskopowym owiniętym folią parafinową.Następnie wyciśnij roztwór za pomocą drugiego szkiełka mikroskopowego owiniętego folią parafinową. Za pomocą pipety zbierz wyciśnięty płyn do probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Podczas oczyszczania żelu agaros pasmo dimerów odpowiadające DONA pojawiło się nad pasmem wolnych nanocząstek złota, najszybciej biegnącym pasmem w próbce.Aby wykonać kolokowane obrazowanie AFM i pomiary Ramana na oczyszczonej antenie nano origami DNA lub DONA, najpierw potraktuj silikonowy chip plazmą przez 10 minut. Inkubować 10 mikrolitrów oczyszczonego roztworu DONA i 10 mikrolitrów 100 milimolowego chlorku magnezu na chipie przez trzy godziny. Następnie umyj frytki dwa razy mieszanką etanolu i wody i wysusz sprężonym powietrzem.Przyklej wysuszony chip do dysku magnetycznego i włóż go do instrumentu do mikroskopii sił atomowych lub obrazowania AFM. Następnie wybierz żądaną długość fali lasera, moc i czas akumulacji dla pomiarów Ramana. W przypadku nanocząstek złota w pełni pokrytych Tamrą wybierz laser o długości 633 nanometrów i mocy 100 mikrowatów.I jedna sekunda czasu integracji. W przypadku pojedynczego pomiaru Tamra zmień moc na 400 mikrowatów. I czterosekundowy czas integracji.Po dostosowaniu parametrów umieść kursor na żądanym DONA na obrazie AFM. Następnie rozpocznij pomiar Ramana. W przypadku pomiarów kolokalizacji wykonano obrazowanie AFM próbki w celu zlokalizowania DONA.Następnie zebrano widma Ramana z pojedynczych DONA i porównano, aby upewnić się, że uzyskane widma pochodziły z cząsteczek Tamra, a główne piki Tamra były widoczne w całkowicie pokrytej nanocząsteczce Tamra Gold. Chociaż stosunek sygnału do szumu dla pojedynczej cząsteczki Tamra Spectra był niższy, główne piki były możliwe do zidentyfikowania.

single-molecule-surface-enhanced-raman-scattering-measurements

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Opisano powtarzalne procesy czyszczenia substratów używanych w badaniach origami DNA, w tym czyszczenie RCA na stole i derywatyzację tlenku krzemu. Zilustrowano protokoły przygotowania powierzchni, osadzania origami DNA, parametrów suszenia i prostych konfiguracji eksperymentalnych.

Przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy DNA origami i eksperymentów

Opisujemy szczegółowy protokół opartego na origami łączenia złotych nanoprętów w chiralne metamolekuły plazmoniczne z silnymi reakcjami chiroptycznymi. Protokół nie ogranicza się do konfiguracji chiralnych i może być łatwo dostosowany do wytwarzania różnych architektur plazmonicznych.

Składanie złotych nanoprętów w chiralne metamolekuły plazmoniczne za pomocą szablonów DNA Origami

Tutaj opisujemy protokół tworzenia dyskretnych i dokładnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach, używając kształtów origami DNA jako szablonów prowadzących. Metoda jest demonstrowana poprzez tworzenie plazmonicznych złotych anten w kształcie muszki na przezroczystym podłożu (szafirze).

Nanowzorce substratów DNA origami struktur nieorganicznych do zastosowań detekcyjnych

W tym badaniu opracowaliśmy tanią nanosondę odcisków palców opartą na powierzchniowo wzmocnionym rozpraszaniu Ramana (SERS) o korzystnej biokompatybilności, aby pokazać bezznacznikowe bioobrazowanie żywych komórek i wykryć dwa szczepy bakterii, pokazując szczegółowo, jak uzyskać widma SERS żywych komórek w sposób nieniszczący.

Bezznacznikowa bioanaliza rozpraszania Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym oparta na nanosondach Au@Carbon dot

Opisujemy metodę pasywacji powierzchni szkła za pomocą glikolu polietylenowego (PEG). Protokół ten obejmuje czyszczenie powierzchni, funkcjonalizację powierzchni i powlekanie PEG. Wprowadzamy nową strategię obróbki powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch rundach, co zapewnia lepszą jakość pasywacji w porównaniu z istniejącymi metodami.

Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Przedstawiono procedurę wytwarzania i przeprowadzania opartego na filtrze testu spektroskopowego Ramana (SERS) do wykrywania zanieczyszczeń chemicznych (np. pestycydu ferbamu i antybiotyku ampicyliny).

Oparty na filtrze test spektroskopowy Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym do szybkiego wykrywania zanieczyszczeń chemicznych

Pokazano nowy sposób produkcji aerożeli na bazie biopolimerów poprzez żelowanie indukowane dwutlenkiem węgla (CO2). Technika ta wykorzystuje dwutlenek węgla pod ciśnieniem (5 MPa) do produkcji hydrożeli biopolimerowych i nadkrytycznego CO2 (12 MPa) do przekształcania żeli w aerożele. Jedynymi rozpuszczalnikami potrzebnymi oprócz CO2 są woda i etanol.

Przygotowanie aerożeli biopolimerowych przy użyciu zielonych rozpuszczalników

Poznaj pomiary SERS pojedynczych cząsteczek wykorzystujące nanoanteny origami DNA. Ta metoda umożliwia wykrywanie biomolekuł z wysoką czułością i śledzenie reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym.

Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA (Wideo) | JoVE Journal

Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA

Przeglądaj więcej filmów