Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA

Nasze badania mają na celu opracowanie nowych narzędzi do wykrywania pojedynczych cząsteczek za pomocą powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana (SERS). Jest to jedyna technika, która zapewnia chemiczny odcisk palca cząsteczki i jest wystarczająco czuła, aby wykryć pojedyncze cząsteczki. W ten sposób można uzyskać szczegółowe informacje mechanistyczne na temat reakcji chemicznych.

Nanostruktury DNA origami zostały wykorzystane do precyzyjnego pozycjonowania zarówno nanocząstek plazmonicznych, jak i cząsteczek docelowych. Jest to konieczne, ponieważ zwiększone rozpraszanie Ramana pochodzi z małej objętości nanometrycznej między nanocząstkami, które nazywamy gorącymi punktami. A teraz stworzyliśmy nową nano antenę plazmonicznego DNA origami właśnie w tym celu.

Głównym wyzwaniem jest umieszczenie docelowych cząsteczek w takich gorących punktach między dwiema nanocząstkami i zebranie danych ramanowskich z dokładnie jednej struktury nanoanteny. Aby zebrać duże ilości danych i skutecznie skorelować mikroskopię sił atomowych ze spektroskopią Ramana, należy wykonać zabieg. Nano anteny plazmonicznego DNA origami pozwalają na powtarzalną produkcję dużej liczby plazmonicznych dimerów, w których cząsteczka docelowa jest precyzyjnie umieszczona pomiędzy nanocząstkami w gorącym punkcie.

Dzięki korelacji danych AFM i ramanowskich możemy teraz upewnić się, że wykryta jest tylko jedna cząsteczka. Teraz możemy śledzić pojedyncze cząsteczki, takie jak cząsteczki barwnika lub białka w czasie rzeczywistym, ich zachowanie w gorących punktach i ich reakcje na zmiany chemiczne w środowisku. Na przykład niedawno monitorowano zmianę stanu spinowego pojedynczych cząsteczek henian.

W przyszłości zamierzamy monitorować reakcje chemiczne na pojedynczym poziomie molekularnym i badać ich mechanizmy reakcji. Ponadto możemy wykorzystać tę technologię do wykrywania biomolekuł istotnych z medycznego punktu widzenia z bardzo wysoką czułością. Aby samodzielnie złożyć strukturę origami DNA w jednym doniczce, zacznij od przygotowania mieszaniny 2,5 nanomolowców okrągłej nici rusztowania M13, MP18 i 100 nanomolowców 201 krótkich zszywek nukleotydowych wielokątów w buforze TAE, uzupełnionych 15-milimolowym chlorkiem magnezu.

Następnie dostosuj całkowitą objętość roztworu do 100 mikrolitrów za pomocą ultraczystej wody. Roztwór należy umieścić w termocyklerze za pomocą gradientu temperatury. Zacznij od szybkiego podgrzania do 80 stopni Celsjusza i postępuj zgodnie z wyświetlanym programem gradientu temperatury krok po kroku.

Aby oczyścić mieszaninę z nadmiaru zszywek, dodaj 100 mikrolitrów roztworu origami DNA do filtra amanowego o masie cząsteczkowej 100 kilodaltonów, a następnie dodaj 400 mikrolitrów ultraczystej wody. Następnie odwirować w temperaturze 6 000 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu wyjmij filtr i odwróć rurkę, aby wyrzucić filtrat, dodaj 400 mikrolitrów ultraczystej wody do filtra i odwiruj, jak pokazano wcześniej.

Aby zebrać oczyszczony roztwór nanostruktury, odwróć filtr do góry nogami w nowej probówce i odwiruj przy 1000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej zgodnie z instrukcjami producenta. Prawidłowy montaż widelca DNA origami został zapewniony za pomocą mikroskopii sił atomowych lub obrazowania AFM. Zgodnie z oczekiwaniami większość widelców była solidna i nie miała złamanych ramion.

Jednak most między ramionami był trudny do zobrazowania ze względu na jego małą średnicę i dużą elastyczność. Aby pokryć nanocząstki złota DNA, weź 400 mikrolitrów komercyjnie uzyskanego roztworu nanocząstek złota i odwiruj go w temperaturze 3 500 G i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie rozpuścić osad w 25 mikrolitrach ultraczystej wody.

Następnie dodaj cztery mikrolitry komercyjnie uzyskanego 100-mikromolowego DNA zmodyfikowanego tiolem. Dodaj jeden mikrolitr 100-milimolowego roztworu TCEP. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji dodać pięć mikrolitrów mieszaniny do wcześniej stężonego roztworu nanocząstek złota. Wiruj powstałą mieszaninę przez pięć sekund i zamrażaj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu zamrożonej mieszaniny w temperaturze pokojowej, odwirować ją w temperaturze 3,500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar dodanej powłoki DNA.

Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie rozpuścić osad w 10 mikrolitrach wody. Zmieniający się kolor roztworu na każdym kroku wskazywał na prawidłowe pokrycie nanocząstki złota. Głęboki czerwony kolor nanocząstek złota zmienił się w ciemnopurpurowo-czerwony, gdy tylko dodano DNA.

Zamrożenie zmieniło kolor na fioletowy, a rozmrożenie przywróciło go do głębokiej czerwieni. Widma absorbancji nanocząstek złota pokrytych DNA o długości 60 nanometrów wykazały przesunięcie piku absorpcji w porównaniu z nanocząstkami nagiego złota. Aby złożyć nano anteny DNA origami lub DONA, użyj nanocząstek złota pokrytych DNA i już zmontowanych widelców origami DNA.

Dodaj roztwór nano widelca do powlekanego roztworu nanocząstek złota, utrzymując końcowy stosunek stężenia molowego 1,5 do jednego. Do mieszaniny dodać chlorek magnezu z 50-milimolowego roztworu podstawowego, aby osiągnąć końcowe stężenie chlorku magnezu wynoszące cztery milimolowe. Dostosuj końcową objętość do 20 mikrolitrów za pomocą ultraczystej wody.

Hybrydyzuj DONA za pomocą gradientu temperatury w termocyklerze. Zaczynając od szybkiego podgrzania do 40 stopni Celsjusza, postępuj zgodnie z wyświetlanym programem gradientu temperatury krok po kroku. W celu oczyszczenia DONA przygotuj 1% żel agaros, rozpuszczając 0,8 grama agarosu w 80 mililitrach TAE uzupełnionym pięciomilimolowym chlorkiem magnezu.

Dodać 2,25 mikrolitra buforu ładującego zawierającego 30% glicerolu i 13 milimolowy chlorek magnezu do 18 mikrolitrów roztworu DONA. Uruchom żel na 60 minut przy napięciu 70 V w lodowatej kąpieli wodnej. Wytnij interesującą Cię opaskę i umieść ją na szkiełku mikroskopowym owiniętym folią parafinową.

Następnie wyciśnij roztwór za pomocą drugiego szkiełka mikroskopowego owiniętego folią parafinową. Za pomocą pipety zbierz wyciśnięty płyn do probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Podczas oczyszczania żelu agaros pasmo dimerów odpowiadające DONA pojawiło się nad pasmem wolnych nanocząstek złota, najszybciej biegnącym pasmem w próbce.

Aby wykonać kolokowane obrazowanie AFM i pomiary Ramana na oczyszczonej antenie nano origami DNA lub DONA, najpierw potraktuj silikonowy chip plazmą przez 10 minut. Inkubować 10 mikrolitrów oczyszczonego roztworu DONA i 10 mikrolitrów 100 milimolowego chlorku magnezu na chipie przez trzy godziny. Następnie umyj frytki dwa razy mieszanką etanolu i wody i wysusz sprężonym powietrzem.

Przyklej wysuszony chip do dysku magnetycznego i włóż go do instrumentu do mikroskopii sił atomowych lub obrazowania AFM. Następnie wybierz żądaną długość fali lasera, moc i czas akumulacji dla pomiarów Ramana. W przypadku nanocząstek złota w pełni pokrytych Tamrą wybierz laser o długości 633 nanometrów i mocy 100 mikrowatów.

I jedna sekunda czasu integracji. W przypadku pojedynczego pomiaru Tamra zmień moc na 400 mikrowatów. I czterosekundowy czas integracji.

Po dostosowaniu parametrów umieść kursor na żądanym DONA na obrazie AFM. Następnie rozpocznij pomiar Ramana. W przypadku pomiarów kolokalizacji wykonano obrazowanie AFM próbki w celu zlokalizowania DONA.

Następnie zebrano widma Ramana z pojedynczych DONA i porównano, aby upewnić się, że uzyskane widma pochodziły z cząsteczek Tamra, a główne piki Tamra były widoczne w całkowicie pokrytej nanocząsteczce Tamra Gold. Chociaż stosunek sygnału do szumu dla pojedynczej cząsteczki Tamra Spectra był niższy, główne piki były możliwe do zidentyfikowania.